CN110903365B - 枣TCP转录因子ZjTCP16及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枣TCP转录因子ZjTCP16及应用，该基因通过克隆枣TCP转录因子成员首次得到ZjTCP16基因，并利用农杆菌介导的方法转入Columbia型拟南芥中验证目的基因的功能，结果表明，该基因能够诱导植株小叶、矮化及生长迟缓。通过将该基因转入需要矮化的植物细胞、组织、器官或种子中，获得转基因植物，能够应用于植物遗传改良。

Description

枣TCP转录因子ZjTCP16及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及枣TCP转录因子ZjTCP16及应用。

背景技术

枣树(Zizyphus jujuba)是我国重要的经济类果树。具有很高的营养和经济价值。目前，全世界近99％的枣树面积、产量和全球近100％的枣产品国际贸易集中在中国。然而近年来枣果品质量下降、品种单一以及枣树病害蔓延严重的难题对我国枣产业造成了重大打击。然而目前我国枣品种虽然繁多，选育手段却较少，仍主要采用地方品种单株选优。由于亲缘关系较近、遗传变异小，因此很难选育出综合性状优良的品种。筛选具有优良树体和枣果品质的枣树品种是枣产业研究的重点和难点。随着科学技术不断发展，基因工程技术在创造植物新基因型方面有独特的作用和优势。已经成为传统育种技术的重要补充，为果树优良品种的选育开辟了新路径。其中从植物中筛选具有优良性状的基因并对其功能鉴定成为基因工程技术育种过程中重要环节。

TCP转录因子是植物中独有的一类转录因子，参与调控植物生长发育、植物防御、植物激素信号传导以及形态建成等多个生命进程。随着生物信息学技术的发展，越来越多的植物中TCP转录因子家族被鉴定。然而TCP转录因子的功能研究目前主要集中于拟南芥等模式植物中。冬枣基因组于2014年测序完成(Liu et al.，2014)，然而枣TCP基因家族功能尚未阐明，关于枣TCP转录因子能够诱导植株小叶、矮化及生长迟缓方面的作用并没有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枣TCP转录因子基因ZjTCP16及其编码蛋白以及在诱导植株小叶、矮化及生长迟缓方面的应用。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

枣TCP转录因子ZjTCP16，其DNA分子是如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或能够与序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述枣TCP转录因子ZjTCP16编码的蛋白选自下组：

(a)如SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个((如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个))氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与(a)限定的蛋白序列有80％((较佳地90％以上，如95％，98％，99％或更高))以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

也就是说本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述枣TCP转录因子ZjTCP16，还包括与SEQ ID NO：1具有较高同源性(如同源性高于40％；较佳地高于50％；较佳地高于60％；更佳地高于70％；更佳地高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％)的同源基因。

其中，序列中的SEQ ID NO.1由1386个碱基组成，自5’端第1位碱基为转录起始位点，至第1386位碱基为转录终止位点，完整编码框为1386个碱基，编码461个氨基酸。

并且含有上述基因的表达载体、重组载体或转基因细胞系以及含有所述载体的宿主细胞也落入本发明的保护范围之内。

本发明中术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。其中，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株。

本发明还提供了上述枣TCP转录因子ZjTCP16或其蛋白在诱导植株小叶、矮化及生长迟缓方面的应用。具体表现在植株的叶片数量减少和叶片长度降低，抽薹高度降低以及节间数减少，并且果荚变小，这里需要强调的一点是，发明人在观察拟南芥表型的时候发现，虽然能降低节间数，但是却发现拟南芥节间的生长并没有显著的变化，可见高度的降低并不是通过缩短节间长度来实现的。并且虽然显著降低了抽薹高度，但抽薹数变化并不大。

所述应用主要包括获得转基因植株，通过将枣TCP转录因子ZjTCP16转入植物细胞、组织、器官或种子中，从而获得转基因植物。

作为本发明的一种实施方式，将多核苷酸通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述ZjTCP16蛋白到植物细胞中，使所述的植物细胞表达ZjTCP16蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达ZjTCP16蛋白的植物。优选的，利用农杆菌转化法将ZjTCP16蛋白的编码基因转入植物中。

