CN110028566B

CN110028566B - GhPRXR1蛋白及其编码基因在调控棉籽含油量中的应用

Info

Publication number: CN110028566B
Application number: CN201910307583.5A
Authority: CN
Inventors: 于霁雯; 马建江; 崔宇鹏; 刘记; 裴文锋; 马启峰; 吴嫚; 李丹; 喻树迅
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2039-04-17
Also published as: CN110028566A; AU2020100579A4

Abstract

本发明公开了GhPRXR1蛋白及其编码基因在调控棉籽含油量中的应用。本发明从陆地棉材料Msco‑12中克隆出棉花GhPRXR1基因，成功构建酵母过表达载体并转化酿酒酵母。3个阳性转基因酵母与转空载体酵母对照相比，油份含量分别提高了20.01％、34.79％和37.25％。本发明还成功构建了病毒诱导GhPRXR1基因沉默载体，并转化陆地棉Msco‑12。6个GhPRXR1基因沉默棉花阳性单株成熟棉籽平均含油量与3个对照单株成熟棉籽平均含油量相比降低了18.11％。说明GhPRXR1基因可调控棉籽含油量，在改良棉籽油产量及棉花育种中具有重要价值。

Description

GhPRXR1蛋白及其编码基因在调控棉籽含油量中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及GhPRXR1蛋白及其编码基因在调控棉籽含油量中的应用。

背景技术

我国是世界上棉花种植面积最大，棉花纤维消费量最多的国家。当今棉花育种研究的重心在于改良纤维品质和提高棉花抗病虫害等逆境胁迫，而有关提高棉籽含油量的研究还相对较少。

研究表明，棉籽占棉花产量的60％-70％，棉籽的出油率为15.0％-48.2％(刘明等，1994；王彦霞等，2011)。棉籽油经过脱酚处理可用于食用，其含有大量的人体所必需的有益脂肪酸，如油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸约占总脂肪酸含量的80％(宋俊乔等，2010)。另外棉籽油比花生油和菜籽油中含有较高的维生素E(王延琴等，2014)，能延缓人体细胞衰老以及降低人体心脑血管疾病发生几率。此外，棉籽油作为生产生物能源燃料也具有广阔的应用前景，石化柴油的碳链长度一般在C15～C18之间，而棉籽油中有99％的脂肪酸碳链长度集中在C16～C18之间，和柴油成分极其相似，棉籽油适合转化生产为生物柴油，并且转化为生物柴油的效率高达95％，另外棉籽油转化而成的生物柴油富含氧而不含硫，因此可使生物柴油的燃烧更为彻底且不污染环境(喻树迅等，2008)。然而，由于近年我国种植面积总体呈现逐年下降的趋势。因此通过利用基因工程手段提高单位面积上棉籽的油脂含量，是维持棉籽油产量以至于提高棉花副产品利用效率的必由之路。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何调控棉籽含油量。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了GhPRXR1蛋白质的新用途。

本发明提供了GhPRXR1蛋白质在调控棉籽含油量中的应用。

本发明还提供了GhPRXR1蛋白质在调控酵母总脂肪含量中的应用。

所述GhPRXR1蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了与GhPRXR1蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与GhPRXR1蛋白质相关的生物材料在调控棉籽含油量中的应用。

本发明还提供了与GhPRXR1蛋白质相关的生物材料在调控酵母总脂肪含量中的应用。

所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码GhPRXR1蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GhPRXR1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码GhPRXR1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GhPRXR1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码GhPRXR1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GhPRXR1蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述应用中，所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。

本发明还提供了上述GhPRXR1蛋白质或生物材料在培育棉籽含油量提高的转基因棉花中的应用。

本发明还提供了上述GhPRXR1蛋白质或生物材料在培育棉籽含油量降低的转基因棉花中的应用。

本发明还提供了上述GhPRXR1蛋白质或生物材料在培育总脂肪含量提高的转基因酵母中的应用。

本发明还提供了上述GhPRXR1蛋白质或生物材料在棉花育种中的应用。

上述应用中，所述调控为提高或降低。所述调控具体体现在如下(1)或(2)：

(1)当棉花中的GhPRXR1蛋白质的表达量和/或活性降低时，棉籽含油量降低；当棉花中的GhPRXR1蛋白质的表达量和/或活性提高时，棉籽含油量提高；

(2)当酵母中的GhPRXR1蛋白质的表达量和/或活性降低时，其代谢产生的总脂肪含量降低；当酵母中的GhPRXR1蛋白质的表达量和/或活性提高时，其代谢产生的总脂肪含量提高。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育棉籽含油量降低的转基因棉花的方法。

本发明提供的培育棉籽含油量降低的转基因棉花的方法包括降低受体棉花中GhPRXR1蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因棉花的步骤；所述转基因棉花的棉籽含油量低于所述受体棉花。

上述方法中，所述降低受体棉花中GhPRXR1蛋白质的表达量和/或活性可通过现有技术中的常规方法来实现，如敲除受体棉花中GhPRXR1蛋白质的编码基因、抑制受体棉花中GhPRXR1蛋白质的编码基因的表达、沉默受体棉花中GhPRXR1蛋白质的编码基因等。

