CN111704659B - 根结线虫ralf蛋白质、编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了根结线虫RALF蛋白质、编码基因及其应用，包括a1)或a2)或a3)或a4)或a5)：a1)是序列表中序列1或2或3所示的蛋白质；a2)含有a1)的融合蛋白质；a3)在序列1或2或3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a4)将a1)或a2)或a3)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与根结线虫的寄生和/或致病和/或发育相关的蛋白质；a5)与a1)具有70％以上同源性且与根结线虫的寄主趋性和/或寄生和/或致病和/或发育相关的蛋白质。本发明对研究根结线虫致病机理具有重大价值，其RALF蛋白质能够被植物受体蛋白FERONIA响应，抑制植物的免疫反应；编码RALF蛋白质的基因作为植物抗线虫工程的靶标基因，调控植物的抗病性。

Description

根结线虫RALF蛋白质、编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及根结线虫RALF蛋白质、编码基因及其应用。

背景技术

植物寄生线虫(Plant-parasitic nematodes)是全球性的粮食作物病虫害之一，其寄主范围很广，每年造成经济损失超过1730亿美元。南方根结线虫作为植物寄生线虫中最重要的一类，其对水稻、西瓜、黄瓜、辣椒等上百种农作物造成每年几十亿美元的经济损失，且其传播方式极广，包括土壤传播、微生物传播、耕作传播等。在我国农业现代化进程的前提下，大规模、机械化生产也会在实际生产中增加寄生线虫的传染性。由于根结线虫的根内寄生、寄主范围广泛的特性限制了化学防治和抗病雨中等防治方法在控制根结线虫危害中的应用，寻找其它有效防止根结线虫的方法是农业生产所长期面临的艰巨任务。

根结线虫对植物寄主的危害主要表现在两个方面：一方面根结线虫侵入寄主植物根尖组织穿剌吸食寄主植物营养，破坏细胞壁对植物组织细胞造成机械损伤，这些伤口为其他病原物入侵寄主植物提供了方便，使寄主植物更容易感染其他病害；另一方面是线虫侵染寄主植物后，通过口针将有毒物质注入植物细胞中，引起植物细胞核分裂但是细胞质不分裂，从而导致其组织细胞发育过度，最终形成多核巨细胞。巨细胞向根结线虫的生长和繁殖提供必须营养来源，降低植物寄主对水分和营养的吸收能力，从而导致其生长发育受阻，产量和品质降低。同时，巨型细胞使其根部细胞分裂形成瘤肿和过度的分枝，或使细胞的中胶层溶解而引起细胞的裂解，使根部和皮层组织形成空洞，以致细胞死亡。

RALF是一类多肽激素，会引起植物组织间快速碱化，在绿色植物中广泛存在。由RALF介导的信号途径广泛参与植物细胞伸长、根基根毛发育、植物受精、抗逆响应和抗病应答等，涉及植物生长发育、逆境胁迫和抗病等多个方面。研究显示：一些病原微生物能够模拟植物中的RALF多肽，降低植物免疫系统，促进自身的侵染。因此，研究线虫RALF基因不仅可以将其作为靶标培育抗线虫的植物，还可以研究其随根结线虫寄生、致病、发育的作用机理，能够为根结线虫与寄主植物寄生关系的研究提供参考。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种根结线虫RALF蛋白质、编码基因及其应用，该蛋白质及其编码基因可提高植物抗根结线虫，为进一步培育有抗植物寄生线虫的植物新品种奠定基础。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：根结线虫RALF蛋白质，为如下a1)或a2)或a3)或a4)或a5)：a1)氨基酸序列是序列表中序列1或2或3所示的蛋白质；a2)含有a1)的融合蛋白质；a3)在序列1或2或3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a4)将a1)或a2)或a3)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与根结线虫的寄生和/或致病和/或发育相关的由a1)衍生的蛋白质；a5)与a1)具有70％以上同源性且与根结线虫的寄主趋性和/或寄生和/或致病和/或发育相关的由a1)衍生的蛋白质。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a4)中的蛋白质的编码基因可通过序列表所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

