CN1821414A - Erf蛋白terf2在提高植物低温胁迫耐性中的应用 - Google Patents

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黄荣峰
张执金
王学臣
张海文
王俊英
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Abstract

本发明涉及ERF蛋白TERF2在提高植物低温胁迫耐性中的应用。利用新型转录调控因子TERF2的基因序列(如SEQ ID NO1)，构建植物表达载体并转化植物，用于提高植物抗冻性能，使植物在寒流突袭或提前到来时，不致冻坏、冻死。本发明对于我国乃致全球的寒冷区域植物的种植，具有广阔的应用前景。

Description

ERF蛋白TERF2在提高植物低温胁迫耐性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及ERF蛋白TERF2在提高植物低温胁迫耐性中的应用。
背景技术
低温对植物的生长发育具有重大的影响。低温同样也严重地影响我国的农作物生产安全。如受低温危害影响比较普遍的东北地区，在低温影响严重的年份，可造成20-30％的减产。南方双季早稻产区的早春季节、长江中下游和华南大部地区的双季晚稻抽穗开花期的低温冷害可造成20-70％的产量损失。因此研究植物的抗冻耐低温胁迫的机理具有重要应用价值。
在植物的低温胁迫应答中，基因表达调控起着重要的作用。通过调控特异基因的表达，植物可以迅速的适应低温胁迫，完成低温胁迫应答。蛋白-DNA相互作用是调控植物基因表达的重要途径。ERF转录因子包含高度保守的ERF DNA结合域，是一类与植物抗逆性密切相关的重要转录因子。它通过识别不同抗逆基因的顺式作用元件，整合了下游相关抗性功能基因的表达，改善植物的抗逆性。因此以ERF转录因子基因转化植物，便可能同时改变多个下游抗逆功能基因的表达调控，从而全面改良转基因植株的耐逆性。
发明内容
本发明旨在利用新型转录调控因子TERF2的基因序列(如SEQ ID NO1)，构建植物表达载体并转化植物，用于提高植物抗冻性能，使植物在寒流突袭或提前到来时，不致冻坏、冻死。
本发明技术方案如下：
ERF蛋白TERF2在植物抗低温耐性中的应用。
所述应用是将TERF2基因用于转化植物，使植物产生低温耐性。
所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
所述植物为棉花、大豆、油菜、玉米、水稻、苗木、烟草或花草。
所述植物为双子叶植物烟草。
所述转化方法为农杆菌介导法、共转化法或基因枪法。
GCC-盒(box)和DRE/CRE元件是植物众多抗逆性相关功能基因启动子中的重要顺式作用元件。本发明利用调控蛋白与GCC-盒的相互作用，以番茄NP24启动子上的GCC-box为诱饵，采用酵母单杂交的方法从番茄表达文库中筛选到一种ERF蛋白-TERF2(基因库登陆号为DQ346740)，发现其在番茄中的表达受乙烯、ABA、水杨酸和低温的诱导，能够与顺式作用元件GCC-盒和DRE结合，具有核定位和转录激活等特性。超表达TERF2的烟草能组成型表达一些乙烯调控的PR基因的表达，如：烟草PR1(prb-1b)，PR2(β-1，3-glucanase)，PR3(chitinase)，PR5(Osmotin)和植物低温应答相关基因如ERD10a，ERD10b，SUSY。抗冻实验证明过表达TERF2能明显地提高烟草对冻害的抗性。可见TERF2是一种与植物抗冻性密切相关的ERF转录因子家族成员。
本发明提供的利用超表达TERF2提高转基因植物的抗冻性的用途，对于我国乃致全球的寒冷区域植物种植，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：表示超表达TERF2基因植物表达载体的构建。
图2：表示-6℃低温下处理植物材料不同时间，恢复生长48小时后，存活率的统计情况。
