CN117265156B - 检测球孢白僵菌过敏原基因的特异性引物对及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及2组检测球孢白僵菌(Beauver ia bass iana)过敏源基因Bb‑f2的特异性引物及应用方法，通过常规PCR和荧光定量q‑PCR诊断菌株是否存在过敏原基因(Bb‑f2)，特异性强，应用于筛选僵蚕是否是由含有缺失过敏原基因的球孢白僵菌所感染的方法、鉴定僵蚕中的球孢白僵菌是否含有过敏原基因、检测僵蚕中的球孢白僵菌的过敏原基因的表达量。本发明可应用于对敲除过敏原基因的球孢白僵菌菌株进行检测和鉴定，对规范化、标准化及专业化生产养殖僵蚕具有重要的意义。

Description

检测球孢白僵菌过敏原基因的特异性引物对及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及检测球孢白僵菌过敏原基因的特异性引物对及其应用。
背景技术
球孢白僵菌是一种重要的昆虫病原菌，可感染700多种昆虫，包括经济昆虫家蚕和蜜蜂。1834年意大利科学家巴希首次从白僵病蚕中分离出白僵菌，并被命名为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。目前最新的分类体系将其归类为真菌界的双核亚界(Dikarya)、子囊菌门(Ascomycota)、盘菌亚门(Pezizomycotina)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、虫草菌科(Cordycipitaceae)的白僵菌属(Beauveria)。不同地区及不同宿主昆虫来源的球孢白僵菌具有一定的遗传多样性和对不同宿主的毒力差异。
我国栽桑养蚕具有5000多年的历史，白僵病蚕作为中药材医用也有近2000多年的历史，距今约2500多年前即公元前一世纪左右，在秦汉时期的《神农本草经》中就有“白僵蚕味咸，主小儿惊痫夜蹄”等的记载，16世纪明代李时珍(1518-1593)在《本草纲目》中详细记载了用白僵蚕来治病的处方和功用，迄今僵蚕作为单品或复方已广泛应用于中医药的实践中，僵蚕的质量标准和检验指标也不断完善。过去僵蚕的来源主要从农村养蚕区域的零星自然发病虫体中收集和收购，僵蚕质量得不到保证，且僵蚕晾晒过程容易污染养蚕环境，对养蚕生产茧丝的蚕区及农户带来传染及危害威胁。感染危害家蚕的白僵菌主要是球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。规模化养殖生产僵蚕，养蚕批次显著增加甚至安排在气温较高的夏秋季节，易受到高温对球孢白僵菌生长发育的影响，另外，僵蚕集中晾晒、采收和储运处理过程中特别是在相对封闭的环境中，虫体表面白僵菌的分生孢子散落飞扬，对操作人员的呼吸系统会带来过敏性反应。因此需要研究即不影响菌株的毒力，又能显著提高菌株对温度的抗逆性以及降低分生孢子对僵蚕采收人员的致敏性反应的球孢白僵菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于PCR法检测球孢白僵菌过敏原基因的特异性引物对，包括序列如SEQ ID NO.14所示的上游引物F和序列如SEQ ID NO.15所示的下游引物R。
本发明的目的在于提供一种基于q-PCR法检测球孢白僵菌过敏原基因的特异性引物对，包括序列如SEQ ID NO.16所示的上游引物F和序列如SEQ ID NO.17所示的下游引物R。
本发明的另一目的在于提供一种筛选僵蚕是否是由含有缺失过敏原基因的球孢白僵菌所感染的方法，具体包括如下步骤：
(1)以僵蚕中球孢白僵菌的基因组DNA为模板，应用针对过敏原基因ORF的引物对进行PCR扩增；所述引物对为序列如SEQ ID NO.14所示的上游引物F和如SEQ ID NO.15所示的下游引物R；
(2)检测第(1)的扩增产物在750pb-1000pb之间是否有扩增产物，没有即缺失过敏原基因，有即存在过敏原基因。
本发明优选的技术方案中，所述球孢白僵菌过敏原基因ORF的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明优选的技术方案中，所述步骤(1)中PCR扩增中，每25.0μL扩增反应体系包括：基因组DNA 2.0μL，含2mM Mg2+的LA Buffer 2.5μL，10U浓度的LA Taq聚合酶0.25μL，2.5mM的dNTP 2.0μL，10mM的上游引物1μL，10mM的下游引物1μL，ddH2O余量。
本发明优选的技术方案中，所述步骤(1)中PCR扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min。
本发明优选的技术方案中，所述步骤(2)中检测扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳法，检测电泳后的PCR产物在842pb是否有条带，没有显示条带确诊为阴性即缺失过敏原基因，显示有该条带确诊为阳性即存在过敏原基因。
本发明的另一目的在于提供一种检测僵蚕中的球孢白僵菌的过敏原基因的表达量的方法，具体包括如下步骤：
(1)以僵蚕中球孢白僵菌株cDNA为模板，应用球孢白僵菌过敏原基因片段的q-PCR引物对进行荧光定量PCR扩增；所述引物对包括序列如SEQ ID NO.16所示的上游引物F和序列如SEQ ID NO.17所示的下游引物R；