本发明还提供了一种所述蛋白质的核酸分子，为如下b1)或b2)或b3)或b4)：b1)核苷酸序列是序列表中序列4或5或6所示的DNA分子；b2) 核苷酸序列是序列表中序列7或8所示的DNA分子；b3)在严格条件下与b1)或b2)所述的DNA分子杂交，且编码权利要求1所述RALF蛋白质的DNA分子；b4)与b1)或b2)所述的DNA分子具有70％以上同源性，且编码权利要求1所述RALF蛋白质的DNA分子。

其中，所述序列4或序列7的核酸分子编码序列1所示的氨基酸序列，所述序列5或序列8的核酸分子编码序列2所示的氨基酸序列，所述序列6的核酸分子编码序列3所示的氨基酸序列。

编码所述RALF蛋白质的核酸分子为编码所述RALF蛋白质的基因，且b1)对应的核苷酸序列（序列4-6）为最基础的基因，依次命名为MiRALF1、MiRALF3和MhRALF3，其分别依次编码序列1-3所述的氨基酸序列，MiRALF1、MiRALF3和MhRALF3基因编码的蛋白质命名为MiRALF1蛋白质、MiRALF3蛋白质和MhRALF3蛋白质。

本发明还保护含有或部分含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、转基因植物组织或重组微生物也属于本发明保护的范围。

重组载体为向表达载体或克隆载体插入所述核酸分子得到的重组质粒，所述重组微生物为将所述重组载体导入出发微生物得到的重组均，所述转基因植物组织为将所述重组载体导入出发植物中获得。

本发明还提供了一种RALF蛋白质的应用，为如下c1)至c3)中的至少一种：c1)调控根结线虫的寄生能力；c2)调控根结线虫的致病能力；c3)调控根结线虫的发育。

本发明还提供了一种RALF蛋白质在培育抗根结线虫转基因植物中的应用，具体可为方法一，包括在出发植物中导入抑制上述RALF蛋白质的表达或活性的物质，得到转基因植物的步骤；与所述出发植物相比，所述转基因植物对根结线虫的抗性提高。

本发明还提供了一种RALF蛋白质在培育抗根结线虫转基因植物中的应用，具体可为方法二，将所述方法一中获得的转基因植物与待改良植物杂交，得到后代转基因植物的步骤；与所述出发植物相比，所述后代转基因植物对根结线虫的抗性提高。

上述抑制RALF蛋白质的表达或活性的物质具体可通过干扰载体、干扰RNA、同源重组等本领域熟悉的方法，达到抑制所述RALF蛋白质的表达或活性的物质。

所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，所述根结线虫具体可为南方根结线虫和北方根结线虫。

本发明还提供了一种抑制RALF蛋白质表达和/或活性的物质在制备产品中的应用，所述抑制RALF蛋白质表达和/或活性物质为抑制编码RALF蛋白质基因表达的干扰载体、干扰RNA或重组病毒，所述产品的功能为抑制根结线虫对植物的寄主趋性和/或抑制根结线虫对植物的寄生和/或抑制根结线虫对植物的致病和/或抑制根结线虫发育。

进一步，所述干扰RNA的核苷酸序列如序列表中序列9所示。

本发明还提供了一种降低根结线虫对寄主的寄生和/或致病的方法，为使根结线虫体内所述RALF蛋白质的表达量和/或活性降低。

本发明还提供了一种与所述RALF蛋白质相互作用的蛋白质FERONIA的应用，为如下d1)至d3)中的至少一种：d1)调控根结线虫的寄生能力；d2)调控根结线虫的致病能力；d3)调控根结线虫的发育。

本发明一种根结线虫RALF蛋白质、编码基因及其应用的有益效果：本发明提供了根结线虫RALF蛋白质及其对应的编码基因，该RALF蛋白质具有典型的RALF功能结构域，具有与植物RALF相同的生物活性，且能够被植物受体蛋白FERONIA（FER）所响应，从而抑制植物的免疫反应；编码RALF蛋白质的基因可作为植物抗线工程的靶标基因，调控植物的抗病性，在培育抗根结线虫转基因植物中具有广阔前景；本发明还对研究根结线虫致病机理以及抗线虫植物的制备具有重大价值。

