CN114736916B

CN114736916B - 紫苏PfLPAT2-3基因在提高植物总脂含量中的应用

Info

Publication number: CN114736916B
Application number: CN202210204050.6A
Authority: CN
Inventors: 王计平; 史华平; 郝月茹; 董书言; 罗涛; 王尧; 尹苗
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2022-03-02
Filing date: 2022-03-02
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2042-03-02
Also published as: CN114736916A

Abstract

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及紫苏PfLPAT2‑3基因在提高植物总脂含量中的应用。所述紫苏PfLPAT2‑3基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述植物为烟草，本发明对参与紫苏油脂代谢的关键酶基因PfLPAT2‑3进行详细的功能研究，为进一步了解紫苏脂肪酸合成积累机制、改善紫苏油产量和品质提供理论参考，同时为其他油料作物通过基因工程技术特异性富集C18:1等不饱和脂肪酸提供了优异的基因元件。

Description

紫苏PfLPAT2-3基因在提高植物总脂含量中的应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及紫苏PfLPAT2-3基因在提高植物总脂含量中的应用。

背景技术

紫苏原产于中国，是一种公认的药食同源植物。紫苏极具开发价值，它的种子含油量高达40％～50％，其中α-亚麻酸含量尤其丰富，因此也成为深海鱼油的良好替代品，长期食用有降血压血脂、提高免疫力、抗衰老等功效，其次紫苏还在食品、医药、生物燃料等领域具有广泛的应用。随着油用市场的不断扩大，越来越多的工作集中在通过基因工程的手段提高作物油产量和质量，而深入了解植物油脂代谢过程及其内在的分子调控机制成为提高作物油含量和质量的研究基础。在植物种子发育过程中，油脂主要以TAG的形式储存，而溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAT酶)是TAG合成过程中的一类关键酶，目前已在多个物种中鉴定并克隆到LPAT，相应的研究表明其具有提高植物种子油含量的作用，同时由于其对底物的特异选择性，LPAT的表达还能定向改善植物油脂的脂肪酸组分，因此LPAT基因的相关研究对提高植物油含量和质量具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了紫苏PfLPAT2-3基因在提高植物总脂含量中的应用，所述紫苏PfLPAT2-3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述植物为烟草。

更进一步的，所述应用包括：

1)使烟草包含紫苏PfLPAT2-3基因；或

2)使烟草表达紫苏PfLPAT2-3基因编码的蛋白。

更进一步的，所述应用的具体过程为：扩增紫苏PfLPAT2-3基因，将该基因连接到植物表达载体上，并转化感受态细胞，制得包含该基因的重组质粒，将重组质粒侵染烟草，使该基因在烟草中得以表达。

更进一步的，扩增紫苏PfLPAT2-3基因的模板为紫苏开花后20天种子的cDNA。

更进一步的，扩增紫苏PfLPAT2-3基因的引物如SEQ ID NO.2-3所示。

更进一步的，植物表达载体为pCAMBIA1303载体。

更进一步的，感受态细胞为根癌农杆菌GV3101。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明对参与紫苏油脂代谢的关键酶基因PfLPAT2-3进行详细的功能研究，为进一步了解紫苏脂肪酸合成积累机制、改善紫苏油产量和品质提供理论参考，同时为其他油料作物通过基因工程技术特异性富集C18:1等不饱和脂肪酸提供了优异的基因元件。

附图说明

图1为PfLPAT2-3基因的PCR扩增。

图2为菌液PCR检测，图中，M：2000bp Marker；1-5：PfLPAT2-3单克隆验证。

图3为pYES2.0载体图谱。

图4为双酶切验证图，图中，M：12000bp Marker；1：pYES2.0-PfLPAT2-3双酶切结果；2：重组载体。

图5为转基因酵母阳性鉴定，图中，M：2000bp Marker；1-3：转pYES2.0空载；4-6：转PfLPAT2-3。

图6为pCAMBIA1303载体图谱。

图7为双酶切验证图，图中，M：12000bp Marker；1：pCAMBIA1303-PfLPAT2-3双酶切结果；2：重组载体。

图8为转基因农杆菌阳性检测图，图中，M：2000bp Marker；1-2：转pCAMBIA1303-PfLPAT2-3的农杆菌；3：转pCAMBIA1303空载体。