图3：植物-6℃低温下处理9小时，恢复生长48小时后的代表性症状。
图4：野生型和转TERF2基因烟草在不同温度冻害处理条件下的电渗透情况。
图5：野生型和转TERF2基因烟草在正常温度(26℃)和低温(4℃)胁迫条件下可溶性糖的含量。
图中WT、OE-2、OE-11、OE-8分别表示为非转基因烟草、转TERF2烟草株系-2、转TERF2烟草株系-11、转TERF2烟草株系-8。
具体实施方式
实施例1：
1.1载体构建
TERF2超表达载体pROK-TERF2的构建：将TERF2的编码序列用引物5’-CCTGATCTAGATGGATTCTTCTTCTTC-3’和5’-CCTGTGTCGACAAAATCATTCGCTTAG-3’扩增后，通过XbaI和Kpn1酶切位点克隆到植物双元表达载体pROK2[由pBI121(Clontech)改造]的35SCaMV启动子的下游。(如图1所示，TERF2全长cDNA插入到pROK2植物表达载体XbaI和Kpn1位点和CaM35S启动子的下游)
上述载体通过电转化方法分别导入农杆菌LBA4404。
1.2.根癌农杆菌介导pROK2-TERF2转化烟草
(1)培养无菌烟草小苗，至长出5片真叶时用于农杆菌转化；
(2)将无菌苗的叶片切去边缘和主脉，切成0.4×0.6cm2大小的外植体；
(3)将农杆菌菌液(OD600＝0.8)用新鲜YEB培养基重悬后浸泡切好的外植体5分钟；
(4)用无菌滤纸吸干外植体表面的菌液，转入MS固体基本培养基，28℃暗培养；
(5)三天后，将材料转到含有抗生素(Kan＝100mg/L，羧苄＝500mg/L)和6-BA的分化培养基中于25℃，16小时光照/8小时黑暗光照周期条件下进行培养，两周继代一次；
(6)待分化出的小苗长至2-3cm高时，切下转入生根培养基中诱导生根。
将上述2实例中获得的T0代转基因植物采用Northern blot鉴定。T0转基因种子使用卡那霉素选择平板萌发，确认其具有3∶1的分离比，然后将T1转基因植株转至土壤培养直至成熟，收获T2种子后开展以下抗冻性功能分析。
1.3抗冻性功能分析(图中WT、OE-2、OE-11、OE-8分别指表示为非转基因烟草、转TERF2烟草株系-2、转TERF2烟草株系-11、转TERF2烟草株系-8)
1.3.1转基因植株的抗冻性鉴定
为了检测转TERF2烟草植株的抗冻性，对生长6周的野生型和转基因烟草进行-6℃低温处理。低温处理时，每处理1小时，取出部分烟草在正常生长条件(26℃，16/8小时光周期)恢复生长48小时，观察和统计野生型和转基因烟草的死亡率，比较野生型和转基因烟草的抗冻性。
结果表明在低温处理5小时时野生型烟草开始死亡，而转基因烟草，处理6小时后，才出现死亡。在处理9小时时，野生型烟草的死亡率已达86.7％，而转TERF2基因烟草的死亡率仅为17.8％(图2，3)。
1.3.2转基因植株的冻害胁迫下电渗漏率的检测
为了检验转TERF2对烟草抗冻性的影响，进一步检测植物抗冻性的重要指标-低温胁迫条件下植物离子渗漏性。分别取两个培养在土壤中超表达转基因烟草和野生型烟草(6周大小的小苗)的叶片(来自不同植株)，用去离子水冲洗，放入50ml离心管中，加入200微升去离子水，按从-2℃到-10℃每个1℃温度梯度处理2小时，然后将处理后的样品加15毫升去离子水，在摇床轻摇过夜，测电渗，然后将样品放在灭菌锅中高温处理10分钟，测电渗，计算电渗漏率。重复上述实验两次，统计平均电渗漏率。
野生型和转基因烟草不同低温温度条件下处理的结果表明，转TERF2烟草改善了低温冻害胁迫条件下(-2℃--10℃)的离子渗漏性(图4)。如图中数据表明，-6℃低温冷冻处理下，野生型烟草平均离子渗漏率高于90％，而转基因烟草的不足40％。
1.3.3转基因植株低温胁迫下可溶性糖含量的检测