附图说明

图1—为MiRALF1、MiRALF3基因在南方根结线虫不同发育阶段的表达量及表达部位检测图；

图2—为MiRALF1、MiRALF3和MhRALF3蛋白质核心结构域的对比分析图；

图3—为MiRALF1、MiRALF3和MhRALF3蛋白质的蛋白活性检测图；

图4—为转基因植物MiRALF1-RNAi对南方根结线虫的防控效果图；

图5—为拟南芥FERONIA缺失突变体对南方根结线虫的防控图；

图6—为水稻FERONIA缺失突变体对南方根结线虫的防控图。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。

实施例1 MiRALF1、MiRALF3基因在南方根结线虫不同发育阶段的表达量及表达部位分析。

（1）利用mRNA提取试剂盒Dynabeads™ mRNA Purification Kits (Invitrogen)，获取不同龄期南方根结线虫的mRNA，通过逆转录试剂盒PrimeScript™ II 1st StrandcDNA Synthesis Kit (Takara)，将上述mRNA逆转录为cDNA。

（2）利用荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(Takara)，使用表1中的引物Mi-RT1-F/ Mi-RT1-R，Mi-RT2-F/Mi-RT2-R分别对MiRALF1、MiRALF3基因进行荧光定量PCR分析，以南方根结线虫actin基因为内参，其引物为Mi-ACT-F/Mi-ACT-R，在荧光定量PCR仪7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems)中检测MiRALF1、MiRALF3在不同龄期南方根结线虫的转录水平。

表1 荧光定量PCR引物表

（3）通过原位杂交技术，检测MiRALF1、MiRALF3基因南方根结线虫的表达部位，具体方法为：

将南方根结线虫的侵染后2龄幼虫和雌成虫用3%多聚甲醛（Sigma-Aldrich）固定过夜，用M9 buffer洗涤3次后，用蛋白酶K （Sigma-Aldrich）消化1 小时后，用M9 buffer洗涤3次，转至-80℃冻存20分钟，分别用甲醇（Sigma-Aldrich）和丙酮（Sigma-Aldrich）于80℃固定10分钟。用杂交溶液（Roche）洗涤一次后，加入预解旋的地高辛探针，终浓度为300ng/mL。其中：探针为BGI-Tech所合成，检测MiRALF1的正反向探针为DIG-MiRALF1-sense）/DIG-MiRALF1-antisense，检测MiRALF3的正反向探针为DIG-MiRALF3-sense/DIG-MiRALF3-antisense，探针序列如表2所示。

表2 地高辛探针序列表

杂交温度为42℃，杂交过夜后，用4× SSC 溶液（0.6 M NaCl and 0.06 M sodiumcitrate, pH 7.0）洗涤三次，每次15分钟，温度为55℃。按照同样的洗涤条件，用0.1× SSC溶液（15 mM NaCl and 1.5 mM sodium citrate, pH 7.0）洗涤三次。用马来酸溶液室温洗涤一次，并用封闭液（Roche）室温封闭30分钟。随后，以1：1000的比例配置地高辛抗体（Roche），加入至封闭液中室温孵育2小时。用含有0.05%吐温20的马来酸溶液室温洗涤三次，每次15分钟。随后用detection buffer溶液（0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, and 50mM MgCl2, pH 9.5）洗涤一次后，加入1× NBT/BCIP (Roche)至上述detection buffer溶液中4℃孵育避光过夜，用双蒸水洗涤3次后，Olympus BX53显微镜拍照。

MiRALF1、MiRALF3基因在南方根结线虫不同发育阶段的表达量及表达部位检测结果如图1所示，其中图1A为南方根结线虫2龄幼虫的模式图、图1B为MiRALF1在南方根结线虫2龄幼虫的特异性表达，即利用原位杂交技术证明了该基因在南方根结线虫的食道腺细胞处特异性表达、图1C为MiRALF3在南方根结线虫2龄幼虫的特异性表达，即利用原位杂交技术证明了该基因在南方根结线虫的食道腺细胞处特异性表达、图1D为南方根结线虫雌成虫的模式图、图1E为MiRALF1在南方根结线虫雌成虫的特异性表达，即利用原位杂交技术证明了该基因在南方根结线虫的食道腺细胞处特异性表达、图1F为MiRALF3在南方根结线虫雌成虫的特异性表达，即利用原位杂交技术证明了该基因在南方根结线虫的食道腺细胞处特异性表达、图1G为植物寄生线虫的侵染时期演示图、图1H为MiRALF1在南方根结线虫不同龄期的基因表达变化，即利用Q-PCR技术检测该基因在侵染时期的表达量较高、图1I为MiRALF3在南方根结线虫不同龄期的基因表达变化，即利用Q-PCR技术检测该基因在侵染时期的表达量较高，通过采用荧光定量PCR技术和原位杂交技术，发现基因MiRALF1和MiRALF3在南方根结线虫侵染时期的表达量较高，且在南方根结线虫的食道腺附近表达。

