CN103588866B

CN103588866B - 植物耐逆性相关转录因子TaWRKY16及其编码基因与应用

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Publication number: CN103588866B
Application number: CN201210288652.0A
Authority: CN
Inventors: 陈受宜; 张劲松; 张正斌; 赵明玉; 牛灿芳; 张万科; 马彪; 林晴
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2012-08-14
Filing date: 2012-08-14
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2032-08-14
Also published as: CN103588866A

Abstract

本发明公开了植物耐逆性相关转录因子TaWRKY16及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现了一种蛋白（转录因子），将其编码基因转入野生型拟南芥中，得到转基因植物，该转基因植物的耐逆性高于野生型拟南芥，为培育耐逆植物品种、特别是培育耐非生物胁迫如耐干旱和/或耐盐和/或耐低温植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。

Description

植物耐逆性相关转录因子TaWRKY16及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物耐逆性相关转录因子TaWRKY16及其编码基因与应用。

背景技术

环境中物理化学因素的变化,例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。目前，基因工程育种已经成为增强作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞有多种途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。植物中已经发现了多类转录因子与植物耐逆性相关，例如：EREBP/AP2中的DREB类，bZIP,MYB等等。

WRKY类转录因子是植物转录因子中的一个大家族，仅拟南芥就含有100多种WRKY成员，所有成员均含有一个或两个WRKY结构域，可与启动子中的W-box结合。WRKY家族参与植物多种生物学功能，例如对病原菌的防卫、植物衰亡、形态发生以及对非生物胁迫的应答等。W-box存在于许多与植物防御反应相关的基因启动子中，介导了病原物来源的激发子诱导的转录反应。病毒、细菌和真菌激发子的侵染以及信号物质如水杨酸的处理，也能够诱发WRKY转录因子的mRNA和蛋白质的合成，而且也能增强它与DNA的结合活性。W-box和WRKY转录因子联合调控其下游基因产物从而起到保护和防卫的作用。人们相继从不同植物中克隆得到在逆境下起作用的WRKY转录因子有：拟南芥AtWRKYs、烟草NtWRKYs以及马铃薯StWRKY。尚未克隆小麦中与非生物胁迫相关的该类转录因子。

小麦是重要的粮食作物，阐明其耐逆机理，进而改善其耐逆性，具有重要的理论及现实意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物耐逆性相关转录因子TaWRKY16及其编码基因。

本发明提供的蛋白，为转录因子，名称为TaWRKY16，来源于小麦，是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。

上述序列表中的序列2由341个氨基酸残基组成，是小麦中的WRKY类转录因子。自序列2的氨基末端为第279-285位氨基酸残基是保守的WRKYGQK结构，由于TaWRKY16含有1个WRKY结构域，因此属于group II。

上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的上述结构域外进行取代和/或缺失和/或添加。

为了使（a）或（b）或（c）中的蛋白便于纯化，可在所述蛋白的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述TaWRKY16可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

编码上述蛋白的基因也属于本发明的保护范围，该基因为如下1）-3）中任一一种的DNA分子：

1）序列表中序列1所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；

3）与1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。

上述(a)或（b）中的TaWRKY16的编码基因TaWRKY16可通过将序列表中序列1自5′端第1至1023位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2X SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1X SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5X SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1X SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1X SSC，0.1%SDS中漂洗。

上述严格条件也可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

上述序列表中的序列1由1023个脱氧核糖核苷酸组成，自5’末端的第1至1023位脱氧核糖核苷酸为TaWRKY16的开放阅读框（Open Reading Frame,ORF），自5’端的第1至3位脱氧核糖核苷酸为TaWRKY16的起始密码子ATG,自5’端的第1021至1023位脱氧核糖核苷酸为TaWRKY16的终止密码子TAG。TaWRKY16的表达受干旱、高盐和低温处理诱导。

含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

上述重组载体为将序列表中的序列1插入表达载体中得到表达上述蛋白的重组载体。在本发明中，上述重组载体可为在pBIN438的BamHI和KpnI位点间插入自序列表中序列1的自5’末端的第1-1023位脱氧核苷酸得到的pBIN438-TaWRKY16。

上述表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。上述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用TaWRKY16构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

上述引物对具体可为如下1）或2）或3）：

1）一条引物的序列如序列表中序列3所示，另一条引物的序列如序列表中序列4所示；此引物是扩增基因全长的引物；

2）一条引物的序列如序列表中序列5所示，另一条引物的序列如序列表中序列6所示；此引物是扩增基因部分片段的引物；

3）一条引物的序列如序列表中序列7所示，另一条引物的序列如序列表中序列8所示；此引物是扩增基因全部片段的引物。

上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高植物耐逆性中的应用也是本发明保护的范围。

在上述应用中，所述耐逆性为耐盐、耐干旱和/或耐低温；

所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为十字花科植物，所述十字花科植物进一步具体为拟南芥。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的方法，为将上述蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。

