CN109021084B

CN109021084B - 枳抗寒基因PtrERF109及其在植物抗寒遗传改良中的应用

Info

Publication number: CN109021084B
Application number: CN201810883033.3A
Authority: CN
Inventors: 刘继红; 王敏; 黄小三
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-08-06
Filing date: 2018-08-06
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2038-08-06
Also published as: CN109021084A

Abstract

本发明公开了一种枳抗寒基因PtrERF109及其在植物抗寒遗传改良中的应用，PtrERF109基因为一种从极抗寒枳（Poncirus trifoliata）中分离、克隆出的转录因子，其序列为SEQ ID NO.1所示。将该基因构建超表达和RNAi载体，并通过农杆菌介导的遗传转化将其分别导入烟草、柠檬和枳中，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本发明所克隆的PtrERF109基因具有提高植物抗寒性的功能。该基因的发现，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

Description

枳抗寒基因PtrERF109及其在植物抗寒遗传改良中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及从枳(Poncirus trifoliata)中分离、克隆得到一个转录调控因子PtrERF109，还涉及该基因在植物抗寒遗传改良中的应用，将该基因在植物中超表达，获得的转基因植物抗寒性明显提高。

背景技术

低温会破坏植物细胞膜的完整性、产生活性氧、降低酶活性，进而抑制细胞正常功能的发挥(Chinnusamy et al.,2007)。在长期的进化过程中，植物已经形成了高效且复杂的抵御低温伤害的应答机制，即在分子、细胞和生理水平上做出一系列的调整，从而减少低温对植物造成的伤害。而与此相关的各种生理活动从本质上讲是基因表达水平发生变化的结果(Nakashima et al.,2009)。低温胁迫应答基因主要分为两类，一类是调节基因，编码调节蛋白，参与信号传导和基因表达的调控，另一类是功能基因，其编码产物在细胞内直接发挥保护作用(Wang et al.,2003；Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki,2005；Shinozaki and Yamaguch i-Shinozaki,2007；Zhu,2016)。转录因子作为重要的调节基因，处在信号传导的重要节点，在低温应答中被一系列的信号传导途径所激活，激活的转录因子通过特定的顺式作用元件与下游多个靶基因结合，调控多个抗逆相关基因的表达，从而提高植物的低温抗性(Golldack et al.,2011；Nakashima et al.,2014)。因此，与增强个别功能基因的表达来增强植物某种抗性的方法相比，对一个关键转录因子的导入或敲出是提高植物抗逆性的更加有效的途径(Mie Kasuga et al.,1999；Valliyodan and Nguyen,2006；Hussain et al.,2011；Cabello et al.,2014；Joshi et al.,2016)。

当遭受外界环境胁迫时，植物会启动一系列的基因表达来做出生理、生化的改变以适应环境的变化。转录因子通过与特定的顺式作用元件结合可调控一大批抗性基因的表达，同时，同一个转录因子也能响应多种胁迫信号的调控。因此，转录因子在植物胁迫应答中起着非常重要的作用，处于信号传导的关键节点。利用转录因子提高植物抗寒性的研究有很多报道(Huang et al.,2013；Jin et al.,2016)，表明转录因子是抗寒遗传工程的重要基因资源(Saibo et al.,2009)。植物基因组中研究较多的转录因子，如bHLH,ABF,MYB,WRKY,NAC及HSF等。目前，虽然有很多ERF转录因子从植物中克隆出来，但大多集中在果实的成熟和衰老上，而研究其抗逆鲜有报到，其涉及到的抗寒功能却更是少之又少。例如，水稻ERF类转录因子Hairy Leaf 6(HL6)与调控水稻表皮毛起始的关键椅子OsWOX3B相互作用从而参与生长素介导水稻表皮毛发育(Sun et al.,2017)。苹果乙烯响应因子ERF17编码区丝氨酸残基的自然突变对果实的褪绿有重要影响，随着编码区串联重复丝氨酸残基数目的增加，基因的转录活性以及对下游叶绿素降解相关结构基因PPH、NYC启动子的结合能力和稳定性也随之增强，从而促进苹果果皮叶绿素的降解(Han et al.,2018)。ORA59能够直接结合到肉桂酸酰胺(HCAAs)合成途径中最后一步关键酶基因AtACT启动子区域的两个GCC-box元件上，激活AtACT的表达，从而使HCAAs得到积累(Li et al.,2018)。小麦中病原诱导的ERF1基因(TaPIE1)会响应乙烯信号并激活下游防卫和胁迫相关基因，对植物死体营养型丝核菌(Rhizoctonia cerealis)侵染和冷寒胁迫的抵抗性有起到了正向调节的作用(Zhu etal.,2014)。乙烯和ABA信号可以诱导棉花中的GhERF4基因，并在棉花应对非生物胁迫中起到关键作用(Jin and Liu,2008)。但是现有技术中并未报道ERF转录因子能够抗寒。

