CN114736890A - 水稻几丁质酶及其编码基因在增强植物抗非生物胁迫中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻几丁质酶及其编码基因在增强植物抗非生物胁迫中的用途。本发明通过包括高盐、干旱胁迫等不同胁迫处理条件下水稻几丁质酶OsGH18基因的时空表达差异分析实验发现，水稻几丁质酶OsGH18基因参与水稻对盐和干旱胁迫的早期应答，并在组织应答模式上存在差别。本发明进一步采用超表达和CRISPR敲除技术分别将水稻几丁质酶OsGH18基因在水稻中进行超表达或进行敲除突变，根据转基因水稻植株的表型变化发现，在水稻中超表达OsGH18基因能够显著改善水稻抵御非生物胁迫的能力。本发明在改良、增强水稻抗逆性以及加速抗逆分子育种进程等方面具有应用前景。

Description

水稻几丁质酶及其编码基因在增强植物抗非生物胁迫中的 用途

技术领域

本发明涉及水稻几丁质酶的新用途，尤其涉及水稻几丁质酶及其编码基因在增强植物抗非生物胁迫抗性中的新用途，属于水稻几丁质酶的新用途领域。

背景技术

水稻(Oryza sativa L)是世界三分之一以上人口的主食。近年来，干旱持续时间越来越长，而且季节性、区域性和水质性干旱形势亦愈发严峻，土壤盐渍化影响范围越来越广。尽管在水稻抗逆耐盐基因功能解析和分子育种、等方面取得了一系列重大进展，但是，抗逆耐盐分子调控机制解析仍是当前逆境研究的重要课题。

糖基水解酶糖苷酶具体分为135个家族即GH1——GH135，每个家族内部的成员，彼此具有很高的结构相似度，根据其催化活性中心结构域的结构，又可将这些家族不完全归纳为14个族（Clan）即GH-A——GH-N(Davies G, Henrissat B. Structures andmechanisms of glycosyl hydrolases. Structure. 1995 Sep 15;3(9):853-9.)。其中糖基水解酶家族18 (GH18)和糖基水解酶家族19 (GH19)为几丁质酶(EC3.2.1.14)可以催化n-乙酰氨基葡萄糖生物聚合物的β-1,4糖苷键的水解裂解。几丁质酶在植物中的生理作用之一是通过降解几丁质来保护植物免受真菌病原体的侵害，其它一些几丁质酶没有任何抗真菌活性。几丁质酶根据其结构、底物特异性、催化机理和对抑制剂的敏感性分为7类(I-VII)。典型的植物几丁质酶具有n端信号区、主结构域(或催化结构域)和c端区域，这些区域仅存在于液泡几丁质酶中。特征催化结构域被称为糖基水解酶(GH)结构域，由220 ~ 230个氨基酸残基组成(Li H and Greene LH. Sequence and structural analysis of thechitinase insertion domain reveals two conserved motifs involved in chitin-binding. PLoS One,2010 ,5: e8654.)。几丁质酶属于GH18家族，包括III类和V类几丁质酶。GH19家族仅由I、II和IV类成员的几丁质酶组成。如旱稻中编码III类几丁质酶的干旱诱导蛋白3 (DIP3)可以增强水稻抗逆性（Guo XL, Bai LR, Su CQ, Shi LR, Wang DW.Molecular cloning and expression of drought-induced protein 3 (DIP3) encodinga class III chitinase in upland rice. Genet Mol Res. 2013;12(4):6860-6870. ）。前人的研究表明通过不同器官RNA的Northern blot分析，水稻几丁质酶的转录本在根中积累较高水平而叶中较低，有组织特异性(Nishiyama, R., Le, D. T., Watanabe, Y .,Matsui, A., T anaka, M., Seki, M., et al. (2012). T ranscriptome analyses ofa salt-tolerant cytokinin-deficient mutant reveal differential regulation ofsalt stress response by cytokinin deficiency. PLoS ONE 7:32124. doi: 10.1371/journal.pone.0032124)。