(2)以球孢白僵菌株的Actin基因为内参，采用引物对对菌株cDNA荧光定量PCR扩增，所述引物对包括序列如SEQ ID NO.18所示的上游引物F和序列如SEQ ID NO.19所示的下游引物R；以Actin基因表达量为参照计算过敏原基因的相对表达量，野生菌株过敏原基因的相对表达量≥1，缺失过敏源基因的菌株其过敏原基因的相对表达量≤0.02，优选为0。
本发明优选的技术方案中，所述RNA反转录cDNA的方法为，获得的RNA模板去除残留的基因组DNA污染,利用qPCR试剂反转录获得第一链cDNA。
本发明优选的技术方案中，所述RNA反转录cDNA的方法为，获得的RNA模板用4×gDNA wiper Mix短暂处理，彻底去除残留的基因组DNA污染,利用HiScript@IIQ RT SuperMix for qPCR试剂反转录获得第一链cDNA。
本发明优选的技术方案中，RNA反转录cDNA反应体系包括，模板RNA1pg-1μg，4×gDNA wiper Mix 4μL，RNase-free dd H2O补充至16μL。
本发明优选的技术方案中，所述实时荧光定量qRT-PCR的反应体系(20μL)如下：100ng cDNA,200nM上游引物，200nM下游引物及10μLGreen Super mix，所述对内参基因的上游引物Actin-F的序列如SEQ ID NO.18所示；下游引物Actin-R:如SEQ IDNO.19所示；对过敏原基因的上游引物：如SEQ ID NO.16所示；下游引物：如SEQ ID NO.17所示。
本发明优选的技术方案中，所述q-PCR扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，95℃延伸15s，然后重复退火和延伸相同时间一次，预设定15-35个循环。
本发明的另一目的在于提供一种鉴定僵蚕中的球孢白僵菌是否含有过敏原基因的方法，具体包括如下步骤：
(1)以僵蚕菌株基因组DNA(gDNA)为模板，应用球孢白僵菌过敏原基因片段的q-PCR引物对，包括序列如SEQ ID NO.16所示的上游引物F和序列如SEQ ID NO.17所示的下游引物R，进行荧光定量PCR扩增；
(2)读取不同菌株gDNA的PCR荧光的CT值；CT值超过30为阴性即菌株缺失过敏原基因，低于30为阳性即菌株存在过敏原基因。
本发明优选的技术方案中，所述实时荧光定量qRT-PCR的反应体系(20μL)如下：100ng gDNA，200nM上游引物，200nM下游引物及10μLGreen Super mix。
本发明优选的技术方案中，所述q-PCR扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，95℃延伸15s，然后以相同时间重复退火和延伸一次，预设定15-35个循环进行PCR。
本发明的目的在于提供一种过敏原基因(Bb-f2)敲除的球孢白僵菌的构建方法，通过敲除球孢白僵菌野生株的过敏原基因(Bb-f2)得到不含过敏原基因(Bb-f2)的球孢白僵菌菌株，所述过敏原基因(Bb-f2)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明优选的技术方案中，所述过敏原基因位于球孢白僵菌基因组的位点在169583-170423之间，ORF序列长842bp。
本发明优选的技术方案中，所述球孢白僵菌野生株为GXsk1011(NCBI/SRP06777.1)。
本发明优选的技术方案中，所述敲除过敏原基因是通过同源重组方法敲除，以敲除载体质粒中的通用除草剂抗性基因Bar，置换球孢白僵菌中过敏原基因(Bb-f2)，以完成对球孢白僵菌过敏原基因的敲除。
本发明优选的技术方案中，所述通用除草剂抗性基因Bar为NCBI/KF780168.1。
本发明优选的技术方案中，所述不含过敏原基因(Bb-f2)的球孢白僵菌菌株，对5龄家蚕的LT50小于4d。
本发明优选的技术方案中，所述不含过敏原基因(Bb-f2)的球孢白僵菌菌株，在40℃高温下胁迫6小时，其生长抑制率低于5％。
本发明优选的技术方案中，所述构建方法具体包括如下步骤：
(1)球孢白僵菌过敏原基因(Bb-f2)在基因组的定位及基因克隆分析
提取球孢白僵菌野生菌株GXsk1011的基因组DNA为模板，用球孢白僵菌过敏原基因(Bb-f2)的ORF特异性引物进行PCR扩增，将扩增产物与克隆载体连接，筛选阳性质粒后测序，确定过敏原基因序列如Seq ID No.1所示；
(2)敲除载体的构建
用两种限制性内切酶对敲除质粒载体进行酶切线性化处理，并用酶切位点特异性的引物验证两种酶切位点；取目的基因过敏原基因(Bb-f2)的上/下游(左右臂)各1500-2500bp左右长度片段并结合敲除质粒载体中的酶切位点为插入位点进行引物设计，同时，以野生株球孢白僵菌GXsk1011基因组为模板，采用Seq ID No.8、Seq ID No.9、Seq IDNo.10、Seq ID No.11，分别扩增过敏原基因(Bb-f2)的上/下游片段(左右同源臂)，然后将左右同源臂分别连接到已线性化处理的敲除质粒载体的抗性基因的两侧，将连接后的产物转化宿主菌进行抗性筛选，然后用引物Seq ID No.12、Seq ID No.13实现对连接转化后的阳性转化子验证筛选；
(3)通过同源重组置换敲除球孢白僵菌基因组的过敏原基因Bb-f2