枳是柑橘产业中应用较广泛的一种砧木，极抗寒，是研究木本植物抗寒性及克隆有关抗寒基因克隆问题的理想材料。因此，克隆枳抗寒有关基因是抗寒基因工程的关键和基础。

发明内容

本发明目的在于提供了一种枳抗寒基因，该基因为一种从极抗寒的枳(Poncirustrifoliata)中分离、克隆出一个转录因子，申请人将其命名为PtrERF109，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示。

本发明还有一目的在于提供了一种枳抗寒基因PtrERF109在植物抗寒中的应用。将该基因构建超表达和RNAi载体、通过农杆菌介导的遗传转化将其分别导入烟草、柠檬和枳，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本发明所克隆的PtrERF109基因具有提高抗寒性的功能。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人基于植物基因克隆技术从极抗寒枳(Poncirus trifoliata)中分离、克隆出的一个转录因子，申请人将其命名为PtrERF109，其序列为SEQ ID NO.1所示，其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；开放阅读框(ORF)预测，发现该基因含一个ORF，长度为927bp，编码308个氨基酸的蛋白，该蛋白的分子量为34.13kDa，等电点为8.29。申请人利用qRT-PCR技术分析了在不同逆境条件处理下PtrERF109基因的时空表达，并对PtrERF109基因的相对表达量进行了分析，分析结果表明PtrERF109基因相对表达量在低温胁迫时最高。当低温处理植株时，随低温处理时间延长，PtrERF109基因的表达量也逐渐增加，到24h时表达量达到了最大值(60倍)，随后缓慢降低，说明PtrERF109对于低温胁迫有十分强烈的响应，表明PtrERF109基因是一个潜在的抗寒育种基因。

申请人设计了一对引物，以枳cDNA为模板，利用PCR技术克隆得到上述基因PtrERF109的cDNA全长序列。

PCR引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物1：5’-ATTCCAGAGCCAACACGAAC-3’；

反向引物1：5’-GAACGTGGGATTTCGCCAGC-3’。

枳抗寒基因PtrERF109在植物抗寒中的应用，包括利用本领域的常规方式，将PtrERF109基因在植株中进行超表达，可获得抗寒的转基因植株；

以上所述的应用中，优选的，所述的植株为烟草、柠檬或枳。

以上所述的应用中，优选的，通过构建PtrERF109基因的植物超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将PtrERF109基因导入植株中。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

该基因的发现，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

附图说明

图1是本发明的技术流程图。

图2是本发明PtrERF109响应不同胁迫处理的表达模式示意图；

图2中A是低温(4℃)处理；图2中B是乙烯利处理；图2中C是脱水处理；图2中D是盐处理；图2中E是启动子GUS染色；图2中F是启动子GUS染色结果Image J量化。误差线表示标准误，**表示P＜0.01。

图3是本发明PtrERF109基因亚细胞定位示意图。

其中：图3中A：GFP基因(对照)在明场(图左)、紫外线(UV)光下(中)、DAPI染色(右二)的成像，最右图为二者叠加后的成像；

图3中B：PtrERF109基因在明场(图左)、UV光下(中)、DAPI染色(右二)的成像，最右图为二者叠加后的成像。

图4是本发明PtrERF109基因转录激活分析示意图；

其中：图4中A是本发明的PtrERF109基因缺失片段构建模式图；图4中B是本发明的PtrERF109基因转录激活检测。

图5是本发明PtrERF109基因转基因烟草鉴定及表达量分析示意图；

其中：图5中A是本发明的PtrERF109基因特异引物鉴定阳性烟草；图5中B是半定量分析烟草PtrERF109基因的表达量。

图6是本发明转PtrERF109基因烟草低温处理表型和生理指标测定示意图；

图6中A是低温处理前后转基因烟草的表型；图6中B是烟草处理后相关生理指标测定，包括成活率(左)、相对电导率(中)、MDA含量(右)；图6中C是烟草低温处理前(左)和处理后(右)叶绿素荧光测定；图6中D是烟草处理前Fv/Fm；图6中E是烟草处理后Fv/Fm。