盐胁迫还能够导致细胞壁Ca²⁺的损失。细胞壁胁迫被认为可引起与真菌细胞-细胞壁整合(CWI)途径类似的专一的信号途径。木葡聚糖内转葡聚糖酶/水解酶（也简称为木聚糖酶）(xyloglucan endotransglucosylases/hydrolases ，XTH)是一个多基因家族编码的蛋白质，其中就包括糖基水解酶家族，XTH介导的细胞壁重塑是基于一种广泛提出的细胞壁模型，其中木葡聚糖作为承载纤维素纤维之间的栓系聚合物(Tenhaken R. Cell wallremodeling under abiotic stress. Front Plant Sci. 2015;5:771)。Cho等人在拟南芥中构建表达了辣椒XTH基因(CaXTH)，该基因此前被鉴定为辣椒中一个非生物胁迫(冷、干旱、盐)诱导的基因。如果CaXTH基因表达，则在含盐培养基上的对照拟南芥幼苗中观察到的根长度的减少不显著（Cho, S. K., Kim, J. E., Park, J. A., Eom, T. J., and Kim,W. T.Constitutive expression of abiotic stress-inducible hot pepper CaXTH3,which encodes a xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase homolog, improvesdrought and salt tolerance in transgenic Arabidopsis plants. FEBS Lett. 2006，580, 3136–3144.）。细胞壁变化极大地影响植物抗逆性。然而现在在水稻中几丁质酶基因在盐和干旱胁迫中作用还未有报道。

发明内容

本发明的主要目的在于提供水稻几丁质酶OsGH18及其编码基因在提高植物抗非生物胁迫中的应用。

为了实现上述之发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明的一方面是提供水稻几丁质酶及其编码基因在提高植物抗非生物胁迫中的用途。

本发明的第二方面是提供了一种提高植物对非生物胁迫抗性的方法，包括：将水稻几丁质酶编码基因在植物中进行过表达得到转基因植物；所得到的转基因植物对于非生物胁迫的抗性增强；譬如：将水稻几丁质酶编码基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；将所述重组植物表达载体转化受体植物，使水稻几丁质编码基因在植物中进行过表达。

作为本发明一种优选的具体实施方案，所述的提高植物对非生物胁迫抗性的具体方法包括：（1）构建含有水稻几丁质酶编码基因的重组植物表达载体；（2）将所构建的重组植物表达载体转化到受体植物组织或植物细胞中；（3）培育筛选得到对非生物胁迫抗性提高的转基因植物。

本发明的第三方面是提供了一种培育抗非生物胁迫的植物新品种的方法，包括：（1）构建含有水稻几丁质酶编码基因的重组植物表达载体；（2）将所构建的重组植物表达载体转化到受体植物组织或植物细胞中；（3）培育筛选得到对非生物胁迫抗性提高的植物新品种。

本发明进一步提供了含有所述水稻几丁质酶编码基因的重组植物表达载体以及含有所述重组植物表达载体的重组宿主细胞；将所述水稻几丁质编码基因可操作的与表达调控元件相连接得到重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区，水稻几丁质酶编码基因和3′非编码区组成；其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、增强型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

作为一种参考的具体实施方案，所述重组植物表达载体构建包括：在植物表达载体pMDC43的GFP下游attR1与attR2之间插入水稻几丁质酶编码基因。

所述的“转化”指将水稻几丁质酶编码基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法等。“稳定转化”指被引入的多核苷酸构建体整合至植物细胞的基因组中并能通过其子代遗传；“瞬时转化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暂时性表达或存在。

转化方案以及将所述基因（或多核苷酸）引入植物的方案可视用于转化的植物（单子叶植物或双子叶植物）或植物细胞的类型而变化。将所述基因多（或核苷酸）引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将所述基因（或多核苷酸）提供给植物。利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株。

本发明可用于转化任何植物种类，所述的植物包括但不限于单子叶植物或双子叶植物；更优选的，所述的植物包括农作物、蔬菜或观赏植物、果树等，例如，可以是水稻、棉花、玉米、高粱、小麦、大豆、马铃薯、大麦、番茄、菜豆、花生或甘蔗等，优选为水稻。

作为本发明一种优选的具体实施方案，所述的非生物胁迫包括干旱胁迫、盐胁迫或渗透胁迫。

作为本发明一种优选的具体实施方案，所述水稻几丁质酶的氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示；所述水稻几丁质酶编码基因的CDS核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，水稻几丁质酶编码基因的全长基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。另外，本领域技术人员还可以将SEQ ID NO.1所示的多核苷酸进行优化以增强在植物（尤其是水稻）中的表达效率。

本发明人前期通过基因芯片对抗逆导入系DK151表达谱分析时发现，水稻几丁质酶OsGH18基因在根和叶片中差异表达，表现出组织器官差异表达特性，呈现两种不同的表达模式，表明水稻几丁质酶OsGH18基因参与水稻非生物胁迫。本发明进一步通过干旱、高盐胁迫下OsGH18基因随着处理时间的延长表达量的变化结合超表达和CRISPR敲除水稻植株的表型变化，进行其基因克隆与功能分析，分析候选基因与水稻非生物胁迫应答的关系，结果表明在水稻中超表达OsGH18基因能够显著改善水稻抵御盐与干旱胁迫的能力。本发明为改良、增强水稻抗逆性，加速抗逆分子育种进程，具有十分重要的理论和实际意义。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“重组植物表达载体”意指一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

