CN116426564B - GhALY1基因在提高植物出油率方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及GhALY1基因在提高植物出油率方面的应用。本发明通过在酿酒酵母及拟南芥中异源表达GhALY1基因，用气相色谱法(Gas Chromatography简称GC)测定转基因系的油分含量及脂肪酸组分含量，明确了GhALY1基因在提高棉籽出油率方面的应用，同时也明确了GhALY1基因表达的蛋白ALY在提高棉籽出油率方面的应用。

Description

GhALY1基因在提高植物出油率方面的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及GhALY1基因在提高植物出油率方面的应用。

背景技术

棉花是世界上最重要的纤维作物和主要的油料作物，棉籽是商品棉的主要副产物，约占籽棉总产量的60％，棉籽含油量占15.0％～48.7％，棉籽油中含有大量的人体所必需的脂肪酸，其中油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸的含量接近80％，使得棉籽油具有较强的抗氧化能力。另外棉籽油与菜籽油和花生油相比棉籽油中含有较高的维生素E，维生素E是一种抗氧化剂，能提高人体抗细胞衰老的能力以及降低人体心脑血管疾病发生几率等功效。此外，棉籽发育时期的脂肪酸组分不仅是决定其营养品质的关键因素而且对棉花纤维的发育也有重要影响，研究发现亚麻酸、棕榈酸在棉花纤维发育阶段有重要调节作用，研究发现超长链饱和脂肪酸能促进棉花纤维伸长，研究发现棉花种仁油分与纤维整齐度指数，伸长率呈显著正相关。说明，棉籽脂肪酸对棉纤维的发育具有促进作用。棉籽油作为生产生物能源燃料也具有广阔的应用前景，石化柴油的碳链长度一般在C15～C18之间，而棉籽油中有99％的脂肪酸碳链长度集中在C16～C18之间，和柴油成分极其相似，棉籽油适合转化生产为生物柴油，并且转化为生物柴油的效率高达95％，另外棉籽油转化而成的生物柴油富含氧而不含硫，因此可使生物柴油的燃烧更为彻底且不污染环境。由于我国近10年种植面积从2004年的569.287万公顷到2013年的434.563万公顷，总体呈现逐年下降的趋势。因此通过利用基因工程手段提高单位面积上棉籽的油脂含量，是维持棉籽油产量以至于提高棉花副产品利用效率的必由之路。

TREX是mRNA输出复合体，由Aly、UAP56、Tex1和THO复合体组成，Aly和THO都具有连接TREX和核帽结合复合体的功能，并且是TREX组分与剪接的mRNA结合所必需的。Pfaff等研究发现拟南芥AtALY1基因在调节根长、种子大小和胚珠发育中起重要作用。此外，AtALY的四重突变体莲座叶和花絮减少，植株矮小，并且花的形态异常，角果变短，因此缺乏ALY蛋白会导致营养和生殖发育的严重缺陷。然而，在棉花中还没有关于ALY基因的研究。

发明内容

本发明提供了GhALY1基因在提高植物出油率方面的应用。GhALY1基因序列如SEQNO.1所示。

进一步的，GhALY1基因可调控的植物包括拟南芥和棉花。

本发明还提供了GhALY1基因表达的蛋白ALY在提高植物出油率方面的应用。蛋白ALY的氨基酸序列如SEQ NO.2所示。

本发明还提供了一种包含GhALY1基因的基因表达载体以及该载体在提高植物出油率方面的应用。

本发明还提供了调控GhALY1基因表达的调控剂在制备用于调控植物出油率制剂中的应用。

本发明具有以下有益效果：本发明通过在酿酒酵母及拟南芥中异源表达GhALY1基因，用气相色谱法(Gas Chromatography简称GC)测定转基因系的油分含量及脂肪酸组分含量，明确了GhALY1基因在提高植物出油率方面的应用，同时也明确了GhALY1基因表达的蛋白ALY在提高植物出油率方面的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1GhALY1基因的克隆；