本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。

作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：茄科、十字花科、蔷薇科、葡萄科的植物。更加优选地，比如，所述的“植物”包括但不限于：茄科的烟草和番茄；十字花科的拟南芥、蔷薇科的苹果、草莓；葫芦科的黄瓜；猕猴桃科的猕猴桃等。

本发明具有如下优点：

本发明通过克隆枣TCP转录因子成员首次得到ZjTCP16基因，并利用农杆菌介导的方法转入Columbia型拟南芥中验证目的基因的功能，结果表明，该基因能够诱导植株小叶、矮化及生长迟缓。

通过将该基因转入需要矮化的植物细胞、组织、器官或种子中，获得转基因植物，应用于植物遗传改良。例如苹果、桃树、梨树等多种果树的树型多样，传统开张树型果树的修建及果实收获都需要耗费大量的人力物力。因此合理密植矮化柱型果树品种是目前果树育种的方向。而利用基因转化技术可以快速准确的获得具有目的性状的树种。

附图说明

图1是枣TCP转录因子ZjTCP16的PCR扩增电泳图，图中4、5、6泳道表示质粒阳性对照，7、8、9泳道表示阴性清水对照，图中M为DL2000marker。

图2是枣ZjTCP16与拟南芥AtTCP氨基酸多序列比对。

图3是野生型拟南芥和不同转ZjTCP16拟南芥株系中ZjTCP16基因的表达量测定；

图4是野生型拟南芥株系和过表达ZjTCP16拟南芥株系在苗期的表型观察图。

图5是野生型拟南芥株系和过表达ZjTCP16拟南芥株系苗期生育指标调查。

图6是野生型拟南芥株系和过表达ZjTCP16拟南芥株系在抽薹期的表型观察图。

图7是ZjTCP16对拟南芥节间长度的影响。

图8是过表达ZjTCP16拟南芥株系中叶片形态建成相关基因的相对表达量测定。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明选用的枣为灰枣品种，由河南省果树瓜类生物学重点实验室提供(Chen etal.，2019)。

实施例一 枣TCP转录因子ZjTCP16的分离和功能鉴定

1、基因ZjTCP16的分离

利用柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒(B518661，生工生物工程股份有限公司，上海)提取枣叶总RNA，通过MonScript RTIII in one Mix反转录试剂盒(莫纳生物科技有限公司)获得单链cDNA，以单链cDNA为模版，以下述序列为引物，引物序列为：

正向ZjTCP16-F：5′-ATGGGGGAGAGCCACCACCAA-3′；

反向ZjTCP16-R：5′-TCAATGGCGAGAATCAGAGGA-3′。

PCR的退火温度为57℃。

通过PCR获得基因ZjTCP16的全长序列，PCR扩增电泳图如图1所示。基因ZjTCP16的全长序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，共1386bp，共编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，共461个。枣ZjTCP16与拟南芥AtTCP家族氨基酸序列进行多序列比对结果如图2。

