CN112442505B - 一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法 - Google Patents
一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112442505B CN112442505B CN201910826257.5A CN201910826257A CN112442505B CN 112442505 B CN112442505 B CN 112442505B CN 201910826257 A CN201910826257 A CN 201910826257A CN 112442505 B CN112442505 B CN 112442505B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- strab5b
- potato
- gene
- cloning
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 85
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 title claims abstract description 73
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 title claims abstract description 73
- 238000010367 cloning Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000011160 research Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims abstract description 47
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims abstract description 42
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 60
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 35
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 30
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 24
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 claims description 9
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 9
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 8
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 8
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 8
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 8
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 claims description 8
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 6
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 6
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 claims description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000233622 Phytophthora infestans Species 0.000 abstract description 9
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 abstract description 8
- 102000030938 small GTPase Human genes 0.000 abstract description 8
- 108091006026 monomeric small GTPases Proteins 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 abstract description 3
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 101150026181 5b gene Proteins 0.000 description 3
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 2
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 108060007624 small GTPase Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101001077409 Homo sapiens Ras-related protein Rab-5B Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000233614 Phytophthora Species 0.000 description 1
- 102100025132 Ras-related protein Rab-5B Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 210000000554 iris Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法，解决的技术问题是马铃薯的晚疫病严重危害马铃薯的生产，研究小G蛋白的StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达，分析其在马铃薯抗晚疫病机制中的作用。本发明包括以下步骤：①查找马铃薯StRab5b的基因序列，设计克隆和构建载体所用的引物，对马铃薯的StRab5b基因进行克隆；对马铃薯的StRab5b基因克隆后，用载体pCAMBIA1300‑221，构建出表达载体PCAMBIA1300‑221‑StRab5b‑GFP；②采用步骤①构建出的表达载体注入烟草叶片中，观察表达载体在烟草叶片中的瞬时表达。本发明初步明确StRab5b基因在抗马铃薯晚疫病过程中的功能，为马铃薯抗病育种和新的种质资源的创制和挖掘奠定理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因表达领域，具体涉及一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的方法。
背景技术
马铃薯是世界上重要的粮食作物，晚疫病是由疫霉菌引起的，是一种世界广泛分布的病原菌，是严重危害马铃薯生产的重要病害，可导致马铃薯大幅度减产。1847年由于晚疫病传播引起的饥荒，使100多万爱尔兰人死亡。我国20世纪50-60年代初，华北、东北和西北曾几次发生晚疫病大流行，使马铃薯生产损失过半，因此，马铃薯晚疫病的防治已经成为当前世界马铃薯生产和育种中重要的防治病害之一。垂直抗性基因由于病原小种变异快而易失去抗性，水平抗性是在病菌小种侵染时，对其发展速度表现一定水平上的限制，因此开发和利用新的马铃薯抗晚疫病基因和转基因研究成为了马铃薯育种的关键问题(宋伯符，1997)，而植物的小G蛋白已成为调控多种信号通路及生理功能的分子开关，因此，研究小G蛋白的StRab5b基因的克隆、载体构建和表达，分析其在马铃薯抗晚疫病机制中的作用具有重要的意义。
植物中Rab蛋白功能多样，研究表明Rab蛋白中存在一些从酵母到哺乳动物非常保守的信号途径，随着基因组学和分子生物学的发展，为了进一步研究Rab蛋白的功能，Rab蛋白参与植物的抗病机制，特别是在马铃薯晚疫病方面的抗病机制的研究将得到进一步的解释。
发明内容
本发明要解决的技术问题是马铃薯的晚疫病严重危害马铃薯的生产，可导致马铃薯大幅度减产，研究小G蛋白的StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达，分析其在马铃薯抗晚疫病机制中的作用具有重要的意义，提供一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法。
为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法，包括以下步骤：采用感染晚疫病菌的烟草叶片，通过①查找马铃薯StRab5b的基因序列，设计克隆和构建载体所用的引物，对马铃薯的StRab5b基因进行克隆；对马铃薯的StRab5b基因克隆后，用载体pCAMBIA1300-221，构建出表达载体pCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP；
②采用步骤①构建出的表达载体pCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP注入烟草叶片中，观察表达载体pCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP在烟草叶片中的瞬时表达，以评估上述表达载体抗烟草晚疫病的抗菌情况；
步骤①所述的对马铃薯的StRab5b基因进行克隆，构建出表达载体pCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP的方法包括以下步骤：a、对马铃薯的StRab5b基因进行克隆后，利用高保真酶
HS DNA Polymerase扩增马铃薯的StRab5b基因，回收扩增后马铃薯的StRab5b基因片段；将扩增后马铃薯的StRab5b基因片段与平末端载体(/>
Simple Cloning Vector)连接后转入大肠杆菌DH5α并进行涂平板操作，涂平板后挑出大肠杆菌DH5α的阳性菌落并提取质粒，保存大肠杆菌DH5α菌液和质粒备用。
b、双酶切(BglII和KpnI)PLG-Rop重组质粒后获得PLG片段，双酶切(BglII和KpnI)步骤a中StRab5b基因片段与平末端载体(
Simple Cloning Vector)连接的重组质粒后获得StRab5b片段，PLG片段与StRab5b片段连接后形成PLG-StRab5b片段后转入大肠杆菌；
c、双酶切(XbaI和SacI)步骤b获得的PLG-StRab5b重组质粒后获得GFP-StRab5b片段并回收，双酶切(XbaI和SacI)pCAMBIA1300-221载体后获得载体大片段，GFP-StRab5b片段与载体大片段连接后获得pCAMBIA1300-221-GFP-StRab5b重组质粒后转入大肠杆菌，挑取阳性菌落后提取质粒，酶切鉴定后转入农杆菌GV3101中保存；
步骤a所述马铃薯的StRab5b基因克隆的方法是：通过Trizol的方法提取马铃薯组培苗底西瑞的RNA，用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit获得cDNA，用Primer5.0软件设计克隆和构建载体所用的引物；所述的用Primer5.0软件设计的引物为：
Rab5b-F：5′-GAAGATCTTCATGGG TTGCGCATCTTCAGC-3′，
Rab5b-R：5′-GGGGTACCCCATGATCAAGCAGCAGTCG-3′；