术语“转化”指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

附图说明

图1为以实时定量PCR分析OsGH18在非生物胁迫下的表达量差异； Salt：150mMNaCl处理(盐胁迫) ；PEG：20％PEG处理(渗透胁迫)。

图2为过表达材料和敲除材料转基因植株PCR纯合鉴定；+:表示添加，-：表示未添加。

图 3为水稻几丁质酶OsGH18基因过表达材料的各个株系的表达量。

图4为超表达OsGH18、CRISPR敲除转基因植株与野生型植株在20%PEG-6000模拟干旱胁迫下的表型。

图5为超表达OsGH18、CRISPR敲除转基因植株转与野生型植株在苗期土壤干旱胁迫或苗期盐胁迫下的表型，上部为超表达OsGH18、CRISPR敲除转基因植株与野生型植株在苗期土壤干旱胁迫下的表型，下部为超表达OsGH18、CRISPR敲除转基因植株与野生型植株在苗期盐胁迫（140mM）下的表型。

图6超表达OsGH18、CRISPR敲除转基因植株在20%PEG-6000下的MDA测定数据。

图7超表达OsGH18、CRISPR敲除转基因植株在20%PEG-6000下的SOD测定数据。

图8超表达OsGH18、CRISPR敲除转基因植株在20%PEG-6000下的POD测定数据。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验例1不同胁迫处理条件下OsGH18基因的时空表达差异分析实验

实验材料：日本晴(Nipponbare，Oryza sativa ssp .japonica) (来源于中国农业科学院作物科学研究所获得)。

⒈水稻的高盐、干旱胁迫

水稻日本晴种子经消毒处理，室温浸种2d，37℃ 发芽1d，萌发后选发芽一致的种子播于去底PCR 96孔板上，每孔1粒，二叶前水培，二叶后用Yoshida 营养液培养，于五叶期开始、高盐(150mmol/LNaCl) 和渗透胁迫(20％PEG)处理，日本晴于胁迫处理0h、1h、2h、4h、8h、12h、24h 后取叶片以及根系。

⒉实时定量PCR分析

采用TRIZOL试剂提取实验样品总RNA并进行RNA纯度的分析：用1％琼脂糖凝胶电泳快速检测提取的总RNA的完整性，DNase I消化RNA中的基因组DNA，具体方法和步骤参照说明书。

反转录：

第一链cDNA的合成用反转录用试剂盒(天根生化科技有限公司，Code no：KR118)。

Real Time PCR分析：

Real Time PCR分析，所用OsGH18的PCR引物如下：

F：5 ′-AAGACGGAGGGCTCACTGAAGG-3 ′；

R：5 ′-CCGAAGACGCTGAAGAAGGAGATG-3 ′；

内参基因UBQ引物序列为：

F：5 ′-GCTCCGTGGCGGTATCAT-3 ′；

R：5 ′- CGGCAGTTGACAGCCCTAG-3 ′。

Real Time PCR的分析使用天根生化科技有限公司的荧光定量检测试剂盒(Codeno：FP209) ，应用的Real Time PCR扩增仪为ABI7500，方法见说明书。

数据分析：

用相对定量法计算目的基因相对表达量Rel .Exp＝2-ΔΔCt，其中ΔΔCt ＝[(待测样品目的基因的Ct-待测样品看家基因的Ct)-(对照组目的基因的Ct- 对照组看家基因的Ct)]。

标准方差的计算用Excel完成，先用统计函数STDEV算出样品和对照的S值，再将两个S值算平方，算出(S12+S22)/3的值，进而算出X＝ Power((S12+S22)/3，0 .5) ，最后算出方差＝(2(-ddct-x)-2(-ddct+x))/2。

日本晴中OsGH18在高盐、PEG胁迫下的表达量变化谱如图1所示，从图1可见，在2种胁迫下OsGH18基因表达量都存在一定的变化，但是表达模式存在差异。在20%PEG 下，OsGH18基因的表达量在地上部先下降后上升趋势，并在胁迫处理2h达最低水平， 而在根中OsGH18基因表达量先上升后下降，在1h达到最高水平，在盐胁迫下OsGH18基因表达量在地上部逐渐上升趋势，而在根中则是先上升后下降的趋势；以上结果表明OsGH18基因参与水稻盐和模拟干旱胁迫的早期应答，并在组织应答模式上存在差别。

实验例2 OsGH18基因在水稻中进行遗传转化实验

⒈OsGH18基因过表达载体构建

首先用用限制性内切酶EmaI1051消化pGWC载体(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得) ，使其线性化并回收。