上述方法中，上述耐逆性具体可为耐盐、耐干旱和/或耐低温。

上述方法中，上述蛋白的编码基因通过上述重组载体导入目的植物；

上述耐盐为150mM NaCl或180mM NaCl胁迫条件下进行；

上述耐干旱为在300mM甘露醇胁迫下或在停止浇水29天,恢复浇水21天的条件下进行；

上述耐低温的低温为-20℃。

上述转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。

本发明中所述的“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“编码序列”、“开放阅读框(ORF)”等包括单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。

本发明基因可通过如下方式导入宿主中：将本发明基因插入表达盒中，再将表达盒通过植物表达载体、非致病自我复制的病毒或弄杆菌导入宿主。携带本发明基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。

上述任一所述方法和应用中，所述植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于玉米，小麦，大麦，黑麦，甘薯，豆，豌豆，菊苣，莴苣，甘蓝，花椰菜，花茎甘蓝,芜菁，萝卜，菠菜，芦笋，洋葱，大蒜，胡椒，芹菜，笋瓜，南瓜，大麻，夏南瓜，苹果，梨，温桲，瓜，李子，樱桃，桃子，油桃，杏，草莓，葡萄，木莓，黑莓，菠萝，鳄梨，蕃木瓜，芒果，香蕉，大豆，番茄，高粱，甘蔗，甜菜，向日葵，菜籽油菜，三叶草，烟草，胡萝卜，棉花，苜蓿，稻，马铃薯，茄子，黄瓜，拟南芥属和木本植物如针叶树和落叶树。特别优选的是水稻、小麦、大麦、玉米、燕麦、黑麦、百脉根、拟南芥、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿；本发明的实施例中选用拟南芥。

转入本发明基因的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。

转入本发明基因的植物中，会有相应的本发明的植物耐逆性相关蛋白的生物合成，进而使转入本发明基因的植物产生改良性状。

本发明的基因可以在序列1的基础上进行以下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果：

1）为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列，本发明核苷酸序列可根据实际需要进行修饰和优化。如可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。而且，优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％，优选为多于45％，更优选为多于50％，最优选多于约60％。

2）为了翻译的有效起始，可以修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列。例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰。

3）将本发明基因与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达。所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子。启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种。例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期耐逆而定。尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达。

优选的组成型启动子包括CaMV 35S和19S启动子。所述启动子还可为来源于在大多数细胞类型中表达的几种肌动蛋白基因中的启动子。另一个优选的组成型启动子为泛素启动子。

上述启动子还可为在根、木髓、叶或花粉中引导表达的启动子，即组织特异性启动子。棉花核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子（美国专利US 6,040,504）、水稻蔗糖合酶启动子（美国专利US 5,604,121）、夜香树黄化叶卷曲病毒启动子（WO01/73087）。

化学诱导型启动子可为Rab29A启动子（美国专利US 5,614,395）。

4）将本发明基因与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率。例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9。任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。

5）可向本发明基因中引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel）和病毒前导序列（例如来源于TMV,MCMV和AMV）。

在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。

上述重组载体中的出发载体可根据所使用的转化技术及靶植物物种的特性进行选择。上述选择可体现在载体中的抗性标记的选择上。对于一些靶物种，可以优选不同的抗生素或除草剂选择性标记。通常用在转化中的选择性标记包括赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因,，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因，和提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

本发明的实验证明，本发明发现了一种蛋白（转录因子）TaWRKY16，将其编码基因转入野生型拟南芥中，得到转基因植物，该转基因植物的耐逆性高于野生型拟南芥，经过高盐或干旱处理后，转基因植物的恢复情况明显好于未转基因拟南芥，且存活率较对照组有显著提高。本发明为培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫如耐干旱和/或耐盐和/或耐低温植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。因此，本发明蛋白及其编码基因在培育耐逆性植物、作物育种等领域中将有广阔的应用前景。