图9为烟草瞬时转化阳性检测，图中，M：2000bp Marker；1-3：转PfLPAT2-3烟草叶片；4-6：转空载烟草叶片。

图10为瞬时转化烟草叶片总脂含量。

图11为烟草遗传转化过程，图中，A：切割后的烟草叶片；B：脱分化诱导愈伤组织；C：愈伤组织形成芽；D：生根培养；E：生长培养；F：炼苗移栽。

图12为转基因烟草转录水平检测图，图中，1：质粒，2：水，3-10：转PfLPAT2-3烟草叶片。

图13为转基因烟草叶片总脂含量，图中，EV：转空载对照；LPAT2-3-OE：PfLPAT2-3转基因株系；EV Control：对照组平均值；OE Control：转基因株系平均值；^**：差异极显著(P＜0.01)。

图14为PfLPAT2-3转基因株系脂肪酸组分；EV：转空载对照；OE：转基因株系；EVControl：对照组平均值；OE Control：转基因株系平均值；^*：差异显著(P＜0.05)，^**：差异极显著(P＜0.01)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：紫苏PfLPAT2-3基因的克隆

1、提取总RNA：利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提取紫苏开花后20天种子总RNA，用超微量核酸分析仪检测RNA的浓度和纯度，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

2、cDNA的合成：以得到的紫苏种子总RNA为模板，使用5×All-In-OneMasterMix反转录试剂盒完成，按照试剂盒说明书反转录得到cDNA，如SEQ ID NO.1所示。

3、设计引物：引物信息见表1。

表1 PfLPAT2-3基因的克隆引物信息

4、PCR反应：扩增体系及程序如下：

PCR扩增体系：

PCR程序：94℃，3min；94℃，30s，59.9℃，30s，72℃，2min，30cycles；72℃，5min。

5、目的片段的回收纯化

将检测正确的单一条带从琼脂糖凝胶上切割下来，按照Universal DNAPurification Kit通用型DNA纯化回收试剂盒进行操作，回收并纯化目的片段，结束后将产物存于-20℃冰箱。

6、克隆与转化

6.1目的基因的克隆

用

-Blunt Zero Cloning Kit试剂盒完成目的基因的克隆，将4μL PCR纯化产物和1μL

-Blunt Zero Cloning Vector混匀，在室温下反应10min，反应结束后立即进行转化操作。

6.2大肠杆菌感受态的制备与转化

将活化后的大肠杆菌DH5α接种于50mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀≤0.5后将菌液置于冰上20min，低温高速离心收集菌体。向收集的细胞中加入10mL预冷的CaCl₂(0.1M)溶液，重复混匀后离心去上清，此操作重复2次。然后向沉淀中加入2mL含15％甘油的CaCl₂(0.1M)溶液重悬菌液，即得感受态细胞，每100μL感受态细胞分装于一个无菌离心管中，用于完成一次转化。感受态制备好可存入-80℃备用，一周内活性最佳。

将10μL克隆的连接产物加入到刚刚解冻的感受态细胞中，混匀后冰浴30min，然后将离心管置于42℃金属浴中90s，结束后迅速冰浴2min。在所得产物中加入800μL LB培养基，37℃，200rmp培养45min。吸取10μL菌液涂布于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB固体筛选板上，37℃暗培养12～16h至出现菌斑。

-Blunt Zero载体带有氨苄青霉素和卡那霉素2种筛选标记，本试验选用卡那霉素作为筛选标记。

6.3阳性克隆筛选

从筛选板上挑取单菌落接种于1mL的LB培养基中(含50μg/mL卡那霉素)，振荡培养至菌液浑浊。吸取菌液进行PCR检测，所用引物为试剂盒中提供的

-Blunt Zero载体引物，PCR程序为94℃，5min；94℃，30s，退火温度，30s，72℃，30s，27cycles；72℃，10min。

将检测阳性的菌液一部分送生工生物(上海)工程股份有限公司测序，一部分存菌用于后续试验。

7、结果与分析

以紫苏开花后20d种子的cDNA为模板，用全长ORF引物扩增出长度在1000～2000bp之间的条带(图1)，与预期长度一致，初步判断是目的条带。将目标片段回收纯化后与