在本发明的具体实施例中，所述降低受体棉花中GhPRXR1蛋白质的表达量和/或活性是通过沉默所述受体棉花中GhPRXR1蛋白质的编码基因来实现；

所述GhPRXR1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子；

进一步的，沉默所述受体棉花中GhPRXR1蛋白质的编码基因方法是通过向受体棉花中导入GhPRXR1基因沉默载体和辅助载体来实现。

更进一步的，所述GhPRXR1基因沉默载体具体为将VIGs-GhPRXR1片段插入pCLCrVA载体的SpeI和AscI酶切位点间，且保持pCLCrVA载体的其他序列不变后得到的；所述VIGs-GhPRXR1片段为序列1第67-436位所示的DNA分子。

所述辅助载体具体为pCLCrVB载体。

上述GhPRXR1基因沉默载体或VIGs-GhPRXR1片段也属于本发明的保护范围。

上述GhPRXR1基因沉默载体或VIGs-GhPRXR1片段在培育棉籽含油量降低的转基因棉花中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用或方法中，所述棉籽含油量是指棉籽油份含量。

上述应用或方法中，所述棉花可为现有技术中的常见品种，在本发明的具体实施例中，所述棉花品种为陆地棉Msco-12。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育总脂肪含量提高的转基因酵母的方法。

本发明提供的培育总脂肪含量提高的转基因酵母的方法包括如下步骤：将上述GhPRXR1蛋白质的编码基因导入受体酵母中，得到转基因酵母；所述转基因酵母的总脂肪含量高于所述受体酵母。

上述方法中，所述GhPRXR1蛋白质的编码基因为序列表中序列1所示的DNA分子。

进一步的，上述GhPRXR1蛋白质的编码基因通过pYES2-GAL1::GhPRXR1导入受体酵母；所述pYES2-GAL1::GhPRXR1为将序列1自5’端第1-999位所示的DNA分子插入pYES2载体的BamHI和XhoI酶切位点间，且保持pYES2载体的其他序列不变得到的载体。

更进一步的，所述受体酵母可为酿酒酵母；所述酿酒酵母具体可为酿酒酵母INVSc1。

本发明从陆地棉材料Msco-12中克隆得到棉花GhPRXR1基因，成功构建酵母过表达载体并转化酿酒酵母，得到3个阳性转基因酵母。3个阳性转基因酵母与转空载体酵母对照相比，油份含量分别提高了20.01％、34.79％和37.25％。此外本发明成功构建了病毒诱导GhPRXR1基因沉默载体，并转化陆地棉Msco-12，得到6个GhPRXR1基因沉默棉花阳性单株。6个GhPRXR1基因沉默棉花阳性单株成熟棉籽平均含油量与3个对照单株成熟棉籽平均含油量相比降低了18.11％。说明GhPRXR1基因可调控棉籽含油量，在改良棉籽油产量及棉花育种中具有重要价值。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳检测GhPRXR1基因。

图2为pYES2载体的图谱。

图3为BamHI和XhoI双酶切融合表达载体pYES2-GAL1::GhPRXR1。Lane1中经过双酶切的融合表达载体pYES2-GAL1::GhPRXR1出现了两条带，下方箭头指示为GhPRXR1基因条带，上方箭头表示pYES2载体条带。Lane2中的条带表示未经过双酶切处理的融合表达载体pYES2-GAL1::GhPRXR1作为对照。

图4为PCR鉴定阳性酵母。

图5为GhPRXR1基因在转基因酵母中的表达量。3个阳性转基因酵母的GhPRXR1基因表达量极显著高于对照(p<0.001)。

图6为甘油三酯酶法测定酵母总脂肪含量。

图7为琼脂糖凝胶电泳检测VIGs-GhPRXR1(370bp)目的序列。

图8为VA引物检测结果。其中，1-3为对照植株，4-9为GhPRXR1基因沉默棉花阳性单株。

图9为VB引物检测结果。其中，1-3为对照植株，4-9为GhPRXR1基因沉默棉花阳性单株。

图10为qRT-PCR检测GhPRXR1基因在GhPRXR1基因沉默棉花阳性单株中的表达量。

图11为核磁共振检测棉籽含油量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的试验材料Msco-12记载于文献“Genetic variation of dynamicfiber elongation and developmental quantitative trait locus mapping of fiberlength in upland cotton(Gossypium hirsutum L.)”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的载体pCLCrVA(以下简称VA)和辅助载体pCLCrVB(以下简称VB)均记载于文献“A versatile system for functional analysis of genes and microRNAsin cotton)”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中所涉及的实验材料如下：

