CN113004385B

CN113004385B - 象耳豆根结线虫msp19蛋白及其编码基因以及它们作为靶标在抑制线虫中的应用

Info

Publication number: CN113004385B
Application number: CN202110283785.8A
Authority: CN
Inventors: 简恒; 孙许谦; 闫世艳; 刘倩
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-03-17
Filing date: 2021-03-17
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2041-03-17
Also published as: CN113004385A

Abstract

本发明公开了象耳豆根结线虫MSP19蛋白及其编码基因以及它们作为靶标在抑制线虫中的应用。本发明提供了一种蛋白质，命名为MSP19蛋白，是序列表的序列5或序列1所示的蛋白质。编码MSP19蛋白的基因也属于本发明的保护范围，命名为MSP19基因。本发明还保护MSP19基因在培育对根结线虫的抗性降低的转基因植物中的应用。本发明还保护用于抑制MSP19基因表达的物质在培育对根结线虫的抗性增高的转基因植物中的应用。本发明为象耳豆根结线虫致病机理研究提供基因资源和防治的理论依据。

Description

象耳豆根结线虫MSP19蛋白及其编码基因以及它们作为靶标在抑制线虫中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及象耳豆根结线虫MSP19蛋白及其编码基因以及它们作为靶标在抑制线虫中的应用。

背景技术

根结线虫(Meloidogyne spp.)是一类活体营养固着型内寄生植物病原线虫。根结线虫寄主范围广，适应性强，对农业生产危害严重，造成巨大经济损失。

象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)于1983年在我国海南省首次发现，之前只在我国南方有分布，并未受到重视。但后续研究发现其寄主范围非常广泛，并且可以克服根结线虫抗性基因Mi-1基因和N基因，同时不会被根结线虫的生防菌穿刺巴氏杆菌(Pasteuria penetrans)寄生，表现出较强的致病力。由此可见，象耳豆根结线虫对我国农业生产威胁巨大，一旦发生大面积扩散或定殖，将会造成毁灭性的的灾害。

近年来随着产业结构调整，我国北方设施栽培面积逐步扩大，以及全球气候变暖等因素的影响使土壤温度的上升，将会使象耳豆根结线虫入侵内陆地区成为可能。据报道，象耳豆根结线虫已在我国广东、福建、广西、云南以及湖南等省份发现，一旦入侵内陆这将会给全国的农作物生产带来威胁。

由于对象耳豆根结线虫致病机理研究不足，传统的防治方法存在特异性差、副作用大、防效有限等突出问题。近年来随着分子生物学技术的发展，应用分子手段筛选与植物病原线虫寄生致病相关的基因，并深入研究其致病机理已成为植物病原线虫研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供象耳豆根结线虫MSP19蛋白及其编码基因以及它们作为靶标在抑制线虫中的应用。

本发明提供了一种蛋白质，获自象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)，命名为MSP19蛋白，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

(a1)序列表的序列5所示的蛋白质；

(a2)序列表的序列1所示的蛋白质；

(a3)来源于象耳豆根结线虫且与(a1)或(a2)具有98％以上同一性且与象耳豆根结线虫的寄生和/或致病和/或发育相关的蛋白质；

(a4)将(a1)或(a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与象耳豆根结线虫的寄生和/或致病和/或发育相关的由(a1)或(a2)衍生的蛋白质。

编码MSP19蛋白的基因也属于本发明的保护范围，命名为MSP19基因。

MSP19基因为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：

(b1)编码区如序列表的序列6所示的DNA分子；

(b2)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；

(b3)来源于象耳豆根结线虫且与(b1)或(b2)具有98％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；

(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

含有MSP19基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明还保护MSP19蛋白的应用，为如下(c1)至(c3)中的至少一种：