实施例2 MiRALF1、MiRALF3和MhRALF3蛋白质的蛋白活性检测

基于原核表达蛋白技术，构建MiRALF1，MiRALF3，MhRALF3和AtRALF1基因的原核表达载体，用体外纯化的方式合成4种蛋白，进行体外活性检测（包括植物根长抑制实验，植物体外pH检测实验，植物MAPK磷酸化检测实验和GST pull-down实验）。具体操作步骤如下：

PCR克隆：PCR 反应扩增MiRALF1，MiRALF3，MhRALF3基因片段。PCR反应体系（50 μL），PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34个循环后，72℃继续延伸10min，完成后在4℃保存。PCR产物回收：将MiRALF1、MiRALF3、MhRALF3的PCR产物进行胶回收，4 ℃保存。MiRALF1，MiRALF3和MhRALF3进行PCR扩增的引物分别为Hmt-MiRALF1-F/Hmt-MiRALF1-R、Hmt-MiRALF3-F/ Hmt- MiRALF3-R、Hmt-MhRALF1-F/Hmt-MhRALF1-R，引物序列如表3所示：

表3 PCR扩增引物表

原核表达载体构建：利用NdeI和BamHI对pET28a载体进行双酶切，并回收载体片段，将所得片段与载体片段预混，利用同源重组的方法进行连接，转化感受态Top10，涂LB平板（含有50 mg/L Kan），37℃过夜培养后，即可获得单菌落，菌落PCR鉴定获得阳性转化子后，37℃摇菌过夜，提取质粒，并测序。所得阳性质粒转入BL21感受细胞。将携有原核表达重组质粒的BL21菌种进行IPTG诱导，28 ℃，4 h，0.5 mM IPTG。诱导后菌体经超声破碎，和Ni柱吸附纯化，纯化后蛋白储存于-20 ℃。

根据文献（Stegmann M., et al. (2017) The receptor kinase FER is aRALF-regulated scaffold controlling plant immune signaling. Science 355(6322): 287-289）的方法，检测线虫RALF蛋白对拟南芥根长的抑制情况；根据文献（HarutaM., et al. (2014) A Peptide Hormone and Its Receptor Protein Kinase RegulatePlant Cell Expansion. Science 343(6169): 408-411.）检测线虫RALF蛋白对体外酸碱值的变化；根据文献（Li C., et al. (2018). EBP1 nuclear accumulation negativelyfeeds back on FERONIA-mediated RALF1 signaling. PLoS Biology 16 (10):e2006340.）检测线虫RALF蛋白对植物体内MAPK磷酸化的变化；根据文献（Xiao, Y., etal. (2019). Mechanisms of RALF peptide perception by a heterotypic receptorcomplex. Nature, 1.）检测线虫RALF与植物受体蛋白FER的体外结合情况。