图2GhALY1加Infusion接头M:DL2000 Marker，1和2为目的片段；

图3将HindⅢ和BamH I酶切的质粒pYES2与目的基因GhALY1进行体外连接；

图4GhALY1连接pYES2载体菌液PCR鉴定M:DL2000 Marker，1-10为含有目的片段的菌株；

图5酵母菌液PCR鉴定；

图6转基因酵母qRT-PCR结果；

图7转基因酵母酵母油分含量(a)及脂肪酸组分含量(b)；

图8GhALY1连接PDONR ZEO载体菌液鉴定；

图9GhALY1连接pEarleyGate 101载体菌液鉴定；

图10Basta筛选GhALY1转基因拟南芥阳性苗；

图11GhALY1转基因拟南芥阳性苗PCR鉴定；

图12GhALY1转基因拟南芥阳性苗Western Blot鉴定；

图13转基因拟南芥油分含量(a)及脂肪酸组分含量(b)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1棉花中GhALY1基因的克隆

1所需工具酶、试剂盒药品

(1)酶及试剂盒：2×Max Master Mix(P515)高保真酶、2×Taq PlusMaster Mix II(Dye Plus)、Invitrogen^TM Gateway^TM BP Clonase^TM II Enzyme mix、Invitrogen^TM Gateway^TM LR Clonase^TM II Enzyme mix、酵母总RNA快速提取试剂盒(ZP407-1)购自庄盟生物、FastPure植物总RNA提取试剂盒(用于富含多糖和多酚的样品)购自南京诺唯赞生物技术公司、HiScript III RT SuperMix反转录试剂盒、/>Plasmid MiniPrep Kit质粒提取试剂盒购自北京全式金公司、/>Quick GelExtraction Kit胶回收试剂盒购自北京全式金公司、大肠杆菌感受态DH5α购自康为世纪、农杆菌感受态GV3101购自唯地生物、酵母INVSc1感受态购自唯地生物、实验所用引物在上海生工生物工程公司。

(2)其他药品：琼脂糖购买于全式金生物公司，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯，卡那霉素和氨苄青霉素等购自宝生物工程大连有限公司，SD-Ura培养基购自北京索莱宝科技有限公司、D-棉籽糖和D-半乳糖购自北京索莱宝科技有限公司。

(3)溶液的配制：本文中提到的但未列出的各种试剂均按《分子克隆实验指南》第三版上的方法配制，生化试剂为分析纯或以上级。

(4)LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L；LB固体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L、琼脂粉15g/L，定容至1L；LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板。

(5)酵母筛选固体培养基SD-Ura(1L)：SD-Ura 8g，琼脂粉20g，葡萄糖20g；

(6)酵母扩增液体培养基SD-Ura(1L)：SD-Ura 8g，葡萄糖20g；

(7)酵母蛋白诱导液体培养基SD-Ura(1L)：SD-Ura 8g，半乳糖20g，棉籽糖10g；

(8)主要仪器：PCR扩增仪(BIO-RAD)、高速离心机(Hettich MIKRO 200R)、电泳设备(BIO-RAD)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、荧光定量PCR仪(ABI7500)、真空冷冻干燥仪(Alpha I-5；Martin Christ)、气相色谱仪(Nexis GC-2030，ShimadzuCorporation,Kyoto,Japan)、全自动样品研磨仪(JXFSTRBP-64，上海净信)。

2GhALY1的电子克隆

将拟南芥的ALY1(AT5G59950.1)基因在测序得到的陆地棉(G.hirsutum,AD1)基因组数据(CRI)的gff3文件数据库中进行同源比对、搜索，找到相应目的序列后，采用DNAMAN软件设计引物，采用PCR技术从中植棉3号中扩增出完整CDS序列726bp，编码241个氨基酸残基。基因CDS序列如SEQ NO.1所示，氨基酸序列如SEQNO.2所示。

3具体克隆基因的过程

(1)试验材料中植棉3号种植于中国农业科学院棉花研究所试验地的，按一般大田管理。所取部位有根、茎、叶、花、蕾、下胚轴、不同发育时期的胚珠和纤维，所取材料迅速投入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用。植物DNA提取采用改良的CTAB法，植物总RNA提取采用诺唯赞公司试剂盒。