根据日本晴序列全长设计引物，以日本晴cDNA为模板，扩增获得 OsGH18的基因编码区全长，同时在5 ′和3 ′端加上pGWC载体线性化后的接头，扩增引物为：

F：5 ′-gcaggctttgactttATGGTGGCGATCACGGCGC-3 ′(下划线部分为接头序列) ；

R：5 ′-gggtctagagactttTTTCTTCGTCGCGGCCTCATC-3 ′(下划线部分为接头序列)；

PCR扩增并回收目的DNA片段(936bp)。采用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech，Code no：639648)进行目的片段与线性化载体的同源重组，阳性克隆质粒进行PCR和测序验证，测序结果表明在载体pGWC的两个EmaI1051酶切位点之间插入了SEQ ID NO.1所示的OsGH18基因片段（该序列所编码OsGH18蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO .2所示）得到入门载体，将重组载体命名为pGWC-OsGH18。

采用

LR

II enzyme mix(Invitrogen，Code no：11791020)进行最终载体构建，阳性克隆质粒进行PCR和测序验证，测序结果表明在载体pMDC43(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得) 的GFP下游插入了SEQ ID NO .1所示的OsGH18基因片段，该序列所编码的OsGH18蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示，将重组载体命名为pMDC43-OsGH18。

⒉OsGH18基因CRISPR敲除载体构建

根据OsGH18基因c DNA序列设计敲除的靶位点 ，所用网站为：http : // skl.scau .edu .cn/dsdecode/；

靶位点1序列：5 ′-TCGTCGTCAAGAGACATAGC-3 ′，

靶位点2序列：5 ′-ACCAGCACGTCGTAGTTCGC-3 ′，

实验方法及载体据来自刘耀光院士实验室(Ma X ,Zhang Q ,Zhu Q ,Liu W ,ChenY ,Qiu R , Wang B ,Yang Z ,Li H ,Lin Y ,Xie Y , Shen R ,Chen S ,Wang Z ,Chen Y ,Guo J , Chen L ,Zhao X ,Dong Z ,Liu YG .A Robust CRISPR/Cas9 Systemfor Convenient ,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and DicotPlants .Molecular Plant,2015,8(8):1274-1284)，将重组载体命名为 pYLCRISPR/Cas9Pubi-OsGH18。

⒊农杆菌转化

冻融法将表达载体pMDC43-OsGH18和敲除载体 pYLCRISPR/Cas9Pubi-OsGH18 转入农杆菌EHA105感受态细胞中(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Ruifang Yang ,Qicai Tang ,HuimeiWang ,Xiaobo Zhang ,GangPan ,HongWang and Jumin Tu Analyses of two rice(Oryza sativa)cyclin-dependentkinase inhibitors and effects of transgenic expression of OsiICK6 on plantgrowth and development，2011 ,Annals of Botany ,107:1087-1101) ，方法参照分子克隆实验指南。

⒋遗传转化

用农杆菌介导的遗传转化法，以日本晴为受体材料，进行遗传转化，培养基配方见表1。

表1 遗传转化所用培养基及其配方

具体方法如下：

1)愈伤诱导

取适量成熟的水稻种子，脱壳后，先用70％酒精清洗消毒1min，期间不断地摇荡，再用15％的次氯酸钠消毒处理30min(可置于摇床上振荡) ；最后用无菌蒸馏水冲洗4～5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后接种。将消毒处理后的种子接种于含有2 .0mg/L的2，4-D的诱导培养基中，28℃暗培养30～40天。培养获得的愈伤在继代培养基上扩大培养，每2周继代一次，直至胚性愈伤形成。

农杆菌侵染

a)将携带有表达质粒载体pMDC43-OsGH18和 pYLCRISPR/Cas9Pubi-OsGH18的农杆菌划线于含有抗生素(50mg/L卡那霉素或壮观霉素、25mg/L利福平)的LB固体培养基表面，28℃，200rpm 培养过夜。

b) 用灭过菌的牙签挑取单克隆菌落，接种到5mL含有相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃震荡培养到OD600＝0 .5。

c)取活化好的的新鲜菌液按1:100的比例接种到25mL相同的YEB液体培养基中，在相同条件下培养至OD600＝0 .5。

d)菌液在5000g，4℃下离心10min收集菌体，弃去上清液；加入25mL 10mM的MgSO4悬浮菌体，并用移液枪轻轻吸打使其充分悬浮，在5000g，4℃下离心10min重新收集菌体，弃去上清液。