将Bb-f2敲除载体质粒通过农杆菌转化后与球孢白僵菌共培养把质粒导入球孢白僵菌，质粒中的抗性基因将球孢白僵菌基因组的过敏原基因Bb-f2替换，通过添加抗性药物的培养基筛选敲除突变株，并通过PCR验证，成功获得敲除球孢白僵菌基因组中的过敏原基因Bb-f2的菌株。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)Bb-f2的ORF特异性引物对序列为Seq IDNo.2和Seq ID No.3。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中的克隆载体为质粒pMD19-T simple载体。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，敲除载体使用质粒pk2-bar，用限制性内切酶EcoRI和PstI进行酶切线性化处理，并用引物Seq ID No.4、Seq ID No.5、Seq ID No.6、Seq ID No.7验证EcoRI和PstI的酶切位点。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，取目的基因过敏原基因(Bb-f2)的上/下游(左右臂)各2000bp左右长度片段并结合敲除质粒载体中的EcoRI和PstI的酶切位点为得到上游片段引物为插入位点进行引物设计，得到上游引物如Seq IDNo.8、Seq ID No.9所示，下游片段引物如Seq ID No.10、Seq ID No.11所示。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，将左右同源臂分别连接到已线性化处理的敲除质粒载体pK2-PB载体的抗性基因bar的两侧，宿主菌为大肠杆菌DH5α。
本发明的另一目的在于提供本发明的过敏原基因(Bb-f2)敲除的球孢白僵菌的构建方法构建得到的不含过敏原基因(Bb-f2)的球孢白僵菌菌株。
本发明优选的技术方案中，所述不含过敏原基因(Bb-f2)的球孢白僵菌菌株，对5龄家蚕的LT50小于4d。
本发明优选的技术方案中，所述不含过敏原基因(Bb-f2)的球孢白僵菌菌株，在40℃高温下胁迫6小时，其生长抑制率低于5％。
本发明优选的技术方案中，所述不含过敏原基因(Bb-f2)的球孢白僵菌菌株为球孢白僵菌△Bb-f2(Beauveria bassiana)，保藏号为CCTCC M 20231265，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
本发明的另一目的在于提供一种球孢白僵菌△Bb-f2(Beauveria bassiana)，保藏号为CCTCC M 20231265，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
本发明的另一目的在于提供不含过敏原基因(Bb-f2)的球孢白僵菌菌株在养殖生产僵蚕中应用。
与现有技术相比，本发明有益的技术效果包括：
1、本发明提供一种过敏原基因敲除的球孢白僵菌的构建方法，通过敲除过敏原基因，既不影响菌株的毒力，又提高了球孢白僵菌高温耐受能力，降低了球孢白僵菌分生孢子过敏性，显著提高菌株对温度的抗逆性以及降低对人体的致敏性反应。应用于僵蚕生产中。
2、本发明针对过敏原基因(Bb-f2)，分别设计筛选提供了二组特异性引物，通过常规PCR和荧光定量q-PCR诊断菌株是否存在过敏原基因(Bb-f2)，特异性强，应用于筛选僵蚕是否是由含有缺失过敏原基因的球孢白僵菌所感染的方法、鉴定僵蚕中的球孢白僵菌是否含有过敏原基因、检测僵蚕中的球孢白僵菌的过敏原基因的表达量。
3、本发明构建的球孢白僵菌过敏原基因缺失菌株，适合僵蚕养殖专业化、规范化、规模化生产应用。
生物材料保藏
本发明所述的球孢白僵菌△Bb-f2(Beauveria bassiana)，保藏号为CCTCCM20231265，已于2023年7月11日提交保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
附图说明
图1球孢白僵菌Bb-f2基因L臂和R臂的PCR扩增产物(A)、构建的Bb-f2敲除载体(B)及其质粒PCR验证(C)，其中A、1-4泳道依次为DL5000 DNA marker、Bb-f2的R臂扩增产物、DL5000 DNA marker、Bb-f2的L臂扩增产物；B、bar代表草丁膦抗性基因，KanR代表卡那霉素抗性基因；C、1-4泳道依次为DL5000 DNA marker、Bb-f2基因敲除载体质粒、以pK2-H-F/R为引物的质粒PCR产物、以pK2-E-F/R为引物的质粒PCR产物；
图2球孢白僵菌中过敏原基因Bb-f2的同源置换敲除示意图(A)，Bb-f2敲除转化子菌丝PCR验证(B)和敲除转化子RT-PCR验证(C)，其中A图中Bar是草丁膦抗性基因的表达元件；B、C图中yKN-F/R、Bb-f2-F/R是验证引物，M:DNA分子量标准；1:野生型菌株；2:敲除株ΔBb-f2；
图3球孢白僵菌野生株(WT)、敲除菌株(ΔBb-f2)及超量表达菌株(OE-Bb-f2)的菌落形态及菌落生长特征；
图4球孢白僵菌野生株及Bb-f2突变株的菌落/菌丝在40℃胁迫不同时间后的菌落直径(A)及生长抑制率(B)，其中WT：野生株；ΔBb-f2：敲除菌株；OE-Bb-f2：超量表达菌株，*表示与野生株相比差异显著(*P<0.05)，**表示与野生株相比差异极显著(**P<0.01)；