MiRALF1、MiRALF3和MhRALF3蛋白质与典型的RALF核心结构域的对比分析图如图2所示，通过生物信息学手段，推断基因MiRALF1、MiRALF3和MhRALF3所编码蛋白具有典型的RALF功能结构域，分别为YISY 结构域和RGC(5N)C结构域（注，5N指5个任意氨基酸），此三种RALF的基因结构和生物活性是一致的，均可与宿主植物的FERONIA受体结合；MiRALF1、MiRALF3和MhRALF3蛋白质的蛋白活性检测结果如图3所示，其中图3A为不同RALF处理拟南芥幼苗，结果显示不同RALF处理拟南芥Col-0，相对于对照组，实验组的根长受到明显抑制，而处理拟南芥fer-4，实验组并无明显变化、图3B为图A的统计学分析，其中**代表p-value值小于0.01、图3C为不同RALF处理下拟南芥幼苗培养基酸碱变化的统计学分析、图3D为不同RALF处理下拟南芥幼苗胞外酸碱显色反应、图3E为MAPK磷酸化水平检测实验，即不同的RALF处理条件下，MAPK会被磷酸化，如图中的pMAPK6/3/4所示、图3F为不同RALF与FER的结合实验，即线虫RALF会如AtRALF1一样与FER结合、图3G为AtRALF1处理条件下Col-0和fer-4活性氧的变化量、图3H为MhRALF3处理条件下Col-0和fer-4活性氧的变化量、图3I为MiRALF1处理条件下Col-0和fer-4活性氧的变化量、图3J为MiRALF3处理条件下Col-0和fer-4活性氧的变化量、通过原核表达蛋白纯化和体外活性检测实验可知：MiRALF1、MiRALF3和MhRALF3能够抑制植物幼苗的生长，促进幼苗体外pH值的上升；可以诱导植物体内MAPK蛋白的磷酸化；且可以与植物受体蛋白FERONIA互作，具体而言，相对于野生型拟南芥，RALF多肽处理FERONIA敲除突变体（fer-4）呈现不敏感表型，同理胞外pH检测实验和活性氧检测实验亦是如此，另外体外GST pull-down结合实验证明了RALF多肽可与FERONIA受体蛋白直接互作。

实施例3 MiRALF1基因沉默后根结线虫的寄生能力检测

基于HIGS技术，构建线虫RALF基因沉默载体。MiRALF1、MiRALF3的基因结构相似、表达模式和生物活性一致，本实施例选取MiRALF1做基因沉默检测试验，选取MiRALF1序列设计干扰靶序列（即干扰RNA，如序列9所示），如序列表2所示，根据干扰靶序列设计以及pHANNIBAL上两端的限制性内切酶位点，分别设计正、反向插入片段的引物。正向片段引物pHANNIBAL-Mi-F1/pHANNIBAL-Mi-R1、反向片段引物pHANNIBAL-Mi-F2/ pHANNIBAL-Mi-R2的序列如表4所示：

表4 基因沉默PCR克隆引物表

以pHANNIBAL-Mi-F1/ pHANNIBAL-Mi-R1引物进行PCR克隆，将克隆产物与预先被限制性内切酶EcoRI酶切的pHANNIBAL载体进行同源重组连接，连接成功后，以pHANNIBAL-Mi-F2/ pHANNIBAL-Mi-R2引物进行PCR克隆，将克隆产物与预先被限制性内切酶HindIII和XbaI酶切的pHANNIBAL载体进行同源重组连接，连接成功后，以限制性内切酶NotI单酶切，将酶切得到的T-DNA片段与预先被限制性内切酶NotI酶切的载体pART27同源重组后，转入EH105农杆菌感受态，获得沉默载体MiRALF1-RNAi HIGS。

再将沉默载体MiRALF1-dsRNAHIGS转入GV3101农杆菌中，并用携带有沉默载体MiRALF1-RNAi HIGS质粒的GV3101农杆菌浸染拟南芥野生型植物（Col-0），收取种子后利用卡那霉素进行阳性筛选。挑取南方根结线虫卵囊，以1.5% NaOCl消毒3分钟，以灭菌水25℃孵化3天，取南方根结线虫的2龄幼虫，用灭菌水稀释到浓度为每毫升2000头，在植物的根尖周围，每株接种1毫升上述幼虫悬液，一定时间内用酸性品红进行线虫染色。

MiRALF1-RNAi HIGS载体质粒的GV3101农杆菌浸染拟南芥野生型植物（Col-0），浸染后的植物命名为转基因植物MiRALF1-RNAi，收取种子后利用卡那霉素进行阳性筛选。获取南方根结线虫的2龄幼虫，用灭菌水稀释到浓度为每毫升2000头，在植物的根尖周围，每株接种1毫升上述幼虫悬液，一定时间内用酸性品红进行线虫染色。

MiRALF1基因沉默后培育得到的转基因植物MiRALF1-RNAi对南方根结线虫的防控效果如图4所示，由图可知，在接种3天后，转基因植物MiRALF1-RNAi相对于拟南芥野生型植物（Col-0），线虫侵染数目显著减少；在接种7天后，MiRALF1-RNAi或FER缺失突变体植物相对于野生型植物，线虫的发育要显著迟缓，表明MiRALF1基因沉默后根结线虫的寄生能力减弱。