步骤②所述的表达载体pCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP注入烟草叶片中的方法包括以下步骤：I、将在卡那霉素和利福平抗性的YEB培养基上划线培养的含有pCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP、pCAMBIA 1300-221-GFP的农杆菌接种在10mlYEB液体培养基中，振荡培养过夜；
II、步骤I所述的YEB液体培养基振荡培养过夜结束后，在转速8000rpm的条件下离心2min，收集菌体；
III、用含有150μM乙酰丁香酮、10mM MgCl2、10mM MES的混合液体重悬步骤II所收集的菌体后得到菌液，测定菌液的OD600值为0.5-0.6时备用；
IV、用无针头的注射器吸取步骤III得到的菌液，并将菌液均匀注入到烟草叶片背面右侧，在21℃温度下培养24h；
V、在烟草叶片的背面右侧接种在4℃条件下诱孢4h的晚疫菌，左侧接种H2O；
VI、然后将接种后的叶片置于21℃，80％湿度的培养箱中培养并观察若干天后发病情况。
进一步的，步骤a所述马铃薯的StRab5b基因克隆的方法是：通过Trizol的方法提取马铃薯组培苗底西瑞的RNA，用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit获得cDNA，用Primer5.0软件设计克隆和构建载体所用的引物；所述的用Primer5.0软件设计的引物为：
Rab5b-F：5′-GAAGATCTTCATGGG TTGCGCATCTTCAGC-3′，
Rab5b-R：5′-GGGGTACCCCATGATCAAGCAGCAGTCG-3′。
进一步的，YEB液体培养基的成分为150μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平和20μM乙酰丁香酮，在温度28℃，转速200rpm的条件下振荡培养过夜。
本发明对马铃薯的StRab5b基因进行克隆、构建超表达载体、在烟草叶片中瞬时表达等，初步明确StRab5b基因在抗马铃薯晚疫病过程中的功能，为马铃薯抗病育种和新的种质资源的创制和挖掘奠定理论基础，同时也为获得StRab5b的马铃薯转基因植株提供依据，并对转基因植株进行抗病性鉴定，进一步探究StRab5b基因在抗马铃薯晚疫病中的功能。
附图说明
图1是本发明StRab5b基因的克隆图；图中：M-200bp Marker，1-StRab5b基因；
图2是本发明平末端载体与StRab5b重组质粒的双酶切(BglII和KpnI)的鉴定结果图；图中：M-5k bp Marker，1-大片段为平末端载体的部分，500bp和800bp间为StRab5b基因。
图3是本发明PLG片段与StRab5b的重组质粒的双酶切(BglII和KpnI)的鉴定结果图；大片段为4.2k bp，小片段在1k bp-1.5k bp间是StRab5b和GFP基因片段；
图4是本发明pCAMBIA1300-221与GFP-Rab5b重组质粒的双酶切(XbaI和SacI)的鉴定结果图；图中：pCAMBIA1300-221的大片段为12k bp，小片段在1k bp-1.5k bp间，是StRab5b和GFP重组基因片段；
图5是本发明PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP、PCAMBIA1300-221-GFP、H2O在烟草叶片上接种晚疫菌0-108h的瞬时表达的病斑情况图；
图6是本发明PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP、PCAMBIA1300-221-GFP、H2O在烟草叶片上接种晚疫菌0-108h的瞬时表达的病斑面积统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的方法，其特征在于：包括以下步骤：①查找马铃薯StRab5b的基因序列，设计克隆和构建载体所用的引物，对马铃薯的StRab5b基因进行克隆；对马铃薯的StRab5b基因克隆后，用载体pCAMBIA1300-221，构建出表达载体PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP；步骤①所述的马铃薯StRab5b的基因序列可以从NCBI网站查找，并利用primer5.0软件设计克隆和构建载体所用的引物；
②采用步骤①构建出的表达载体PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP注入烟草叶片中，观察表达载体PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP在烟草叶片中的瞬时表达。由于烟草和马铃薯的StRab5b基因的同源性为94％，而蛋白同源性达到98％，因此以烟草叶片来做瞬时表达。采用马铃薯叶片做瞬时表达时不如烟草叶片好操作，容易把叶片打烂，接晚疫菌后接病处发病严重，影响病斑统计的结果，因此选用的烟草叶片。
步骤①所述的对马铃薯的StRab5b基因进行克隆，构建出表达载体PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP的方法包括以下步骤：a、对马铃薯的StRab5b基因进行克隆后，利用高保真酶
HS DNA Polymerase扩增马铃薯的StRab5b基因，回收扩增后马铃薯的StRab5b基因片段；将扩增后马铃薯的StRab5b基因片段与平末端载体(/>
Simple Cloning Vector)连接后转入大肠杆菌DH5α并进行涂平板操作，涂平板后挑出大肠杆菌DH5α的阳性菌落并提取质粒，保存大肠杆菌DH5α菌液和质粒备用；本步骤所述的将扩增后马铃薯的StRab5b基因片段与平末端载体(/>
Simple Cloning Vector)连接后转入大肠杆菌DH5α的方法是根据“pEASY-Blunt Simple Cloning Kit试剂盒”的说明书进行的操作；涂平板后挑出阳性菌落并提取质粒后测序，经测序，质粒中的StRab5b基因与公布的StRab5b基因序列完全一致。平末端载体(/>