(c1)调控根结线虫的寄生能力；

(c2)调控根结线虫的致病能力；

(c3)抑制植物免疫反应。

本发明还保护抑制MSP19基因表达的干扰载体。

以载体pSAT 5为骨架载体，在NcoⅠ和XhoⅠ位点之间插入序列表的序列3所示的双链DNA分子，在PstⅠ和KpnⅠ位点之间插入序列表的序列4所示的双链DNA分子，得到重组质粒pSAT5-RNAiMSP19。将重组质粒pSAT5-RNAiMSP19用XbaI和KpnI双酶切，回收具有干扰片段的酶切产物(干扰片段即序列3所示的区段和序列4所示的区段)；将载体pSUPER用XbaI和KpnI双酶切，回收载体骨架；将所述酶切产物与所述载体骨架连接，得到具有所述干扰片段的重组质粒，即为干扰载体。

本发明还保护MSP19基因在培育对根结线虫的抗性降低的转基因植物中的应用。

本发明还保护用于抑制MSP19基因表达的物质在培育对根结线虫的抗性增高的转基因植物中的应用。用于抑制MSP19基因表达的物质具体可为所述干扰载体。

本发明还保护一种培育对根结线虫的抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：将MSP19基因导入目的植物，得到对根结线虫的抗性降低的植物。将MSP19基因导入目的植物具体可为将具有MSP19基因的重组表达载体导入目的植物。具有MSP19基因的重组表达载体具体可为：在载体pSuper1300的XbaI和KpnI位点之间插入序列表的序列6所示的双链DNA分子，得到的重组质粒Super1300-NSMSP19。

本发明还保护一种培育抗根结线虫的植物的方法，包括如下步骤：将抑制MSP19基因表达的物质导入目的植物，得到对根结线虫的抗性增高的植物。抑制MSP19基因表达的物质具体可为所述干扰载体。

以上任一所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。

以上任一所述植物可为十字花科植物。

以上任一所述植物可为拟南芥属植物。

以上任一所述植物可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。

以上任一所述植物可为茄科植物。

以上任一所述植物可为烟草。

以上任一所述根结线虫具体可为象耳豆根结线虫。

通过原位杂交技术，发现MSP19基因在线虫食道腺部位特异表达，表明MSP19为食道腺体特异表达的蛋白，并且会分泌到细胞外发挥作用。亚细胞定位实验模拟MSP19在植物细胞发挥作用的部位，实验发现烟草的整个细胞都有表达，表明其可能分泌到植物细胞后在整个细胞发挥作用。实时荧光定量PCR检测了MSP19虫态发育表达模式，发现此基因在线虫寄生植物后的虫态时期，基因表达量会维持在较高水平，表明MSP19可能参与了线虫寄生以及巨大细胞维持。MSP19超表达拟南芥株系对线虫的敏感性显著升高，相反拟南芥介导的RNAi干扰株系对线虫的敏感性显著降低，表明MSP19是线虫致病过程中的一个关键基因。同时对MSP19基因功能初步探究发现，在烟草叶片上瞬时表达该蛋白其可以抑制由BAX引起的免疫坏死反应，且可以抑制由线虫侵染植物根部引起的活性氧的爆发，表明该基因具有抑制植物的免疫反应的功能。

本发明为象耳豆根结线虫致病机理研究提供基因资源和防治的理论依据。

附图说明

图1为原位杂交实验的结果。

图2为亚细胞定位的结果。

图3为MSP19基因的相对表达丰度的结果。

图4为三个干扰株系中，平均每株植株上的根结数目和线虫数目。

图5为三个超表达株系中，平均每株植株上的根结数目和线虫数目。

图6为ROS实验的结果。

图7为细胞程序性坏死的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、象耳豆根结线虫食道腺基因MSP19克隆

