CN110055273B

CN110055273B - GhMAH1蛋白及其编码基因在调控棉花纤维长度中的应用

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Publication number: CN110055273B
Application number: CN201910307584.XA
Authority: CN
Inventors: 马建江; 于霁雯; 裴文锋; 马启峰; 刘记; 崔宇鹏; 吴嫚; 李丹; 喻树迅
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2039-04-17
Also published as: CN110055273A; AU2020100575A4

Abstract

本发明公开了GhMAH1蛋白及其编码基因在调控棉花纤维长度中的应用。本发明从陆地棉长纤维材料Msco‑12中克隆得到棉花GhMAH1基因，成功构建了病毒诱导GhMAH1基因沉默载体，并转化Msco‑12棉花，获得5个GhMAH1基因沉默棉花阳性单株。5个GhMAH1基因沉默棉花阳性单株成熟棉纤维平均长度为22.20mm，而3个对照单株棉纤维平均长度为25.47mm，与对照相比，GhMAH1基因的表达被抑制后，棉纤维平均长度显著降低了12.83％。说明GhMAH1基因可调控棉纤维长度，在改良棉花纤维品质及棉花育种中具有重要价值。

Description

GhMAH1蛋白及其编码基因在调控棉花纤维长度中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及GhMAH1蛋白及其编码基因在调控棉花纤维长度中的应用。

背景技术

棉花是重要的经济作物，其为人类提供最重要的天然纺织材料。我国是世界上棉花年均总产量最高的国家，然而我国棉花纤维品质较美国等一些国家还存在一定差距。因此改良棉花纤维品质性状(尤其是棉花纤维长度性状)是棉花育种工作的重点。

棉花纤维细胞是目前世界上公认最长的单细胞，其发育过程包含四个阶段，起始伸长期(0-7天)、快速伸长期(5-25天)、细胞壁加厚期(20-35天)和脱水成熟期(35-50天)(Pang et al.,2010；Ma et al.,2016)。其中纤维的快速伸长期决定最终纤维长度(Kim etal.,2001；Lee et al.,2007；Singh et al.,2009)。烷烃羟化酶MAH1-like是细胞色素P450家族的成员，在次级醇或酮的生物合成中起着重要作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何调控棉花纤维长度。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了GhMAH1蛋白质的新用途。

本发明提供了GhMAH1蛋白质在调控棉花纤维长度中的应用。

所述GhMAH1蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了与GhMAH1蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与GhMAH1蛋白质相关的生物材料在调控棉花纤维长度中的应用。

所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码GhMAH1蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GhMAH1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码GhMAH1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GhMAH1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码GhMAH1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GhMAH1蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述应用中，所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。

本发明还提供了上述GhMAH1蛋白质或上述生物材料在培育纤维长度提高的转基因棉花中的应用。

本发明还提供了上述GhMAH1蛋白质或上述生物材料在培育纤维长度降低的转基因棉花中的应用。

本发明还提供了上述GhMAH1蛋白质或上述生物材料在棉花育种中的应用。

上述应用中，所述调控为提高或降低。所述调控具体体现在：当棉花中的GhMAH1蛋白质的表达量和/或活性降低时，所述棉花纤维长度降低；当棉花中的GhMAH1蛋白质的表达量和/或活性提高时，所述棉花纤维长度提高。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育纤维长度降低的转基因棉花的方法。

本发明提供的培育纤维长度降低的转基因棉花的方法包括降低受体棉花中GhMAH1蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因棉花的步骤；所述转基因棉花的纤维长度短于所述受体棉花。

上述方法中，所述降低受体棉花中GhMAH1蛋白质的表达量和/或活性可通过现有技术中的常规方法来实现，如敲除受体棉花中GhMAH1蛋白质的编码基因、抑制受体棉花中GhMAH1蛋白质的编码基因的表达、沉默受体棉花中GhMAH1蛋白质的编码基因等。

