CN116731141A - 与植物耐逆性相关的GsbZIP43蛋白及其相关生物材料与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与植物耐逆性相关的GsbZIP43蛋白及其相关生物材料与应用。本发明的蛋白质GsbZIP43为a1)或a2)或a3)或a4)：a1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；a2)在序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐逆性相关的蛋白质；a4)与序列3所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于大豆且与植物耐逆性相关的蛋白质。本发明的实验证明，将GsbZIP43基因超表达于拟南芥中，可增强拟南芥对盐碱胁迫的耐性，说明该蛋白可以为培育耐盐碱的转基因植物的研究奠定基础。

Description

与植物耐逆性相关的GsbZIP43蛋白及其相关生物材料与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及与植物耐逆性相关的GsbZIP43蛋白及其相关生物材料与应用。
背景技术
盐碱胁迫作为世界上最常见的影响作物生长发育、降低作物产量的逆境胁迫环境因素广受关注。目前全世界有150多亿亩的盐碱地，而我国就有15亿亩盐碱地，约占世界总面积的10％左右。因此，合理开发利用盐碱地，挖掘潜在耕地资源，对于提高土地利用面积、提高粮食产量都有着特殊意义。近年来，随着植物基因工程与分子生物学的发展，通过分子设计育种手段培育耐盐碱作物，提高作物的产量与品质已成为快速、有效的分子育种方法。因此挖掘相关耐盐碱基因并应用于大豆耐盐碱育种中变得尤为重要。
植物bZIP转录因子家族，即碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper)家族，是植物体内最大的转录因子家族之一。bZIP家族转录因子广泛参与植物的各种生物学过程，如ABA信号通路、种子萌发、植物开花、以及各种非生物胁迫等等。在大豆bZIP转录因子研究中，已有研究报道GmbZIP44，GmbZIP62，GmbZIP78导入拟南芥显著提升了植株耐盐能力；GmbZIP123提高了转基因拟南芥种子的油脂、葡萄糖、果糖和蔗糖含量；GmbZIP60能被ABA显著诱导，调控ABA相关通路基因表达；GmFDL19可以和FT相关基因互作调控大豆开花。然而目前对于GsbZIP43的相关功能还尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了与植物耐逆性相关蛋白GsbZIP43的新用途。
本发明提供了GsbZIP43蛋白在如下1)-3)中的应用：
1)调控植物耐逆性；
2)培育耐逆性提高的转基因植物；
3)植物育种；
所述GsbZIP43蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
a2)在序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐逆性相关的蛋白质；
a4)与序列3所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于大豆且与植物耐逆性相关的蛋白质。
其中，序列3由163个氨基酸残基组成。
上述a2)所述的蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述a3)所述的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述a4)所述的蛋白质中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。所述同一性包括与本发明的序列3所示的氨基酸序列具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同源性的氨基酸序列。
上述a1)或a2)或a3)或a4)所述的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了与GsbZIP43蛋白相关的生物材料的新用途。
本发明提供了与GsbZIP43蛋白相关的生物材料在如下1)-3)中的应用：
1)调控植物耐逆性；
2)培育耐逆性提高的转基因植物；
3)植物育种。
所述生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：
A1)编码GsbZIP43蛋白的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。
上述应用中，A1)所述核酸分子为如下B1)或B2)或B3)或B4)所示的基因：
B1)序列1所示的基因组DNA分子；
B2)序列2所示的cDNA分子；