1、取接种象耳豆根结线虫45-60天的空心菜根系，洗净后挑取卵块,25℃孵化3天，收集新鲜的二龄幼虫。

2、将步骤1收集的线虫液氮冷冻，研磨破碎，然后提取总RNA，反转录得到cDNA。

3、以步骤2得到的cDNA为模板，采用MSP19_F和MSP19_R组成的引物对进行PCR扩增。

MSP19_F(上游引物)：5’-ATGTCGGCTCTCCTCTTCACTACTACC-3’；

MSP19_R(下游引物)：5’-TTAAACAGTATTAGCTCTTCCACCAC-3’。

PCR扩增的反应体系(50.0μL)：ddH₂O 32μL，5×Q5 PCR buffer 10μL，10mMdNTPs1μL，MSP19_F 2.5μL，MSP19_R 2.5μL，cDNA 1.5μL，Q5超保真DNA聚合酶(NEB)0.5μL。

PCR扩增的反应条件：98.0℃预变性30s；98.0℃变性10s，58.0℃退火30s，72.0℃延伸30s，35个循环；72.0℃保温2min。

4、回收步骤3得到的PCR扩增产物，进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物如序列表的序列2所示，编码序列表的序列1所示的蛋白质。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为MSP19蛋白。将编码MSP19蛋白的基因命名为MSP19基因。

实施例2、象耳豆根结线虫MSP19基因在线虫表达部位以及植物中的亚细胞定位

以DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II(Roche)对象耳豆根结线虫二龄幼虫进行原位杂交实验。杂交结果显示反义探针有杂交信号(见图1)。杂交信号位于食道腺，表明该基因可能为食道腺细胞表达基因。

将去除信号肽的MSP19蛋白的编码基因(即序列表的序列6所示的双链DNA分子)连接到pYBA1132载体上(载体本身具有eGFP标签，外源插入DNA与eGFP编码序列形成融合基因，表达具有eGFP标签的蛋白)，得到融合表达载体pYBA1132-NSMSP19-GFP。将融合表达载体转化农杆菌EHA105后注射烟草瞬时表达，通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光来确定MSP19基因在植物细胞中的表达部位和MSP19蛋白发挥功能的部位(结果见图2)。

实施例3、MSP19基因的发育表达模式

采用实时荧光定量PCR分析象耳豆根结线虫的不同发育阶段(卵、寄生前二龄幼虫、寄生期二龄幼虫、寄生期三龄幼虫、寄生期四龄幼虫和成熟雌虫)中MSP19基因的表达差异情况。侵染对象为拟南芥。

用于检测MSP19基因的引物如下：

MSP19-qRT-F：5'-AGCAAAAGCAAACAAACCAGAT-3'；

MSP19-qRT-R：5'-GCTCTTGGTTGTCCACATTTAA-3'。

以GAPDH基因为内参基因，进行三次生物学重复实验，采用2^-△△Ct法分析结果。

MSP19基因的相对表达丰度见图3。相对于卵时期，MSP19基因在线虫侵染拟南芥之后的虫态中表达量上调，且在侵染后四龄表达量最高。结果表明，MSP19蛋白可能参与线虫的前期侵染植物以及后期对巨大细胞的维持等相关过程。

实施例4、MSP19基因的致病性分析

一、构建重组质粒

1、构建RNA干扰载体pSUPERMSP19

载体pSAT 5(即文献中的“pSAT5.nosP.RNAi”)：参考文献：MeryDafny-Yelin,Sang-Min Chung,Ellen L.Frankman,and TzviTzfira；pSAT RNA Interference Vectors:A Modular Series forMultiple Gene Down-Regulation in Plants；Plant Physiology,December 2007,Vol.145,pp.1272–1281。

载体pSUPER(即文献中的“pSuper vector”)：参考文献：Zhao J,Li L,Liu Q,LiuP,Li S,Yang D,Chen Y,Pagnotta S,Favery B,Abad P et al.2019.A MIF-likeeffector suppresses plant immunity and facilitates nematode parasitism byinteracting with plant annexins.Journal of Experimental Botany 70:5943–5958.。