Simple CloningVector)购买于北京全式金生物技术有限公司。
b、双酶切(BglII和KpnI)PLG-Rop重组质粒后获得PLG片段，双酶切(BglII和KpnI)步骤a中StRab5b基因片段与平末端载体(
Simple Cloning Vector)连接后的重组质粒后获得StRab5b片段，PLG片段与StRab5b片段连接后形成PLG-StRab5b片段后转入大肠杆菌；PLG-Rop重组质粒中含有GFP基因，能进行BglII和KpnI酶切，可以实现与StRab5b基因的连接。本发明的PCAMBIA1300-221-GFP载体不能被BglII和KpnI酶切，所以通过中间载体PLG-Rop去实现。StRab5b中的St代表马铃薯；本步骤平末端载体(/>
Simple Cloning Vector)与StRab5b重组质粒的双酶切(BglII和KpnI)的鉴定结果如图2所示，大片段为3.8k bp，由于平末端载体上也存在BglII酶切位点，因此小片段酶切出两段，目的基因片段在500-800bp间；本步骤PLG片段与StRab5b的重组质粒的双酶切(BglII和KpnI)的鉴定结果如图3所示，大片段为4.2k bp，小片段在1k bp-1.5k bp间是StRab5b和GFP基因片段；
c、双酶切(XbaI和SacI)步骤b获得的PLG-StRab5b重组质粒后获得GFP-StRab5b片段并回收，双酶切(XbaI和SacI)pCAMBIA1300-221载体。后获得载体大片段，GFP-StRab5b片段与载体大片段连接后获得pCAMBIA1300-221-GFP-StRab5b重组质粒后转入大肠杆菌，挑取阳性菌落后提取质粒，酶切鉴定后转入农杆菌GV3101中保存；本步骤pCAMBIA1300-221与GFP-Rab5b重组质粒的双酶切(XbaI和SacI)的鉴定结果如图4所示，pCAMBIA1300-221的大片段为12k bp，小片段在1k bp-1.5k bp间，是StRab5b和GFP重组基因片段；
步骤a所述马铃薯的StRab5b基因克隆的方法是：通过Trizol的方法提取马铃薯组培苗底西瑞的RNA，用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit获得cDNA，用Primer5.0软件设计克隆和构建载体所用的引物；所述的用Primer5.0软件设计的引物为：
Rab5b-F：5′-GAAGATCTTCATGGG TTGCGCATCTTCAGC-3′，
Rab5b-R：5′-GGGGTACCCCATGATCAAGCAGCAGTCG-3′；
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit是宝生物工程有限公司TaKaRa生产的，采用上述引物对马铃薯StRab5b基因进行克隆。如图1所示，是StRab5b基因的克隆图。
实施例1：
将步骤②所述的表达载体pCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP注入烟草叶片中的方法包括以下步骤：I、将在卡那霉素和利福平抗性的YEB培养基上划线培养的含有pCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP的农杆菌接种在10mlYEB液体培养基中，培养过夜；
II、步骤I所述的YEB液体培养基振荡培养过夜结束后，在转速8000rpm的条件下离心2min，收集菌体；
III、用含有150μM乙酰丁香酮、10mM MgCl2、10mM MES的混合液体重悬步骤II所收集的菌体后得到菌液，测定菌液的OD600值为0.5-0.6时备用；
IV、用无针头的注射器吸取步骤III得到的菌液，并将菌液均匀注入到烟草叶片背面右侧，在21℃温度下培养24h；
V、在烟草叶片的背面右侧接种在4℃条件下诱孢4h的晚疫菌，左侧接种H2O；本步骤所述的接种的晚疫菌用血球计数板显微观察后将孢子液浓度调整到1×106个/mL。
VI、然后将接种后的叶片置于21℃，80％湿度的培养箱中培养并观察若干天后发病情况。本步骤在培养箱中培养时每天时间按照昼16h、夜8h设定。
YEB液体培养基的成分为150μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平和20μM乙酰丁香酮，在温度28℃，转速200rpm的条件下振荡培养过夜。
对比例1：
对比例1是对实施例1中表达载体PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP注入烟草叶片中中观察瞬时表达设置的对照实验：包括以下步骤：I、将在卡那霉素和利福平抗性的YEB培养基上划线培养的含有pCAMBIA 1300-221-GFP的农杆菌接种在10mlYEB液体培养基中，培养过夜；
II、步骤I所述的YEB液体培养基振荡培养过夜结束后，在转速8000rpm的条件下离心2min，收集菌体；
III、用含有150μM乙酰丁香酮、10mM MgCl2、10mM MES的混合液体重悬步骤II所收集的菌体后得到菌液，测定菌液的OD600值为0.5-0.6时备用；
IV、用无针头的注射器吸取步骤III得到的菌液，并将菌液均匀注入到烟草叶片背面右侧，在21℃温度下培养24h；
V、在烟草叶片的背面右侧接种在4℃条件下诱孢4h的晚疫菌，左侧接种H2O；本步骤所述的接种的晚疫菌用血球计数板显微观察后将孢子液浓度调整到1×106个/mL。
VI、然后将接种后的叶片置于21℃，80％湿度的培养箱中培养并观察若干天后发病情况。本步骤在培养箱中培养时每天时间按照昼16h、夜8h设定。
YEB液体培养基的成分为150μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平和20μM乙酰丁香酮，在温度28℃，转速200rpm的条件下振荡培养过夜。
对比例2：