B3)与B1)或B2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GsbZIP43蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；
B4)在严格条件下与B1)或B2)或B3)限定的核苷酸序列杂交，且编码GsbZIP43蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GsbZIP43蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码GsbZIP43蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GsbZIP43蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述应用中，A2)所述的含有编码GsbZIP43蛋白的核酸分子的表达盒(GsbZIP43基因表达盒)是指能够在宿主细胞中表达GsbZIP43蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动GsbZIP43转录的启动子，还可包括终止GsbZIP43转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
可用现有的表达载体构建含有所述GsbZIP43基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述应用中，所述耐逆性可为耐盐碱胁迫。
进一步的，所述耐盐碱胁迫可为耐碳酸盐胁迫。
更进一步的，所述耐碳酸盐胁迫可为耐NaHCO3胁迫。
上述应用中，所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性；所述提高植物耐逆性体现为：在NaHCO3胁迫处理下，植物中GsbZIP43蛋白含量和/或活性越高或GsbZIP43基因表达量越高，植物的耐逆性越高；进一步体现为：在NaHCO3胁迫处理下，植物中GsbZIP43蛋白含量和/或活性越高或GsbZIP43基因表达量越高，植物的根长越长、SOD活性越高、POD活性越高、MDA含量越低、叶绿素含量越高、长势越好。
上述应用中，所述植物育种的目的为培育耐盐碱植物(如耐碳酸盐植物)。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物。所述豆科植物具体可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮。所述十字花科植物具体可为拟南芥或油菜。所述菊科植物具体可为向日葵。所述拟南芥具体可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。
本发明提供的培育耐逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中GsbZIP43蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。
上述方法中，所述耐逆性可为耐盐碱胁迫。
进一步的，所述耐盐碱胁迫可为耐碳酸盐胁迫。
再进一步的，所述耐碳酸盐胁迫可为耐NaHCO3胁迫。
更进一步的，所述耐NaHCO3胁迫可为幼苗期耐NaHCO3胁迫或成苗期耐NaHCO3胁迫。
在本发明的具体实施例中，所述耐NaHCO3胁迫具体体现在如下X1)-X5)中的任一种：
X1)在碳酸盐胁迫(NaHCO3胁迫)下，所述转基因植物的根长长于所述受体植物；
X2)在碳酸盐胁迫(NaHCO3胁迫)下，所述转基因植物的SOD活性高于所述受体植物；
X3)在碳酸盐胁迫(NaHCO3胁迫)下，所述转基因植物的POD活性高于所述受体植物；
X4)在碳酸盐胁迫(NaHCO3胁迫)下，所述转基因植物的MDA含量低于所述受体植物；
X5)在碳酸盐胁迫(NaHCO3胁迫)下，所述转基因植物的叶绿素含量高于所述受体植物。
所述NaHCO3胁迫具体可为4mM NaHCO3或150mM NaHCO3。
上述方法中，所述提高受体植物中GsbZIP43蛋白的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达GsbZIP43蛋白。
进一步的，所述过表达的方法为将GsbZIP43蛋白的编码基因导入受体植物。
更进一步的，所述GsbZIP43蛋白的编码基因如序列表中序列2所示。