以载体pSAT 5为骨架载体，在NcoⅠ和XhoⅠ位点之间插入序列表的序列7所示的双链DNA分子，在PstⅠ和KpnⅠ位点之间插入与序列表的序列7反向互补的双链DNA分子，得到重组质粒pSAT5-RNAieGFP。将重组质粒pSAT5-RNAieGFP用XbaI和KpnI双酶切，回收具有干扰片段的酶切产物；将载体pSUPER用XbaI和KpnI双酶切，回收载体骨架；将所述酶切产物与所述载体骨架连接，得到具有所述干扰片段的重组质粒，即为对照载体。

2、构建超表达载体pSuper1300-NSMSP19

载体pSuper1300(即文献中的“pSuper1300-FLAG”)：参考文献：Yang,H.,Shi,Y.,Liu,J.,Guo,L.,Zhang,X.,and Yang,S.(2010).A mutant CHS3 protein with TIR-NBLRR-LIM domains modulates growth,cell death and freezing tolerance in atemperaturedependent manner in Arabidopsis.The Plant Journal 63,283–296.。

在载体pSuper1300的XbaI和KpnI位点之间插入序列表的序列6所示的双链DNA分子(编码序列表的序列5所示的蛋白质)，得到重组质粒Super1300-NSMSP19。

二、制备超表达株系

1、将重组质粒Super1300-NSMSP19导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。

2、通过蘸花法将步骤1得到的重组农杆菌转化哥伦比亚生态型拟南芥，然后培养并收集种子，即为T0代种子。将T0代种子点种于含25mg/L潮霉素的MS培养基平板，培养14天，将可以正常生长的植株移栽到穴盘中正常培养并收集种子，即为T1代种子。

T1代种子长成的植株即为T1代植株。将T1代植株自交并收获种子，即为T2代种子。T2代种子长成的植株即为T2代植株。将T2代植株自交并收获种子，即为T3代植株。T2代种子长成的植株即为T3代植株。

对于某一T1代植株来说，如果其抽样检测的后代(T2代植株和T3代植株)均为PCR鉴定阳性，该T1代植株及其后代为一个纯合的转基因株系。

PCR鉴定的方法：提取植株叶片的基因组DNA，采用MSP19-S-F和MSP19-S-R组成的引物对进行PCR扩增，如果得到约468bp的扩增产物，该植株为PCR鉴定阳性植株。

MSP19-S-F：5’-ATGACAGGCGATCGAAAAG-3’

MSP19-S-R：5’-TTAAACAGTATTAGCTCTTCCACCAC-3’。

得到三个转基因株系，即三个超表达株系，分别命名为MSP19-S-1株系、MSP19-S-2株系、MSP19-S-3株系。

三、制备干扰株系

用干扰载体代替重组质粒Super1300-NSMSP19，其他同步骤二。

PCR鉴定的方法：提取植株叶片的基因组DNA，采用MSP19-R-F和MSP19-R-R组成的引物对进行PCR扩增，如果得到约231bp的扩增产物，该植株为PCR鉴定阳性植株。

MSP19-R-F：5’-ATGACAGGCGATCGAAAAGCCTCT-3’

MSP19-R-R：5’-TTTACATTTGGTTTCGCCATTATT-3’

得到三个转基因株系，即三个干扰株系，分别命名为MSP19-R-1株系、MSP19-R-2株系、MSP19-R-3株系。

四、制备转eGFP对照载体株系

用对照载体代替重组质粒Super1300-NSMSP19，其他同步骤二。

PCR鉴定的方法：提取植株叶片的基因组DNA，采用eGFP-R-F和eGFP-R-R组成的引物对进行PCR扩增，如果得到约298bp的扩增产物，该植株为PCR鉴定阳性植株。

eGFP-R-F：5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’；

eGFP-R-R：5’-AGATGGTGCGCTCCTGG-3’。

得到转基因株系，命名为eGFP-R株系。

五、进行线虫寄生致病能力体内干扰研究

试验植株：MSP19-R-1株系的T3代植株、MSP19-R-2株系的T3代植株、MSP19-R-3株系的T3代植株、eGFP-R株系的T3代植株、MSP19-S-1株系的T3代植株、MSP19-S-2株系的T3代植株、MSP19-S-3株系的T3代植株、哥伦比亚生态型拟南芥(哥伦比亚生态型拟南芥用Col或COL表示)。每个株系25株。