图7是本发明转PtrERF109基因柠檬低温处理表型和生理指标测定示意图；

图7中A是柠檬转基因系(TG13、TG40)与野生型柠檬(WT)处理前(左)、处理后(中)以及处理后在常温下恢复7d(右)的表型；

图7中B是柠檬处理后电导率；

图7中C是柠檬处理前后MDA含量。

图8是本发明转PtrERF109基因植株中H₂O₂含量分析示意图

图8中A是过氧化物酶基因Prx1在转基因柠檬低温处理前后的表达量；

图8中B是转基因柠檬低温处理前后POD酶活测定；

图8中C是转基因柠檬低温处理后DAB染色；

图8中D是转基因柠檬低温处理前后H₂O₂含量；

图8中E转基因烟草低温处理后DAB染色；

图8中F是转基因烟草低温处理前后H₂O₂含量。

图9是VIGS材料鉴定及表达量分析示意图；

图9中A是PtrERF109干涉材料(PtrERF109-TRV2)鉴定，“M”代表marker，“P”代表阳性质粒，“W”代表ddH₂O，“WT”代表野生型枳；

图9中B是空载材料TRV2鉴定；

图9中C是随机选取10株阳性材料鉴定PtrERF109表达量。

图10是枳干涉PtrERF109基因植株(简称TRV-PtrERF109)抗寒性分析示意图；

图10中A是干涉PtrERF109基因枳低温处理前(左)和处理后(右)的表型；

图10中B是干涉PtrERF109基因枳电导率；

图10中C是干涉PtrERF109基因MDA含量；

图10中D是干涉PtrERF109基因枳处理前(左)和处理后(右)叶绿素荧光表型；

图10中E是干涉PtrERF109基因枳处理前Fv/Fm值；

图10中F是干涉PtrERF109基因枳处理后Fv/Fm值。

图11是干涉PtrERF109抑制了Prx1的表达及POD酶酶活性促进ROS积累示意图；

图11中A是低温处理前后VIGS植株(简称TRV-PtrERF109)中Prx1表达量；

图11中B是低温处理前后VIGS植株(简称TRV-PtrERF109)POD的酶活；

图11中C是低温处理前后VIGS植株(简称TRV-PtrERF109)DAB染色；

图11中D是低温处理前后VIGS植株(简称TRV-PtrERF109)H₂O₂含量。

图12是本发明的PtrERF109结合Prx1基因启动子上检测示意图；

图12中A是酵母单杂bait和prey载体示意图，P1代表含有GCC-box元件的启动子片段，mP1表示将GCC-box突变后的P1片段；

图12中B是酵母单杂交分析PtrERF109结合Prx1启动子实验；

图12中C是凝胶迁移实验(EMSA)分析PtrERF109结合Prx1启动子；

图12中D是双荧光素酶(LUC)实验中effector和reporter载体示意图；

图12中E是LUC实验分析PtrERF109激活Prx1启动子的结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：

枳PtrERF109基因全长cDNA的克隆

以枳cDNA为模板，采用高保真酶进行扩增，扩增体系见表1，扩增程序见表2，扩增引物序列为：

PtrERF109-F:5’-ATTCCAGAGCCAACACGAAC-3’

PtrERF109-R:5’-GAACGTGGGATTTCGCCAGC-3’；

采用AxyPrep-96DNA凝胶回收试剂盒(Axygene,USA)对扩增得到产物进行纯化回收，纯化产物与

18-T载体(TaKaRa,Japan)进行连接，连接体系见表3-3，16℃孵育30min后转化大肠杆菌感受态Trans5α。

表1 基因扩增体系

Table 1 Reaction system of gene amplification

表2 基因扩增PCR程序

Table 2 PCR program for gene amplification

转化后12-16h挑取平板上单克隆于1.5mL离心管，加入含相应抗生素的LB液体培养基，37℃摇床震荡培养至菌液浑浊，而后进行阳性鉴定。试剂采用2×TSINGKE MasterMix(Tsingke，China)，PCR程序见表2，反应体系见表4。获得阳性克隆后，将阳性克隆送至擎科公司测序，根据测序结果，获得PtrERF109的基因全长cDNA序列。

表3

18-T载体连接体系

表4 阳性鉴定反应体系

发现该基因含一个ORF，长度为927bp，编码308个氨基酸的蛋白，该蛋白的分子量为34.13kDa，等电点为8.29，将该基因命名为PtrERF109，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