工具酶、试剂盒、药品、载体及感受态细胞：植物总RNA提取试剂盒(DP432)和DNAMarker III(MD103)试剂均是天根生化(科技)北京有限公司的产品；RNA反转录试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(AT311-02)，荧光定量酶TransStart Top Green qPCR SuperMix(AQ131-04)，克隆载体pEASY-T5 ZeroCloning Kit(CT501-01)，质粒提取试剂盒EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit(EM111-01)和EB替代物GelStain(GS101-03)均是北京全式金生物技术有限公司的产品；高保真PCR扩增酶KOD-Plus-Neo(KOD-401)是TOYOBO生物公司的产品，Gel Extraction Kit胶回收试剂盒是Omega生物公司的产品；DNA Purification Kit PCR产物纯化试剂盒和PrimeScriptTM RTase RNA反转录试剂盒均是TaKaRa生物公司的产品；T4 DNA连接酶(C301-01)是诺唯赞生物技术有限公司的产品；RNAprep pure酵母总RNA提取试剂盒是Promega公司的产品；实验所用引物在北京GENEWIZ生物公司合成；大肠杆菌感受态菌体(Escherichia coli)DH5α是上海生工的产品；限制性内切酶BamHI，XhoI，SpeI，AscI均是NEB公司的产品；组织甘油三酯测定试剂盒(E1013)是北京普利莱基因技术有限公司的产品。酿酒酵母感受态细胞INVSc1(YC1050)是上海唯地生物技术有限公司的产品；pYES2(VT1351)载体是优宝生物的产品。Carrier DNA(YC1050)是上海唯地生物技术有限公司的产品。

其他药品：琼脂糖是北京全式金生物技术有限公司的产品；蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等均为国产分析纯；氨苄青霉素(IA0340)、卡那霉素(YZ-130556)、利福平(IR0110)、链霉素(IS0360)、蔗糖(YZ-4454)、棉籽糖(D8180)、半乳糖(YZ-4117A)、酵母缺陷型培养基SD-Ura(S0620)等均是北京索莱宝科技有限公司的产品。

下述实施例中提到的但未列出的各种试剂均按《分子克隆实验指南》第三版上的方法配制，生化试剂均为分析纯或以上级。

下述实施例中所涉及的培养基配方如下：

LB液体培养基：溶剂为水，溶剂及其浓度分别如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L；LB固体培养基：溶剂为水，溶剂及其浓度分别如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L、琼脂粉15g/L；LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板。

酿酒酵母菌体繁殖液体培养基(扩增SD-URA培养基)：称量SD-URA 8g至900nL的超纯水，调节pH至5.8后放入121℃高压灭菌15min，待温度降低到约为55℃时加入过滤除菌的质量分数为20％的葡萄糖溶液100mL，调节pH至5.8。

酿酒酵母菌体繁殖平板固体培养基：称量SD-URA 8g和琼脂粉20g至900nL的超纯水，调节pH至5.8后放入121℃高压灭菌15min，待温度降低到约为55℃时加入过滤除菌的质量分数为20％的葡萄糖溶液100mL。

酿酒酵母蛋白诱导液体培养基(诱导SD-URA培养基)：称量SD-URA 8g至800nL的超纯水，调节pH至5.8后放入121℃高压灭菌15min，待温度降低到约为55℃时分别加入过滤除菌的质量分数为20％的半乳糖溶液100mL和质量分数为10％的棉籽糖溶液100mL。

下述实施例中所涉及的主要仪器如下：PCR扩增仪(BIO-RAD)、高速离心机(Hettich MIKRO 200R)、电泳设备(BIO-RAD)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、荧光定量PCR仪(ABI7500)、真空冷冻干燥仪(ALPHA I-5)、酶标仪(BIO-TEC KC4)、棉籽油份含量(棉籽含油量)测定仪器为纽迈核磁共振仪器(NMI20-Analyst)。

实施例1、GhPRXR1基因的克隆

(1)试验材料的获得

试验材料Msco-12种植于中国农业科学院棉花研究所试验地，按常规方法进行大田管理。所取组织为开花后20、25、30和35天的胚珠，所取材料迅速放入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用。

(2)RNA的提取

采用天根公司试剂盒提取植物总RNA。

(3)cDNA的获得

以提取的各时期棉花胚珠混合总RNA(500ng)为模板，利用全式金的反转录试剂盒将其反转录为cDNA。反应体系如表1所示。反应过程在PCR仪器内先25℃温育10min，然后42℃反应30min，最后85℃保留5s失活。保存4℃备用。将反转录产物cDNA溶液稀释5倍作为PCR反应模板。

表1、cDNA合成体系

Total RNA	500ng
		Anchored Oilgo(dT)<sub>18</sub>Primer(0.5ug/μl)	1μL
Random Primer(0.1ug/μl)	1μL
		2×TS Reaction Mix	10μL
TranScript RT/RI Enzyme Mix	1μL
		gDNA Remover	1μL
RNase-free Water	x
		Total volume	20μL

(4)目的基因的扩增

以步骤(3)获得的cDNA为模板，采用引物GhPRXR1-ORF-F和GhPRXR1-ORF-R进行PCR，得到PCR产物，引物序列如下：

GhPRXR1-ORF-F：5′-ATGAGGAAAATCATGGGTGCCA-3’；

GhPRXR1-ORF-R：5′-TTAGTGAAGCTTGTTTGCAAGA-3’。

PCR反应体系如表2所示。PCR反应程序如表3所示。

表2、目的基因GhPRXR1开放阅读框全长序列扩增体系

组分	体积
		dd H<sub>2</sub>O	31μL
10×PCR Buffer for KOD-PLUS-Neo	5μL
		2mM dNTPs	5μL
25mM MgSO<sub>4</sub>	3μL
		正向引物	1.5μL
反向引物	1.5μL
		模板	2μL
KOD-Plus-Neo	1μL
		Total	50μL