-Blunt Zero Cloning Vector相连，转入大肠杆菌，通过卡那霉素筛选获得单克隆，PCR检测鉴定出阳性克隆(图2)。将检测成功的菌液送公司测序，经过比对发现与紫苏PfLPAT2-3基因的ORF序列一致，确定克隆成功。

实施例2：植物表达载体的构建和转化

1、重组表达载体的构建

1.1质粒提取

构建载体所用的质粒是用TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒从扩繁菌液中提取。提取pYES2.0空载质粒(图3)和测序成功连PfLPAT2-3基因的T质粒，存于-20℃冰箱备用。具体操作参照说明书进行。

1.2目的片段的扩增与纯化

在目标序列的基础上设计含有相应酶切位点的PCR引物(表2)，以克隆成功的T质粒为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并将目的条带进行回收纯化。

表2引物信息

注：下划线表示酶切位点，酶切位点前是保护碱基。

1.3双酶切构建重组载体

1.3.1双酶切

用限制性核酸内切酶分别双酶切空载质粒和上述纯化后的目的片段，37℃酶切1h，酶切反应在金属浴或PCR仪中进行，酶切反应体系如下。

pYES2.0酵母表达载体构建所用酶切体系：

1.3.2酶连

酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，并将条带纯化回收，按如下体系配制，在PCR仪中16℃过夜连接。

1.3.3重组质粒验证

将上述连接产物转入大肠杆菌，涂布于含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB固体培养基上进行筛选，待长出菌斑后挑取单克隆进行PCR检测，检测成功的菌液扩繁并提取质粒进行双酶切验证。

2、酵母感受态的制备与转化

2.1酵母菌株的培养

INVSC1酿酒酵母是一种理想的蛋白表达菌株，具有氨苄和卡那抗性，用YPD培养基30℃条件下生长最佳。INVSc1酿酒酵母是His,Leu,Trp和Ura营养缺陷型菌株，因此在缺组氨酸，亮氨酸，色氨酸和尿嘧啶的缺陷型培养基中无法生长。而pYES2.0载体具有氨苄抗性，含有URA3位点，可以在缺尿嘧啶的培养基上生长。因此，可以用添加卡那霉素的缺尿嘧啶的培养基(SC-URA)筛选阳性转化株。

2.2酵母感受态的制备

取活化后的INVSc1酵母菌接种于30mL的YPD液体培养基中，置于30℃摇床中振荡培养至菌液OD₆₀₀＝0.4～0.5，1000g离心5min收集细胞；沉淀用30mL无菌去离子水悬浮后再次离心收集细胞，向沉淀中加入1mL的LiAc(100mM)重悬菌体，感受态细胞制备完成。每100μL分装到一个无菌离心管中，用于转化一个质粒，离心后弃上清置于冰上备用。为保证转化效率，感受态细胞最好现制现用。

2.3醋酸锂法转化酵母

转化操作参照酵母转化试剂盒进行。先按如下体系配制预混液，然后将感受态细胞分别加入到配好的预混液中，反复吹吸使感受态细胞彻底悬浮。在金属浴中30℃孵育30min后42℃热击30min，期间每10min混匀一次。将反应液离心去上清，向沉淀中加入100μL无菌去离子水，混匀后吸取10μL涂布于含有卡那霉素(50μg/mL)的SC-URA固体培养基(含2％葡萄糖)上，30℃倒置培养2～4天。

预混液体系：

2.4重组酵母阳性鉴定

从培养2～4天的SC-URA筛选板上挑取单菌落，接种到3mL SC-URA液体培养基(含2％葡萄糖)中，30℃过夜培养直至菌液浑浊，用表2中带有酶切位点的引物进行PCR检测，鉴定阳性重组子。

因为酵母细胞壁较厚，检测前需进行破壁处理，取1.5mL菌液13000rpm离心1min去上清，然后加入500μL ddH₂O再次离心收集细胞，向沉淀中加入200μL TE缓冲液，置于100℃金属浴中反应10min后-20℃冰浴10min，离心收集上清液用于PCR检测。