上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物。所述豆科植物具体可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮。所述十字花科植物具体可为拟南芥或油菜。所述菊科植物具体可为向日葵。所述拟南芥具体可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述GsbZIP43基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明将GsbZIP43基因超表达于拟南芥中，得到GsbZIP43转基因拟南芥。通过实验证明：在碳酸盐胁迫下，GsbZIP43转基因拟南芥的根长长于受体植物、SOD活性、POD活性和叶绿素含量高于受体植物，MDA含量低于受体植物。说明GsbZIP43基因可增强拟南芥对盐碱胁迫的耐性，GsbZIP43蛋白可以为培育耐盐碱转基因植物的研究奠定基础。
附图说明
图1为野生大豆碳酸盐胁迫应答GsbZIP43基因的筛选及酵母功能验证。
图2为GsbZIP43酵母体内转录激活活性分析。
图3为GsbZIP43蛋白在植物细胞内的亚细胞定位分析。
图4为GsbZIP43基因在50mM碳酸盐胁迫下的表达模式分析。
图5为植物表达载体构建与转化大肠杆菌/农杆菌后菌落PCR鉴定。其中，M：DL15K；+：阳性对照；-：阴性对照；1～2：菌落PCR产物。
图6为转基因拟南芥分子生物学鉴定。其中，M：2K Plus II；+：阳性对照(pCAMBIA3300U-GsbZIP43)；-：水对照；1～6：转基因植株。A：GsbZIP43转基因植株的PCR检测；B：GsbZIP43转基因植株的RT-PCR检测。
图7为GsbZIP43转基因拟南芥的碳酸盐胁迫耐性分析。A：幼苗期GsbZIP43转基因植株在碳酸盐胁迫下的生长情况；B：GsbZIP43转基因植株在碳酸盐胁迫下的根长；C：成苗期GsbZIP43转基因植株在碳酸盐胁迫下的生长情况；D：成苗期叶绿素含量；E：成苗期SOD活性；F：成苗期POD活性；G：成苗期MDA含量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的大豆材料G07256记载于文献“Ge Y,Li Y,Zhu YM,Bai X,Lv DK,Guo DJ,Ji W,Cai H:Global transcriptome profiling of wild soybean(Glycinesoja)roots under NaHCO3 treatment[J].BMC plant biology 2010,10.”和“葛瑛,朱延明,吕德康,董婷婷,王维世,谭上进,刘彩虹,邹平.野生大豆碱胁迫反应的研究[J].草业科学,2009,26(02):47-52.”中，公众可从黑龙江八一农垦大学处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pCAMBIA330035Su记载于文献“Xiaoli Sun,Wei Ji,XiaodongDing,Xi Bai,Hua Cai,Shanshan Yang,Xue Qian,Mingzhe Sun,Yanming Zhu.GsVAMP72,anovel Glycine soja R-SNARE protein,is involved in regulating plant salttolerance and ABA sensitivity.Plant Cell Tiss Organ Cult 2013,113:199–215”中，公众可从黑龙江八一农垦大学处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的根癌农杆菌GV3101记载于文献“Lee CW,et al.Agrobacteriumtumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense inArabidopsis thaliana,Plant Cell,2009,21(9),2948-62”中，公众可从黑龙江八一农垦大学处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、野生大豆中耐碳酸盐相关基因GsbZIP43的获得
一、野生大豆碳酸盐胁迫应答GsbZIP43基因的筛选
本发明从吉林西部重度盐碱地(pH＝10.6)采集了345份野生大豆材料，经过碳酸盐胁迫处理(150mM NaHCO3，pH9.5)和生理指标分析，筛选出了1份耐碳酸盐能力最强的株系G07256。通过以耐碱能力极强的野生大豆G07256为试验材料，构建野生大豆cDNA文库，并将cDNA文库转入AH109酵母菌株中，然后利用含10mM、11mM、12mM、13mM NaHCO3的SD缺失亮氨酸培养基进行筛选碱胁迫应答相关基因，最终基于构建的野生大豆cDNA文库获得了显著响应碳酸盐逆境的关键调控基因GsbZIP43。
二、GsbZIP43全长基因的克隆
1、采用同源克隆技术通过Phytozome获得与栽培大豆同源的GsbZIP43基因的全长序列，以此为模板应用Primer Premier 5.0设计基因全长克隆引物如下：
GsbZIP43-S：5'-GGAATTCCATATGGCTTCTCCTGGTGG-3'(下划线为Nde I识别序列)
GsbZIP43-AS：5'-GGAATTCTCAATACATGATCAACATTTCATTG-3'(下划线为EcoR I识别序列)