试验方法如下：

1、取在MS培养基平板上生长的试验植株(萌发一周)，转移至装有培养基质(培养基质即1体积份营养土和1体积份蛭石混合得到的)的容器中，每个容器移栽1株。

2、在培养基质中培养3周后，在每株拟南芥苗的根部接种约300条象耳豆根结线虫二龄幼虫。

3、接种象耳豆根结线虫20天后，进行数据统计。

三个干扰株系中，平均每株植株上的根结数目和线虫数目见图4。与哥伦比亚生态型拟南芥相比：三个干扰株系的根结数目分别减少了29.7％、31.4％、23.0％；三个干扰株系的线虫数目分别减少30.0％、22.7％、23.5％。

三个超表达株系中，平均每株植株上的根结数目和线虫数目见图5。与哥伦比亚生态型拟南芥相比：三个超表达株系的根结数分别增加23.3％、47.0％、29.3％；三个超表达株系的线虫数目分别增加21.8％、44.7％、26.6％。

实验结果表明，象耳豆根结线虫的MSP19基因的干扰和异源表达之后可以显著改变植物对线虫的敏感性，说明MSP19基因在象耳豆根结线虫与寄主互作致病过程中可能发挥重要功能。

实施例5、MSP19基因功能的初步探究

一、ROS实验

荧光分子H2DCFDA作为探针，依据H2DCFDA本身特性，当其进入细胞后，能够被水解生成H2DCF，H2DCF不能透过细胞膜。细胞内的活性氧能够使H2DCF氧化生成DCF，DCF可以发出荧光，进而通过观察DCF的荧光强弱，推断ROS爆发水平。

收集孵化的象耳豆根结线虫二龄幼虫，经0.2％次氯酸钠溶液消毒，然后取200-300条线虫接种到MSP19基因超表达株系拟南芥植株的根部，然后培养植株48h，之后用10μM的H2DCFDA染色液将样品(接种线虫的拟南芥根部)浸泡10-20min，用洗脱液(含0.1mM KCl和0.1mM CaCl₂的水溶液)清洗去除染色液，最后在显微镜下观察荧光，并拍照记录。

结果见图6。结果显示，MSP19的转基因拟南芥株系根部的活性氧的含量低于野生型拟南芥，表明MSP19基因可以抑制植物的活性氧的爆发，从而促进线虫的侵染与定殖。

二、MSP19可以抑制由BAX基因引起的细胞程序性坏死

通过gateway技术构建MSP19基因(MSP19基因见序列表的序列6)的植物表达载体pGWB402-MSP19,并转化农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。

悬浮缓冲液：50ml的无菌水中加入500μl 1M MES水溶液、500μl 1M MgCl₂水溶液和100μl 100mM乙酰丁香酮溶液(溶剂为DMSO)，混匀。

将重组农杆菌在28℃培养，离心收集菌体，并用悬浮缓冲液重悬菌体，浓度调至OD600＝0.5。选取种植6-7周的本生烟草叶片，将烟草叶片分为四个区：1号位置注射悬浮缓冲液；2号位置注射转化MSP19基因的农杆菌(对照叶片注射PGW-402空载农杆菌)；3号位置注射转化MSP19基因的农杆菌(对照叶片注射PGW-402空载农杆菌)，24小时之后注射转化BAX的农杆菌(BAX序列见序列8)；4号位置注射悬浮缓冲液，24小时后注射转化BAX的农杆菌。

结果见图7。结果表明MSP19可以抑制由BAX基因引起的细胞程序性坏死，进而表明MSP19可能参与了抑制植物免疫反应的过程。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 象耳豆根结线虫MSP19蛋白及其编码基因以及它们作为靶标在抑制线虫中的应用

<130> GNCYX210380

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 177

<212> PRT

<213> Meloidogyne spp.