e)用25mL含有200μM乙酰丁香酮(AS)的AA-AS浸染培养基重新悬浮。

f)将生长状态良好的胚性愈伤从继代培养基中转移至表面覆有无菌滤纸的培养皿中(愈伤切成0 .3～0 .4mm大小) ，在超净工作台上风干10～20min。

g)将干燥的胚性愈伤浸入含有上述菌液的50mL离心管中20min，期间每隔5min摇荡一次；之后倒掉菌液，将愈伤取出置于无菌滤纸上风干10～20 min，然后转移至表面铺有无菌滤纸的含有200μM乙酰丁香酮(AS)的CC培养基中，25℃黑暗条件下共培养3天。

h)收集表面没有明显农杆菌的愈伤组织，用含600mg/L头孢霉素的无菌水冲洗3次，吸取多余水分。

i)将愈伤组织转入筛选培养基(含500mg/L头孢霉素和50mg/L潮霉素的N6培养基)上继续筛选2～3次，每次两周。最终得到生长良好的鲜黄色潮霉素抗性愈伤组织。

转化体植株再生

取新鲜潮霉素抗性的愈伤，将愈伤组织分割成2mm的小块，接于预分化培养基中，28℃暗培养7天，然后置于光照培养间(12h光照/12h黑暗)继续培养 8-9天后将已分化出不定芽的愈伤组织后转入再生培养基(250mL组培瓶) 上，继续光照培养。等到不定芽长成4～6cm高的小苗后再转移到生根培养基中，在28℃光照培养间(12h光照/12h黑暗) 条件下培养约15天，得到转化体植株，移到温室种植(T0代) ，一月后取叶片进行PCR阳性鉴定(Hpt-F：5’-CTATTTCTTTGCCCTCGGAC-3’，Hpt-R：5’-CCTGACCTATTGCATCTCCC-3’) ，并收获其阳性植株种子 (T1代)。

对敲除OsGH18基因的转基因植株以及过表达OsGH18基因的转基因植株进行纯合鉴定的引物如下：

①敲除OsGH18基因的转基因植株鉴定引物

KO-F attgacgacgaccacagc

KO-R GTCGGTCTTGTTCGTGCA

②过表达OsGH18基因的转基因植株的鉴定引物

OE-F atggcatggatgaactatacaa

OE-R GACGTCCTTGGCCGAATTG

图2为过表达材料和敲除材料转基因植株PCR纯合鉴定。

⒌转基因植株分子鉴定和抗逆性鉴定

选用T2代OsGH18转基因超表达、OsGH18基因CRISPR和野生型日本晴的种子，发芽后播种于盛有草炭土的盒子内，培养条件为光照/黑暗为16/8h，光照条件26℃，黑暗条件22℃，光强30000lx。利用荧光定量PCR(方法同上)和测序的方法检测转基因水稻在RNA水平的表达量。

图3为OsGH18基因过表达材料的各个株系的表达量。从图3中见，相比于野生型材料，OsGH18基因过表达材料各株系中OsGH18的表达量都有不同程度的提高，在过表达材料中OE-2上调表达最为显著。

以下为敲除材料的敲除情况，敲除5个株系的两种类型：

类型1:

位点1 CAGCCATGGCGCGCCACCAGC--TGTCTCTTGACGACGACGATGC

类型2:

位点1 CAGCCATGGCGCGCCACCAGC--TGTCTCTTGACGACGACGATGC

位点2 ACGGCGGGCCGGCGAAACTACGACGTGCT

类型1:

ATGGCGCGCCACCAGC**TGTCTCTTGACGACGACGATGCTAGTAGCCGTCGTCGTCTTCCTCCCGTGCCTCGCCACCGCCACCGGAAAGACCGGCCAGATCGCCGTCTTCTGGGGCCGCAACAAGACGGAGGGCTCACTGAAGGAGGCCTGCGACACCGGCCTCTACACCACCGTCATCATCTCCTTCTTCAGCGTCTTCGGCCACGGCCGCTACTGGACCGACCTCTCCGGCCACGATGTCTCCCGAGTCGGCGCCGACGTCAAGCACTGCCAGTCCAAGAACATCCCCGTCCTCCTCTCCGTCGGCGGCGACGGCTACCAGTACTCGCTCCCCACCGCCAATTCGGCCAAGGACGTCGCGGACCACCTCTGGCACGCCTACCTCGGCGGCGGCCGCAGGGGCGTGTTCCGCCCCTTCGGCGACGCCGTGCTCGACGGCGTCGACCTCTACATCGACCACGGCGGGCCGGCGAAaCTACGACGTGCTGGTCCGGCGCCTCGCCGGCTACCGCGGCAAGCCGGTGCTGCTGACGGCGACGCCGAGGTGCGTGTACCCGGACGCGAACGCGGCGGCGGCGCTGGGGACGGGGCTGGTGCGGCGCATCCACCCGCGGTTCTACGGCGACGCGGCGTGCACGAACAAGACCGACGGCGAGGGGCGGAGGAGCCTGTTCGACTGGGAGGACTGGGACGCGTGGACGTCGCGGTTCCCGGCGAGCCAGGTGTACGTGGGGCTTCCGGCGGAGGAGACGGCGGCGGACTGGATAAACCCGGAGTCGCTCTACTACGCCGTGATGCAGAGGGCGCAGACAGCGAGCAACTACGGCGGCGCCATGCTGTGGGACCGAGGCGCCGACAAAGCCTACGATAACTACTACGGCAGGGCGCTCAAGGACTTCGTTTGA