实施例2：

不同逆境条件处理下PtrERF109基因的qRT-PCR分析

采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法对PtrERF109基因的表达模式进行分析，定量试剂为QuantiNova^TM SYBRGreen PC(QIGEN，Germany)，方法参照说明书，反应体系见表5。

表5 定量PCR反应体系

以枳中Actin作为内参基因，反转录得到的cDNA为模板。每个样品重复四次，反应所用基因引物见附录Ⅱ。定量PCR反应在Applied Biosystems QuanStudio^TM 7 Flex Real-Time PCR系统(ABI，USA)中完成，反应程序见表6。反应完之后采用2^-ΔΔCt算法对基因表达进行计算。内参基因qRT-PCR引物为：

Actin-F：5’-CCGACCGTATGAGCAAGGAAA-3’

Actin-R：5’-TTCCTGTGGACAATGGATGGA-3’

表6 定量PCR反应程序

本实验对其在低温下的表达模式进行了研究，并发现随低温处理时间延长，PtrERF109基因的表达量也逐渐增加，到24h时表达量达到了峰值(60倍)，随后缓慢降低，这与其在表达谱中的表达模式是一致的(图2中A)。同时，在对其它胁迫处理的研究中发现PtrERF109也受脱水处理诱导表达，虽然诱导倍数不高，但是保持在一个持续增加的趋势(图2中C)。PtrERF109在盐处理早期有微弱的响应，之后的表达被盐处理所抑制(图2中D)。当用乙烯利(释放乙烯)处理时，PtrERF109基因被快速且强烈诱导表达，乙烯利溶液处理1h后，其表达量就达到了峰值，相比于处理前表达量达到了160倍之多。但在乙烯利处理后期，其表达量呈缓慢降低的趋势(图2中B)。

为进一步确认PtrERF109为低温应答的转录因子，我们扩增了该基因的启动子(约2000bp)，并将该启动子连接于带有GUS报告基因的载体上，农杆菌介导瞬时转化甜橙愈伤，而后进行GUS染色。GUS染色发现，低温处理前转化的愈伤就有一定的染色，说明PtrERF109的启动子本身就已经具有一定的活性，但是低温处理后GUS的颜色明显加深，空载对照在处理前后都未染上色(图2中E)。Image J量化后可进一步看出处理后的愈伤GUS染色相对值显著高于处理前的GUS染色，说明PtrERF109的启动子活性在低温处理后显著增强了，即该基因的启动子是响应低温的(图2中F)。

实施例3：

PtrERF109基因亚细胞定位和转录激活分析

扩增PtrERF109的ORF区域(不含终止密码子)，并构建到101LYFP载体上，YFP蛋白位于基因的3’端，表达由CaMV35S启动子驱动。35S:PtrERF109-YFP与对照35S:YFP分别瞬时转化到本氏烟草的叶片表皮细胞，激光共聚焦观察荧光发现对照的荧光充满整个表皮细胞，包括细胞质、细胞核，而转化35S:PtrERF109-YFP的荧光只集中在细胞核内，细胞核由DAPI染色进一步确认。此外，与定位在细胞核的带mCherry荧光蛋白共转，也得到了相同的结果，说明PtrERF109是一个核定位蛋白(见图3中A，3中B)。

PtrERF109已验证是一个定位在核的转录因子，为了研究其是否具有转录活性，首先用“Nine Amino Acids Transactivation Domain 9aaTAD Prediction Tool”软件(Piskacek et al 2007)预测其可能的转录激活区域，预测得到5个可能的转录激活区域(每个区域含9个氨基酸)。在这预测得到的5个转录激活区域中，1个在N端(11^th-19^th aa)),1个在AP2domain里(172^th-180^th aa)，另外3个分布在C端(260^th-268^th aa，272^th-280^th aa，285^th-293^th aa)。因此，我们将该基因分为全长、N端(PtrERF109ΔC，1^th-210^th aa)和C端(PtrERF109ΔN，211^th-308^th aa)3部分，并分别构建到GAL4DNA-BD融合载体上，转化酵母菌株AH109(图4中A)。以空载pGBKT7作为阴性对照，所有的转化子都能在SD-Trp缺失培养基上生长，而只有全长PtrERF109和C端PtrERF109ΔN能在三缺培养基SD-Trp/Ade/His以及加了10mmol/L3-AT的三缺培养基上正常生长，且在加有X-α-Gal的培养基上被染上蓝色，说明PtrERF109具有转录激活活性，且转录区域在C端(图4中B)。