<400> 1

Met Ser Ala Leu Leu Phe Thr Thr Thr Leu Leu Ile Ile Ser Leu Ala

1 5 10 15

Phe Ile Ala Ile Ala Glu Gly Thr Gly Asp Arg Lys Ala Ser Thr Ser

20 25 30

Ser Cys Lys Val Val Gly Thr Leu Ile His Leu Gly Asp Lys Asp Lys

35 40 45

Ile Pro Pro Ala Lys Ala Asn Lys Pro Asp Val Gln Asn Thr Leu Lys

50 55 60

Met Ser Gly Asn Ala Gln Ile Phe Lys Thr Asn Gln Val Thr Leu Asn

65 70 75 80

Val Asp Asn Gln Glu Pro Cys Thr Val Lys Ile Asn Asn Gly Glu Thr

85 90 95

Lys Cys Lys Ile Thr Gly Asp Glu Leu Asn Gly Lys Phe Ile Phe Glu

100 105 110

Thr Glu Lys Gly Thr Glu Ile Thr Val Pro Phe Lys Asp Ala Lys Leu

115 120 125

Phe Ser Gly Asn Lys Cys Val Ile Glu Leu Val Gly Tyr Asp Lys Glu

130 135 140

Thr His Glu Thr Lys Leu Lys Ile Asn Gly Asn Asp Phe Val Ile Lys

145 150 155 160

Lys Lys Asp Gly Thr Val Ser Thr Lys Cys Gly Gly Arg Ala Asn Thr

165 170 175

Val

<210> 2

<211> 534

<212> DNA

<213> Meloidogyne spp.

<400> 2

atgtcggctc tcctcttcac tactaccctt ctaatcattt cattggcttt tattgccata 60

gctgagggaa caggcgatcg aaaagcctct acctcgagct gtaaggtggt tggaacactt 120

attcatttag gggacaaaga caaaattccc ccagcaaaag caaacaaacc agatgtacaa 180

aatactctaa aaatgtctgg aaatgctcaa atattcaaaa ctaatcaagt gaccttaaat 240

gtggacaacc aagagccttg taccgttaaa attaataatg gcgaaaccaa atgtaaaata 300

accggagatg aattaaatgg aaaatttatt ttcgaaactg aaaaaggaac tgaaattact 360

gttcctttca aagatgctaa attgttttct ggaaataagt gtgttattga acttgttggt 420

tatgacaagg aaactcatga aactaaactt aaaattaatg gaaatgattt tgtgattaaa 480

aagaaggatg gtactgtttc aactaagtgt ggtggaagag ctaatactgt ttaa 534

<210> 3

<211> 231

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgacaggcg atcgaaaagc ctctacctcg agctgtaagg tggttggaac acttattcat 60

ttaggggaca aagacaaaat tcccccagca aaagcaaaca aaccagatgt acaaaatact 120

ctaaaaatgt ctggaaatgc tcaaatattc aaaactaatc aagtgacctt aaatgtggac 180

aaccaagagc cttgtaccgt taaaattaat aatggcgaaa ccaaatgtaa a 231

<210> 4

<211> 231

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttacatttg gtttcgccat tattaatttt aacggtacaa ggctcttggt tgtccacatt 60

taaggtcact tgattagttt tgaatatttg agcatttcca gacattttta gagtattttg 120

tacatctggt ttgtttgctt ttgctggggg aattttgtct ttgtccccta aatgaataag 180

tgttccaacc accttacagc tcgaggtaga ggcttttcga tcgcctgtca t 231

<210> 5

<211> 155

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Thr Gly Asp Arg Lys Ala Ser Thr Ser Ser Cys Lys Val Val Gly