对比例2是对实施例1中表达载体PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP注入烟草叶片中中观察瞬时表达设置的对照实验：包括以下步骤：
I、用无针头的注射器吸取H2O，并将H2O均匀注入到烟草叶片背面右侧，在21℃温度下培养24h；
II、在烟草叶片的背面右侧接种在4℃条件下诱孢4h的晚疫菌，左侧接种H2O；本步骤所述的接种的晚疫菌用血球计数板显微观察后将孢子液浓度调整到1×106个/mL。
III、然后将接种后的叶片置于21℃，80％湿度的培养箱中培养并观察若干天后发病情况。本步骤在培养箱中培养时每天时间按照昼16h、夜8h设定。
本发明实施例1是在烟草叶片上注入表达载体3PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP，对比例1是在烟草叶片上注入表达载体PCAMBIA 1300-221-GFP，对比例2是在烟草叶片上注入H2O。观察实施例1、对比例1和对比例2在烟草叶片上的瞬时表达，如图5所示，分别是接种后0h、24h、48h、96h、108h后的病斑情况。由图5可以看出，瞬时表达PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP、PCAMBIA1300-221-GFP、H2O的叶片病斑随着接种时间的推移都有所增加，但瞬时表达PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP的病斑均小于PCAMBIA1300-221-GFP和H2O。
进行病斑面积统计，病斑面积统计结果如图6所示，病斑面积统计公式为1/4×II×长×宽，病斑面积大小顺序除了0-48h之内的时间，其余时间均为PCAMBIA1300-221-GFP＞H2O＞PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP，且表现为显著差异。
本发明马铃薯StRab5b基因和烟草NtRab5b基因的蛋白序列的比对结果为：StRab5b和NtRab5b cDNA序列比对同源性93.9％，StRab5b和NtRab5b蛋白序列比对同源性97.5％。
本发明马铃薯StRab5b基因和烟草NtRab5b基因全长、蛋白序列如下：
马铃薯StRab5b基因全长：
Potato locus PGSC0003DMG400007437
Symbol：PGSC0003DMG400007437
Name：PGSC0003DMG400007437
Type：Gene
Length：1034
Organism：Solanum tuberosum
Description：RAB5B
Location(s)：PGSC_DMv3_219_ch11：6962021..6969106
GFF source：BGI
Chromosome：11
ORIGIN
马铃薯StRab5b蛋白序列：
烟草NtRab5b基因全长：
Nicotiana tabacum small GTPase Rab5b(Rab5b)mRNA，complete cds
GenBank：DQ335217.1
Symbol：Rab5b
Locus name：GTPase Rab5b
Gene activity：GTPase
LOCUS：DQ335217 808bp mRNA linear PLN 04-FEB-2008
DEFINITION：Nicotiana tabacum small GTPase Rab5b(Rab5b)mRNA，completecds.
ACCESSION：DQ335217
VERSION：DQ335217.1
SOURCE：Nicotiana tabacum(common tobacco)
ORGANISM：Nicotiana tabacum
Length：808
CDS：1..603
ORIGIN
烟草NtRab5b蛋白序列
Claims (3)
1.一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法，其特征在于：包括以下步骤：采用感染晚疫病菌的烟草叶片，通过①查找马铃薯StRab5b的基因序列，设计克隆和构建载体所用的引物，对马铃薯的StRab5b基因进行克隆；对马铃薯的StRab5b基因克隆后，用载体pCAMBIA1300-221，构建出表达载体PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP；
②采用步骤①构建出的表达载体
PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP注入烟草叶片中，观察表达载体PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP在烟草叶片中的瞬时表达，以评估上述表达载体抗烟草晚疫病的抗菌情况；
所述步骤①所述的对马铃薯的StRab5b基因进行克隆，构建出表达载体PCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP的方法包括以下步骤：a、对马铃薯的StRab5b基因进行克隆后，利用高保真酶
HS DNA Polymerase扩增马铃薯的StRab5b基因，回收扩增后马铃薯的StRab5b基因片段；将扩增后马铃薯的StRab5b基因片段与平末端载体/>
Simple Cloning Vector连接后转入大肠杆菌DH5α并进行涂平板操作，涂平板后挑出大肠杆菌DH5α的阳性菌落并提取质粒，保存大肠杆菌DH5α菌液和质粒备用；
b、利用BglII和KpnI双酶切PLG-Rop重组质粒后获得PLG片段，BglII和KpnI双酶切的步骤a中StRab5b基因片段与平末端载体
Simple Cloning Vector连接的重组质粒后获得StRab5b片段，PLG片段与StRab5b片段连接后形成PLG-StRab5b片段后转入大肠杆菌；