表3、PCR反应程序

Step1	预变性	94℃,2min
			Step2	变性	98℃,10s
Step3	退火	58℃,30s
			Step4	延伸	68℃,35s
Step5	延伸	68℃,10min

备注：从Step4到step3进行35次循环扩增

(5)PCR产物的检测

反应结束后4℃保存，用1％的琼脂糖电泳进行检测，条带大小符合预期设计则视为有效结果(图1)。对目的片段运用胶回收试剂盒进行切胶回收，并将胶回收的产物连接克隆载体pEASY-T5，然后转化大肠杆菌感受态DH5α。37℃过夜培养从Amp抗性LB培养基上挑取单克隆到含有Amp的600μL LB培养基中，37℃摇菌培养5h后进行菌液PCR验证，送含有目的基因片段大小条带的菌液测序。

测序结果表明：PCR扩增得到大小为999bp的条带，其核苷酸序列如序列1所示，将序列1所示的基因命名为GhPRXR1基因，自5’端1-999位为ORF，GhPRXR1基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示，将序列2所示的蛋白命名为GhPRXR1蛋白。

实施例2、转GhPRXR1酵母的获得及总脂肪含量测定

一、转GhPRXR1酵母的获得

1、pYES2-GAL1::GhPRXR1酿酒酵母表达载体的构建

(1)引物的设计与合成

根据终载体pYES2的图谱(图2)设计BamHI-XhoI为插入位点并合成引物。

引物序列如下：

GhPRXR1-BamHI-F(含酶切位点BamHI)：5’-TTCGGATCCGCCACCATGAGGAAAATCATGGGTGCCA-3’；

GhPRXR1-XhoI-R(含酶切位点XhoI)：5’-ATCCTCGAGTTAGTGAAGCTTGTTTGCAAGA-3’。

(2)目的基因ORF序列扩增

以实施例1获得的cDNA为模板，使用KOD-Plus-Neo高保真酶采用GhPRXR1-BamHI-F和GhPRXR1-XhoI-R扩增得到含有BamHI和XhoI酶切位点的GhPRXR1目的基因序列。反应体系如表4所示。反应程序如表5所示。

表4、目的基因扩增体系

表5、PCR反应程序

Step1	预变性	94℃,2min
			Step2	变性	98℃,10s
Step3	退火	60℃,30s
			Step4	延伸	68℃,50s
Step5	延伸	68℃,10min

备注：从Step4到step3进行35次循环扩增

(3)融合表达载体的构建

用限制性内切酶BamHI和XhoI对上述步骤(2)获得的PCR扩增产物进行双酶切，回收大小为1023bp的目的片段，用限制性内切酶BamHI和XhoI对pYES2载体进行双酶切，回收大小为5857bp的骨架载体，连接大小为1023bp的目的片段和大小为5857bp的骨架载体，16℃连接过夜(连接体系如表6所示)，得到pYES2-GAL1::GhPRXR1并对其进行测序。

表6、T4 DNA连接酶体系

灭菌蒸馏水	4μL
		10×Ligase Buffer	1μL
GhPRXR1片段	3μL
		pYES2载体	1μL
T4 DNA Ligase(400U/μL)	1μL

测序结果表明：pYES2-GAL1::GhPRXR1为将序列1自5’端第1-999位所示的DNA分子插入pYES2载体的BamHI和XhoI酶切位点间，且保持pYES2载体的其他序列不变得到的载体。

(4)PCR验证

将上述步骤(3)获得的pYES2-GAL1::GhPRXR1转化感受态细胞，并对其进行PCR验证。具体步骤如下：

a.超净工作台灭菌30min，从-70℃超低温冰箱中取出100μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞，放于冰上，预冷10min；

b.取出一个Ep管，标上记号，置于冰上，加入80μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞(冰上操作)；

c.然后加入10μL的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；

d.冰浴结束后，放在42℃的恒温水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴2min；

e.吸500μL不含Amp的LB液体培养液到Ep管中，混匀，置于摇床中160rpm，37℃摇2h；

f.取出摇床结束的Ep管，2000～3000rmp离心5min，弃上清300μL，剩余的菌液轻柔吸打混匀后加在含Amp的LB固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；

g.37℃恒温培养箱中培养16～20h。

h.随机挑取单克隆进行PCR验证。

PCR验证所用引物序列如下：GhPRXR1-ORF-F：5′-ATGAGGAAAATCATGGGTGCCA-3’和GhPRXR1-ORF-R：5′-TTAGTGAAGCTTGTTTGCAAGA-3’，PCR扩增得到大小为999bp的目的条带为阳性克隆。

i.挑选有目的大小条带的单克隆菌株，在含有Amp的LB培养基中进行扩繁，37℃，190rmp条件下摇床过夜，采用全式金公司质粒提取试剂盒提取质粒并对质粒进行BamHI和XhoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

结果如图3所示。Lane1中经过双酶切的融合表达载体pYES2-GAL1::GhPRXR1出现了两条带，下方箭头指示为GhPRXR1基因条带，上方箭头表示pYES2载体条带。Lane2中的条带表示未经过双酶切处理的融合表达载体pYES2-GAL1::GhPRXR1作为对照。