实施例4：

植物转化载体构建

设计引物将PtrERF109基因全长扩增并插入至pBI121载体上的Xba I和Sma I两个酶切位点中间，引物设计如下，以野生型枳cDNA为模板。

PtrERF109-pBI121-F:5’-GCTCTAGAATGCAAAGATCCTCAAAGCGAC-3’

PtrERF109-pBI121-R:5’-TCCCCCGGGTCATGAAGTAAGACCATTGGCAG-3’；

扩增片段回收、

18-T载体连接及转化、阳性克隆检测及送样测序等步骤的方法参照实施例1。

待测序结果正确后，对阳性菌株用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂(Axygen，USA)盒提取质粒，质粒命名为pBI121-PtrERF109。用限制性内切酶Xba I和Sma I分别对质粒18-T-PtrERF109和pBI121进行双酶切，酶切后电泳并回收，酶切体系见表7。之后采用TaKaRa T4DNA Ligase(TaKaRa,Japan)连接DNA片段与回收载体，16℃反应过夜，连接体系见表8。将连接产物转化大肠杆菌感受态Trans5α，挑取单克隆进行阳性鉴定后选取阳性单克隆于含有卡那(Kan)抗生素的LB液体培养基内摇菌、提取质粒，至此超表达载体pBI121-PtrERF109构建完成。构建好测载体转入农杆菌感受态GV3101备用。

表7 双酶切体系

表8 T4连接酶连接体系

实施例5：

烟草的遗传转化

1)菌株准备：从-80℃取出保存好的pBI121-PtrERF109载体，用接种环沾少量农杆菌液，在LB固体培养基(含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、25mg/L庆大霉素)上划线，28℃培养2-3d；挑取单克隆，在新的LB固体培养基(含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、25mg/L庆大霉素)上划线再次划线，培养2-3d，用灭菌的手术刀片将菌体刮下，并置于不含抗生素的MS液体培养基中，28℃，200r/min培养1-2h，充分摇散菌体，并用MS液体培养基调整OD₆₀₀值到0.6-0.8以备侵染用；

2)外植体准备：选取长势良好的无菌烟草，取最大的2-3片叶片，去掉主脉及叶边缘，切成0.5cm²左右大小的方块，放入无菌且加有少量MS液体培养基的三角瓶中，供侵染用；

3)侵染及共培养：将第一步中培养好的菌液倒入装有外植体的三角瓶中，侵染10min，侵染过程中不断轻摇。侵染后，用灭菌的滤纸吸干外植体带有的菌液,叶背面向下，放于铺有无菌滤纸的共培培养基(MS+2.25mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA)上，培养室中暗培养3d；

4)筛选培养：共培养3d后的全部外植体收集放入无菌的三角瓶中，加入含400mg/LCef的无菌水清洗2-3次，然后再用无菌水清洗2-3次，最后用无菌滤纸吸干外植体表面的水，置于筛选培养基(MS+400mg/L Cef+100mg/L Km+2.25mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA)上培养；

5)生根培养：将长至1-2cm长的抗性芽切下来，置于MS+400mg/L培养基中生根培养。

上述培养基中均含有3.0％蔗糖和0.8％琼脂，且pH值调至5.9-6.0。培养基高温高压灭菌后，待其冷却至60℃以下时，加入已过滤灭菌的抗生素，分装备用。

当抗性芽生根后，且长出2-3片叶片时，取少量叶片进行DNA提取，DNA提取步骤如下：

1)取少量烟草叶片放入1.5mL离心管中，液氮研磨至粉末状，加入600μL CATB提取液，CTAB提取液配制方法见表3-8；

2)充分混匀后放入65℃水浴锅水浴90min，期间每30min颠倒混匀一次；

3)水浴完成后，加入700μL 24:1(氯仿：异戊醇)混合抽提液，剧烈颠倒混匀，常温下12000r/min离心15min，吸取上层清液(约500μL)转移至新的1.5mL离心管中；

4)加入与上清等体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀后，放于-20℃冰箱沉淀(沉淀时间可延长)；

5)沉淀完成后取出，12000r/min离心10min。倒掉上清，加入1mL预冷的75％乙醇，清洗2-3两次，弃酒精，于通风橱内风干；

6)每管加入20-30μL ddH₂O溶解DNA，溶解好的DNA保存-20℃冰箱。

浓度检测，每个样品取1μL，于NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo,USA)测量，其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.8-2.0范围内时，DNA纯度较高。同时也通过凝胶电泳检测。

转基因烟草阳性植株的鉴定，以上述提取的DNA为模板，用两对引物检测，35S启动子正向引物加基因反向引物，以及NPT II特异引物。引物序列如下：

35S-F:5’-TCCTCGGATTCCATTGCCCAGC-3’