2.5转基因酵母的诱导表达

pYES2.0载体以GAL1启动子驱动目的基因的表达，需要用半乳糖诱导重组蛋白的表达。参考张飞、周雅莉的方法诱导转基因酵母的表达。取PCR检测阳性的菌液1mL接种到100mL SC-URA液体培养基(含2％葡萄糖)中，30℃过夜振荡培养。离心收集菌体，用无菌水清洗3次后将菌体转到500mL添加2％半乳糖的SC-URA液体培养基中，用于诱导重组蛋白的表达。30℃振荡培养2～3天，此时菌液OD₆₀₀大约1.0左右，活性较好，然后离心去上清，沉淀用无菌水清洗3次后收集菌体。收集到的酵母细胞用冷冻干燥机处理后研磨成粉末，放入离心管中常温保存，用于后续试验。

3、结果与分析

3.1将克隆得到的目的片段分别与pYES2.0载体相连接，得到含有目的基因的重组质粒，分别转入大肠杆菌用氨苄青霉素筛选并进行PCR检测。PCR鉴定为阳性的单克隆经扩繁后提取质粒进行双酶切验证。图4为用HindⅢ和XhoⅠ对pYES2.0-PfLPAT2-3重组质粒进行双酶切后的结果，获得两条泳带，上面较亮的条带为载体片段，下面较暗的条带是目的基因片段，依据Marker可大致判断载体片段长度在5000～6000bp之间，目的基因片段在1000～1500bp之间，与预期结果一致，因此基本判定含有PfLPAT2-3基因的酵母重组载体构建成功。

将双酶切验证成功的质粒送公司测序比对，结果分析序列正确，无碱基突变，证明紫苏PfLPAT2-3基因已连接到pYES2.0载体上，重组载体构建成功。

3.2将已构建好的pYES2.0-PfLPAT2-3重组质粒转入INVSc1酿酒酵母中，以转pYES2.0空载质粒的酵母为阴性对照。转化后的菌液均匀涂布于含卡那霉素的SC-URA固体培养基(含2％葡萄糖)上进行筛选。挑取单菌落进行PCR检测，鉴定阳性克隆。转基因酵母检测引物用表2中带有酶切位点的引物，转pYES2.0空载的酵母检测使用pYES2.0载体通用引物。PCR检测结果(图5)显示，转pYES2.0空载菌检条带在100～250bp之间，转pYES2.0-PfLPAT2-3重组载体酵母菌检条带在1000～2000bp之间，电泳所得条带均与预期长度一致，说明各重组质粒已成功转入INVSc1酵母中。

实施例3：紫苏PfLPAT2-3基因组成型表达载体的构建及烟草遗传转化

1、植物重组表达载体的构建

本试验所用根癌农杆菌GV3101菌株、pCAMBIA1303空载质粒(图6)保存于山西农业大学分子农业与生物能源研究所，pCAMBIA1303-PfLPAT2-3重组载体的构建及酶切验证步骤参考实施例2中酵母重组载体的构建。所用引物见表3。

表3引物序列

注：下划线表示酶切位点，酶切位点前是保护碱基。

2、农杆菌转化与阳性菌株筛选

2.1根癌农杆菌GV3101菌株的培养

根癌农杆菌GV3101菌株用LB培养基在28℃下培养生长状态最佳。GV3101菌株中包含利福平抗性基因，因此可以在含有利福平的培养基上正常生长。

2.2农杆菌感受态的制备

取活化后的根癌农杆菌接种于50mL含利福平(50μg/mL)的LB液体培养基中，置于28℃摇床中振荡培养至菌液OD₆₀₀＝0.4～0.6，离心收集菌体，沉淀用10mL预冷的NaCl(0.15mol/L)重悬后再次离心，去掉上清后加入10mL含15％甘油的CaCl₂(20mM)重悬细胞，制成感受态细胞。将感受态细胞分装成每管200μL，存于-80℃冰箱备用。

2.3冻融法转化农杆菌

吸取5μL重组质粒加入到200μL感受态细胞中，冰浴5min后置于液氮中冷冻5min，然后转至37℃金属浴中热击5min。待冷却后加入800μL LB液体培养基，28℃慢速振荡培养4h后离心富集菌体，吸取10μL涂布到含利福平(50μg/mL)和卡那(50μg/mL)的固体LB筛选板上，28℃倒置培养48h。

2.4阳性转化株的筛选

从筛选板上挑取单菌落接种于1mL含利福平和卡那的LB培养基中，28℃过夜培养，进行菌液PCR检测，琼脂糖凝胶电泳检测阳性的菌液扩繁后存菌，用于后续试验。检测引物用表3中带酶切位点的引物，PCR检测操作参考实施例1。