附图说明

图1为TaWRKY16基因在高盐和干旱处理时的相对表达量

图2为TaWRKY16基因在冷处理时的相对表达量

图3为重组表达载体的结构示意图

图4为TaWRKY16过表达株系的分子鉴定

图5为TaWRKY16过表达株系在高盐和干旱胁迫下的绿苗率比较

图6为TaWRKY16过表达株系在高盐胁迫下的表型和存活率统计

图7为TaWRKY16转基因株系在干旱胁迫下的表型和存活率统计

图8为TaWRKY16过表达株系在低温胁迫下表型

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值。

根癌农杆菌AGL1（根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens(SmithetTownsend)Conn)AGL1）记载于转甜菜碱醛脱氢酶基因豆瓣菜的耐盐性，李银心、常凤启、杜立群、郭北海、李洪杰、张劲松、陈受宜、朱至清；植物学报，2000年05期，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

pBIN438载体（双元表达载体）由方荣祥院士惠赐。记载于李太元,田颖川,秦晓峰,等.高效抗虫转基因烟草的研究[J].中国科学(B辑),1994,24(3):276-282.)，公众经方荣祥院士同意后可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

耐旱品种小麦西峰20记载于宋廷新,李国栋,冬小麦新品种西峰20号选育报告,甘肃农业科技,1995年,7期,2-3，公众经可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

旱敏感品种鲁麦15号记载于刁洪军,田忠银,新品种发布:鲁麦15号小麦,种子世界,1995年,2期,38页，公众经可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)：种子购自Arabidopsis Biological ResourceCenter(ABRC)，以下简称野生型拟南芥。

所有植物材料均生长于22-25°C每天的光照为16h/8h(光照/黑暗)。

实施例1、小麦耐逆性相关蛋白TaWRKY16编码基因cDNA克隆和表达

一、小麦耐逆性相关蛋白TaWRKY16编码基因cDNA克隆

在小麦EST数据库中进行BLAST检索，聚类到43个WRKY类基因片段，命名为TaWRKY1-43。其中26个基因的编码蛋白含有完整的WRKY和锌指结构域，另外17个基因的编码蛋白含有不完整的WRKY或锌指结构域。

根据43个WRKY基因片段的序列设计引物如下：

W16RTL：5’-GGATCC GAATTC ATGGAGGAAGTGGAGGAGGC-3’，（序列3）

W16RTR：5’-GGTACC GTCGAC AGCTTGCGCAGACTGAGTTG-3’；（序列4）

从经200mM NaCl处理及未处理的三叶期小麦西峰20苗中提取总RNA，以RT-RCR方法测定43个基因的表达与胁迫处理的关系。筛选得到至少在高盐/干旱/低温/ABA一种胁迫中受诱导的基因，该基因的核苷酸序列为序列表中的序列1，将该基因命名为TaWRKY16，编码区为序列表中序列1自5’末端的第1-1023位核苷酸；该基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2，该蛋白命名为TaWRKY16。

二、逆境胁迫处理下TaWRKY16基因的表达特征

将耐旱品种小麦西峰20和旱敏感品种鲁麦15号种子种在盆中，生长至三叶期后取幼苗进行如下胁迫处理：1）盐处理：用200mM NaCl水溶液灌根；2）干旱处理：将苗小心拔出，吸干水分，室温（25℃）下，进行大气干旱；3）冷处理：在持续光照，4℃条件下生长；光照培养，分别在上述各种处理后0、3、6和12小时时，采集叶片，迅速置于液氮，随后用于总RNA提取。

收集上述叶片1g在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀得到总RNA。以下列引物进行Real Time-PCR分析。

W16F TCATCCCAGGGGGTACTACAA（序列5）

W16R ATCATCCACGCAACGCTCAAC（序列6）

结果如图1-图2所示，图1A为耐旱品种西峰20生长至三叶期以200mM NaCl处理的结果，图1B为旱敏感品种鲁麦15号生长至三叶期以200mM NaCl处理的结果，图1C为耐旱品种西峰20干旱处理的结果，图1D为旱敏感品种鲁麦15号干旱处理的结果；图2A耐旱品种西峰20冷处理的结果，图2B为旱敏感品种鲁麦15号冷处理的结果；从图中看出，TaWRKY16基因的表达在耐旱和旱敏感的品种中均受干旱、高盐和低温（4℃）处理的诱导，只是诱导的模式有所差异。

实施例2、TaWRKY16基因在培育耐逆性转基因植物中的应用

一、构建转TaWRKY1拟南芥

1、表达载体pBI121-TaWRKY1的构建

提取小麦西峰20的总RNA，反转录得到cDNA为模板，用含有BamHI和KpnI接头序列的特异引物W16VectorL和W16VectorR进行PCR扩增，得到约1000bp的PCR产物。经过测序，该PCR产物为1023bp，具有序列表中序列1所示的核苷酸序列，即为TaWRKY16。