NPT II-F:5’-CGGCTATGACTGGGCACAACA-3’

NPT II-R:5’-CGGCAGGAGCAAGGTGAGATG-3’

表9 CTAB提取液配方

通过PCR鉴定获得了多株阳性植株，选取#29和#46系做进一步分析(图5中A)。半定量分析发现该基因确实在烟草中超量表达，收获超表达植株T2代种子用于后续分析(图5中B)。

实施例6：

转基因烟草鉴定及抗寒性鉴定

30d苗龄的盆栽转基因烟草和野生型烟草(WT)被用于低温抗性鉴定。在低温处理前，超表达PtrERF109基因的烟草和野生型烟草没有明显的表型差异，但在-2℃处理12h后，野生型受到伤害比转基因系更严重，绝大多数的叶片都呈水渍化状态，而转基因系只有部分烟草呈现水渍化(图6中A)。恢复后统计成活率，转基因植株具有更高的成活率，其中#29系为89.1％，#46系为84.3％，而野生型植株的存活率仅为14.7％。电导率测定发现野生型烟草在低温处理后的相对电导率更高，说明更严重的细胞膜伤害发生在了野生型烟草中，从而导致了更严重的电解质泄漏。此外，相对于WT烟草，转基因烟草积累的MDA含量更低(6中B)。

图6中C中，处理前野生型和转基因植株叶绿素荧光都呈现深蓝色，而在处理后野生型呈现蓝色部位的面积远远小于转基因系，褐色部位面积大于转基因系。叶绿素荧光参数Fv/Fm值用于表征PSⅡ反应中心光能的转化效率，在没有外界胁迫时该数值趋于稳定，变化极小，而当植物遭受外界胁迫时，该参数明显降低。因此，可以通过对植物叶片叶绿素荧光参数Fv/Fm值的测定来评价植物的抗逆能力。通过测定发现，处理前转基因系与野生型的Fv/Fm值无明显差异(图6中D)，而处理后转基因Fv/Fm值明显高于野生型(图6中E)，说明野生型在低温胁迫下伤害程度更大。总之，通过表型观察以及生理数据测定表明超表达PtrERF109使转基因烟草具有更高的耐寒抗冻能力。

实施例7：

转基因柠檬低温抗性鉴定

为进一步探究PtrERF109是否也能提高柑橘的抗寒能力，我们将该基因在低温敏感的柠檬中进行超表达，并对盆栽土培的超表达柠檬(TG13系和TG14系)和野生型柠檬WT进行抗冻分析。处理之前，TG40系的植株相对较矮小，推测可能是因为过高的PtrERF109表达所导致的结果。-4℃处理8h后，植株都受到了严重的伤害，但是野生型受到伤害的程度明显比转基因系更严重。室温恢复7d后，野生型柠檬未能恢复过来，整株植株死亡，T13系只有下部的叶片还存活，而TG40系的恢复很好(图7中A)。与表型结果一致，低温处理后的转基因系柠檬具有更低的相对电导率和MDA含量(图7中B,7中C)。这些结果说明，超表达PtrERF109增强了柠檬的抗寒性。

对Prx1基因的表达量用qRT-PCR进行检测，发现无论是在低温处理前还是在处理后，Prx1基因在转基因柠檬中的表达量都要高于野生型(图8中A)。同时，转基因柠檬在处理前拥有更高的POD酶活性，虽然低温处理后转基因系和野生型柠檬的POD酶活都增加了，但是转基因系酶活增加的幅度更大(图8中B)。增加的POD酶活会促进H₂O₂的清除，所以相比于野生型柠檬，在处理后的转基因柠檬中积累了更少的H₂O₂(图8中C，8中D)。在低温处理后的烟草中也发现转基因烟草积累了更少的H₂O₂(图8中E,8中F)。因此，在低温处理下转基因植株表现出更强的活性氧清除的能力，这可能是导致其低温抗性增强的重要原因。利用上述方法，将该基因在枳中进行超表达，可显著提高枳的抗寒能力。