3、烟草瞬时表达及检测

3.1农杆菌瞬时转化烟草

本研究所用本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、普通烟草(Variety Sumcum NN(SNN))均由山西农业大学分子农业与生物能源研究所保种。本氏烟草用土培的方式在培养箱中16h光照培养，普通烟草为无菌组培苗，光照培养箱16h光照培养。

将转化成功的含有重组质粒的农杆菌接种于含Rif和Kan的LB液体培养基培养至OD₆₀₀≈0.6，离心收集菌体，用配置好的悬浮液重悬菌体，使菌液OD₆₀₀≈0.2，室温放置2～4h后可用于侵染烟草。

选取生长健壮，叶片鲜绿的烟草植株进行注射。用针头轻轻划破烟草叶片下表皮，将重悬后的菌液注入烟叶中，扩散面积不宜太大。烟草正常生长3天后取样提取RNA，用于PCR鉴定阳性，5天后取样冷冻干燥，用于检测脂肪酸含量及组分的变化。

3.2瞬时表达烟草叶片的检测

取瞬时侵染3天后的烟叶提取RNA，反转录后进行PCR检测，鉴定目的基因是否表达。检测引物用表3中带酶切位点的引物，RNA提取和反转录具体操作参考实施例1，PCR体系和程序参考实施例1。

3.3瞬时转化烟草叶片脂肪酸含量及成分测定

取瞬时侵染5天后的烟叶冷冻干燥，提取总脂肪酸和脂肪酸甲酯，测定总脂和脂肪酸组分变化。具体操作如下：

3.3.1称取冷冻干燥后的烟叶粉末50mg置于50mL离心管中，向其中加入V甲醇:V氯仿＝2:1的混合液7.5mL，37℃100rpm抽提24h后离心收集上层有机相至新的离心管中。向沉淀中再加入V甲醇:V氯仿＝2:1的混合液7.5mL，重复抽提12h后收集上层有机相。再次向沉淀中加入V甲醇:V氯仿＝2:1的混合液5mL，再次抽提12h后收集上层有机相。将3次收集的上层有机相混合后加入5mL氯仿溶液和9mL 1％的NaCl溶液，使得V氯仿:V甲醇:V水＝2:2:1.8，充分混匀后，离心收集下层有机相于干净的已称重的空玻璃指形管(m0)中。放到烘箱中烘干有机试剂，油脂留在指形管壁上，再次称重(m1)。酵母总脂肪酸含量＝(m1-m0)/0.05。每个样品设置3次重复。

3.3.2用Tri 17:0(十七烷酸甘油三酯)作为内标，以加入Tri 17:0的量作为参考，可计算出提取物中其他脂肪酸的含量。

称取冻干烟叶粉末50mg，置于干净的玻璃指形管中，向其中加入50μL的Tri 17:0(10mg/mL)作为内标，加入1mL V_氯仿:V_甲醇＝2:1混合液(含0.001％BHT)，漩涡混匀后低速离心，再加入500μL 0.9％的KCl混匀，然后加入1mL氯仿，漩涡混匀后离心，吸取下层氯仿相转移至一个新的玻璃管中，用氮吹仪吹干后加入500μL含2.5％浓硫酸的甲醇，混匀后置于80℃水浴锅中甲酯化2h。结束后加入500μL正己烷清洗玻璃管，混匀后稍离心使溶液分层，再加入1mL 0.9％的KCl，振荡混匀后再次离心使溶液分层，吸取含有脂肪酸甲酯的上清液于另一干净的玻璃管中，氮吹仪吹干后加入500μL正己烷，使脂肪酸甲酯完全溶解，然后转移至GC小瓶中，存于-20℃冰箱备用。每个样品设置3次重复试验。