实施例4 FERONIA缺失突变后根结线虫的寄生能力减弱

根据文献（Duan, Q., Kita, D., Li, C., Cheung, A. Y. and Wu, H. M.(2010). FERONIA receptor-like kinase regulates RHO GTPase signaling of roothair development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 17821-17826.Li, C., Wang,L., Cui, Y., He, L., Qi, Y., Zhang, J., Lin, J., Liao, H., Lin, Q., Yang, T.,et al. (2016). Two FERONIA-like receptor (FLR) genes are required to maintainarchitecture, fertility, and seed yield in rice. Mol. Breeding 36.）的方法获得缺失突变体。

所得FERONIA在拟南芥和水稻体内的缺失突变体（fer-4；Col-0背景）；（flr1；dongjin背景），获取南方根结线虫的2龄幼虫，用灭菌水稀释到浓度为每毫升2000头，在缺失突变体植物的根尖周围，每株接种1毫升上述幼虫悬液，一定时间内用酸性品红进行线虫染色。

FERONIA在拟南芥和水稻体内的缺失突变体对南方根结线虫的防控效果分别如图5、6所示，由图可知，在接种3天后，FERONIA在拟南芥和水稻体内的缺失突变体相对于拟南芥野生型植物（Col-0），线虫侵染数目显著减少；在接种7天后，FERONIA在拟南芥和水稻体内的缺失突变体相对于野生型植物，线虫的发育要显著迟缓，表明FERONIA缺失后根结线虫的寄生能力减弱。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南大学

<120> 根结线虫RALF蛋白质、编码基因及其应用

<130> 1

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 90

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MiRALF1蛋白质

<400> 1

Met Leu Pro Ala Pro Leu Ile Leu Ile Ile Ile Leu Ala Ile His Ala

1 5 10 15

Ala Thr Val Leu Ser Gly Ile Pro Ala Pro Ala Gly Ile Thr Ala Thr

20 25 30

Leu Ala His Cys Leu Gly Leu His Ile Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ala