图5球孢白僵菌野生株(WT)、敲除菌株(ΔBb-f2)及超量表达菌株(OE-Bb-f2)感染家蚕后病蚕尸体症状；
图6球孢白僵菌不同菌株对小鼠的鼻滴试验，注：相同字母标注表示组间差异不显著(p>0.05)，不同字母标注表示组间存在显著差异(p<0.05)；
图7球孢白僵菌不同菌株皮肤点刺试验对小鼠的过敏反应。注：相同字母标注表示组间差异不显著(p>0.05)，不同字母标注表示组间存在显著差异(p<0.05)；
图8球孢白僵菌过敏原基因ORF的检测，ΔBb-f2为本发明缺失过敏原基因的菌株，WT为存在过敏原基因的菌株；
图9不同菌株q-PCR的溶化曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的详细内容做进一步解释和描述，但并不以此限制本发明的保护范围。
实施例中的球孢白僵菌野生株WT为GXsk1011(NCBI/SRP06777.1)来源于本实验室。
实施例中的超量株的制备方法为：质粒pK2-sur(来源于西南大学生物技术中心)在sur基因元件下游的酶切位点处与基因Bb-f2的ORF区和球孢白僵菌的强启动子g3pd进行连接，构建得到超量表达载体质粒，然后通过向野生菌株转化、筛选获得含有过敏原基因强启动子的超量株。
实施例中的试剂均购自南京诺维赞生物科技有限公司。
实施例1球孢白僵菌△Bb-f2菌株的构建
1、球孢白僵菌过敏原基因(Bb-f2)在基因组的定位及基因克隆分析
通过NCBI数据库搜索及分析该基因位于球孢白僵菌基因组核苷酸序列的位点在169583-170423之间，使用Primer v5软件设计球孢白僵菌过敏原基因(Bb-f2)的ORF特异性引物，引物序列为Seq ID No.2:5’ATGAAGACACCGAGCTTTCTAATTG3’(F)、Seq ID No.3：5’TTAAGCCTTTGACTTCTCCGCAGGC 3’(R)，提取球孢白僵菌野生菌株GXsk1011的基因组DNA为模板，以高保真LA taq酶进行扩增Bb-f2基因，扩增得到的PCR产物经电泳初步检测确定片段大小的正确性，然后切胶，回收目的片段与质粒pMD19-T simple载体连接，筛选阳性质粒后测序，过敏原的基因序列如表1中的Seq ID No.1所示，该基因ORF序列长842bp，分析表明该基因序列编码过敏原蛋白氨基酸达260个，N端含有一个信号肽序列(由22个氨基酸组成)，介导球孢白僵菌的过敏原蛋白向菌体外分泌。
2、敲除载体(质粒)的构建
选择真菌通用的敲除载体质粒pk2-bar(带有PtrpC-Bar-TtrpC即启动子-草丁膦抗性基因-终止子的表达元件)，用限制性内切酶EcoRI和PstI进行酶切线性化处理，并用引物Seq ID No.4、Seq ID No.5、Seq ID No.6、Seq ID No.7验证EcoRI和PstI的酶切位点；利用NCBI数据库对目的基因过敏原蛋白基因(Bb-f2)上/下游片段序列进行检索，取目的基因上/下游(左右臂)各2000bp左右长度片段并结合载体pk2-bar中酶切位点EcoRⅠ和XbaⅠ为插入位点进行引物设计，得到上游片段引物为Seq ID No.8、Seq ID No.9和下游片段引物为Seq ID No.10、Seq ID No.11，同时，以野生株球孢白僵菌GXsk1011基因组为模板，采用SeqID No.8、Seq ID No.9、Seq ID No.10、Seq ID No.11，分别扩增目的基因的上/下游片段(左右同源臂)，对扩增产物分别进行核酸凝胶电泳并以大小正确的条带为准，进一步进行PCR扩增产物的胶回收纯化，然后利用无缝克隆连接试剂盒将左右同源臂分别连接到已线性化处理的pk2-bar片段的抗性基因bar(NCBI/KF780168.1)的两侧，将连接后的产物转化进入大肠杆菌DH5α中并利用卡那霉素进行抗性筛选，然后用引物Seq ID No.12、Seq IDNo.13实现对连接转化后的阳性转化子验证筛选。上述引物序列见表1。敲除过敏原基因的载体如图1所示。
3、通过同源重组置换敲除球孢白僵菌基因组的过敏原基因Bb-f2
将Bb-f2敲除载体质粒通过农杆菌转化后与球孢白僵菌共培养把质粒导入球孢白僵菌，质粒中的草丁膦抗性基因bar基因将球孢白僵菌基因组的过敏原基因Bb-f2替换，通过添加草丁膦的培养基筛选敲除突变株，并通过PCR验证。至此，成功获得敲除球孢白僵菌基因组中的过敏原基因Bb-f2的菌株ΔBb-f2。如图2所示。
4、敲除球孢白僵菌过敏原基因突变株所涉及的核苷酸序列见下表
表1.构建球孢白僵菌过敏原基因敲除菌株所涉及的核苷酸序列
菌种保藏：经鉴定，本发明所述的球孢白僵菌△Bb-f2(Beauveria bassiana)，保藏号为CCTCC M 20231265，已于2023年7月11日提交保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
实施例2敲除过敏原基因对球孢白僵菌菌落形态和生长的影响试验
1、实验材料和方法：取适量球孢白僵菌敲除突变株ΔBb-f2、野生株WT和超量表达株OE-Bb-f2，分别配制成1×107/mL的分生孢子悬液，分别取2μL孢子悬液点接于SDAY固体培养基正中间，设置3个重复组，于26℃和12:12h(L:D)条件下陆续培养9天，观察菌落形态及采用十字交叉法测量菌落直径。
SDAY固体培养基的具体组成为：葡萄糖40g，酵母膏10g，蛋白胨10g，蒸馏水定容到1L，116℃高压蒸汽灭菌20min。