1 5 10 15

Thr Leu Ile His Leu Gly Asp Lys Asp Lys Ile Pro Pro Ala Lys Ala

20 25 30

Asn Lys Pro Asp Val Gln Asn Thr Leu Lys Met Ser Gly Asn Ala Gln

35 40 45

Ile Phe Lys Thr Asn Gln Val Thr Leu Asn Val Asp Asn Gln Glu Pro

50 55 60

Cys Thr Val Lys Ile Asn Asn Gly Glu Thr Lys Cys Lys Ile Thr Gly

65 70 75 80

Asp Glu Leu Asn Gly Lys Phe Ile Phe Glu Thr Glu Lys Gly Thr Glu

85 90 95

Ile Thr Val Pro Phe Lys Asp Ala Lys Leu Phe Ser Gly Asn Lys Cys

100 105 110

Val Ile Glu Leu Val Gly Tyr Asp Lys Glu Thr His Glu Thr Lys Leu

115 120 125

Lys Ile Asn Gly Asn Asp Phe Val Ile Lys Lys Lys Asp Gly Thr Val

130 135 140

Ser Thr Lys Cys Gly Gly Arg Ala Asn Thr Val

145 150 155

<210> 6

<211> 468

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgacaggcg atcgaaaagc ctctacctcg agctgtaagg tggttggaac acttattcat 60

ttaggggaca aagacaaaat tcccccagca aaagcaaaca aaccagatgt acaaaatact 120

ctaaaaatgt ctggaaatgc tcaaatattc aaaactaatc aagtgacctt aaatgtggac 180

aaccaagagc cttgtaccgt taaaattaat aatggcgaaa ccaaatgtaa aataaccgga 240

gatgaattaa atggaaaatt tattttcgaa actgaaaaag gaactgaaat tactgttcct 300

ttcaaagatg ctaaattgtt ttctggaaat aagtgtgtta ttgaacttgt tggttatgac 360

aaggaaactc atgaaactaa acttaaaatt aatggaaatg attttgtgat taaaaagaag 420

gatggtactg tttcaactaa gtgtggtgga agagctaata ctgtttaa 468

<210> 7

<211> 298

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatct 298

<210> 8

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggacgggt ccggggagca gcttgggagc ggcgggccca ccagctctga acagatcatg 60

aagacagggg cctttttgct acagggtttc atccaggatc gagcagggag gatggctggg 120

gagacacctg agctgacctt ggagcagccg ccccaggatg cgtccaccaa gaagctgagc 180

gagtgtctcc ggcgaattgg agatgaactg gacagcaata tggagctgca gaggatgatt 240

gctgacgtgg acacggactc cccccgagag gtcttcttcc gggtggcagc tgacatgttt 300

gctgatggca acttcaactg gggccgcgtg gttgccctct tctactttgc tagcaaactg 360

gtgctcaagg ccctgtgcac taaagtgccc gagctgatca gaaccatcat gggctggaca 420

ctggacttcc tccgtgagcg gctgcttgtc tggatccaag accagggtgg ctgggaaggc 480

ctcctctcct acttcgggac ccccacatgg cagacagtga ccatctttgt ggctggagtc 540

ctcaccgcct cgctcaccat ctggaagaag atgggctga 579

Claims

1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列5所示的蛋白质；

(a2)序列表的序列1所示的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(b1)或(b2)：

(b1)编码区如序列表的序列6所示的DNA分子；

(b2)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.权利要求1所述蛋白质的应用，为如下(c1)至(c3)中的至少一种：

(c1)调控根结线虫的寄生能力；

(c2)调控根结线虫的致病能力；

(c3)抑制植物免疫反应。

6.抑制权利要求2或3所述基因表达的干扰载体。

7.权利要求2或3所述基因在培育对根结线虫的抗性降低的转基因植物中的应用。

8.用于抑制权利要求2或3所述基因表达的干扰载体在培育对根结线虫的抗性增高的转基因植物中的应用。

9.一种培育对根结线虫的抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求2或3所述基因导入目的植物，得到对根结线虫的抗性降低的植物。

10.一种培育抗根结线虫的植物的方法，包括如下步骤：将抑制权利要求2或3所述基因表达的干扰载体导入目的植物，得到对根结线虫的抗性增高的植物。