35 40 45

Ala Ala Gly Ala Thr Leu Thr Gly Gly Gly Pro Val Ala Pro Thr Thr

50 55 60

Ala Gly Cys Gly Met Ile Thr Leu Cys Ala Ala Ala Leu Leu Ile Gly

65 70 75 80

Ile Ala Ser Thr Ala Leu Pro Thr Ala Gly

85 90

<210> 2

<211> 88

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MiRALF3蛋白质

<400> 2

Met Arg Phe Asn Phe Tyr Ile Leu Ile Ile Ile Ile Leu Asn Ile His

1 5 10 15

Thr Asn Tyr Val Phe Ser Asp Ile Phe Asn Phe Asp Glu Ile Ala Arg

20 25 30

Tyr Lys Arg His Cys Gly Asp Lys Phe Val Ser Tyr Gly Ala Val Glu

35 40 45

Gly Asp Arg Ile His Asp Gln His His Leu Pro Tyr Ala Asn Pro Tyr

50 55 60

Glu Arg Gly Cys Asn Asp Ile Thr Arg Cys Arg Lys Glu Lys Lys Gln

65 70 75 80

Leu Gly Tyr Ser Tyr Phe Ser Pro

85

<210> 3

<211> 47

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MhRALF3蛋白质

<400> 3

Met Ala Leu Ala Ile Gly Thr Pro Ala Leu Gly Ala Ala Ala Ala Pro

1 5 10 15

Ser Gly Leu His Ser Pro Ala Pro Ser Gly Ala Gly Thr Gly Ala Gly

20 25 30

Cys Gly Thr Ile Gly His Cys Ala Ser Ser Leu Gly Ala Ala Leu

35 40 45

<210> 4

<211> 272

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MiRALF1

<400> 4

atgaaattta atttttaatt ttaattatta ttttaaatat tcacaacaat tatgttttga 60

gtgaaatatt taattttgat gaaattacaa gatataaacg gcattgtaaa gaaaaacaca 120

tctcttatgg agctctaaga aatgatagac aaaattataa aactcaagaa cagccagtta 180

acccctatac aagaggttgt gaaatgataa ctaaatgtcg aagagattta aagattgaaa 240

ttcgttcaac tcgcttacca tataatgaat aa 272

<210> 5

<211> 267

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MiRALF3

<400> 5

atgagattta atttttatat tttaataatt attattttaa atattcacac caattatgtc 60

tttagtgata tatttaattt tgatgaaatt gcaagatata aacgccattg tggagataaa 120

tttgtttcat atggagccgt cgaaggagat agaatccatg atcaacatca tttaccatac 180

gctaatcctt atgaaagagg ttgcaatgat ataactagat gtcgtaaaga aaaaaagcag 240

ttgggctata gctatttctc tccttga 267

<210> 6

<211> 144

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MhRALF3

<400> 6

atggctaaag acatcggata tccagctttg gggaatgata atgccccttc tggaaaacac 60

tctcctgccc cttctggtaa ccaatatcaa agaggttgtg aaaccataga acattgtcgc 120

agttcgaaag aaaataacaa ataa 144

<210> 7

<211> 598

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MiRALF1-qDNA

<400> 7

atgaaattta atttttaatt ttaattatta ttttaaatat tcacaacaat tatgttttga 60

gtgaaatatt taattttgat gaaattacaa gatataaacg gcattgtaaa ggtatttaat 120

atttttattt aaattatttt acaaccctcc ttggatgaat ttatttcttt ttttatagct 180

agctgaagtg aattcgctct tgtagcgata ctttcattgt taaataaaat ttttctttaa 240

gttaatagtt ccctcttaat ttaaaattct gttgacagtc tacatttaac gggaatatat 300

tttagtgaaa aatttcaaat attttattta aagtacaact taattaaaca aacaaaaata 360

tcatttattt aaattaatta ttaaatttgc aagccaaaaa attcttttat tttaattttt 420

aataattatt tttaaagaaa aacacatctc ttatggagct ctaagaaatg atagacaaaa 480

ttataaaact caagaacagc cagttaaccc ctatacaaga ggttgtgaaa tgataactaa 540

atgtcgaaga gatttaaaga ttgaaattcg ttcaactcgc ttaccatata atgaataa 598

<210> 8

<211> 726

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MiRALF3-qDNA

<400> 8

atgagattta atttttatat tttaataatt attattttaa atattcacac caattatgtc 60

tttagtgata tatttaattt tgatgaaatt gcaagatata aacgccattg tggaggtatt 120

acagtgtttg ttaagaaatt ataaacaacc tagttatttc tgtgtttcta ggttcttatt 180

gtctaattta atctaaaaaa ttttgaaaaa tatttcacta gatggtctca cgtccgcaaa 240

tgattgtctt gccctcacct tatttcatta tcctctcata atgattaaaa aatgggcaaa 300

tattaacaac gtattttctc taaaataacc gcccctatct ctctcatata agccaccctc 360

cttctaaaat aagcccactc tagtgtcgat cgaaaaataa gcccctgggc ttttttatag 420

aaaatacgta tttagcaggt aattagaact gttgaaaagt tttacaaaaa attttttgaa 480

catttccatt gatattgagt aggaaggcaa gttgaactaa gtctaatgat ttttatcgag 540

ttctaataat ttatttaaat tagtttattt aaagataaat ttgtttcata tggagccgtc 600

gaaggagata gaatccatga tcaacatcat ttaccatacg ctaatcctta tgaaagaggt 660

tgcaatgata taactagatg tcgtaaagaa aaaaagcagt tgggctatag ctatttctct 720

ccttga 726

<210> 9

<211> 156

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 干扰RNA

<400> 9

aaacacatct cttatggagc tctaagaaat gatagacaaa attataaaac tcaagaacag 60

ccagttaacc cctatacaag aggttgtgaa atgataacta aatgtcgaag agatttaaag 120

attgaaattc gttcaactcg cttaccatat aatgaa 156

Claims (4)

1.根结线虫RALF蛋白质，其特征在于：为如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)含有a1)的融合蛋白质；a3)在序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.一种编码如权利要求1所述蛋白质的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是核苷酸序列如序列表中序列5所示的DNA分子。

3.含有如权利要求2所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

4.一种如权利要求1所述RALF蛋白质的应用，其特征在于：为如下c1)至c3)中的至少一种： c1)调控根结线虫的寄生能力；c2)调控根结线虫的致病能力；c3)调控根结线虫的发育。

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