2、实验结果：在菌落形态上敲除突变株与野生株WT和超量表达株有明显的差异，其特征如图3所示，且敲除突变株的菌落直径(5.23±0.12cm)显著大于野生株WT(2.15±0.15cm)和超量表达株(3.51±0.13cm)。试验表明：敲除过敏原基因不影响菌株的生长，且对菌丝的生长有明显的促进作用。
实施例3敲除过敏原基因对球孢白僵菌耐热性的影响试验
1、实验材料和方法：将野生株及敲除和超量表达突变株配制成1×107conidia/mL的分生孢子悬液，分别取2μL菌液接种于SDAY平板上，在26℃条件下培养2天后，分别于40℃热激1、2、4、6h后放到26℃培养箱培养，以没有热激的菌株作对照，9天后测定菌落直径及抑制率。
2、实验结果：敲除过敏原基因的球孢白僵菌菌株及超量表达菌株相对于野生株具有更强的耐热性。球孢白僵菌的生长发育适温为20-30℃，低于15℃或高于35℃菌丝的生长会受到一定程度的抑制。40℃为临界致死温度，在此温度胁迫6小时(6h)的情况下，对野生株的生长抑制率达到了38％，而对敲除过敏原基因的球孢白僵菌菌株的抑制率不到5％。见图4。
实施例4敲除过敏原基因的球孢白僵菌对宿主的毒力试验
1、实验材料和方法：采用体壁侵染接种法测定野生型菌株及Bb-f2敲除和超量表达突变株对家蚕五龄期幼虫的毒力。用0.05％Tween-80溶液配制1×107conidia/mL浓度的分生孢子悬液，30头昆虫为一组，设置3个重复组，以0.05％的吐温80溶液处理组作为空白对照。处理后的家蚕幼虫置于26℃培养，每隔12h记录各组的死亡虫数，统计获得半致死时间(LT50)。
2、实验结果，以野生型菌株为对照，敲除菌株ΔBb-f2对家蚕LT50相比野生株缩短了0.6d为3.9±0.02d；OE-Bb-f2超量株LT50为4.0±0.02d比野生型的LT50(4.5±0.03d)也有所降低，但超量株在体表菌丝的生长及产孢受到抑制。结果表明：敲除过敏原基因的球孢白僵菌对家蚕的毒力未受影响，且毒力相对于野生株有明显提高。对家蚕的感染症状见图5。
实施例5敲除过敏原基因的球孢白僵菌分生孢子对实验动物小鼠的致敏性试验
1、实验动物：5-6周龄BALB/c雌性小鼠，体重17-20g，25℃培养；
2、菌体配制：用0.05％吐温80的配置孢悬液，用血球计数板计数孢子数量，调整孢悬液浓度为3×108conidia/mL；
3、实验分组：动物分组：30只小鼠随机分为5组鼻滴和5组表皮点刺。
①阳性对照：10mg/ml组胺；②阴性对照：无菌水；③野生株；④敲除株；⑤超量菌株；
4、实验方法：
(1)鼻滴法:无菌微量枪头吸取50μL球孢白僵菌孢悬液、组胺及无菌水缓慢滴入小鼠双侧鼻孔，维持垂直体位5min,然后放置在饲养笼内，观察小鼠的行为反应，每天鼻滴1次，连续试验3d，鼻滴后60分钟内持续观察小鼠的反应。
(2)表皮点刺：将50μL球孢白僵菌孢悬液、组胺及无菌水分别注入皮肤的表皮和肌肉之间，固定小鼠后，将注射部位毛发剃去，局部常规消毒后注射，实验处理后放置在饲养笼内，观察小鼠的行为反应及皮疹情况，每天点刺1次，连续试验3d，点刺后60分钟内持续观察小鼠的反应。
5、实验观察：
试验处理后观察60min(1h)内小鼠症状：其临床症状是否表现为打喷嚏、鼻塞、鼻痒、清鼻涕、抓挠身体、红疹等，并拍摄小鼠的动态视频，做数据化处理的基础材料。
6、实验结果：
球孢白僵菌不同菌株(野生株、过敏原基因敲除株及超量表达株)以及阴性对照(无菌水)和阳性对照(组胺)对小鼠的鼻滴试验和皮肤点刺试验显示，无菌水对小鼠无过敏反应，小鼠对组胺和白僵菌过敏原基因超量表达株为重度过敏反应，野生株有中度过敏反应，过敏原基因敲除株小鼠的过敏反应显著降低，仅有轻度过敏反应；过敏反应和症状，除组胺点刺皮肤出现红疹，其他实验组均无红疹，过敏反应主要表现为剧烈抓挠鼻子及身体，严重者四处摩擦身体。实验结果见表2、表3及图6和图7。
表2、球孢白僵菌不同菌株鼻滴试验致小鼠的过敏反应
注：1、抓鼻轻碰数次为轻度(+)，抓鼻轻碰数次与四处摩擦之间为中度(++)，四处摩擦为重度(+++)；2、每次挠痒持续时间约3-5分钟；3、①②③为三个重复；4、相同字母标注表示组间差异不显著(p>0.05)，不同字母标注表示组间存在显著差异(p<0.05)。
表3、球孢白僵菌不同菌株皮肤点刺试验致小鼠的过敏反应
注：1、抓挠身体为轻度(+)，抓挠身体与四处摩擦之间为中度(++)，四处摩擦为重度(+++)；2、每次挠痒持续时间约3-5分钟；3、①②③为三个重复；4、相同字母标注表示组间差异不显著(p>0.05)，不同字母标注表示组间存在显著差异(p<0.05)。
实施例6敲除过敏原基因的球孢白僵菌在养殖生产僵蚕中的应用
1、实验材料和方法：实验菌株-野生型菌株(WT)及过敏原基因Bb-f2敲除突变株，按生产配方将菌种分别配制成含1×107-1×108conidia/mL浓度的分生孢子悬液，分别在两间蚕房给五龄起蚕体壁喷体接种，饲养8-9天后，随机抽样100头，重复抽样三次，分别调查感染死亡率、僵化率、灰分含量、虫体丝腺环完整率；另外，采用引物序列SEQ.ID.NO 2、SEQ.ID.NO 3，通过PCR分别对菌株进行了鉴定，以及采收僵蚕时调查操作人员对分生孢子的过敏性反应情况。
2、实验结果：以野生型菌株为对照，敲除菌株ΔBb-f2对家蚕的感染死亡率、僵化率及虫体丝腺环完整率高于野生株、灰分含量低于野生株，试验数据见表4。经问询调查，采收僵蚕时操作人员对敲除菌株飞散的分生孢子的过敏性反应显著降低；通过PCR对菌株的DNA中的过敏原基因扩增及凝胶电泳检测，在凝胶板上电泳没有过敏原基因的扩增带，证实为过敏原基因敲除菌株。