2、转GhPRXR1酵母的获得

(1)表达载体的转化

将步骤1构建的pYES2-GAL1::GhPRXR1酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞。具体步骤如下：

a.取100μL冰上融化的酿酒酵母INVSc1感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5μg，Carrier DNA(YC1050)(95-100℃，5min，快速冰浴，重复一次)10μL，PEG/LiAc 500μL并吸打几次混匀，30℃水浴30min(15min时翻转6-8次混匀)。

b.将管放42℃水浴15min(7.5min时翻转6-8次混匀)。

c.5000rpm离心40s，弃上清，ddH₂O 400μL重悬，离心30s，弃上清。

d.ddH₂O 50μL重悬，涂质粒筛选用SD-U medium酿酒酵母菌体繁殖平板固体培养基，29℃培养48-96h。

同时按照上述方法将pYES2载体转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，得到转空载体酵母。

(2)转GhPRXR1酵母的鉴定及诱导培养

a.挑取酵母单克隆，在盛有1mL的SD-U medium酿酒酵母菌体繁殖液体培养基中30℃，300rmp/min过夜培养。

b.采用pYES2载体特异引物T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’和CYC1Terminator：5’-GTGACATAACTAATTACATGATG-3’进行PCR鉴定。

结果如图4所示，从11个转基因酵母菌株中共鉴定出8个阳性转GhPRXR1酵母。

(3)qRT-PCR检测GhPRXR1基因表达

a.随机选取3个阳性转GhPRXR1酵母菌株(200μL菌液)分别接种至含30mL扩增SD-URA培养基的200mL无菌三角瓶。在摇床中30℃、300rpm/min摇床生长至OD₆₀₀＝30-35(约48h)。

b.室温5000rpm离心5min收集沉淀物，弃除上清，用60mL诱导SD-URA培养基重悬细胞，30℃，300rpm/min摇床继续培养48h，5000g离心1min，收集菌体沉淀。

c.用promega公司的酵母RNA提取试剂盒提取部分酵母菌体沉淀的总RNA。用全式金反转录试剂盒合成cDNA，用全式金荧光定量试剂盒进行qRT-PCR验证。

qRT-PCR反应体系为：2×TransStar Top/Tip Green qPCR SuperMix 10μL、Forward Primer(10μM)0.4μL、Reverse Primer(10μM)0.4μL、Passive Reference Dye(50×)0.4μL、Template cDNA 2μL、RNase-Free Water up to 20μL。

qRT-PCR反应程序：预变性94℃(30s)；变性94℃(5s)，退火58℃(15s)，延伸72℃(12s)，45个循环。

融解曲线分析：95℃(15s)，60℃(1min)，95℃(15s)，10℃(2min)。

荧光定量引物序列：

qRT-GhPRXR1-F：5’-TGCTTCCAAGATTCTGGTGGG-3’；

qRT-GhPRXR1-R：5’-CAATGCAAGGTCCCACAGGT-3’；

qRT-18SF：5’-TTAGTTGGTGGAGTGATTTG-3’；

qRT-18SR：5’-GGTGGCTCTGTCAGTGTAG-3’。

按照上述方法将pYES2载体转化酿酒酵母INVSc1得到的转空载体酵母菌株进行培养、RNA提取和qRT-PCR检测。

结果如图5所示。3个阳性转GhPRXR1酵母中的GhPRXR1基因表达量极显著高于转空载体对照(p<0.001)，并将这3个阳性转GhPRXR1酵母分别命名为转GhPRXR1酵母阳性株系1、转GhPRXR1酵母阳性株系2和转GhPRXR1酵母阳性株系3，用于下述脂肪含量测定。

二、转GhPRXR1酵母的总脂肪含量测定

1、转GhPRXR1酵母的诱导表达

将转GhPRXR1酵母阳性株系1、转GhPRXR1酵母阳性株系2和转GhPRXR1酵母阳性株系3和转空载体对照分别接种至酿酒酵母蛋白诱导液体培养基(诱导SD-URA培养基)中培养48h，然后用50mL离心管在5000g的离心机中离心1min，分别收集被诱导SD-URA培养基培养48h的转GhPRXR1酵母阳性株系1菌体沉淀、转GhPRXR1酵母阳性株系2菌体沉淀和转GhPRXR1酵母阳性株系3菌体沉淀和转空载体对照菌体沉淀，并用0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤两次菌体，最后放入冷冻真空干燥仪进行24h干燥。

2、总脂肪含量测定

采用组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒(购买于普利莱公司，货号：E1013-105)分别对步骤1获得的各菌体沉淀中的总脂肪含量进行测定。

结果如图6所示。转空载体对照的总脂肪含量为812.0μmol/L，而3个转GhPRXR1酵母阳性株系1、株系2和株系3的总脂肪含量分别为974.5μmol/L、1114.5μmol/L和1094.5μmol/L。与转空载体对照相比，3个转GhPRXR1酵母阳性株系1、株系2和株系3总脂肪含量分别显著提高了20.01％、34.79％和37.25％。说明GhPRXR1可调控酵母总脂肪含量。