从图2可以看出，ZjTCP16与拟南芥AtTCP家族蛋白均含有约60个氨基酸组成的保守bHLH结构域(TCP结构域序列)。

2、ZjTCP16基因的功能鉴定试验

为研究ZjTCP16基因在枣疯病症状发生过程中是否调控了枣的形态建成，通过转基因拟南芥来鉴定其功能。

2.1构建重组载体

将PCR获得的目的片段通过SE无缝克隆试剂盒(庄盟生物科技有限公司)连接到pSAK277植物过表达载体上。

使用pSAK277载体引物检测阳性克隆。引物分别如下：

pSAK277-F：5′-CATCGAAAGGACAGTAGAAAAGG-3′；

pSAK277-R：5′-CATTAGAATGAACCGAAACCG-3′。

然后将克隆片段回收后送至上海生工生物科技股份有限公司测序。

2.2转基因拟南芥阳性株的筛选

鉴于枣遗传转化体系构建周期长且技术并不完善，故采用模式植物Columbia型拟南芥用于ZjTCP16基因的功能验证。提取经过测序的pSAK277-ZjTCP16载体的质粒，利用液氮冻融法转入农杆菌GV3101中。调整农杆菌菌液浓度OD至0.8-1.0，采用蘸花法浸染转化Columbia番茄，待侵染的拟南芥结种后，收获的种子在含有卡那霉素(50mg/L)的MS固体培养基上进行筛选。筛选过程如下：用6.25％次氯酸钠溶液进行表面消毒5min，无菌水漂洗5次干净后，滤纸上晾干。种子播种于pH＝5.8，含有0.7％琼脂的MS培养基中。4℃纯化48h后移至14h/10h光暗，25℃，80％相对湿度、250μmol m^-2s^-1光强的组培室中培养。待筛选培养基上长出绿色的小苗4d后移至穴盘中在上述条件下进行培养。待抽薹后提取DNA，常规PCR鉴定阳性植株。收获T₀代种子后，继续在含有卡纳霉素的MS培养基上筛选阳性植株。移栽到穴盘后观察与野生型的差别。

PCR分子鉴定阳性植株引物：

ZjTCP16F：5′-ATGGGGGAGAGCCACCACCAA-3′；

ZjTCP16R：5′-TCAATGGCGAGAATCAGAGGA-3′。

用于证实片段插入。

3、转ZjTCP16拟南芥株系中ZjTCP16的相对表达量测定

荧光定量PCR操作步骤：柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒(B518661，生工生物工程股份有限公司，上海)从野生型和T1代转ZjTCP16拟南芥株系叶片及茎段中提取总RNA，利用MonScript RTIII inone Mix反转录试剂盒获得单链cDNA，并以此为模板，进行qRT-PCR检测，采用MonAmp SYBR Green qPCR Mix进行扩增反应。

反应总体积20ul，包括150ng cDNA(1μL)，MonAmp SYBR Green qPCR Mix(10μL)，0.5μmol·L^-1上、下游引物(各1μL)和无RNA酶水(7μL)。

反应程序：95℃预变性，5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。每个样品3次重复。采用Primer Premier 3.0分别对各个转录本序列的设计特异性引物。

定量引物序列为：

正向qZjTCP16-F：5′-TGGTCGAACACCCAAACACTAA-3′；

反向qZjTCP16-R：5′-CGACTTTATTGTGTCGGCAATG-3′。

采用qRT-PCR检测ZjTCP16基因在野生型和转ZjTCP16拟南芥株系中的相对表达量。选取AtUBC作为内参基因，用2^-ΔΔCt公式计算基因相对表达量(Livak and Schmittgen，2001)，结果如图3所示。基因ZjTCP16在不同的转ZjTCP16的过表达株系中显著高表达。比WT型拟南芥中表达量普遍高出10倍以上(图3)。选取2个表达量高的转ZjTCP16基因株系(ZjTCP16#3，ZjTCP16#4)作为代表株系与野生型进行比较。

实施例二 基因ZjTCP16在转基因拟南芥株系中的作用

2.1基因ZjTCP16对苗期拟南芥生长的影响

图3为野生型拟南芥株系((WT))和转ZjTCP16拟南芥株系(ZjTCP16#1，ZjTCP16#2，ZjTCP16#3，ZjTCP16#4)在苗期的观察图。从图4可以看出，转基因拟南芥株系在移栽后5d(5DAT)起至移栽后20DAT显著小于野生型拟南芥。具体表现为在整个苗期(5-20DAT)转ZjTCP16的拟南芥株系在叶片数量和叶片长度方面都要显著的低于野生型拟南芥(图5)。结果表明，ZjTCP16显著抑制了苗期拟南芥的生长。

2.2基因ZjTCP16对抽薹期拟南芥生长的影响

对野生型与转ZjTCP16拟南芥株系抽薹后的生长状态进行观测。可以看出，在抽薹期与果荚期，ZjTCP16基因可以显著诱导拟南芥出现矮化表型，具体表现在抽薹高度上和节间数显著少于野生型株系(表1)。对不同株系拟南芥的果荚大小的测定结果表明，转ZjTCP16的两个株系拟南芥的果荚都要显著小于同时期的野生型拟南芥株系。综上所述，ZjTCP16诱导拟南芥出现矮化表型并影响果荚的生长(图6)。