实施例8：

VIGS材料鉴定及低温抗性分析

采用VIGS介导的方法，将该基因进行干涉。转化的植株用两对引物检测，一对是扩增TRV2引物，一对是扩增TRV1的引物，只有当转化植株能同时用两对引物扩增出条带时才被认定为阳性植株。TRV2-PtrERF109与TRV1共转的植株为实验组(TRV-PtrERF109)，TRV2空载与TRV1共转为对照组(TRV)。转化后对2个月苗龄的植株做阳性鉴定，每个组至少鉴定出数十棵阳性植株(图9中A，9中B)。随机选取10棵枳阳性VIGS植株，用qRT-PCR鉴定PtrERF109的表达量(图9中C)，发现阳性植株中PtrERF109的表达量相对于空载被抑制到18％至57％，且普遍具有较低表达量，说明VIGS具有较高的干涉效率；

PtrERF109干涉植株与对照植株在表型上并没有明显的区别，但是-2℃处理12h后，干涉植株的叶片萎蔫程度远高于对照组(图10中A)，说明其受低温伤害的程度更严重。相比于对照，在低温处理后PtrERF109干涉植株有更高的相对电导率(图10中B)，同时积累了更多的MDA(图10中C)。叶绿素荧光成像发现干涉植株的叶片在处理后几乎全部呈现褐色，而对照组只有顶部的嫩叶呈现褐色，处理之前二者没有差别(图10中D)。其次，转基因系与对照组的最大光合速率值Fv/Fm在处理前没有显著差异(图10中E)，也是在处理后才显著低于对照组(图10中F)。综上所述，干涉PtrERF109基因严重抑制了植株的抗寒性，从而进一步证明了该基因在提高植物抗寒性中的重要作用。

之前的结果已经证明了在超表达植株中PtrERF109可能调控了Prx1基因的表达，从而增加转基因植株在低温胁迫下清除H₂O₂的能力。同样，我们也研究了干涉植株中H₂O₂的清除或积累情况。首先，PtrERF109基因的表达抑制也限制了Prx1基因的表达，无论是在处理前还是处理后，干涉植株中PtrERF109的表达量始终低于对照(图11中A)，而与此对应的是被抑制的POD酶活。处理前，PtrERF109干涉植株的酶活比对照组稍低，而在处理后，虽然两者的酶活都有所上升，但是干涉植株的酶活却显著的低于对照(图11中B)。其次，在处理后的PtrERF109干涉植株中积累了更多的H₂O₂，DAB染色和H₂O₂的含量测定证明了这一点(图11C，11D)。这些结果说明干涉PtrERF109基因使枳在低温处理下H₂O₂的清除受到了抑制，从而导致了植株H₂O₂的积累，进而使植物更容易受到低温胁迫的伤害。

实施例9：

PtrERF109与Prx1启动子的结合验证

分析Prx1启动子发现在其ATG上游670bp左右处有一个GCC-box元件，将含有该元件的Prx1启动子片段构建到酵母单杂载体pAbAi上，形成Bait 1，同时将该元件突变后形成Bait 2(图12中A)。之后与Prey(pGADT7-PtrERF109)一起转化到酵母菌株Y1Hgold中，最后在缺失培养基上观察转化子的生长状态。在SD-Ura/Leu培养基上，各个转化子都能正常生长。但是在加了200ng/mL AbA的SD-Ura/Leu培养基上，只有Bait 1加Prey的转化子以及阳性对照(pGADT7-Rec-p53+p53-AbAi)能正常生长，而GCC-box突变了的Bait 2加Prey的转子以及阴性对照(pGADT7+Bait1/2)的不能生长，说明PtrERF109能够特异的结合到GCC-box元件上，并激活下游报告基因的表达(图12中B)。

其次，我们将纯化的PtrERF109蛋白与生物素标记的含GCC-box的探针孵育后进行凝胶迁移实验(EMSA)，经化学发光后检测到PtrERF109蛋白与探针的结合带，当加入竞争探针(不含生物素标记)后，这种结合会较弱，而且竞争的强度随竞争探针浓度的增加而增加。但是PtrERF109蛋白与GCC-box突变的探针不能结合(图12中C)，再次用体外实验证明了PtrERF109蛋白能与Prx1基因启动子上的GCC-box特异的结合。

为了进一步在植物体内验证PtrERF109与Prx1基因启动子结合，我们进行了双荧光素酶实验(LUC)。将含有GCC-box的Prx1启动子的片段以及将GCC-box突变的Prx1启动子的片段连接到pGreenII 0800-LUC载体上形成reporter或mReporter(m表示mutated)，将PtrERF109全长连接到pGreenII 62-SK载体上形成effector。之后用农杆菌介导的方法共转到分别将effector与reporter或mReporter分别瞬时转化到本式烟草叶片，并测定其荧光值。我们发现PtrERF109能激活Reporter中荧光素酶基因的表达，而不能激活mReporter中荧光荧光素酶基因的表达，说明PtrERF109在植物体内能与Prx1基因启动子结合(图12中D、E)。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 枳抗寒基因PtrERF109及其在植物抗寒遗传改良中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 927