人工合成上述引物序列，并配制成100μmol/L母液，使用浓度为10μmol/L，-20℃贮存。
2、选取饱满的野生大豆G07256种子，用浓H2SO4处理10min，无菌水冲洗3～4次，25℃暗培养2-3d催芽。待芽长到1～2cm时，将其转移至1/4Hoagland营养液中，置于人工气候箱中培养。待幼苗长至21d后，在含有50mM NaHCO3的Hoagland营养液中处理1h，迅速取材，采用TRIzol法并根据赛默飞公司TRIzol RNA Isolation Reagents的步骤提取RNA。
3、以OligodT为引物进行cDNA第一条链的合成，方法参见Invitrogen公司SuperScriptTMⅢReverse Transcriptase说明书。
4、以野生大豆总cDNA为模板，采用PrimeSTARTM HS DNA Polymerase进行PCR扩增，得到GsbZIP43基因全长CDS区，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。将GsbZIP43基因全长CDS区与pEASY-T载体连接，构建得到pEASY-GsbZIP43克隆载体。
实施例2、GsbZIP43蛋白转录激活活性分析
1、将实施例1构建的pEASY-GsbZIP43克隆载体与pGBKT7空载体经Nde I和EcoR I双酶切后，连接，构建得到BD-GsbZIP43载体。
2、将BD-GsbZIP43载体转化大肠杆菌DH5α，并将阳性克隆用于测序。
3、分别将测序正确的BD-GsbZIP43载体、阴性对照BD空载体和阳性载体BD-GsbZIP67(已在酵母中验证过具有转录激活活性)转入AH109酵母菌株中，进行转录激活活性鉴定。
结果如图2所示，结果显示：转化GsbZIP67和GsbZIP43的酵母菌株可以在SD-Trp-His缺陷培养基上正常生长，而转入BD空载体的酵母菌株在SD-Trp-His的缺陷培养基上不能正常生长。利用X-Gal染色同时也证明GsbZIP43具有转录激活活性，转入GsbZIP67和GsbZIP43的酵母菌株为蓝色，转入BD空载体的酵母菌株颜色无明显变化。
实施例3、GsbZIP43蛋白在植物细胞内的亚细胞定位分析
1、采用基因特异引物GsbZIP43-F1和GsbZIP43-R1进行PCR扩增，得到GsbZIP43基因全长CDS区。引物序列如下：
GsbZIP43-F1：5’-ATAGATCTGATGGCTTCTCCTGGTGG-3’；其中，下划线为Bgl II识别序列，后面红色G保证与下游RFP蛋白不串码)；
GsbZIP43-R1：5’-GGTTAATTAAATACATGATCAACATTTCATTGTC-3’；其中，下划线为PacI识别序列。
2、将步骤1获得的GsbZIP43基因全长CDS区与pCAMBIA1302-RFP载体连接，构建得到pCAMBIA1302-GsbZIP43-RFP植物表达载体。
3、将GsbZIP43-RFP植物表达载体转化农杆菌并注射烟草，然后在激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白表达。同时以OsERF096.2-YFP作为细胞核定位的阳性对照。
结果如图3所示，结果显示：阳性对照OsERF096.2-YFP在细胞核中表达，而GsbZIP43也定位于细胞核中。
实施例4、GsbZIP43基因在碱胁迫条件下的表达模式分析
1、对3周龄的野生大豆G07256幼苗进行50mM NaHCO3碳酸盐胁迫处理，分别在0h、1h、3h、6h、12h、24h取根尖组织。
2、采用TRIzol法提取总RNA，采用反转录试剂盒SuperScriptTM III ReverseTranscriptase kit(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)反转录获得cDNA。
3、采用SYBR定量试剂盒SYBR Premix ExTaqTM II Mix(TaKaRa,Shiga,Japan)于荧光定量PCR仪ABI 7500(Applied Biosystems,USA)上进行Real-time PCR检测基因表达量。定量分析采用比较CT法(△△CT)，以GAPDH基因(Genbank登录号：DQ355800)为内参，未经处理的样品作为参照因子。经GAPDH基因均一化处理后，通过2-△△CT法计算GsbZIP43基因表达量变化差异，以处理样本相对于未处理样本的倍数表示。
GsbZIP43基因特异引物为5’-ATGGGGGAACTGAGCAACA-3’和5’-ATTGAACAACTGAGTGGTCGTCT-3’。
GAPDH基因特异引物为5’-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3’和5’-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3’。