在本发明的具体实施例中，所述降低受体棉花中GhMAH1蛋白质的表达量和/或活性是通过沉默所述受体棉花中GhMAH1蛋白质的编码基因来实现；

所述GhMAH1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子；

进一步的，沉默所述受体棉花中GhMAH1蛋白质的编码基因方法是通过向受体棉花中导入GhMAH1基因沉默载体和辅助载体来实现。

更进一步的，所述GhMAH1基因沉默载体具体为将VIGs-GhMAH1片段插入pCLCrVA载体的SpeI和AscI酶切位点间，且保持pCLCrVA载体的其他序列不变后得到的；所述VIGs-GhMAH1片段为序列1第472-708位所示的DNA分子。

所述辅助载体具体为pCLCrVB载体。

上述GhMAH1基因沉默载体或VIGs-GhMAH1片段也属于本发明的保护范围。

上述GhMAH1基因沉默载体或VIGs-GhMAH1片段在培育纤维长度降低的转基因棉花中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用或方法中，所述棉花可为现有技术中的常见品种。在本发明的具体实施例中，所述棉花品种为陆地棉Msco-12。

本发明从陆地棉长纤维材料Msco-12中克隆得到棉花GhMAH1基因，成功构建了病毒诱导GhMAH1基因沉默载体，并转化陆地棉Msco-12，共获得5个GhMAH1基因沉默棉花阳性单株。实验结果表明：通过病毒诱导基因沉默的手段抑制GhMAH1基因在棉花纤维中的表达能显著降低棉花纤维长度。5个GhMAH1基因沉默棉花阳性单株成熟棉纤维平均长度为22.20mm，而3个对照单株棉纤维平均长度为25.47mm，纤维长度较对照显著减少了12.83％。说明GhMAH1基因可调控棉纤维长度，在改良棉花纤维品质及棉花育种中具有重要价值。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳检测GhMAH1基因。

图2为琼脂糖凝胶电泳检测VIGs-GhMAH1(237bp)目的序列。

图3为VA引物检测结果。其中，1-3为对照植株，4-8为GhMAH1基因沉默棉花阳性单株。

图4为VB引物检测结果。其中，1-3为对照植株，4-8为GhMAH1基因沉默棉花阳性单株。

图5为qRT-PCR检测GhMAH1基因在GhMAH1基因沉默棉花中的表达量。

图6为GhMAH1基因沉默棉花单株的纤维长度测定。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的试验材料Msco-12记载于文献“Genetic variation of dynamicfiber elongation and developmental quantitative trait locus mapping of fiberlength in upland cotton(Gossypium hirsutum L.)”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的载体pCLCrVA(以下简称VA)和辅助载体pCLCrVB(以下简称VB)均记载于文献“A versatile system for functional analysis of genes and microRNAsin cotton)”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的农杆菌LBA4404(AC1030)是上海唯地生物技术有限公司的产品。

下述实施例中所涉及的实验材料如下：

酶及试剂盒：植物总RNA提取试剂盒(DP432)和DNA Marker III(MD103)试剂均是天根生化(科技)北京有限公司的产品；RNA反转录试剂盒TransScript One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis SuperMix(AT311-02)，荧光定量酶TransStart Top GreenqPCR SuperMix(AQ131-04)，克隆载体pEASY-T5Zero Cloning Kit(CT501-01)，质粒提取试剂盒EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit(EM111-01)，PCR扩增酶(AP111-02)和EB替代物GelStain(GS101-03)均是北京全式金生物技术有限公司的产品；高保真PCR扩增酶KOD-Plus-Neo(KOD-401)是TOYOBO生物公司的产品；Gel Extraction Kit胶回收试剂盒是Omega生物公司的产品；DNA Purification Kit PCR产物纯化试剂盒和PrimeScriptTMRTase RNA反转录试剂盒均是TaKaRa生物公司的产品；T4DNA连接酶(C301-01)是诺唯赞生物技术有限公司的产品；RNAprep pure酵母总RNA提取试剂盒是Promega公司的产品；实验所用引物在北京GENEWIZ生物公司合成；大肠杆菌感受态菌体(Escherichia coli)DH5α是上海生工的产品；限制性内切酶SpeI，AscI均是NEB公司的产品。