c、利用XbaI和SacI双酶切的步骤b获得的PLG-StRab5b重组质粒后获得GFP-StRab5b片段并回收，XbaI和SacI双酶切pCAMBIA1300-221载体后获得载体大片段，GFP-StRab5b片段与载体大片段连接后获得pCAMBIA1300-221-GFP-StRab5b重组质粒后转入大肠杆菌，挑取阳性菌落后提取质粒，酶切鉴定后转入农杆菌GV3101中保存；
所述马铃薯StRab5b基因如下：
步骤②所述的表达载体pCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP注入烟草叶片中的方法包括以下步骤：I、将在卡那霉素和利福平抗性的YEB培养基上划线培养的含有pCAMBIA1300-221-StRab5b-GFP、pCAMBIA 1300-221-GFP的农杆菌接种在10mlYEB液体培养基中，振荡培养过夜；
II、步骤I所述的YEB液体培养基振荡培养过夜结束后，在转速8000rpm的条件下离心2min，收集菌体；
III、用含有150μM乙酰丁香酮、10mM MgCl2、10mM MES的混合液体重悬步骤II所收集的菌体后得到菌液，测定菌液的OD600值为0.5-0.6时备用；
IV、用无针头的注射器吸取步骤III得到的菌液，并将菌液均匀注入到烟草叶片背面右侧，在21℃温度下培养24h；
V、在烟草叶片的背面右侧接种在4℃条件下诱孢4h的晚疫菌，左侧接种H2O；
VI、然后将接种后的叶片置于21℃，80％湿度的培养箱中培养并观察若干天后发病情况。
2.根据权利要求1所述的一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的方法，其特征在于：步骤a所述马铃薯的StRab5b基因克隆的方法是：通过Trizol的方法提取马铃薯组培苗底西瑞的RNA，用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit获得cDNA，用Primer5.0软件设计克隆和构建载体所用的引物；所述的用Primer5.0软件设计的引物为：
Rab5b-F：5′-GAAGATCTTCATGGG TTGCGCATCTTCAGC-3′，
Rab5b-R：5′-GGGGTACCCCATGATCAAGCAGCAGTCG-3′。
3.根据权利要求1所述的一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的方法，其特征在于：YEB液体培养基的成分为150μg/mL卡那霉素、100μg/mL利福平和20μM乙酰丁香酮，在温度28℃，转速200rpm的条件下振荡培养过夜。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910826257.5A CN112442505B (zh) | 2019-09-03 | 2019-09-03 | 一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910826257.5A CN112442505B (zh) | 2019-09-03 | 2019-09-03 | 一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112442505A CN112442505A (zh) | 2021-03-05 |
| CN112442505B true CN112442505B (zh) | 2023-06-23 |
Family
ID=74735399
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910826257.5A Active CN112442505B (zh) | 2019-09-03 | 2019-09-03 | 一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112442505B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003000898A1 (en) * | 2001-06-22 | 2003-01-03 | Syngenta Participations Ag | Plant genes involved in defense against pathogens |
| CN104737830A (zh) * | 2015-04-14 | 2015-07-01 | 河北北方学院 | 一种解决马铃薯品种作为杂交母本不育的方法 |
| CN105543273A (zh) * | 2016-01-14 | 2016-05-04 | 云南农业大学 | 一种利用植物质体瞬时快速表达外源蛋白方法 |
| CN107699579A (zh) * | 2017-11-03 | 2018-02-16 | 南京农业大学 | 一种提高植物抗病性的基因及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL155154A0 (en) * | 2000-09-30 | 2003-10-31 | Diversa Corp | Whole cell engineering by mutagenizing a substantial portion of a starting genome, combining mutations, and optionally repeating |
-
2019
- 2019-09-03 CN CN201910826257.5A patent/CN112442505B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003000898A1 (en) * | 2001-06-22 | 2003-01-03 | Syngenta Participations Ag | Plant genes involved in defense against pathogens |
| CN104737830A (zh) * | 2015-04-14 | 2015-07-01 | 河北北方学院 | 一种解决马铃薯品种作为杂交母本不育的方法 |