表4敲除过敏原基因的球孢白僵菌菌株应用于养殖生产僵蚕的试验数据
注：1.丝腺环完整率是指僵蚕中间折断后体内留存有丝腺环达4个的僵蚕个体的比率；2.总灰分测定按中国药典通则2302方法；3.不同字母标注表示组间差异显著(p<0.05)。
实施例7对球孢白僵菌过敏原基因Bb-f2的ORF的检测
1、实验材料和方法：对患病僵蚕采样，取菌丝直接提取基因组DNA，所述菌丝的培养方法为：取分生孢子制备成1×107/mL孢子悬液，在萨氏固体培养基上先培养7天后，再制备1×107孢子悬液，然后将其接种到萨氏液体培养基(l0g/L酵母提取物，40g/L葡萄糖，l0g/L胰蛋白胨，双蒸水定容至1L，116℃，高压灭菌20min)中，200rpm培养2-3天后在抽滤瓶中抽滤菌丝并烘干备用；
菌丝通过真菌基因组DNA提取试剂盒(Fungal DNA Mini Kit)提取样品DNA，
具体操作如下：
(1)用液氮研磨10-50mg的菌丝，研磨后装入1.5mL离心管中，加入800μL BufferFG1，剧烈混匀，确保块状物散开；
(2)将样品放入65℃水浴锅中加热10分钟，加热时上下颠倒混匀两次，然后加入140μL Buffer FG2并混匀，10000rpm离心10min；
(3)将上清转移到新的1.5mL离心管中，不要吸到沉淀，加入0.7倍体积的异丙醇并震荡混匀，10000rpm离心5min，并收集沉淀；
(4)加入300uL无菌水(加热到65℃)，涡旋复苏DNA，然后再加入4μL RNase A涡旋混匀；
(5)加入150μL Buffer FG3和300μL无水乙醇充分混匀后，加入到试剂盒试剂盒中的HiHand DNA柱子中，10000rpm离心1min，去掉滤液和收集管；
(6)将柱子转移到一个新的收集管中，加入750μL DNA wash Buffer，10000rpm离心1min，重复洗涤两次；
(7)空柱10000rpm离心2min并去除残留的乙醇；
(8)将柱子转移到一个新的1.5mL离心管中，在吸附柱膜中央加入50-100μL 65℃预热后的Elution Buffer静置3-5min，10000rpm离心1min，收集洗脱液并测定其浓度，于-80℃保存。
以提取的基因组DNA为模板，应用本发明设计的针对过敏原基因ORF的引物SEQ.ID.NO 14：5’ATGAAGACACCGAGCTTTCTAA 3’(F)，和、SEQ.ID.NO 15：5’TTAAGCCTTTGACTTCTCCGCA 3’(R)，以高保真LA taq酶进行扩增过敏原基因，PCR反应体系(25μL)如下：
表5球孢白僵菌过敏原基因(ORF)的PCR反应体系
PCR扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min。
扩增得到的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，检测样品扩增产物在Marker的750pb-1000pb之间即840pb左右处是否有条带，根据该条带的存在与否，诊断该僵蚕样品是否是由敲除过敏原基因的菌株感染引起，没有显示该条带确诊为阴性(缺失过敏原基因)，显示有该条带确诊为阳性(菌株存在过敏原基因)。如图8所示。
实验检测结果：共检测了75个样，其中僵蚕专业饲养场随机采样30个(四川30个)，丝茧育自然感染的僵蚕随机采样30个(四川10个、重庆8个、云南6个、广西6个)，实验室改良菌株(球孢白僵菌△Bb-f2(Beauveria bassiana)，保藏号为CCTCC M 20231265)感染僵蚕5个，实验室保藏野生菌株感染僵蚕5个，实验室保藏过敏原基因超量表达菌株感染僵蚕5个，检测结果如表6所示。
表6.球孢白僵菌过敏原基因(ORF)的PCR检测结果
实施例8荧光定量q-PCR以球孢白僵菌cDNA为模板对过敏原基因表达量的检测
1、实验材料和方法：对患病僵蚕采样，取菌丝直接提取基因组RNA，所述菌丝的培养方法为：取分生孢子制备成1×107/mL孢子悬液，在萨氏固体培养基上先培养7天后，再制备1×107孢子悬液，然后将其接种到萨氏液体培养基(l0g/L酵母提取物，40g/L葡萄糖，l0g/L胰蛋白胨，双蒸水定容至1L,116℃，高压灭菌20min,若是固体培养基加琼脂15g/L)中，200rpm培养2-3天后在抽滤瓶中抽滤菌丝并烘干备用，参照Omega公司E.Z.N.A.TMFungal RNA Mini Kit真菌RNA提取试剂盒对上述所得菌丝进行RNA的提取，每个处理组重复三次，RNA样品经DNase I Set(Omega biotek)作DNA膜上消化，收集纯化的RNA。通过Thermo Fisher反转录试剂盒将其反转录为cDNA。
参照RNA提取试剂盒对菌丝进行RNA的抽提，具体步骤如下：
(1)用液氮预冷研钵、研杵，将菌丝用液氮研磨至粉末状；
(2)加入500μL Buffer RB/β-巯基乙醇混合液(1mL Buffer RB加200μLβ-巯基乙醇)，裂解材料。
(3)加500μL水饱和酚和100μL 2M醋酸钠(PH 4.0)，涡旋；
(4)加200μL氯仿，振荡15s,冰浴10min；离心后于上清中加入等体积70％乙醇；
(5)消化液转移至RNA结合柱中10000×g离心30s；