其他药品：琼脂糖是北京全式金生物技术有限公司的产品；蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠均为国产分析纯；氨苄青霉素(IA0340)、卡那霉素(YZ-130556)、利福平(IR0110)，链霉素(IS0360)均是北京索莱宝科技有限公司的产品。

下述实施例中提到的但未列出的各种试剂均按《分子克隆实验指南》第三版上的方法配制，生化试剂均为分析纯或以上级。

下述实施例中所涉及的培养基配方如下：LB液体培养基：溶剂为水，溶剂及其浓度分别如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L；LB固体培养基：溶剂为水，溶剂及其浓度分别如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L、琼脂粉15g/L；LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板。

下述实施例中所涉及的主要仪器如下：PCR扩增仪(BIO-RAD)、高速离心机(Hettich MIKRO 200R)、电泳设备(BIO-RAD)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、荧光定量PCR仪(ABI7500)。纤维长度测定用中国农业科学院棉花研究所农业部质量检测中心的HVI大容量棉花纤维测试仪(HVI 900)完成。

实施例1、GhMAH1基因的克隆

(1)试验材料的获得

试验材料Msco-12种植于中国农业科学院棉花研究所试验地，按常规方法进行大田管理。所取组织为开花后10、15、20和25天的纤维，所取材料迅速放入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用。

(2)RNA的提取

采用天根公司试剂盒提取植物总RNA。

(3)cDNA的获得

以提取的各时期棉花纤维混合总RNA(500ng)为模板，利用全式金的反转录试剂盒将其反转录为cDNA。反应体系如表1所示。反应过程在PCR仪器内先25℃温育10min，然后42℃反应30min，最后85℃保留5s失活。保存4℃备用。将反转录产物cDNA溶液稀释5倍作为PCR反应模板。

表1、cDNA合成体系

Total RNA	500ng
		Anchored Oilgo(dT)<sub>18</sub>Primer(0.5ug/μl)	1μL
Random Primer(0.1ug/μl)	1μL
		2×TS Reaction Mix	10μL
TranScript RT/RI Enzyme Mix	1μL
		gDNA Remover	1μL
RNase-free Water	x
		Total volume	20μL

(4)目的基因的扩增：以步骤(3)获得的cDNA为模板，采用引物GhMAH1-ORF-F和GhMAH1-ORF-R进行PCR，得到PCR产物，引物序列如下：

GhMAH1-ORF-F：5′-ATGGCGTTTGTGGGTATTCTTG-3’；

GhMAH1-ORF-R：5′-TTAGTCCCATCTGCTAGAAACCC-3’。

PCR反应体系如表2所示。PCR反应程序如表3所示。

表2、目的基因GhMAH1开放阅读框全长序列扩增体系

组分	体积
		dd H<sub>2</sub>0	31μL
10×PCR Buffer for KOD-PLUS-Neo	5μL
		2mM dNTPs	5μL
25mM MgSO<sub>4</sub>	3μL
		正向引物	1.5μL
反向引物	1.5μL
		模板	2μL
KOD-Plus-Neo	1μL
		Total	50μL

表3、PCR反应程序

Step1	预变性	94℃,2min
			Step2	变性	98℃,10s
Step3	退火	58℃,30s
			Step4	延伸	68℃,90s
Step5	延伸	68℃,10min