实施例3、GhPRXR1基因在调控棉籽含油量中的应用

一、GhPRXR1基因沉默棉花的获得

1、病毒诱导GhPRXR1基因沉默载体的构建

(1)引物的设计

根据终载体VA的图谱设计SpeI-AscI为插入位点并合成引物，引物序列如下：

VIGsGhPRXR1-SpeI-F(含酶切位点SpeI)：5’-ATGCCTGCAGACTAGTCTGTGTCGGCATTTGCACAG-3’；

VIGsGhPRXR1-AscI-R(含酶切位点AscI)：5’-TAGACCTAGGGGCGCGCCCCCAACGAAACGATGCCTTC-3’。

(2)VIGs-GhPRXR1(370bp)的扩增

以测序正确的GhPRXR1大肠杆菌单克隆菌液为模板，采用步骤(1)设计的引物进行PCR扩增，得到PCR产物。该PCR产物即为长度为370bp的VIGs-GhPRXR1(370bp)片段(VIGs-GhPRXR1(370bp)片段为序列1第67-436位)。PCR产物的电泳检测结果如图7所示。

(3)重组质粒的构建

用限制性内切酶SpeI和AscI分别对VA载体和步骤(2)获得的VIGs-GhPRXR1(370bp)片段进行双酶切，然后纯化回收线性化的VA载体和VIGs-GhPRXR1片段。用T4连接酶将VIGs-GhPRXR1片段与线性化的VA载体融合构建病毒载体并转化大肠杆菌感受态DH5α，在含有卡那霉素的LB固体培养基中过夜生长并挑取单克隆，摇菌并送测序。将测序正确的载体命名为VA::VIGs-GhPRXR1(370bp)重组载体。

VA::VIGs-GhPRXR1(370bp)重组载体为将VIGs-GhPRXR1片段(序列1第67-436位)插入VA载体的SpeI和AscI酶切位点间，且保持VA载体的其他序列不变后得到的载体。

2、重组菌的构建

将测序正确的单克隆菌液在10mL含有卡那霉素的LB培养基中扩繁8h，提取VA::VIGs-GhPRXR1(370bp)重组质粒。

将提取的VA::VIGs-GhPRXR1(370bp)重组质粒转化农杆菌感受态(LBA4404)，得到重组菌VA::VIGs-GhPRXR1(370bp)/LBA4404。

将空载体对照VA转化农杆菌感受态(LBA4404)，得到重组菌VA/LBA4404。

将辅助载体VB转化农杆菌感受态(LBA4404)，得到重组菌VB/LBA4404。

具体转化过程如下：

a.根癌农杆菌LBA4404感受态细胞100μL中加入质粒1μg，混匀后冰浴30min；液氮速冻75s，37℃热激2～6min；

b.冰浴5min，再加入600μL LB液体培养基；

c.190rpm，28℃，培养4h后取100μL菌液涂在含有卡那霉素、链霉素和利福平的LB筛选培养基上，28℃培养大约36～48h，抗性菌落可见；

d.挑选阳性克隆，在LB液体培养基上28℃培养48h，甘油终浓度在15％左右，-20℃保存备用。

3、GhPRXR1基因沉默棉花的获得

采用幼叶注射法将步骤2制备的重组菌转化棉花，得到转基因棉花。具体步骤如下：

a.吸取50μL的重组菌菌液(重组菌VA::VIGs-GhPRXR1(370bp)/LBA4404、重组菌VA/LBA4404、重组菌VB/LBA4404)在含有利福平、卡那霉素和链霉素的抗性筛选的LB液体培养基中，28℃，190rpm过夜培养约16小时，可见菌液颜色变黄。测定OD₆₀₀值1.5-2.0(久置的菌液最好先活化再扩摇)。

b.菌液回收：4000rpm离心10min，转化介质调节OD₆₀₀＝1.5。转化介质的配置如表7所示。

表7、转化介质的配置

c.菌液室温(25℃)静置3h(时间可增长，可以增加转化效率)。

d.将步骤c获得的重组菌菌液VA::VIGs-GhPRXR1(370bp)/LBA4404和重组菌菌液VB/LBA4404按照体积比为1:1比例混匀，得到实验组注射液；

将步骤c获得的重组菌菌液VA/LBA4404和重组菌菌液VB/LBA4404按照体积比为1:1比例混匀，得到对照组注射液。

e.用种植约两周后的Msco-12棉花材料，拿针头划伤子叶背面，用无针注射器将注射液注入(注射液的注入量约为1mL)。

f.注射后的棉花植株黑暗过夜培养之后，置于25℃棉花培养室16/8小时光照周期培养。

4、GhPRXR1基因沉默棉花的鉴定

(1)PCR鉴定GhPRXR1基因沉默棉花阳性单株

对病毒侵染45天后的棉花取其倒三叶提取DNA并进行PCR检测。引物序列如下：

VA-F：5’-ATTTTGCGCCTGACTAGCCT-3’；

VA-R：5’-CGAATTTTCAACGTTGCATACA-3’；

VB-F：5’-ATGTACAGTTTAAAGAGTAGACG-3’；

VB-R：5’-ATTATCCAATATAATCAAGGTCATAC-3’。

VA引物扩增得到大小为584bp，且VB引物扩增得到大小为771bp的单株为GhPRXR1基因沉默棉花阳性单株；VA引物扩增得到大小为214bp，且VB引物扩增得到大小为771bp的单株为对照单株。检测结果如图8和图9。最终共得到3个对照单株和6个GhPRXR1基因沉默棉花阳性单株。