4、烟草遗传转化

4.1农杆菌介导的烟草遗传转化

在超净工作台中取30天叶龄长势良好的普通烟草叶片，用无菌手术刀切去叶边缘和主叶脉，将叶片切割成0.5cm²大小的小块，正面朝上平铺于预培养基中，置于培养箱中预培养48h；将转化成功的带有pCAMBIA1303-PfLPAT2-3重组质粒的农杆菌培养至OD600＝0.5～0.6，用于侵染培养后的烟草叶片；预培养后的叶片在菌液中浸泡8min，期间多次搅动增加菌液进入叶片机率，无菌水冲洗2～3次，然后将叶片正面朝上置于一个新的预培养基上，锡箔纸包裹暗培养48h；将叶片转入筛选培养基中进行分化培养，每隔15天更换一次新鲜培养基，直至分化出芽。将每个单独的芽转入生根培养基中，长出根后转入生长培养基中，幼苗长至合适大小进行炼苗移栽。

4.2转基因烟草的鉴定

取转基因烟草叶片，用CTAB法提取DNA，以DNA为模板，加入带酶切位点的引物(表3)进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，检测目的基因是否整合到烟草基因组中。DNA检测成功的植株再次取叶片提取RNA，反转录后进行PCR扩增，检测目的基因是否整合到烟草的转录组中。PCR体系和程序参考实施例1。

4.3转基因烟草脂肪酸含量及组分测定

取鉴定成功的转基因烟草植株的叶片，冷冻干燥后研磨成粉末，提取总脂和脂肪酸甲酯，用于脂肪酸含量和组分测定，具体操作参考本实施例步骤3.3。

5、结果与分析

5.1如图7所示，为XbaⅠ和KpnⅠ双酶切pCAMBIA1303-PfLPAT2-3重组质粒，根据Marker的位置判断双酶切后载体片段长度大致在12000bp以上，目的基因片段长度在1000～1500bp之间，与预期结果一致，据此认为含有目的基因的植物表达载体构建成功。

将双酶切验证成功的质粒送公司测序比对，结果分析序列正确，无碱基突变，证明紫苏PfLPAT2-3基因已成功连接到pCAMBIA1303载体上，重组载体构建成功。

5.2利用冻融法将构建好的pCAMBIA1303-PfLPAT2-3重组表达载体及pCAMBIA1303空载体转入农杆菌中，挑取筛选板上的单菌落进行PCR验证，结果(图8)显示，电泳条带所在位置与预期一致，农杆菌转化成功。

5.3取瞬时侵染3天后的烟草叶片，提取RNA反转录后用表3中的引物进行PCR扩增，凝胶电泳检测目的基因的表达，结果(图9)显示，电泳条带与目的基因长度一致，说明瞬时转化基因表达成功。

5.4取瞬时转化5天后的烟草叶片，真空冷冻干燥后研磨成粉末，提取总脂，分析瞬时转化后烟叶的总脂含量变化。结果(图10)显示，相对于转空载的烟草叶片，转PfLPAT2-3基因的烟草叶片总脂含量显著增加，增加了3.2％，说明紫苏PfLPAT2-3基因的表达促进了烟叶总脂肪酸的积累。

同时提取脂肪酸甲酯，分析瞬时转化后烟叶的脂肪酸组分变化，结果显示，以转空载为对照组，转PfLPAT2-3烟草叶片的脂肪酸组成没有变化，脂肪酸组分占比发生改变，其中C18:1提高8.37％，C18:3的所占比例增高2.46％，C16:0明显下降，其他组分无明显变化。

5.5用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，潮霉素作为筛选标记，进行烟草的遗传转化(图11)，将PfLPAT2-3转入到烟草中，取转基因植株的叶片，提取DNA，PCR检测为阳性的植株，再提取叶片RNA，反转录后进行PCR扩增，电泳检测目的基因的表达，结果(图12)显示电泳条带与目的基因长度一致，说明目的基因已经成功整合到烟草的转录组中。

5.6提取转基因烟草T₀代叶片的总脂肪酸和脂肪酸甲酯，进行总脂含量和脂肪酸组分分析。总脂含量分析结果(图13)显示，与转空载叶片相比，转PfLPAT2-3叶片总脂肪酸含量明显提高，平均值提高了2.52％。脂肪酸组分分析结果(图14)显示，转PfLPAT2-3叶片与转空载叶片的脂肪酸组分一样，但转PfLPAT2-3烟叶中C18:1和C18:3含量升高明显，分别提高了11.84％和1.69％，C16:0和C18:0含量下降明显，C18:2略有下降，其他组分无明显变化。这些结果与对转PfLPAT2-3重组酵母外源添加脂肪酸的结果基本一致，进一步说明紫苏PfLPAT2-3对C18:1酰基底物具有偏好性。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 山西农业大学