类型2:

ATGGCGCGCCACCAGC**TGTCTCTTGACGACGACGATGCTAGTAGCCGTCGTCGTCTTCCTCCCGTGCCTCGCCACCGCCACCGGAAAGACCGGCCAGATCGCCGTCTTCTGGGGCCGCAACAAGACGGAGGGCTCACTGAAGGAGGCCTGCGACACCGGCCTCTACACCACCGTCATCATCTCCTTCTTCAGCGTCTTCGGCCACGGCCGCTACTGGACCGACCTCTCCGGCCACGATGTCTCCCGAGTCGGCGCCGACGTCAAGCACTGCCAGTCCAAGAACATCCCCGTCCTCCTCTCCGTCGGCGGCGACGGCTACCAGTACTCGCTCCCCACCGCCAATTCGGCCAAGGACGTCGCGGACCACCTCTGGCACGCCTACCTCGGCGGCGGCCGCAGGGGCGTGTTCCGCCCCTTCGGCGACGCCGTGCTCGACGGCGTCGACCTCTACATCGACCACGGCGGGCCGGCGAACTACGACGTGCTGGTCCGGCGCCTCGCCGGCTACCGCGGCAAGCCGGTGCTGCTGACGGCGACGCCGAGGTGCGTGTACCCGGACGCGAACGCGGCGGCGGCGCTGGGGACGGGGCTGGTGCGGCGCATCCACCCGCGGTTCTACGGCGACGCGGCGTGCACGAACAAGACCGACGGCGAGGGGCGGAGGAGCCTGTTCGACTGGGAGGACTGGGACGCGTGGACGTCGCGGTTCCCGGCGAGCCAGGTGTACGTGGGGCTTCCGGCGGAGGAGACGGCGGCGGACTGGATAAACCCGGAGTCGCTCTACTACGCCGTGATGCAGAGGGCGCAGACAGCGAGCAACTACGGCGGCGCCATGCTGTGGGACCGAGGCGCCGACAAAGCCTACGATAACTACTACGGCAGGGCGCTCAAGGACTTCGTTTGA

根据上述敲除情况可见，CRISPR敲除株系1在CDS起始的17位和18位缺失T与A碱基及477位插入A导致移码突变，CRISPR敲除株系2在CDS起始的17位和18位缺失T与A碱基导致移码突变。

在水稻生长至四叶期用PEG(20％)处理模拟干旱胁迫，每胁迫处理进行6次随机重复，实验设3次重复，结果见图4。图4中左部A,D两图是OsGH18转基因株系与野生型植株在胁迫前的表型，右部BC和EF为20% PEG-6000分别处理10和7天然后恢复期为7天后的转基因株系和野生型株系的表型。

图5的上部OsGH18转基因植株与野生型植株在苗期土壤干旱胁迫下的表型，图5的下部为OsGH18转基因植株与野生型植株在苗期盐胁迫（140mM）下的表型。

根据图4和图5的试验结果可见，在水稻中超表达水稻几丁质酶OsGH18基因能够显著改善水稻抵御干旱胁迫的能力，将水稻中的OsGH18基因进行突变或敲除后会明显降低水稻抵御干旱胁迫的能力，因此，水稻OsGH18蛋白及其编码基因和重组载体能够应用于增强作物的抗非生物胁迫能力。

转基因植株在20%PEG-6000下的MDA含量测定

MDA含量测定方法：首先用10%三氯乙酸(TCA)溶液冰上研磨样品来提取丙二醛，离心取部分上清液加入0.67%硫代巴比妥酸(TBA)，之后分别测定532 nm、600 nm和450 nm处的吸光度值，根据公式计算MDA的摩尔浓度，C (μmol/L) = 6.45 (A532 - A600) - 0.56A450（Ouyang S.Q., Liu Y.F., Liu P., et al. Receptor-like kinase OsSIK1 improves drought and salt stress tolerance in rice (Oryza sativa) plants.Plant Journal for Cell and Molecular Biology, 2010, 62(2): 316.）。