(2)qRT-PCR检测GhPRXR1基因在GhPRXR1基因沉默棉花中的沉默效率

在3个对照单株和6个GhPRXR1基因沉默棉花阳性单株开花期当天进行挂牌，取开花后20天的胚珠，提取RNA并反转录，用qRT-PCR方法检测GhPRXR1基因在GhPRXR1基因沉默棉花中的沉默效率。

荧光定量引物序列如下：

qRT-GhPRXR1-F：5’-TTTCGTTGGGAGGCCCTTAC-3’；

qRT-GhPRXR1-R：5’-AGTTCTGCCGACACTGTGAG-3’。

qRT-18S-F：5’-TTAGTTGGTGGAGTGATTTG-3’；

qRT-18S-R：5’-GGTGGCTCTGTCAGTGTAG-3’。

结果如图10所示。结果表明：GhPRXR1基因在6个GhPRXR1基因沉默棉花阳性单株中的平均表达量较3个对照单株平均表达量显著下降了31.96％。

二、GhPRXR1基因沉默棉花棉籽油含量测定

使用棉籽油份含量(棉籽含油量)测定仪器测定6个GhPRXR1基因沉默棉花阳性单株和3个对照单株的棉籽油份含量。具体步骤如下：每个单株收获位于棉花植株中部位置的棉籽，并分别进行单株棉籽油份测定，棉籽油份含量测定仪器为纽迈核磁共振仪器(NMI20-Analyst)，按照仪器使用说明书进行操作。每个单株的种子测3个重复，用3次重复的平均值代表该单株的含油量。

结果如图11所示。结果表明：3个对照单株的棉籽含油量分别为23.42％、23.79％、23.02％，平均含油量为23.41％，而GhPRXR1基因沉默后的6个阳性单株的棉籽含油量分别为19.88％、19.27％、20.46％、21.54％、17.47％、16.40％，平均含油量为19.17％。与对照相比，GhPRXR1基因被沉默后，棉籽平均含油量降低了18.11％。说明GhPRXR1基因可调控棉籽含油量。

序列表

<110>中国农业科学院棉花研究所

<120> GhPRXR1蛋白及其编码基因在调控棉籽含油量中的应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>999

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atgaggaaaa tcatgggtgc caaagttctt ttcttctttg ctttgctttc cttttcagct 60

gtctcggcat ttgcacagga tgaggaagac caaggtcttg ttatgaactt ctacaaggat 120

tcttgtcctc aggctgaaga cattatcaag gagcaagtta agctactgta caagcgacac 180

aaaaacactg ctttttcttg gctgagaaac attttccatg actgtgctgt ccagtcatgt 240

gatgcttcac tgctgctgga ctccacaaga aggagcttgt ctgagaagga gacagacagg 300

agctttggcc taaggaattt caggtacatt gagaccatca aagaagctgt agaaagggaa 360

tgtcctggag ttgtttcttg tgctgatatc cttgttctgt ctgctaggga aggcatcgtt 420

tcgttgggag gcccttatat tcctctcaaa actggaagaa gagacggtag aaggagcaga 480

gcagatgttg tggaggagta tcttccggac cacaatgaga ccatctctgg cgttcttgac 540

aggtttgccg ccatgggtat tgacacccct ggagtcgttg ccctcctagg agctcacagt 600

gtcggcagaa ctcactgtgt gaagctggtg catcgtttgt acccagaggt tgaccctgcc 660

ctcaaccccg accatgttcc acacatactc cataaatgcc ctgatcagat cccagacccc 720

aaggccgtcc agtatgtgag aaacgaccgt gggacaccca tggttttgga taacaactac 780

tacaggaaca tactggacaa caagggtttg ttgattgtgg atcaccaact ggcgtacgac 840

aaaaggacca gaccttatgt gaagaaaatg gccaagagcc aagactattt cttcaaggag 900

ttctcaaggg ccattactct cctctctgag aacaatcctc tcactggtag caagggtgag 960

atcaggaagc aatgcaatct tgcaaacaag cttcactaa 999

<210>2

<211>332

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Arg Lys Ile Met Gly Ala Lys Val Leu Phe Phe Phe Ala Leu Leu