(2)将1μg RNA反转录为cDNA，将反转录产物cDNA溶液稀释5倍作为PCR反应模板。

以提取的各时期棉花胚珠总RNA为模板，利用诺唯赞公司的反转录试剂盒将其反转录为cDNA，具体步骤为：

①基因组DNA去除体系：

RNA模板 1μg

4×gDNA wiper Mix 4μL

RNase-free ddH2O to 16μL

配完上述体系后，用移液器吸打混匀，之后放PCR仪中42℃反应2min。

②反转录反应体系：5×HiScriptⅢqRT SuperMix 4μL

第①步反应液 16μL

配完上述体系后，用移液器吸打混匀，之后放PCR仪中37℃反应15min，85℃反应5sec。反应结束后，将cDNA稀释10倍，分装后于-80℃超低温冰箱保存。

(3)进行PCR反应扩增目的基因

使用DNAMAN软件设计GhALY1基因全长引物，以反转录所得到的混合cDNA为模板对棉花GhALY1基因进行PCR扩增。使用诺唯赞公司的2×Max Master Mix(P515)高保真酶进行扩增，反应体系为：

配制上述反应体系后进行PCR反应，反应程序为：

(4)PCR反应结束后，使用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行PCR检测，条带大小符合预期设计则视为有效结果如图1所示。

(5)使用北京全式金公司试剂盒Quick Gel Extraction Kit进行凝胶回收

(6)将上述胶回收的产物连接pYES2载体并转化大肠杆菌。

(7)37℃过夜培养从抗性LB培养基上挑取单克隆到含有Amp的600μL LB培养基中37℃摇菌培养4h。

(8)菌液PCR验证，送含有目的基因片段大小条带的菌液测序。

3.pYES2-GAL1::GhALY1酿酒酵母表达载体的构建

3.1质粒提取及酶切

质粒提取北京全式金公司的Plasmid MiniPrep Kit质粒提取试剂盒，质粒浓度经检测为260ng/μL，琼脂糖凝胶电泳检测，没有蛋白污染，达到试验要求，内切酶选用HindⅢ和BamH I进行双酶切。

3.2pYES2-GAL1::GhALY1酿酒酵母表达载体的构建

目的基因ORF序列扩增：根据终载体pYES2的图谱设计HindⅢ和BamH I为插入位点并合成引物，引物序列如下：

In-GhALY1-F:5’-actatagggaatattaagcttATGTCAAGTGCATTAGAGATG-3’(含酶切位点HindⅢ)

In-GhALY1-R:5’-gcggccgttactagtggatccTCAATTTGTCTGCATTGCTTC-3’(含酶切位点BamH I)

使用高保真酶扩增得到目的片段，目的基因扩增体系如表1所示。

表1目的基因扩增体系

(1)配制上述反应体系后进行PCR反应，反应程序为：

(2)电泳检测与回收：

PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶电泳，调节电压至90V，电泳1h，照相记录电泳结果(图2)，在紫外灯下观察，迅速切下目的条带。用胶回收试剂盒回收目的片段，具体方法按试剂盒说明书进行。

(3)融合表达载体构建：

(3.1)同源重组：

同源重组连接体系见表2，配制完反应体系后，于37℃连接30min，反应完成后置于冰上5min。

(3.2)连接产物的转化：

将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，具体步骤为：

a.从-80℃超低温冰箱取出DH5α感受态(100μL)放置于冰盒中融化；

b.待感受态融化后将连接产物加入其中，轻轻混匀后，冰上静置30min；

c.42℃水浴90sec，冰浴2min；

d.在超净工作中，向其中加入600μL无抗性的LB液体培养基，放置于37℃，180rpm摇床中培养1h；

e.在超净工作中，吸取200μL菌液于含有Amp抗性的LB固体培养基中，用涂布器均匀的涂开后封培养皿，放置于37℃培养箱中倒置过夜培养；

f.挑取阳性克隆后，进行菌液PCR检测，验证结果如图4。

g.对6号单克隆在含有Amp的LB培养基进行50mL扩繁，37℃条件下190rpm的摇床过夜，使用用全式金公司质粒提取试剂盒提取质粒备用。

4.pYES2酿酒酵母表达载体构建、遗传转化及诱导表达

4.1酵母筛选固体培养基SD-Ura(1L)配制如下：

a.称取SD-Ura 8g，Agar 20g加入950mL蒸馏水中，溶解后121℃高压灭菌15-18分钟；

b.冷却后加入50mL，40％无菌葡萄糖；

c.在超净工作台内将培养基倒入无菌培养皿中，凝固后备用；

4.2利用INVSc1感受态细胞进行转化，具体过程如下：

a.取-80℃保存的酿酒酵母感受态INVSc1(100μL)放于冰面上，使其融化；

b.向融化的感受态中依次加入载体质粒10μL，预处理后的Carrier DNA 10μL(95℃金属浴5min后快速插入冰中)，PEG/LiAc500μL，之后吸打混匀，30℃水浴30min(15min时上下翻转8次混匀)；