表1野生型拟南芥株系和过表达ZjTCP16拟南芥株系抽薹期生育指标调查

2.3基因ZjTCP16诱导拟南芥矮化和小叶建成的机制

为了进一步研究ZjTCP16基因对叶片形态建成的调节机制，本发明运用qRT-PCR技术鉴定了与叶片形态建成相关的基因(如AS2、LOB及KNOX家族成员)在野生型和转ZjTCP16型拟南芥叶片中的表达情况。

图8为野生型拟南芥株系和转ZjTCP16拟南芥株系中控制叶片建成相关基因的定量图。结果表明，与野生型拟南芥株系相比，转ZjTCP16拟南芥株系中的AtAS2和AtLOB基因显著上调，而拟南芥KNOX家族类基因AtKNAT1和AtKNAT6被显著下调。据文献报道AS2和LOB基因的过表达均会造成植株出现植株矮化，叶片生长受到抑制等表型(马燕，2007；Shuaiet al.，2002)。而AS2可以与AS1形成蛋白复合体抑制KNOX类基因(Byme et al.，2003；Xuet al.，2003)。据此可以说明在分子水平上，ZjTCP16可以通过调控AS2、LOB以及KNOX家族基因的方式诱导拟南芥出现矮化和小叶症状。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 枣TCP转录因子ZjTCP16及应用