定量Real-time PCR结果如图4所示，结果显示：碳酸盐胁迫处理后，GsbZIP43基因表达量呈上升趋势，并在碳酸盐胁迫处理3h后达到顶峰，3h过后基因表达量又呈现下调趋势。表明GsbZIP43基因的表达受碳酸盐胁迫诱导。
实施例5、GsbZIP43转基因拟南芥植株的获得及碳酸盐胁迫耐性分析
一、GsbZIP43转基因拟南芥的获得及鉴定
1、根据GsbZIP43基因序列及pCAMBIA330035Su载体，设计基因特异引物。引物序列如下(其中U为USER酶切位点)：
GsbZIP43-U-F：5’-GGCTTAAUATGTACCCATACGACGTACCAG-3’；
GsbZIP43-U-R：5’-GGTTTAAUTCAATACATGATCAACATTTCATTG-3’。
2、以实施例1中构建的pEASY-GsbZIP43为模板，采用步骤1中的引物进行PCR扩增，得到N端带有HA标签的GsbZIP43全长基因。
3、用限制性内切酶PacI和Nt.BbvCI对pCAMBIA330035Su载体进行双酶切，得到载体酶切产物。将获得的载体酶切产物、USER酶(NEB，M5505S)和步骤2获得的N端带有HA标签的GsbZIP43全长基因在37℃下孵育20min，利用USER酶对GsbZIP43基因片段的尿嘧啶处进行切割，形成可与pCAMBIA330035Su载体互补的粘性末端，接着25℃下孵育20min，并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(全式金，CD201-01)。挑取单菌落进行PCR鉴定，并将阳性单菌落送交公司测序，得到重组表达载体pCAMBIA330035Su-GsbZIP43。
测序结果表明：重组表达载体pCAMBIA330035Su-GsbZIP43为在pCAMBIA330035Su载体的两个PacI酶切位点间插入序列2所示的DNA分子，且保持pCAMBIA330035Su载体的其他序列不变后得到的载体。pCAMBIA330035Su-GsbZIP43重组表达载体的结构示意图如图5A所示。PCR鉴定结果如图5B所示。
4、采用冻融法，将重组表达载体pCAMBIA330035Su-GsbZIP43转化根癌农杆菌GV3101，经PCR鉴定获得重组农杆菌pCAMBIA330035Su-GsbZIP43/GV3101。PCR鉴定结果如图5C所示。
5、将重组农杆菌pCAMBIA330035Su-GsbZIP43/GV3101通过Floral-dip法侵染野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)。将T0代种子表面消毒后，播种于含25mg/L固杀草的1/2MS培养基上进行筛选。将T1代抗性苗移栽至营养钵中培养，得到固杀草抗性的超量表达转基因拟南芥，并进行PCR鉴定。部分抗性植株的鉴定结果如图6A所示。
6、提取PCR鉴定为阳性植株的总RNA，利用实施例4中的扩增引物进行半定量RT-PCR，以拟南芥ACTIN2基因为内参，分析GsbZIP43基因在转基因植株中的表达量。
结果如图6B所示。从图中可以看出：野生型拟南芥植株的RT-PCR无扩增产物，而GsbZIP43转基因拟南芥均可以扩增出目的条带，表明外源基因GsbZIP43不但已顺利整合到拟南芥的基因组上，而且能够在转基因拟南芥中正常转录表达。
将RT-PCR阳性的T1代转基因拟南芥单株收种子，并分别播种于含25mg/L固沙草的1/2MS培养基上进行筛选，观察T2代分离情况。如此重复，直至得到T3代GsbZIP43转基因基因拟南芥纯合体株系。选取T3代GsbZIP43转基因拟南芥纯合体株系(#10)和(#12)用于下述碳酸盐耐性分析。
二、GsbZIP43转基因拟南芥的碳酸盐胁迫耐性分析
1、选取饱满的野生型拟南芥、T3代GsbZIP43转基因拟南芥纯合体株系(#10)和(#12)种子，用5％ NaClO处理6-8min，灭菌ddH2O冲洗5-7次，4℃春化3d，播种于正常的1/2MS培养基，22℃培养7d。然后将幼苗分别移至正常的1/2MS培养基、含有4mM NaHCO3的1/2MS培养基中竖直培养16d。观察胁迫处理后植株长势，并统计植株根长和鲜重。实验重复三次，每种处理各株系采用30株植株。
结果如图7A所示，结果显示：碳酸盐胁迫抑制了野生型拟南芥和GsbZIP43转基因拟南芥根的伸长，但GsbZIP43转基因拟南芥株系的根长显著长于野生型拟南芥，且鲜重也重于野生型拟南芥但无明显变化。
2、选取饱满的野生型拟南芥、T3代GsbZIP43转基因拟南芥纯合体株系(#10)和(#12)种子，春化后播种于营养钵中(营养土：君子兰土：蛭石1：1：1)，置于人工气候培养箱中培养。选取长势一致的4周龄拟南芥植株，每3d浇灌1次150mM NaHCO3(pH 8.0)溶液进行胁迫处理，处理15d后，观察胁迫处理后植株长势，并检测野生型拟南芥和GsbZIP43转基因拟南芥叶片中的SOD活性、POD活性、MDA含量以及叶绿素含量。实验重复三次，每种处理各株系采用30株植株。其中，SOD的测定方法采用李合生所著《植物生理生化实验原理和技术》中NBT(淡蓝四唑)法。POD的测定方法采用李合生所著《植物生理生化实验原理和技术》中育创木酚法。叶绿素的测定方法采用李合生所著《植物生理生化实验原理和技术》中分光光度法。MDA的测定方法采用《现代生理学实验指南》中TBA(硫代巴比妥酸)法。