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcaaagat cctcaaagcg accgagattc tgctccgttt ccgccgccca caacccgccg 60

ccgtcgcctc ctcagcgtcg cctcacccaa gagcaagaac tcgccatcat ggtcgcagcg 120

ctcgaaaacg tcctcgtcgg aaacacagac aacgatttct ccaccgatat ttttcgattt 180

caagattgga cggcgtctaa cgcagcagcc atcgcctcca cgtccacgag ttataatagc 240

cacaacacta attttgggaa tgggatgcta cctcctgccg acacgtgtca agtgtgcaac 300

attcaaggtt gtttgggatg caattatttc ccgccaaata ataaccatca cccccaccaa 360

caacaacagc agcagcaacg gcgaaagaaa gcagcagcta ctagcagcgg cggcgcggga 420

aagaggagag ggaagaagaa ttacagaggg gtgaggcaga ggccgtgggg aaaatgggcg 480

gctgagattc gtgacccgag gagggcgacc cgtgtctggc tggggacgtt caacacggcg 540

gaggaggcag cgagggcgta cgataaggcc gccgttgagt tccgtgggcc cagggccaag 600

cttaatttcc catttcccga tagcacgaca gtggcaacag catacgagca gcagcagcag 660

cagctgcagc agggggagtc atcgcattca cagcatccac aacaagtggc gtcgcaagac 720

agcaatcaaa gtgttgcgag aactaataat aataataata ataataatgg gaattcggcg 780

gcggcaacag aagtaatggg ggatcagatt cagagtgact tttgggagat gattggagaa 840

gacgagattc aacagtggat gacgatgatg gattttggca ccgattcttc agactctgct 900

aatactgcca atggtcttac ttcatga 927

<210> 2

<211> 308

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gln Arg Ser Ser Lys Arg Pro Arg Phe Cys Ser Val Ser Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Pro Pro Pro Ser Pro Pro Gln Arg Arg Leu Thr Gln Glu Gln

20 25 30

Glu Leu Ala Ile Met Val Ala Ala Leu Glu Asn Val Leu Val Gly Asn

35 40 45

Thr Asp Asn Asp Phe Ser Thr Asp Ile Phe Arg Phe Gln Asp Trp Thr

50 55 60

Ala Ser Asn Ala Ala Ala Ile Ala Ser Thr Ser Thr Ser Tyr Asn Ser

65 70 75 80

His Asn Thr Asn Phe Gly Asn Gly Met Leu Pro Pro Ala Asp Thr Cys

85 90 95

Gln Val Cys Asn Ile Gln Gly Cys Leu Gly Cys Asn Tyr Phe Pro Pro

100 105 110

Asn Asn Asn His His Pro His Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Arg Arg

115 120 125

Lys Lys Ala Ala Ala Thr Ser Ser Gly Gly Ala Gly Lys Arg Arg Gly

130 135 140

Lys Lys Asn Tyr Arg Gly Val Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala

145 150 155 160

Ala Glu Ile Arg Asp Pro Arg Arg Ala Thr Arg Val Trp Leu Gly Thr

165 170 175

Phe Asn Thr Ala Glu Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Lys Ala Ala Val

180 185 190

Glu Phe Arg Gly Pro Arg Ala Lys Leu Asn Phe Pro Phe Pro Asp Ser

195 200 205

Thr Thr Val Ala Thr Ala Tyr Glu Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln Gln

210 215 220

Gly Glu Ser Ser His Ser Gln His Pro Gln Gln Val Ala Ser Gln Asp

225 230 235 240

Ser Asn Gln Ser Val Ala Arg Thr Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn

245 250 255

Gly Asn Ser Ala Ala Ala Thr Glu Val Met Gly Asp Gln Ile Gln Ser

260 265 270

Asp Phe Trp Glu Met Ile Gly Glu Asp Glu Ile Gln Gln Trp Met Thr

275 280 285

Met Met Asp Phe Gly Thr Asp Ser Ser Asp Ser Ala Asn Thr Ala Asn

290 295 300

Gly Leu Thr Ser

305

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> x

<400> 3

attccagagc caacacgaac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> X

<400> 4

gaacgtggga tttcgccagc 20

Claims

1.一种分离的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1所述蛋白或权利要求2所述基因在提高植物抗寒能力中的应用，所述的植物为烟草、柠檬或枳。