备注：从Step4到step3进行35次循环扩增

(5)PCR产物的检测

反应结束后4℃保存，用1％的琼脂糖电泳进行检测，条带大小符合预期设计则视为有效结果(图1)。对目的片段运用胶回收试剂盒进行切胶回收，并将胶回收的产物连接克隆载体pEASY-T5，然后转化大肠杆菌感受态DH5α。37℃过夜培养从Amp抗性LB培养基上挑取单克隆到含有Amp的600μL LB培养基中，37℃摇菌培养5h后进行菌液PCR验证，送含有目的基因片段大小条带的菌液测序。

测序结果表明：PCR扩增得到大小为1512bp的条带，其核苷酸序列如序列1所示，将序列1所示的基因命名为GhMAH1基因，自5’端1-1512位为ORF，GhMAH1基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示，将序列2所示的蛋白命名为GhMAH1蛋白。

实施例2、GhMAH1基因在提高棉花纤维长度中的应用

一、GhMAH1基因沉默棉花的获得及鉴定

1、病毒诱导GhMAH1基因沉默载体的构建

(1)引物的设计

根据终载体VA的图谱设计SpeI-AscI为插入位点并合成引物，引物序列如下：

VIGsGhMAH1-SpeI-F(含酶切位点SpeI)：5’-ATGCCTGCAGACTAGTGAACATGTCGCCAAACGAGG-3’；

VIGsGhMAH1-AscI-R(含酶切位点AscI)：5’-TAGACCTAGGGGCGCGCCATGCTCTTGCCCCATGTTGA-3’。

(2)VIGs-GhMAH1(237bp)的扩增

以测序正确的GhMAH1大肠杆菌单克隆菌液为模板，采用步骤(1)中设计的引物进行PCR扩增，得到PCR产物，该PCR产物即为长度为237bp的VIGs-GhMAH1片段(VIGs-GhMAH1片段为序列1第472-708位)。PCR反应体系如表4所示。PCR反应程序如表5所示。PCR产物的电泳检测结果如图2所示。

表4、VIGs-GhMAH1序列扩增体系

Components	Volume
		dd H<sub>2</sub>0	31μL
10×PCR Buffer for KOD-PLUS-Neo	5μL
		2mM dNTPs	5μL
25mM MgSO<sub>4</sub>	3μL
		正向引物	1.5μL
反向引物	1.5μL
		模板	2μL
KOD-Plus-Neo	1μL
		Total	50μL

表5、PCR反应程序

Step1	预变性	94℃,2min
			Step2	变性	98℃,10s
Step3	退火	56℃,30s
			Step4	延伸	68℃,20s
Step5	延伸	68℃,10min

备注：从Step4到step3进行35次循环扩增

(3)重组载体的构建

用限制性内切酶SpeI和AscI分别对VA载体和步骤(2)获得的VIGs-GhMAH1片段进行双酶切，然后纯化回收线性化的VA载体和VIGs-GhMAH1片段。用T4连接酶将VIGs-GhMAH1片段与线性化的VA载体融合构建病毒载体并转化大肠杆菌感受态DH5α，在含有卡那霉素的LB固体培养基中过夜生长并挑取单克隆，摇菌并送测序。将测序正确的载体命名为VA::VIGs-GhMAH1(237bp)重组载体。

VA::VIGs-GhMAH1(237bp)重组载体为将VIGs-GhMAH1片段(VIGs-GhMAH1片段为序列1第472-708位)插入VA载体的SpeI和AscI酶切位点间，且保持VA载体的其他序列不变后得到的载体。

2、重组菌的构建

把测序正确的单克隆菌液在10mL的含有卡那霉素的LB培养基中扩繁8h，提取VA::VIGs-GhMAH1(237bp)重组质粒。

将提取的VA::VIGs-GhMAH1(237bp)重组质粒转化农杆菌感受态(LBA4404)，得到重组菌VA::VIGs-GhMAH1(237bp)/LBA4404。