引物序列如下：

W16VectorL：5’-GGATCC GAATTC ATGGAGGAAGTGGAGGAGGC-3’(BamHI，序列7)

W16VectorR：5’-GGTACC GTCGAC AGCTTGCGCAGACTGAGTTG-3’(KpnI，序列8)

用BamHI和KpnI双酶切PCR产物，回收，与经过同样酶切的植物表达载体pBIN438骨架连接，得到重组载体，经过测序，该重组载体为将序列表中的序列1插入pBIN438的BamHI和KpnI酶切位点之间得到的载体，将该重组载体命名为pBIN438-TaWRKY16；该重组载体的结构示意图如图3所示。

2、转TaWRKY16基因植株的获得和鉴定

将pBIN438-TaWRKY16用电击法导入根癌农杆菌AGL1，得到重组菌AGL1/pBIN438-TaWRKY16。将重组菌提取质粒，经过测序，该质粒为pBIN438-TaWRKY16；证明该重组菌为阳性克隆。

将重组菌AGL1/pBIN438-TaWRKY16通过花浸泡的方法（Clough-SJ,Bent-AF.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.Plant-Journal.1998,16:6,735-743）利用农杆菌AGL1转化野生型哥伦比亚生态型拟南芥（Col-0，以下简称为野生型拟南芥），收获种子后，播于含卡那霉素（50mg/L）的MS筛选培养基上，获得42个单株T₀代转TaWRKY16拟南芥，待T₀代植株长至6叶时移到蛭石上生长。

分别提取野生型拟南芥和T₀代转TaWRKY16拟南芥的总RNA进行RT-PCR鉴定分析,引物为：

WRKY16F GAGGATGGAAATGGCAAGTGT

WRKY16R TGGTTATGTTCGCCCTCGTAT

结果如图4所示，横坐标为编号为16-1、4、5、10、1、16、18、22、28、32、38的T₀代转TaWRKY16拟南芥，纵坐标为比野生型增加的转录百分数；结果表明，42株检测出TaWRKY16基因的表达，为阳性T₀代转TaWRKY16拟南芥（图中均为阳性），而野生型拟南芥中没有检测出目的基因的表达。

将分子鉴定阳性T₀代转TaWRKY16拟南芥单株收种子，各单株种子分别播种，用卡那霉素继续筛选以观察T₁代的分离情况，如此重复直至得到T₃代转TaWRKY16拟南芥，获得遗传稳定的转基因株系。

T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。

采用同样的方法将空载体pBIN438转入野生型拟南芥中，得到T₀代转空载体拟南芥，采用上述引物进行鉴定，未得到目标片段，说明该T₀代转空载体拟南芥构建正确；播种筛选如此重复直至得到T₃代转空载体拟南芥。

二、转TaWRKY1拟南芥的表型分析

选取目的基因表达量不同的3个转基因株系，编号为16-5、16-32和16-38的T₃代转TaWRKY16拟南芥作进一步表型分析。

1、转TaWRKY16基因耐盐性鉴定

1）绿苗率鉴定

将野生型拟南芥（col-0）、T₃代转空载体拟南芥和编号为16-5、16-32和16-38的T₃代转TaWRKY16拟南芥的种子分别置于正常MS培养基和添加150mM NaCl的MS培养基中萌发6天，统计其绿苗率。各株系采用30棵植株，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图5A、5B、5D所示，5A为在正常MS培养基中的绿苗表型；5B为在添加150mM NaCl的MS培养基中的绿苗表型；5D为在添加150mM NaCl的MS培养基中的绿苗率；可以看出，在正常MS培养基上，各植株均为绿苗，绿苗率为100%；而在添加150mM NaCl的MS培养基上，野生型拟南芥、16-5、16-32和16-38的绿苗率分别为24%、59%、71%和52%。表明，编号为16-5、16-32和16-38的T₃代转TaWRKY16拟南芥在高盐处理时的绿苗率明显高于对照。