c.将感受态放于42℃水浴15min(7.5min时上下翻转8次混匀)；

d.5000rpm离心40sec后弃上清，在超净台中加入400μL灭菌ddH₂O，用枪头吹打重悬，离心30sec弃上清；

e.在超净台中加入60μL灭菌ddH₂O，用枪头吹打重悬，之后用涂布器均匀的涂在SD-Ura固体培养基中，放置于29℃恒温培养箱培养48h；

f.同时按照上述方法将没有酶切的pYES2载体转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，得到转空载体酵母

g.在超净台中挑取单克隆放入含有1mL扩增液体SD-Ura培养基的离心管中(缠上封口膜)，29℃摇床中过夜培养。使用pYES2-F和pYES2-R引物对空载体及转基因酵母进行菌液鉴定，鉴定结果如图5，空载对照和转基因各挑选6个阳性菌株。

酵母菌株鉴定引物序列：

pYES2-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’

pYES2-R：5’-GTGACATAACTAATTACATGATG-3’

4.3酵母诱导液体培养基SD-Ura(1L)配制如下：

a.称取SD-Ura 8g加入950mL蒸馏水中，溶解后121℃高压灭菌15-18分钟；

b.待培养基温度降到55℃时，加入已过滤除菌的20％的半乳糖100mL和10％的棉籽糖100mL，备用。

4.4酵母诱导培养

a.在超净台中将挑选的菌株取1mL转移至含有50mL扩增液体SD-Ura培养基的锥形瓶中，放置于29℃摇床中培养48h；

b.在超净台中将50mL菌液转移至50mL无菌离心管中，5000rpm离心10min，弃上清，之后向离心管中加入50mL蛋白诱导培养基SD-Ura，用枪头吸打重悬菌液后转移至新的锥形瓶中，放置于29℃摇床中培养48h；

c.将诱导完成的菌液进行5000rpm离心10min，弃上清后放入冷冻真空干燥仪进行24h干燥；

d.使用研磨仪对冻干后的酵母研磨至粉末状态。

5.酵母RNA的提取以及qRT-PCR验证基因表达

(1)使用酵母总RNA快速提取试剂盒对空载体及转基因酵母RNA进行提取，使用诺唯赞公司的反转录试剂盒进行逆转录反应，使用诺唯赞公司的荧光定量试剂盒进行qRT-PCR验证。

(2)qRT-PCR反应体系如表3

表3qRT-PCR反应体系

qRT-PCR反应步骤为：①预变性：qRT-PCR从95℃开始，持续30sec；②循环反应：95℃(10sec)变性，60℃(30sec)引物退火，40个循环；③溶解曲线：95℃(15sec)，60℃(60sec)，95℃(15sec)。选择酵母的18SRNA作为内参基因。每个模板进行3次技术重复，并使用2^-ΔΔCT方法计算基因相对表达量。

荧光定量引物序列：

RT-18S-F：5’-TTAGTTGGTGGAGTGATTTG-3’

RT-18S-R：5’-GGTGGCTCTGTCAGTGTAG-3’

RT-GhALY1-F：5’-GCTCGGCACCGTATACTTCT-3’

RT-GhALY1-R：5’-CGTAGAGCTTCGTTCCGGTT-3’

结果如图6所示：3个转GhALY1基因阳性酵母株系中的GhALY1基因表达量极显著高于转空载体对照(p<0.01)。

6.转基因酵母的油分及脂肪酸成分含量测定

将qRT-PCR结果中的3个高表达系用于酵母油分及脂肪酸组分含量测定。利用气相色谱仪测定酵母的油分及脂肪酸组分含量，结果如图7所示，结果显示，与对照相比，3个转基因酵母系的油分含量分别提高了16.96％、13.86％和16.31％，且脂肪酸组分中的棕榈酸(C16:0)含量分别提高了4.97％、6.24％和4.21％，硬脂酸(C18:0)含量分别提高了14.89％、13.65％和14.51％。

7.拟南芥过表达载体构建与遗传转化

为了获得GhALY1基因的过表达拟南芥，本研究使用BP和LR反应将克隆出的GhALY1基因连接到表达载体pEarleyGate 101，之后通过浸花法侵染拟南芥获得转基因阳性苗，具体步骤为：