将空载体对照VA转化农杆菌感受态(LBA4404)，得到重组菌VA/LBA4404。

将辅助载体VB转化农杆菌感受态(LBA4404)，得到重组菌VB/LBA4404。

具体转化过程如下：

a.根癌农杆菌LBA4404感受态细胞100μL中加入质粒1μg，混匀后冰浴30min；液氮速冻75s，37℃热激2～6min；

b.冰浴5min，再加入600μL LB液体培养基；

c.190rpm，28℃，培养4h后取100μL菌液涂在含有卡那霉素、链霉素和利福平的LB筛选培养基上，28℃培养大约36～48h，抗性菌落可见；

d.挑选阳性克隆，在LB液体培养基上28℃培养48h，甘油终浓度在15％左右，-20℃保存备用。

3、GhMAH1基因沉默棉花的获得

采用幼叶注射法将步骤2制备的重组菌转化棉花，得到转基因棉花。具体步骤如下：

a.吸取50μL的重组菌菌液(重组菌VA::VIGs-GhMAH1(237bp)/LBA4404、重组菌VA/LBA4404、重组菌VB/LBA4404)在含有利福平、卡那霉素和链霉素的抗性筛选的LB液体培养基中，28℃，190rpm过夜培养约16小时，可见菌液颜色变黄。测定OD₆₀₀值1.5-2.0(久置的菌液最好先活化再扩摇)。

b.菌液回收：4000rpm离心10min，转化介质调节OD₆₀₀＝1.5。转化介质的配置如表6所示。

表6、转化介质的配置

c.菌液室温(25℃)静置3h(时间可增长，可以增加转化效率)。

d.将步骤c获得的重组菌菌液VA::VIGs-GhMAH1(237bp)/LBA4404和重组菌菌液VB/LBA4404按照体积比为1:1比例混匀，得到实验组注射液；

将步骤c获得的重组菌菌液VA/LBA4404和重组菌菌液VB/LBA4404按照体积比为1:1比例混匀，得到对照组注射液。

e.用种植约两周后的Msco-12棉花材料，拿针头划伤子叶背面，用无针注射器将注射液注入(注射液的注入量约为1mL)。

f.注射后的棉花植株黑暗过夜培养之后，置于25℃棉花培养室16/8小时光照周期培养。

4、GhMAH1基因沉默棉花的鉴定

(1)PCR鉴定GhMAH1基因沉默棉花阳性单株

对病毒侵染45天后的棉花取其倒三叶提取DNA并进行PCR检测。反应体系如表7所示。反应程序如表8所示。引物序列如下：

VA-F：5’-ATTTTGCGCCTGACTAGCCT-3’；

VA-R：5’-CGAATTTTCAACGTTGCATACA-3’；

VB-F：5’-ATGTACAGTTTAAAGAGTAGACG-3’；

VB-R：5’-ATTATCCAATATAATCAAGGTCATAC-3’。

表7、VIGs-GhMAH1阳性单株检测PCR体系

组分	体积
		dd H<sub>2</sub>O	6.10μL
10×EasyTaq Buffer	5.00μL
		2.5mM dNTP	4.00μL
正向引物	0.50μL
		反向引物	0.50μL
模板	1.00μL
		EasyTaq DNA聚合酶	0.10μL
Total	10μL

表8、PCR反应程序

Step1	预变性	94℃,3min
			Step2	变性	94℃,30s
Step3	退火	56℃,30s
			Step4	延伸	68℃,70s
Step5	延伸	68℃,5min

备注：从Step4到step3进行35次循环扩增

VA引物扩增得到大小为451bp，且VB引物扩增得到大小为771bp的单株为GhMAH1基因沉默棉花阳性单株；VA引物扩增得到大小为214bp，且VB引物扩增得到大小为771bp的单株为对照单株。检测结果如图3和图4。最终共得到3个对照单株和5个阳性单株。