<130> 2019

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1386

<212> DNA

<213> Ziziphus jujuba

<400> 1

atgggggaga gccaccacca agcaacagca tcgtcaagat tggggataag gaacaccggg 60

ggggagatcg tcgaggttca aggaggccac attgttcgct ccaccggccg aaaagaccga 120

cacagcaagg tctgtaccgc gaaaggcccc agagaccgac gagtcaggct ctctgctcac 180

actgctatcc aattttacga cgtccaggat cgccttggct acgaccgacc cagcaaagcc 240

gtcgattggc tcatcaagaa agccagagcc gccatagacg agctcgcgga gctacccgca 300

tggaacccaa cgtcttcaaa cgccgcagcc acagcaactc tgaattcagc ggcaacccag 360

cagcatgtca acgaagagaa cgagaacgca attgggatcc accgcgccgg caccggcgat 420

gcggtggaaa ctatcgcttc tgttagtcgg agagcgacgg cggcgacgat ggttggaggt 480

ggaggagatg ggagagtctc catcgaatgt agtagtagca gactcaatct gcaacagcag 540

caaatggtcg aacacccaaa cactaactct actttcctgc caccgtcttt ggattcggac 600

gccattgccg acacaataaa gtcgttcttc ccaatgggtg catcagccga gactccgccg 660

tcgtcgattc agttccacca gagctatccg ccagatttgc tgtccagaac gagtagccaa 720

agccaagatc tgcgcctttc cctccactct tttcaagact caatgcttct ccaccaccat 780

caagctcaga ctcaggctca acaacagcaa caccaccatg cgcatactgc acaccagact 840

gagcaagctc ttttctctgg aaccggaatc caactgggtt tcgatgggtc ttccggcggt 900

tggccggagc accaccacca tgcgggtgag atgagcaggt ttcagagaat ggtagcgtgg 960

agtgctggtg cagatactgg tagtgccgga gatagtggag gaggaggggg tggtggtgga 1020

ggtggaggag aaggcggtgg attcacattc aactcgctgc tgactccgtc accaccgact 1080

cagccatcgc cgtcgccgcc attgcagtcg ttcttcggcc gaggccagtt cttttcacaa 1140

cagaggggac cccttcagtc cagtaacacg ccttcagttc gcgcttggat cgacccgtct 1200

attgccgatc atcaccatca ccttcagatt tcgcatacaa cacatcagtc ttctcatata 1260

tcaggcatgg gattcgcctc cggcggattc tccgggtttc gtattccggc acgaattcag 1320

ggtgaagagg aacacgacgg tatctctgat aagccgtcct ctgcttcctc tgattctcgc 1380

cattga 1386

<210> 2

<211> 461

<212> PRT

<213> Ziziphus jujuba

<400> 2

Met Gly Glu Ser His His Gln Ala Thr Ala Ser Ser Arg Leu Gly Ile

1 5 10 15

Arg Asn Thr Gly Gly Glu Ile Val Glu Val Gln Gly Gly His Ile Val

20 25 30

Arg Ser Thr Gly Arg Lys Asp Arg His Ser Lys Val Cys Thr Ala Lys

35 40 45

Gly Pro Arg Asp Arg Arg Val Arg Leu Ser Ala His Thr Ala Ile Gln

50 55 60

Phe Tyr Asp Val Gln Asp Arg Leu Gly Tyr Asp Arg Pro Ser Lys Ala

65 70 75 80

Val Asp Trp Leu Ile Lys Lys Ala Arg Ala Ala Ile Asp Glu Leu Ala

85 90 95

Glu Leu Pro Ala Trp Asn Pro Thr Ser Ser Asn Ala Ala Ala Thr Ala

100 105 110

Thr Leu Asn Ser Ala Ala Thr Gln Gln His Val Asn Glu Glu Asn Glu

115 120 125

Asn Ala Ile Gly Ile His Arg Ala Gly Thr Gly Asp Ala Val Glu Thr

130 135 140

Ile Ala Ser Val Ser Arg Arg Ala Thr Ala Ala Thr Met Val Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Asp Gly Arg Val Ser Ile Glu Cys Ser Ser Ser Arg Leu Asn

165 170 175

Leu Gln Gln Gln Gln Met Val Glu His Pro Asn Thr Asn Ser Thr Phe

180 185 190

Leu Pro Pro Ser Leu Asp Ser Asp Ala Ile Ala Asp Thr Ile Lys Ser

195 200 205

Phe Phe Pro Met Gly Ala Ser Ala Glu Thr Pro Pro Ser Ser Ile Gln

210 215 220

Phe His Gln Ser Tyr Pro Pro Asp Leu Leu Ser Arg Thr Ser Ser Gln

225 230 235 240

Ser Gln Asp Leu Arg Leu Ser Leu His Ser Phe Gln Asp Ser Met Leu

245 250 255

Leu His His His Gln Ala Gln Thr Gln Ala Gln Gln Gln Gln His His

260 265 270

His Ala His Thr Ala His Gln Thr Glu Gln Ala Leu Phe Ser Gly Thr

275 280 285

Gly Ile Gln Leu Gly Phe Asp Gly Ser Ser Gly Gly Trp Pro Glu His

290 295 300

His His His Ala Gly Glu Met Ser Arg Phe Gln Arg Met Val Ala Trp

305 310 315 320

Ser Ala Gly Ala Asp Thr Gly Ser Ala Gly Asp Ser Gly Gly Gly Gly

325 330 335

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Phe Thr Phe Asn Ser

340 345 350

Leu Leu Thr Pro Ser Pro Pro Thr Gln Pro Ser Pro Ser Pro Pro Leu

355 360 365

Gln Ser Phe Phe Gly Arg Gly Gln Phe Phe Ser Gln Gln Arg Gly Pro

370 375 380

Leu Gln Ser Ser Asn Thr Pro Ser Val Arg Ala Trp Ile Asp Pro Ser

385 390 395 400

Ile Ala Asp His His His His Leu Gln Ile Ser His Thr Thr His Gln

405 410 415

Ser Ser His Ile Ser Gly Met Gly Phe Ala Ser Gly Gly Phe Ser Gly

420 425 430

Phe Arg Ile Pro Ala Arg Ile Gln Gly Glu Glu Glu His Asp Gly Ile

435 440 445

Ser Asp Lys Pro Ser Ser Ala Ser Ser Asp Ser Arg His

450 455 460

Claims (3)

1.枣 TCP 转录因子 ZjTCP16 在诱导拟南芥植株小叶、矮化及生长迟缓方面的应用，其特征在于，其 DNA 序列如 SEQ ID NO:1 所示。

2.根据权利要求 1 所述的应用，其特征在于，枣 TCP 转录因子 ZjTCP16 的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。

3.根据权利要求 1 所述的应用，其特征在于，所述矮化具体表现包括抽薹高度降低以及节间数减少。

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