野生型拟南芥（col-0）和T₃代转空载体拟南芥结果无显著差异。

2）存活率鉴定

将萌发7天生长状况相同的野生型拟南芥（col-0）、T₃代转空载体拟南芥和编号为16-5、16-32和16-38的T₃代转TaWRKY16拟南芥幼苗均移到含180mM NaCl的蛭石中生长25天，转移到蛭石中正常条件下恢复生长10天，分别观察生长状况。以在不含有NaCl的蛭石中生长为未处理对照。各株系采用30棵植株，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图6所示，A为180mM NaCl处理25天表型（上图为未处理，下图为180mMNaCl处理），B为180mM NaCl处理后恢复10天表型（上图为未处理，下图为180mM NaCl处理），C为盐处理后恢复10天的存活率统计结果图；从图中看出，在正常条件下生长的植株无明显差异（图6A）；在盐胁迫下转基因植株和野生型拟南芥的生长均受到抑制，与野生型拟南芥相比，T₃代转TaWRKY16拟南芥幼苗生长受到抑制的程度较轻（图6B）；将盐处理幼苗转移到蛭石中正常条件下恢复生长10天，T₃代转TaWRKY16拟南芥恢复表型好于野生型拟南芥（图6B）。图6C的存活率统计表明，野生型拟南芥、编号为16-5、16-32和16-38的T₃代转TaWRKY16拟南芥在高盐胁迫25天恢复生长10天时的存活率分别为32%、74%、65%和54%。可以看出，T₃代转TaWRKY16拟南芥的存活率显著高于对照。

因此在拟南芥中异源过量表达TaWRKY16明显提高了转基因植株的耐盐性。

2、转TaWRKY16基因耐干旱性鉴定

1）绿苗率鉴定

将野生型拟南芥（col-0）、T₃代转空载体拟南芥和编号为16-5、16-32和16-38的T₃代转TaWRKY16拟南芥的种子分别置于正常MS培养基和添加300mM甘露醇的MS培养基中萌发6天，统计其绿苗率。各株系采用30棵植株，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图5A、5C、5E所示，5A为在正常MS培养基中的绿苗表型；5C为在添加300mM甘露醇的MS培养基中的绿苗表型；5E为在添加300mM甘露醇的MS培养基中的绿苗率；可以看出，在正常MS培养基上，各植株均为绿苗，绿苗率为100%；而在添加300mM甘露醇的MS培养基上，野生型拟南芥、16-5、16-32和16-38的绿苗率分别为43%、62%、69%和58%。表明，编号为16-5、16-32和16-38的T₃代转TaWRKY16拟南芥在干旱处理时的绿苗率明显高于对照。

2）、存活率鉴定

将萌发7天生长状况相同的的野生型拟南芥（col-0）、T₃代转空载体拟南芥和编号为16-5、16-32和16-38的T₃代转TaWRKY16拟南芥幼苗转移到蛭石中,停止浇水29天,恢复浇水21天后，调查生长状况。以一直浇水为对照。各株系采用30棵植株，实验重复三次，结果取平均值。

表型观察结果如图7A中可以看出，对照条件下各株系生长无显著差异；而在干旱胁迫下T₃代转TaWRKY16拟南芥幼苗及野生型拟南芥幼苗的生长均受到抑制（如部分叶片变黄、叶片皱缩等），T₃代转TaWRKY16拟南芥幼苗受到的抑制程度明显小于野生型拟南芥，将上述胁迫处理的幼苗移到蛭石中，正常条件下恢复生长21天，T₃代转TaWRKY16拟南芥的存活率高于野生型拟南芥。

在干旱29天后恢复浇水21天时统计存活率，结果如图7B所示，野生型拟南芥、编号为16-5、16-32和16-38的T₃代转TaWRKY16拟南芥的存活率分别为58%、95%、98%和88%，可以看出，转基因株系的存活率明显高于野生型，达到极显著水平。

因此TaWRKY16的异源过量表达明显提高了转基因植株的耐旱性。

3、转TaWRKY16基因耐低温性鉴定

生长状况相同的17天的野生型拟南芥（col-0）、T₃代转空载体拟南芥和编号为16-5、16-32和16-38的T₃代转TaWRKY16拟南芥幼苗在－20℃处理2小时后置于23℃中继续培养，恢复30天,观察生长状况。以未进行低温处理为对照。结果如图8所示，A为未进行低温处理；B为-20℃处理2小时后置于23℃下恢复5天；C为-20℃处理2小时后置于23℃下恢复30天；可以看出，三个T₃代转TaWRKY16拟南芥株系的生长状况均明显优于野生型拟南芥，T₃代转TaWRKY16拟南芥的抗低温性获得了明显改善。

Claims

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为序列表中序列1所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.扩增权利要求2或3所述基因全长的引物对。

6.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高植物耐逆性中的应用；

所述耐逆性为耐盐、耐干旱和/或耐低温；

所述植物为拟南芥。

7.一种培育转基因植物的方法，为将权利要求1所述蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物；

所述耐逆性为耐盐、耐干旱和/或耐低温；

所述植物为拟南芥。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

权利要求1所述蛋白的编码基因通过权利要求4所述重组载体导入目的植物。