(2)qRT-PCR检测GhMAH1基因在GhMAH1基因沉默棉花中的沉默效率

在3个对照单株和5个阳性单株开花期当天进行挂牌，取开花后20天的纤维，提取RNA并反转录，用qRT-PCR的方法检测GhMAH1基因在GhMAH1基因沉默棉花中的沉默效率。

qRT-PCR反应体系为：2×TransStar Top/Tip Green qPCR SuperMix 10μL、Forward Primer(10μM)0.4μL、Reverse Primer(10μM)0.4μL、Passive Reference Dye(50×)0.4μL、Template cDNA 2μL、RNase-Free Water up to 20μL。

qRT-PCR反应程序：预变性94℃(30s)；变性94℃(5s)，退火58℃(15s)，延伸72℃(12s)，45个循环。

融解曲线分析：95℃(15s)，60℃(1min)，95℃(15s)，10℃(2min)。

荧光定量引物序列如下：

qRT-GhMAH1-F：5’-GTTGGGTGCTGAAGAGGTGA-3’；

qRT-GhMAH1-R：5’-TGGCCACTGGGAAGAATGTC-3’；

qRT-18S-F：5’-TTAGTTGGTGGAGTGATTTG-3’；

qRT-18S-R：5’-GGTGGCTCTGTCAGTGTAG-3’。

结果如图5所示。结果表明：GhMAH1基因在5个阳性单株中的平均表达量较3个对照单株平均表达量显著下降了90.68％。

三、GhMAH1基因沉默棉花纤维长度测定

测定5个GhMAH1基因沉默棉花阳性单株和3个对照单株的纤维长度。具体步骤如下：每个单株收获位于棉花植株中部位置的棉铃，并分别进行单铃纤维长度测定，每个单株分别测3个中部单铃纤维长度，平均值代表该单株纤维长度。纤维长度测定使用中国农业科学院棉花研究所农业部质量检测中心的HVI大容量棉花纤维测试仪(HVI 900)完成，按照仪器使用说明书进行操作。

结果表明：3个对照单株的纤维长度分别为26.3mm、24.9mm和25.2mm，3个对照单株的纤维平均长度为25.47mm。而GhMAH1基因沉默后的5个阳性单株的纤维长度分别为21.5mm、22.7mm、23.6mm、23.6mm和19.6mm，5个阳性单株的纤维平均长度为22.2mm(图6)。与对照相比，GhMAH1基因的表达被抑制后，棉纤维平均长度显著降低了12.83％。说明GhMAH1基因可调控棉花纤维长度。

序列表

<110>中国农业科学院棉花研究所

<120>GhMAH1蛋白及其编码基因在调控棉花纤维长度中的应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1521

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atggcgtttg tgggtattct tgaaatttta attgctttca tttgctttgt atttctggga 60