1 5 10 15

Ser Phe Ser Ala Val Ser Ala Phe Ala Gln Asp Glu Glu Asp Gln Gly

20 25 30

Leu Val Met Asn Phe Tyr Lys Asp Ser Cys Pro Gln Ala Glu Asp Ile

35 40 45

Ile Lys Glu Gln Val Lys Leu Leu Tyr Lys Arg His Lys Asn Thr Ala

50 55 60

Phe Ser Trp Leu Arg Asn Ile Phe His Asp Cys Ala Val Gln Ser Cys

65 70 75 80

Asp Ala Ser Leu Leu Leu Asp Ser Thr Arg Arg Ser Leu Ser Glu Lys

85 90 95

Glu Thr Asp Arg Ser Phe Gly Leu Arg Asn Phe Arg Tyr Ile Glu Thr

100 105 110

Ile Lys Glu Ala Val Glu Arg Glu Cys Pro Gly Val Val Ser Cys Ala

115 120 125

Asp Ile Leu Val Leu Ser Ala Arg Glu Gly Ile Val Ser Leu Gly Gly

130 135 140

Pro Tyr Ile Pro Leu Lys Thr Gly Arg Arg Asp Gly Arg Arg Ser Arg

145 150 155 160

Ala Asp Val Val Glu Glu Tyr Leu Pro Asp His Asn Glu Thr Ile Ser

165 170 175

Gly Val Leu Asp Arg Phe Ala Ala Met Gly Ile Asp Thr Pro Gly Val

180 185 190

Val Ala Leu Leu Gly Ala His Ser Val Gly Arg Thr His Cys Val Lys

195 200 205

Leu Val His Arg Leu Tyr Pro Glu Val Asp Pro Ala Leu Asn Pro Asp

210 215 220

His Val Pro His Ile Leu His Lys Cys Pro Asp Gln Ile Pro Asp Pro

225 230 235 240

Lys Ala Val Gln Tyr Val Arg Asn Asp Arg Gly Thr Pro Met Val Leu

245 250 255

Asp Asn Asn Tyr Tyr Arg Asn Ile Leu Asp Asn Lys Gly Leu Leu Ile

260 265 270

Val Asp His Gln Leu Ala Tyr Asp Lys Arg Thr Arg Pro Tyr Val Lys

275 280 285

Lys Met Ala Lys Ser Gln Asp Tyr Phe Phe Lys Glu Phe Ser Arg Ala

290 295 300

Ile Thr Leu Leu Ser Glu Asn Asn Pro Leu Thr Gly Ser Lys Gly Glu

305 310 315 320

Ile Arg Lys Gln Cys Asn Leu Ala Asn Lys Leu His

325 330

Claims

1.GhPRXR1蛋白质在调控棉籽含油量中的应用；

或，GhPRXR1蛋白质在调控酵母总脂肪含量中的应用；

所述GhPRXR1蛋白质是如下a）或b）所示的蛋白质：

a）氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b）在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与GhPRXR1蛋白质相关的生物材料在调控棉籽含油量中的应用；

或，与GhPRXR1蛋白质相关的生物材料在调控酵母总脂肪含量中的应用；

所述GhPRXR1蛋白质是如下a）或b）所示的蛋白质：

a）氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b）在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述生物材料为下述A1）至A8）中的任一种：

A1）编码GhPRXR1蛋白质的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；

A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；

A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；

A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；

A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物。

3.GhPRXR1蛋白质或与GhPRXR1蛋白质相关的生物材料在培育棉籽含油量提高的转基因棉花中的应用；

或，GhPRXR1蛋白质或与GhPRXR1蛋白质相关的生物材料在培育总脂肪含量提高的转基因酵母中的应用；

或，GhPRXR1蛋白质或与GhPRXR1蛋白质相关的生物材料在棉花育种中的应用；

所述GhPRXR1蛋白质是如下a）或b）所示的蛋白质：

a）氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

所述生物材料为下述A1）至A8）中的任一种：

A1）编码GhPRXR1蛋白质的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；

A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；

A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；

A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；

A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：A1）所述核酸分子为如下1）或2）或3）所示的基因：

1）其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2）与1）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码GhPRXR1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的核苷酸序列杂交，且编码GhPRXR1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

5.一种培育棉籽含油量降低的转基因棉花的方法，包括降低受体棉花中GhPRXR1蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因棉花的步骤；所述转基因棉花的棉籽含油量低于所述受体棉花；

所述GhPRXR1蛋白质是如下a）或b）所示的蛋白质：

a）氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述降低受体棉花中GhPRXR1蛋白质的表达量和/或活性的方法是通过沉默所述受体棉花中GhPRXR1蛋白质的编码基因来实现。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述GhPRXR1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：沉默所述受体棉花中GhPRXR1蛋白质的编码基因方法是通过向受体棉花中导入GhPRXR1基因沉默载体和辅助载体来实现。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述GhPRXR1基因沉默载体为将VIGs-GhPRXR1片段插入pCLCrVA载体的SpeI和AscI酶切位点间，且保持pCLCrVA载体的其他序列不变后得到的。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述VIGs-GhPRXR1片段为序列1第67-436位所示的DNA分子；

或，所述辅助载体为pCLCrVB载体。

11.GhPRXR1基因沉默载体或VIGs-GhPRXR1片段在培育棉籽含油量降低的转基因棉花中的应用；

所述GhPRXR1基因沉默载体为将VIGs-GhPRXR1片段插入pCLCrVA载体的SpeI和AscI酶切位点间，且保持pCLCrVA载体的其他序列不变后得到的；

所述VIGs-GhPRXR1片段为序列1第67-436位所示的DNA分子。

12.一种培育总脂肪含量提高的转基因酵母的方法，包括如下步骤：将GhPRXR1蛋白质的编码基因导入受体酵母中，得到转基因酵母；所述转基因酵母的总脂肪含量高于所述受体酵母；

所述GhPRXR1蛋白质是如下a）或b）所示的蛋白质：

a）氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述GhPRXR1蛋白质的编码基因为序列表中序列1所示的DNA分子。