<120> 紫苏PfLPAT2-3基因在提高植物总脂含量中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1149

<212> DNA

<213> 紫苏

<400> 1

atggcgatcc cagccgcgat tgttgttgtg ccgttaggtg ttctcttctt ctgttctggg 60

ctcgtcgtta atctaatcca ggcagtgtgt tatgtgctaa taaggccttt gtcaaagaac 120

acttaccgga ggataaacag gcaggtggca gaacttttat ggcttgagct cgtgtggctg 180

atcgactggt gggctagtct caagattgaa ttgcacactg attctgaaac cttcaaattg 240

atgggtaaag aacacgcact cctcatatgt aaccacaaga gtgacattga ttggcttgtt 300

ggatgggttt tggctcagcg ttctggttgc cttggtagca ctttggctgt aatgaagaaa 360

tcatcaaagc tccttcctgt cataggatgg tctatgtggt tctctgagta tctctttctt 420

gaaagaagct gggcaaagga tgagaacacc ttaaagtcag gacttcaacg gctaagggat 480

ttccctctac cattttggct ggcacttttt gttgagggaa ctcgcttcac cgaggcaaaa 540

cttttagctg ctcaagaata tgcatcctca tcagggctac cagttccaag aaatgtgttg 600

attcctcgaa ctaagggttt tgtaacagct gtaagtcata tgcgttcatt tgttccagcc 660

atatatgatg taacagttgc tattcccaag gcatctcctc aaccaaccat gctaagactt 720

tttaaaggac agtcttctgt ggttcatgta cacctaaagc gacatttgat gaaggatttg 780

ccagaaacag atgaagcggt tgctcaatgg tgtagagatg cctttgtagc aaaggataag 840

ttattggaca aacatattgc tgagggttcc ttaggtgaaa gacagcaaga gattgggcgt 900

ccattgaagt cccttttggt ggtctgttct tgggccattt tcctcatttt gggggctttg 960

aaagttttcc agcggacctc aatcttctct tcatggaaag gcatcacatt ttcagcgatt 1020

tgtttagcaa tcgtcacagt tctcatgcaa atcttgattc agttctctaa agctgagaag 1080

tcgacccctg ccagaatcgc cccagcaagt gggggagaaa cctcaacaag acaagacaga 1140

cagcggtaa 1149

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcgatcc cagccgcgat tg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccgctgtctg tcttgtcttg tt 22

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttaagcttat ggcgatccca gccgcgattg 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgctcgagcc gctgtctgtc ttgtcttgtt 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

actctagaat ggcgatccca gccgcgattg 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcggtacccc gctgtctgtc ttgtcttgtt 30

Claims

1.紫苏PfLPAT2-3基因在提高烟草脂肪酸含量中的应用，其特征在于，所述脂肪酸为C18:1或C18:3，通过使烟草包含紫苏PfLPAT2-3基因或使烟草表达紫苏PfLPAT2-3基因编码的蛋白，提高烟草叶片中C18:1或C18:3含量；

所述紫苏PfLPAT2-3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，。

2.根据权利要求1所述的紫苏PfLPAT2-3基因在提高烟草脂肪酸含量中的应用，其特征在于，具体过程包括：扩增紫苏PfLPAT2-3基因，将该基因连接到植物表达载体上，并转化感受态细胞，制得包含该基因的重组质粒，将重组质粒侵染烟草，使该基因在烟草中得以表达。

3.根据权利要求2所述的紫苏PfLPAT2-3基因在提高烟草脂肪酸含量中的应用，其特征在于，扩增紫苏PfLPAT2-3基因的模板为紫苏开花后20天种子的cDNA。

4.根据权利要求3所述的紫苏PfLPAT2-3基因在提高烟草脂肪酸含量中的应用，其特征在于，扩增紫苏PfLPAT2-3基因的引物如SEQ ID NO.2-3所示。

5.根据权利要求4所述的紫苏PfLPAT2-3基因在提高烟草脂肪酸含量中的应用，其特征在于，植物表达载体为pCAMBIA1303载体。

6.根据权利要求5所述的紫苏PfLPAT2-3基因在提高烟草脂肪酸含量中的应用，其特征在于，感受态细胞为根癌农杆菌GV3101。