tgcctgaaaa atagtaaaga tgggcagcca attaatttcc cactagtggg gatgatgccg 120

cagctcttac tcaacgttca ccggatccac gattggtgca ctgagattct ccaaatgtgc 180

cattgcactt cacttttcat aggcccttgg ttcactcaga tgaacttctt gttgacctgc 240

gaccccgcca acgtccacta cgtcatgatt tccaacttcc acaacttccc caaaggatcc 300

gacttcaagg agattttcga aatcttgggc gacggcattt tcaacgccga catggatttg 360

tggaaatacc agaggaaagt cgctcaagaa ttcgttaggc atcagctttt ccaccgactg 420

ttgtcgacaa ctagtcgagc caaggtggaa aacgggctaa ttcccgttct cgaacatgtc 480

gccaaacgag gcttggtggt caacttagaa gatgttctcc agaggtttac atttgattct 540

accttcatct tatttactgg caacgacccc gaaagcctct ccgttgactt ccctgaagtt 600

catttctcca aggccctgga tgatgcagaa gaagccttgt tttatcggct tgcaaggcct 660

caaagcttta ttaagctgca aaaatggctc aacatggggc aagagcataa atacagaaag 720

gcgtgggaag ttcttgatga tgtaatagca aaatgcataa accagaggag gaaagaactg 780

aaccaagggt tgaccaaaga agcagaccaa gtagagggta ttgatctttt aacgtcatac 840

ataacccaag agaaagcaac aggtttgaaa tgtaatgaca agttcttgag agacaccatt 900

ttgaatatga tgattgcagg gagggacacc acgagctcag ctctcacttg gttcatttgg 960

ttggtttcga ggcatcccaa agtggagaaa aagatcatag aagagcttcg atcaaaaata 1020

cccgaaaagg aaaccaaaaa gaggcgagtg ttgggtgctg aagaggtgaa agatttggtt 1080

tatttacatg gagcattgtg tgaggcacta aggttatatc cctcggttcc tttccagctc 1140

aaggaaccat tgaaagcaga cattcttccc agtggccatc cagttcatcc aaagatgaaa 1200

atcatgttta acttgtattc aatgggaaga atgaagtcaa tatggggtga agattcatac 1260

gaattcaagc ctgaaagatg gattacagag cgaggaggga ttaaatacga ggcatcaacc 1320

aagttcttgt ctttcaatgc aggtccaagg atatgcgtag ggaaaaaagt ggcgtttgtt 1380

ataatgaaaa ctgtggcatc tgctattatc tacaattatc gtataaatgt gttggaagaa 1440

acacctgttg ttccagctgc ctccattata cttcacacca aggatggatt aatggctagg 1500

gtttctagca gatgggacta a 1521

<210>2

<211>506

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Ala Phe Val Gly Ile Leu Glu Ile Leu Ile Ala Phe Ile Cys Phe