7.1PDONR/Zeo载体连接

根据pDONR/Zeo图谱设计BP反应引物，引物序列如下：

GhALY1-BP-F：

5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGTCAA GTGCATTAGAGATG-3’

GhALY1-BP-R：

5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAATTTGTCTG CATTGCTTCAG-3’

将回收的DNA片段通过BP反应连接pDONR/Zeo载体，反应体系如表4：

表4BP反应体系

配制好上述反应体系于200μL离心管中，25℃放置1h。之后将连接产物转DH5α，在含有博来霉素的LB固体培养基中过夜生长，挑单克隆使用M13-F和M13-R引物进行菌液鉴定，鉴定结果如图8，选择1号阳性菌液进行摇菌提质粒。

M13F：5’-GTTGTAAAACGACGGCCAG-3’

M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’

7.2pEarleyGate 101载体连接

将1号的质粒通过LR反应连接表达载体pEarleyGate 101，反应体系如表5：

表5LR反应体系

配制好上述反应体系于200μL离心管中，25℃放置1h。之后将连接产物转大肠杆菌感受态DH5α，挑单克隆使用35S-F和EYFP-R引物进行菌液鉴定，选出正确的阳性菌液进行摇菌提质粒，转化农杆菌感受态GV3101，挑单克隆使用35S-F和EYFP-R引物进行菌液鉴定(图9)，使用50％甘油进行保菌备用。

35S-F：5’-cccactatccttcgcaag-3’

EYFP-R：5’-gaacttgtggccgtttac-3’

7.3侵染拟南芥及阳性苗筛选

a.野生型拟南芥(Col-0)种植于温度22℃、光照时间16h的拟南芥温室中，在侵染前一天适当浇水。

b.在超净工作台中，将带有pEarlyGate101-GhALY1目的基因载体的农杆菌菌液取10μL于含有卡那霉素和利福平的LB固体培养基中进行划线，将平板过夜倒置放于28℃恒温培养箱中。

c.在超净工作台中，用无菌枪头挑取菌落于100mL LB液体培养基(含有卡那霉素和利福平)放于28℃，180rpm摇床中进行过夜培养，待其OD600在1.0-1.6之间时停止培养。

d.将100mL菌液转移至50mL无菌的离心管中，5000rpm，离心10min，弃上清，用重悬液(表6)将菌体重悬，重悬至OD600为0.8，黑暗放置3h。

表6重悬液配方

e.将重悬液倒于培养皿中，将每一钵的拟南芥花序全部浸入菌液1min，来回晃动拟南芥增加转化效率，之后封上保鲜膜，黑暗处理24h后转置拟南芥温室继续日常培养，收获T0代种子。

f.T0代种子混收后，撒播至培养托盘(营养土：蛭石体积＝1:1)，适量浇水，盖上保鲜膜放于拟南芥温室中，出苗后每天早晚喷洒10％Basta除草剂，阴性苗出现干枯、死亡，阳性苗颜色嫩绿正常生长如图10，之后将阳性苗移栽至新的营养钵中，抽薹后取莲座叶进行DNA提取，之后PCR检测确定阳性苗如图11。之后随机挑选了3个株系进行Western Blot实验，发现3个株系的GhALY1蛋白都有表达(图12)。

8.转基因拟南芥的油分及脂肪酸成分含量测定

将Western Blot结果中的3个高表达系用于拟南芥油分及脂肪酸组分含量测定，结果如图13所示。利用气相色谱仪测定拟南芥的油分及脂肪酸组分含量，结果显示，与拟南芥WT相比，3个转基因拟南芥系的油分含量分别提高了11.81％、10.06％和6.17％，且脂肪酸组分中的油酸(C18:1)含量分别提高了39.89％、29.66％和25.97％。

Claims (5)

1.GhALY1基因在提高植物出油率方面的应用，所述植物为拟南芥和棉花，所述GhALY1基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种如权利要求1所述基因表达的蛋白ALY在提高植物出油率方面的应用，所述植物为拟南芥和棉花。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蛋白ALY的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种基因表达载体在提高植物出油率方面的应用，其特征在于，所述基因表达载体包括如权利要求1中所述的GhALY1基因，所述植物为拟南芥和棉花。

5.调控权利要求1所述的GhALY1基因表达的调控剂在制备用于调控植物出油率制剂中的应用，所述植物为拟南芥和棉花。