转基因植株在20%PEG-6000下的MDA含量测定结果见表6。

转基因植株在20%PEG-6000下的SOD、POD的酶活测定

SOD、POD的酶活测定方法：用PBS溶液研磨样品，获取抗氧化酶的粗提液，利用分光光度计测定不同波长的吸光值从而计算SOD、POD的酶活（Ouyang S.Q., Liu Y.F., LiuP., et al. Receptor-like kinase OsSIK1 improves drought and salt stresstolerance in rice (Oryza sativa) plants. Plant Journal for Cell and MolecularBiology, 2010, 62(2): 316.）。

转基因植株在20%PEG-6000下的SOD、POD的酶活测定结果分别见图7和图8。

根据测定结果可见，过表达OsGH18基因的转基因植株中的抗氧化物质较多，其抗氧化胁迫能力较强。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 水稻几丁质酶及其编码基因在增强植物抗非生物胁迫中的用途

<130> BJ-2011-220213A-L

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 906

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 1

atggcgcgcc accagctatg tctcttgacg acgacgatgc tagtagccgt cgtcgtcttc 60

ctcccgtgcc tcgccaccgc caccggaaag accggccaga tcgccgtctt ctggggccgc 120

aacaagacgg agggctcact gaaggaggcc tgcgacaccg gcctctacac caccgtcatc 180

atctccttct tcagcgtctt cggccacggc cgctactgga ccgacctctc cggccacgat 240

gtctcccgag tcggcgccga cgtcaagcac tgccagtcca agaacatccc cgtcctcctc 300

tccgtcggcg gcgacggcta ccagtactcg ctccccaccg ccaattcggc caaggacgtc 360

gcggaccacc tctggcacgc ctacctcggc ggcggccgca ggggcgtgtt ccgccccttc 420

ggcgacgccg tgctcgacgg cgtcgacctc tacatcgacc acggcgggcc ggcgaactac 480

gacgtgctgg tccggcgcct cgccggctac cgcggcaagc cggtgctgct gacggcgacg 540

ccgaggtgcg tgtacccgga cgcgaacgcg gcggcggcgc tggggacggg gctggtgcgg 600

cgcatccacc cgcggttcta cggcgacgcg gcgtgcacga acaagaccga cggcgagggg 660

cggaggagcc tgttcgactg ggaggactgg gacgcgtgga cgtcgcggtt cccggcgagc 720

caggtgtacg tggggcttcc ggcggaggag acggcggcgg actggataaa cccggagtcg 780

ctctactacg ccgtgatgca gagggcgcag acagcgagca actacggcgg cgccatgctg 840

tgggaccgag gcgccgacaa agcctacgat aactactacg gcagggcgct caaggacttc 900

gtttga 906

<210> 2

<211> 301

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400> 2

Met Ala Arg His Gln Leu Cys Leu Leu Thr Thr Thr Met Leu Val Ala

1 5 10 15

Val Val Val Phe Leu Pro Cys Leu Ala Thr Ala Thr Gly Lys Thr Gly

20 25 30

Gln Ile Ala Val Phe Trp Gly Arg Asn Lys Thr Glu Gly Ser Leu Lys

35 40 45

Glu Ala Cys Asp Thr Gly Leu Tyr Thr Thr Val Ile Ile Ser Phe Phe

50 55 60

Ser Val Phe Gly His Gly Arg Tyr Trp Thr Asp Leu Ser Gly His Asp

65 70 75 80

Val Ser Arg Val Gly Ala Asp Val Lys His Cys Gln Ser Lys Asn Ile

85 90 95

Pro Val Leu Leu Ser Val Gly Gly Asp Gly Tyr Gln Tyr Ser Leu Pro

100 105 110

Thr Ala Asn Ser Ala Lys Asp Val Ala Asp His Leu Trp His Ala Tyr

115 120 125

Leu Gly Gly Gly Arg Arg Gly Val Phe Arg Pro Phe Gly Asp Ala Val

130 135 140

Leu Asp Gly Val Asp Leu Tyr Ile Asp His Gly Gly Pro Ala Asn Tyr

145 150 155 160

Asp Val Leu Val Arg Arg Leu Ala Gly Tyr Arg Gly Lys Pro Val Leu

165 170 175

Leu Thr Ala Thr Pro Arg Cys Val Tyr Pro Asp Ala Asn Ala Ala Ala

180 185 190

Ala Leu Gly Thr Gly Leu Val Arg Arg Ile His Pro Arg Phe Tyr Gly

195 200 205

Asp Ala Ala Cys Thr Asn Lys Thr Asp Gly Glu Gly Arg Arg Ser Leu

210 215 220

Phe Asp Trp Glu Asp Trp Asp Ala Trp Thr Ser Arg Phe Pro Ala Ser

225 230 235 240