1 5 10 15

Val Phe Leu Gly Cys Leu Lys Asn Ser Lys Asp Gly Gln Pro Ile Asn

20 25 30

Phe Pro Leu Val Gly Met Met Pro Gln Leu Leu Leu Asn Val His Arg

35 40 45

Ile His Asp Trp Cys Thr Glu Ile Leu Gln Met Cys His Cys Thr Ser

50 55 60

Leu Phe Ile Gly Pro Trp Phe Thr Gln Met Asn Phe Leu Leu Thr Cys

65 70 75 80

Asp Pro Ala Asn Val His Tyr Val Met Ile Ser Asn Phe His Asn Phe

85 90 95

Pro Lys Gly Ser Asp Phe Lys Glu Ile Phe Glu Ile Leu Gly Asp Gly

100 105 110

Ile Phe Asn Ala Asp Met Asp Leu Trp Lys Tyr Gln Arg Lys Val Ala

115 120 125

Gln Glu Phe Val Arg His Gln Leu Phe His Arg Leu Leu Ser Thr Thr

130 135 140

Ser Arg Ala Lys Val Glu Asn Gly Leu Ile Pro Val Leu Glu His Val

145 150 155 160

Ala Lys Arg Gly Leu Val Val Asn Leu Glu Asp Val Leu Gln Arg Phe

165 170 175

Thr Phe Asp Ser Thr Phe Ile Leu Phe Thr Gly Asn Asp Pro Glu Ser

180 185 190

Leu Ser Val Asp Phe Pro Glu Val His Phe Ser Lys Ala Leu Asp Asp

195 200 205

Ala Glu Glu Ala Leu Phe Tyr Arg Leu Ala Arg Pro Gln Ser Phe Ile

210 215 220

Lys Leu Gln Lys Trp Leu Asn Met Gly Gln Glu His Lys Tyr Arg Lys

225 230 235 240

Ala Trp Glu Val Leu Asp Asp Val Ile Ala Lys Cys Ile Asn Gln Arg

245 250 255

Arg Lys Glu Leu Asn Gln Gly Leu Thr Lys Glu Ala Asp Gln Val Glu

260 265 270

Gly Ile Asp Leu Leu Thr Ser Tyr Ile Thr Gln Glu Lys Ala Thr Gly

275 280 285

Leu Lys Cys Asn Asp Lys Phe Leu Arg Asp Thr Ile Leu Asn Met Met

290 295 300

Ile Ala Gly Arg Asp Thr Thr Ser Ser Ala Leu Thr Trp Phe Ile Trp

305 310 315 320

Leu Val Ser Arg His Pro Lys Val Glu Lys Lys Ile Ile Glu Glu Leu

325 330 335

Arg Ser Lys Ile Pro Glu Lys Glu Thr Lys Lys Arg Arg Val Leu Gly

340 345 350

Ala Glu Glu Val Lys Asp Leu Val Tyr Leu His Gly Ala Leu Cys Glu

355 360 365

Ala Leu Arg Leu Tyr Pro Ser Val Pro Phe Gln Leu Lys Glu Pro Leu

370 375 380

Lys Ala Asp Ile Leu Pro Ser Gly His Pro Val His Pro Lys Met Lys

385 390 395 400

Ile Met Phe Asn Leu Tyr Ser Met Gly Arg Met Lys Ser Ile Trp Gly

405 410 415

Glu Asp Ser Tyr Glu Phe Lys Pro Glu Arg Trp Ile Thr Glu Arg Gly

420 425 430

Gly Ile Lys Tyr Glu Ala Ser Thr Lys Phe Leu Ser Phe Asn Ala Gly

435 440 445

Pro Arg Ile Cys Val Gly Lys Lys Val Ala Phe Val Ile Met Lys Thr

450 455 460

Val Ala Ser Ala Ile Ile Tyr Asn Tyr Arg Ile Asn Val Leu Glu Glu

465 470 475 480

Thr Pro Val Val Pro Ala Ala Ser Ile Ile Leu His Thr Lys Asp Gly

485 490 495

Leu Met Ala Arg Val Ser Ser Arg Trp Asp

500 505

Claims

1.GhMAH1蛋白质在调控棉花纤维长度中的应用；

所述GhMAH1蛋白质为氨基酸序列是序列2所示的蛋白质。

2.与GhMAH1蛋白质相关的生物材料在调控棉花纤维长度中的应用；

所述GhMAH1蛋白质为氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

所述生物材料为下述A1）至A12）中的任一种：

A1）编码GhMAH1蛋白质的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；

A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；

A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；

A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；

A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物；

A9）含有A1）所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10）含有A2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11）含有A3）所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12）含有A4）所述重组载体的转基因植物细胞系。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1）所述核酸分子为序列1所示的DNA分子。

4.权利要求1中所述的GhMAH1蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在培育纤维长度提高的转基因棉花中的应用。

5.权利要求1中所述的GhMAH1蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在培育纤维长度降低的转基因棉花中的应用。

6.权利要求1中所述的GhMAH1蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在棉花育种中的应用。

7.一种培育纤维长度降低的转基因棉花的方法，包括降低受体棉花中权利要求1中所述的GhMAH1蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因棉花的步骤；所述转基因棉花的纤维长度短于所述受体棉花。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述降低受体棉花中权利要求1中所述的GhMAH1蛋白质的表达量和/或活性的方法是通过沉默所述受体棉花中权利要求1中所述的GhMAH1蛋白质的编码基因来实现；所述GhMAH1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：沉默所述受体棉花中权利要求1中所述的GhMAH1蛋白质的编码基因方法是通过向受体棉花中导入GhMAH1基因沉默载体和辅助载体来实现；

所述GhMAH1基因沉默载体为将VIGs-GhMAH1片段插入pCLCrVA载体的SpeI和AscI酶切位点间，且保持pCLCrVA载体的其他序列不变后得到的；

所述VIGs-GhMAH1片段为序列1第472-708位所示的DNA分子；

所述辅助载体为pCLCrVB载体。

10.权利要求9中所述的GhMAH1基因沉默载体。

11.权利要求9中所述的VIGs-GhMAH1片段。

12.权利要求10所述的GhMAH1基因沉默载体或权利要求11所述的VIGs-GhMAH1片段在培育纤维长度降低的转基因棉花中的应用。