(6)使用DNase I Set(Omega biotek)作DNA膜上消化：
(7)加入500μL Wash Buffer I至结合柱，离心，弃滤过液；
(8)加入500μL Wash BufferⅡ至结合柱，离心1min，倒掉滤过液；
(9)再次加入500μL Wash BufferⅡ重复第10步；
(10)将RNA柱子重新套回2mL收集管中，空柱10000×g，离心1min以去除乙醇；
(11)加入50μL DEPC水，静置1min,离心1min以洗脱RNA；
(12)再次加入50μL DEPC，重复(11)步；
(13)所得的RNA进行电泳检测，测定纯度及浓度，-80℃保存备用。
RNA反转录cDNA:获得的RNA模板首先用4×gDNA wiper Mix短暂处理，彻底去除残留的基因组DNA污染,利用HiScript@IIQ RT Super Mix for qPCR试剂反转录获得第一链cDNA。其方法是：首先按表7中将试剂加到200μL无RNase的离心管中，42℃水浴反应2min,加入5×HiScript II qRT Super Mix II，50℃延伸15min,85℃反应5sec,所得cDNA于-20℃保存备用。
表7.RNA反转录cDNA反应体系
对获得的cDNA样品，应用本发明筛选提供的球孢白僵菌过敏原基因片段的q-PCR引物，SEQ.ID.NO 16：5’TGATGGTTGGGAGCAGTCG 3’(F)及SEQ.ID.NO 17：5’GTCATGGCGGCCTTGTCTG 3’(R)进行荧光定量PCR；同时以菌株的Actin基因为内参，采用引物:SEQ.ID.NO 18：5'ATGGAGGAAGAAGTTGCTGC3'(F)和SEQ.ID.NO 19：5'ACACGGAGCTCGTTGTAGAA3'，扩增cDNA获得内参基因CT值。
实时荧光定量qRT-PCR的反应体系(20μL)如下：100ng cDNA,200nM上游引物，200nM下游引物及10μLGreen Super mix。
q-PCR扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，95℃延伸15s，然后重复退火和延伸相同时间一次，预设定15～35个循环。所获得的数据用2-△△Ct的方法计算基因的相对表达量。
2、实验检测结果：共检测了35个样，其中选择僵蚕专业饲养场样品10个，丝茧育自然感染的僵蚕样品10个，实验室改良的菌株(敲除过敏原基因)感染的僵蚕5个，保藏的野生菌株感染的僵蚕5个，保藏的过敏原基因超量表达菌株感染的僵蚕5个，检测结果如表8所示。从表中数据显示过敏原基因的相对表达量，未敲除过敏原基因的菌株过敏原基因的相对表达量≥1，缺失过敏源基因的菌株其过敏原基因的相对表达量为0或≤0.02。不同菌株q-PCR的溶化曲线如图9所示。
表8.以球孢白僵菌cDNA为模板对过敏原基因的荧光定量q-PCR检测结果
实施例9荧光定量q-PCR以球孢白僵菌gDNA为模板对过敏原基因的检测
1、实验材料和方法：
(1)本实验对僵蚕菌株样品直接提取菌株基因组DNA(gDNA)进行荧光定量q-PCR检测。提取菌株基因组DNA的方法如实施例一所述。
(2)对获得的gDNA样品，应用本发明筛选的球孢白僵菌过敏原基因片段的q-PCR引物SEQ.ID.NO 16：5’TGATGGTTGGGAGCAGTCG 3’(F)及SEQ.ID.NO 17：5’GTCATGGCGGCCTTGTCTG 3’(R)进行荧光定量PCR。
实时荧光定量qRT-PCR的反应体系(20μL)如下：100ng gDNA，200nM上游引物，200nM下游引物及10μLGreen Super mix。
q-PCR扩增程序：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，95℃延伸15s，然后以相同时间重复退火和延伸一次，预设定15～35个循环进行PCR，读取不同菌株gDNA的PCR荧光的CT值。
2、实验检测结果：共检测了75个样，其中僵蚕专业饲养场随机采样30个(四川30个)，丝茧育自然感染的僵蚕随机采样30个(四川10个、重庆8个、云南6个、广西6个)，实验室改良的菌株(敲除过敏原基因)感染的僵蚕5个，保藏的野生菌株感染的僵蚕5个，保藏的过敏原基因超量表达菌株感染的僵蚕5个，检测结果如表9所示。从表9检测结果显示，CT值超过30为阴性即菌株缺失过敏原基因，低于30为阳性即菌株存在过敏原基因。
表9.以球孢白僵菌gDNA为模板对过敏原基因的荧光定量q-PCR检测结果
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种检测缺失过敏原基因Bb-f2 ORF的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的方法，具体包括如下步骤：
（1）以僵蚕中球孢白僵菌的基因组DNA（gDNA）为模板，应用针对过敏原基因Bb-f2 ORF的引物对进行PCR扩增；所述引物对为序列如SEQ ID NO.14所示的上游引物F1和如SEQ IDNO.15所示的下游引物R1；
（2）检测步骤（1）的扩增产物在750pb-1000pb之间是否有扩增产物，没有即为缺失过敏原基因Bb-f2 ORF的球孢白僵菌；
所述缺失过敏原基因Bb-f2 ORF的球孢白僵菌为球孢白僵菌菌株△Bb-f2，保藏号为CCTCC M 20231265，保藏单位为中国典型培养物保藏中心；