提高可溶性糖的含量是植物抗冻性的重要表现。将培养在土壤中超表达转基因烟草和野生型烟草(10周大小的苗)分别在正常温度(26℃)和低温(4℃)培养48小时，取叶片，冻干后(约20毫克)，加80％的乙醇2毫升，80℃处理15分钟，室温摇床轻摇1小时，再加80％的乙醇2毫升，80℃处理15分钟，室温摇床轻摇1小时，4℃过夜后5000g离心10分钟，然后1-2倍体积的氯仿抽提去除叶绿素，再利用蒽酮法检测其可溶性糖的含量。
通过对转TERF2烟草检测其可溶形糖的含量，发现TERF2明显提高了转基因烟草冻害胁迫下可溶性糖的含量(图5)。如图中所示，低温4℃处理48小时后，转基因烟草可溶性糖含量达到400(微克/毫克.干重)，而野生型烟草可溶性糖的含量不足200(微克/毫克.干重)。
结论：本发明提供的利用超表达TERF2提高转基因植物的抗病冻性，具有广阔的应用前景。
附录：
SEQ ID NO1(GenBank基因库登录号DQ346740，编码区105bp-246bp，321-961bp，内含子249bp-322bp，小写字母表示)
ACCAAAACCAAAACTGAAACTAAAAgaaaacttttctatacattttTCATTTCTGTATCAATCAATA
TTCTTTGTTTCTGCTGTTTTGATGAAATCACACTAAGATGTGTGGTGGTGCAATTCTT
GCTGATATCATTCCTCCTCGTGACCGCCGTTTGTCATCCACCGACCTATGGCCGACTG
ATTTCTGGCCAATTTCCACCCAAAATGTTCCTCTCAACCCCAAACGAGCTCGACCCTC
TACAGgtactagttaatcatatataaagcttaatttgttgattttgtttttatgctcatttaggcatttcaacaaacagGTGGTGAGCAG
ATGAAGAAGAGGCAAAGGAAGAATCTTTACAGAGGGATAAGACAACGTCCATGGGG
TAAATGGGCTGCTGAAATTCGTGACCCGAGAAAAGGGGTTAGGGTTTGGTTAGGTAC
TTTCAACACTGCTGAAGAAGCTGCAAGAGCTTATGATAGAGAAGCTCGTAAAATCAG
GGGTAAGAAAGCTAAAGTTAATTTCCCCAATGAAGATGACGACCATTACTGCTACAG
TCATCCAGAGCCCCCTCCCTTGAACATTGCTTGTGATACTACTGTTACTTACAATCAA
GAATCAAATAACTGTTACCCCTTTTACTCAATCGAGAACGTTGAACCTGTTATGGAAT
TTGCAAGTTATAATGGAATTGAAGATGGAGGAGAGGAGATGGTGAAAAATTTGAAT
AACAGGGTTGTAGAGGAAGAGGAGAAAACAGAGGATGAAGTGCAGATACTTTCTGA
TGAGCTGATGGCTTATGAGTCATTGATGAAGTTCTATGAAATACCGTATGTTGACGG
GCAATCAGTGGCGGCGACGGTGAATCCAGCGGCGGAGACCGCCGTGGGCGGTGGCT
CGATGGAGCTTTGGAGTTTTGATGATGTTAGTCGTCTACAACCAAGTTATAATGTAGT
T TAATTATTGTTTTG

Claims (6)

1.ERF蛋白TERF2在植物低温耐性中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将TERF2基因用于转化植物，使植物产生低温耐性。
3.根据权利要求1所述的应用，所述植物为双子叶植物和单子叶植物。
4.根据权利要求3所述的应用，所述植物为棉花、大豆、油菜、玉米、水稻、苗木、烟草或花草。
5.根据权利要求4所述的应用，所述植物为烟草。
6 根据权利要求2所述的应用，所述转化方法为农杆菌介导法、共转化法或基因枪法。
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