结果如图7C-G所示，结果显示：碳酸盐胁迫处理后野生型拟南芥和GsbZIP43转基因拟南芥都逐渐失绿变紫甚至死亡，但GsbZIP43转基因拟南芥植株的长势明显优于野生型拟南芥(图7C)。经碳酸盐胁迫处理后，所有植株的SOD活性、POD活性和MDA含量均有升高，但是GsbZIP43转基因拟南芥的SOD活性和POD活性显著高于野生型拟南芥，MDA含量显著低于野生型拟南芥。进一步测定叶绿素含量，结果表明：经碳酸盐胁迫处理后，所有株系的叶绿素含量均有降低，但是GsbZIP43转基因拟南芥的叶绿素含量显著高于野生型拟南芥。
综上结果表明：GsbZIP43基因超量表达显著提高了拟南芥的盐碱胁迫耐性，GsbZIP43蛋白可正向调控植物耐盐碱性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.GsbZIP43蛋白在如下1)-3)中的应用：
1)调控植物耐逆性；
2)培育耐逆性提高的转基因植物；
3)植物育种；
所述GsbZIP43蛋白为a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
a2)在序列3所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐逆性相关的蛋白质；
a4)与序列3所示的氨基酸序列具有90％同一性、来源于大豆且与植物耐逆性相关的蛋白质。
2.与GsbZIP43蛋白相关的生物材料在如下1)-3)中的应用：
1)调控植物耐逆性；
2)培育耐逆性提高的转基因植物；
3)植物育种；
所述生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：
A1)编码GsbZIP43蛋白的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下B1)或B2)或B3)或B4)所示的基因：
B1)序列1所示的基因组DNA分子；
B2)序列2所示的cDNA分子；
B3)与B1)或B2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述的GsbZIP43蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；
B4)在严格条件下与B1)或B2)或B3)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述的GsbZIP43蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐盐碱胁迫。
5.一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：提高受体植物中权利要求1中所述GsbZIP43蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐盐碱胁迫；
和/或，所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物具体体现在如下X1)-X5)中的任一种：
X1)在碳酸盐胁迫下，所述转基因植物的根长长于所述受体植物；
X2)在碳酸盐胁迫下，所述转基因植物的SOD活性高于所述受体植物；
X3)在碳酸盐胁迫下，所述转基因植物的POD活性高于所述受体植物；
X4)在碳酸盐胁迫下，所述转基因植物的MDA含量低于所述受体植物；
X5)在碳酸盐胁迫下，所述转基因植物的叶绿素含量高于所述受体植物。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中权利要求1中所述GsbZIP43蛋白的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达GsbZIP43蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述过表达的方法为将GsbZIP43蛋白的编码基因导入受体植物中。
9.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述GsbZIP43蛋白的编码基因序列如序列表中序列2所示。
10.根据权利要求1-4任一所述的应用或权利要求5-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物；
和/或，所述双子叶植物为十字花科植物；
和/或，所述十字花科植物为拟南芥。
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