| CN105543273A (zh) * | 2016-01-14 | 2016-05-04 | 云南农业大学 | 一种利用植物质体瞬时快速表达外源蛋白方法 |
| CN107699579A (zh) * | 2017-11-03 | 2018-02-16 | 南京农业大学 | 一种提高植物抗病性的基因及其应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Targeted and Untargeted Approaches Unravel Novel Candidate Genes and Diagnostic SNPs for Quantitative Resistance of the Potato (Solanum tuberosum L.) to Phytophthora infestans Causing the Late Blight Disease;Teresa Mosquera等;《PLoS One》;20160609;第11卷(第6期);e0156254 * |
| 植物Rab蛋白的研究进展;高文等;《西北植物学报》;20131215(第12期);204-212 * |
| 水稻小G蛋白OsRab5b的亚细胞定位研究;邵军丽等;《生物技术通报》;20151231(第11期);145-151 * |
| 超量表达响应β-氨基丁酸诱导的StWRKY8基因提高马铃薯晚疫病抗性;王海霞等;《农业生物技术学报》;20180725;第26卷(第7期);第1107-1115页 * |
| 黑龙江省马铃薯晚疫病菌的交配型和multi-locus基因型分析;张铉哲等;《中国蔬菜》;20180326(第04期);第63-69页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112442505A (zh) | 2021-03-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111424022B (zh) | 大丽轮枝菌VdEG抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用 | |
| CN113528518B (zh) | 抑制核盘菌的miRNA及其应用 | |
| CN105838723B (zh) | 一种紫花苜蓿抗寒基因MsZFP及其编码蛋白与应用 | |
| CN109627303B (zh) | 三七病程相关蛋白PnPR3的基因及其应用 | |
| CN116355067B (zh) | 抑制核盘菌的水稻OsGLP8-12及其应用 | |
| CN116425847B (zh) | 抑制核盘菌的水稻OsGLP8-10及其应用 | |
| CN116444636B (zh) | 抑制核盘菌的水稻OsGLP3-6及其应用 | |
| CN110592100B (zh) | 一种木薯camta基因及其抑制表达载体的构建和抗病应用 | |
| CN112442505B (zh) | 一种马铃薯StRab5b基因的克隆、载体构建和瞬时表达的研究方法 | |
| CN115976052A (zh) | 小麦茎基腐病抗性基因TaHSP18．6、其表达产物、重组载体及应用 | |
| CN113980107B (zh) | 一种植物编码序列、扩增引物及在优化株型节间距的应用 | |
| CN112195178B (zh) | 番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787及其克隆方法与应用方法 | |
| CN102140446A (zh) | 油菜iMyAP基因过表达在油菜抗菌核病中的应用 | |
| CN111471689B (zh) | 一种提高大豆对胞囊线虫病抗性的基因及其应用 | |
| CN116751769B (zh) | 咖啡短体线虫Pc-CL蛋白、编码基因及其应用 | |
| CN103088035A (zh) | 大豆凝集素基因lec-s 的应用 | |
| CN115894652B (zh) | 桃小分子热休克基因在提高植物耐苯甲酸胁迫方面的应用 | |
| CN114591984B (zh) | OsAP79基因诱导水稻抗褐飞虱的应用 | |
| CN117265156B (zh) | 检测球孢白僵菌过敏原基因的特异性引物对及其应用 | |
| CN110511932B (zh) | 棉花纤维长度相关microRNA477及其前体DNA和应用 | |
| CN104830872A (zh) | 棉花GhEDR2基因及其编码蛋白与应用 | |
| CN117986334A (zh) | 一种影响植物对黑斑病抗性的转录因子PpCBP60B及其编码基因和应用 | |
| CN117987420A (zh) | 一种植物介导的美洲斑潜蝇基因沉默方法及应用 | |
| CN114621962A (zh) | 花生AhBI-1基因VIGS沉默体系 | |
| CN113637059A (zh) | GhTLP19蛋白在调控棉花抗黄萎病菌中的应用及调控棉花抗黄萎病菌的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20210305 Assignee: Zhangjiakou Changhe Agricultural Development Co.,Ltd. Assignor: HEBEI NORTH University Contract record no.: X2023980049339 Denomination of invention: A research method for cloning, vector construction, and transient expression of potato StRab5b gene Granted publication date: 20230623 License type: Common License Record date: 20231130 |