Gln Val Tyr Val Gly Leu Pro Ala Glu Glu Thr Ala Ala Asp Trp Ile

245 250 255

Asn Pro Glu Ser Leu Tyr Tyr Ala Val Met Gln Arg Ala Gln Thr Ala

260 265 270

Ser Asn Tyr Gly Gly Ala Met Leu Trp Asp Arg Gly Ala Asp Lys Ala

275 280 285

Tyr Asp Asn Tyr Tyr Gly Arg Ala Leu Lys Asp Phe Val

290 295 300

<210> 3

<211> 1265

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 3

gatgccttca catcacgtac taattaagcc atcgtatcat atcagccatg gcgcgccacc 60

agctatgtct cttgacgacg acgatgctag tagccgtcgt cgtcttcctc ccgtgcctcg 120

ccaccgccac cggaaagacc ggccagatcg ccgtcttctg gggccgcaac aagacggagg 180

gctcactgaa ggaggcctgc gacaccggcc tctacaccac cgtcatcatc tccttcttca 240

gcgtcttcgg ccacggccgc tactggaccg acctctccgg ccacgatgtc tcccgagtcg 300

gcgccgacgt caagcactgc cagtccaaga acatccccgt cctcctctcc gtcggcggcg 360

acggctacca gtactcgctc cccaccgcca attcggccaa ggacgtcgcg gaccacctct 420

ggcacgccta cctcggcggc ggccgcaggg gcgtgttccg ccccttcggc gacgccgtgc 480

tcgacggcgt cgacctctac atcgaccacg gcgggccggc gaactacgac gtgctggtcc 540

ggcgcctcgc cggctaccgc ggcaagccgg tgctgctgac ggcgacgccg aggtgcgtgt 600

acccggacgc gaacgcggcg gcggcgctgg ggacggggct ggtgcggcgc atccacccgc 660

ggttctacgg cgacgcggcg tgcacgaaca agaccgacgg cgaggggcgg aggagcctgt 720

tcgactggga ggactgggac gcgtggacgt cgcggttccc ggcgagccag gtgtacgtgg 780

ggcttccggc ggaggagacg gcggcggact ggataaaccc ggagtcgctc tactacgccg 840

tgatgcagag ggcgcagaca gcgagcaact acggcggcgc catgctgtgg gaccgaggcg 900

ccgacaaagc ctacgataac tactacggca gggcgctcaa ggacttcgtt tgatcgattc 960

tcacattcaa tccggccgcc attgctgctt catcggagct tcaattcgat caacttcttc 1020

ttcccaatag tatatgcatg attgtgtata ataatggagc cagctttgaa tttgtttgcg 1080

tagcgtgtgt acgtgtgcgc gtatgtaatt tgtgagtgtc tctcagggtg ctgtatgctt 1140

gaattaaggt acatgaacaa taaattcaag tatgcactac gtatctgcta gtagttgtat 1200

ttgttctcaa gagttggaga gtggggcttg ggctagctat ataccgggaa taaactattt 1260

tgatc 1265

Claims (10)

1.水稻几丁质酶或水稻几丁质酶编码基因在提高植物对于非生物胁迫抗性中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的非生物胁迫包括干旱胁迫、盐胁迫或渗透胁迫。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的植物是农作物。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的农作物是水稻。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述水稻几丁质酶的氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示；所述水稻几丁质酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

6.一种提高植物对非生物胁迫抗性的方法，其特征在于，包括：将水稻几丁质编码基因在植物中进行过表达得到转基因植物；所得到的转基因植物对于非生物胁迫的抗性增强。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括：（1）构建含有水稻几丁质酶编码基因的重组植物表达载体；（2）将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；（3）培育筛选得到对非生物胁迫抗性提高的转基因植物。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述水稻几丁质酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述非生物胁迫包括干旱胁迫、盐胁迫或渗透胁迫；所述的植物是农作物。

9.一种培育抗非生物胁迫的植物新品种的方法，其特征在于，包括：（1）构建含有水稻几丁质酶编码基因的重组植物表达载体；（2）将所构建的重组植物表达载体转化到植物的组织或植物的细胞中；（3）培育筛选得到对非生物胁迫抗性提高的植物新品种。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述水稻几丁质酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；非生物胁迫包括干旱胁迫、盐胁迫或渗透胁迫；所述的植物是农作物。

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