所述过敏原基因Bb-f2 ORF的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的方法，所述步骤(1)的PCR扩增中，25.0μL扩增反应体系包括：gDNA 2.0μL，含2 mM Mg2+的LA Buffer 2.5μL，10 U浓度的LA Taq聚合酶0.25μL，2.5mM的dNTP 2.0μL，10mM的上游引物F1 1μL，10mM的下游引物R1 1μL，ddH2O余量。
3. 如权利要求2所述的方法，所述步骤(1)中PCR 扩增程序：95℃预变性3 min；95℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5 min。
4. 如权利要求3所述的方法，所述步骤(2)中检测扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳法，检测电泳后的PCR产物在842pb是否有条带，没有显示条带即为缺失过敏原基因Bb-f2ORF的球孢白僵菌。
5. 一种通过表达量检测缺失过敏原基因Bb-f2 ORF的球孢白僵菌的方法，具体包括如下步骤：
（1）以僵蚕中球孢白僵菌株cDNA为模板，应用球孢白僵菌过敏原基因Bb-f2 ORF片段的q-PCR引物对进行荧光定量q-PCR扩增；所述引物对为序列如SEQ ID NO.16所示的上游引物F2，和序列如SEQ ID NO.17所示的下游引物R2；
（2）以球孢白僵菌株的Actin基因为内参，采用引物对对菌株cDNA荧光定量q-PCR扩增，所述引物对为序列如SEQ ID NO.18所示的上游引物Actin-F和序列如SEQ ID NO.19所示的下游引物Actin-R；以Actin基因表达量为参照计算过敏原基因Bb-f2的相对表达量，相对表达量≤0.02即为缺失过敏源基因Bb-f2 ORF的球孢白僵菌；
所述缺失过敏原基因Bb-f2 ORF的球孢白僵菌为球孢白僵菌菌株△Bb-f2，保藏号为CCTCC M 20231265，保藏单位为中国典型培养物保藏中心；
所述过敏原基因Bb-f2 ORF的序列如SEQ ID NO.1所示。
6. 如权利要求5所述的方法，所述实时荧光定量q-PCR的20μL反应体系如下：100 ngcDNA, 200 nM上游引物F2，200 nM下游引物F2及10 μL 2×iQTMSYBR® Green Super mix。
7. 如权利要求6所述的方法，所述q-PCR 扩增程序：95℃预变性10 min；95℃变性15s，60℃退火1min，95℃延伸15 s，然后重复退火和延伸相同时间一次，预设定15-35个循环。
8. 一种鉴定缺失过敏原基因Bb-f2 ORF的球孢白僵菌的方法，具体包括如下步骤：
（1）以僵蚕菌株基因组DNA（gDNA）为模板，应用球孢白僵菌过敏原基因Bb-f2 ORF片段的q-PCR引物对，所述引物对为序列如SEQ ID NO.16所示的上游引物F2和序列如SEQ IDNO.17所示的下游引物R2组成，进行荧光定量q-PCR扩增；
（2）读取不同菌株gDNA的q-PCR荧光的CT值；CT值超过30即为缺失过敏原基因Bb-f2 ORF的球孢白僵菌；
所述缺失过敏原基因Bb-f2 ORF的球孢白僵菌为球孢白僵菌菌株△Bb-f2，保藏号为CCTCC M 20231265，保藏单位为中国典型培养物保藏中心；
所述球孢白僵菌过敏原基因Bb-f2 ORF的序列如SEQ ID NO.1所示。
9. 一种缺失过敏原基因Bb-f2 ORF的球孢白僵菌菌株△Bb-f2，保藏号为CCTCC M20231265，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
10. 一种权利要求9所述的缺失过敏原基因Bb-f2 ORF的球孢白僵菌菌株在养殖生产僵蚕中应用。
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Beauveria bassiana ARSEF 2860 major allergen Asp f 2-like protein partial mRNA;NCBI;《GenBank》;20140723;全文，CDS部分 *
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In vitro transcriptomes analysis identifies some special genes involved in pathogenicity difference of the Beauveria bassiana against different insect hosts;Jing Liu;《Microbial Pathogenesis》;20210307;第第154卷卷;第3页右栏，表S1 *
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NCBI.Beauveria bassiana ARSEF 2860 major allergen Asp f 2-like protein partial mRNA.《GenBank》.2014,全文，CDS部分. *

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