CN105017392A

CN105017392A - 植物转录因子GmDREBL在培育耐逆植物中的应用

Info

Publication number: CN105017392A
Application number: CN201410168338.8A
Authority: CN
Inventors: 陈受宜; 张劲松; 张玉芹; 牛素玲; 张万科; 韦伟; 林晴; 马彪
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2014-04-24
Filing date: 2014-04-24
Publication date: 2015-11-04

Abstract

本发明公开了植物转录因子GmDREBL在培育耐逆植物中的应用。本发明提供了GmDREBL蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在调控植物耐逆性中的应用；所述GmDREBL蛋白是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明将该蛋白的编码基因导入植物细胞，可获得对干旱等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因植物品种。

Description

植物转录因子GmDREBL在培育耐逆植物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及植物转录因子GmDREBL在培育耐逆植物中的应用。

背景技术

环境中物理化学因素的变化,例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。目前，基因工程育种已经成为增强作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞有多种途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。植物中已经发现了多类转录因子与植物耐逆性相关，例如：EREBP/AP2中的DREB类，bZIP,MYB,WRKY等等。

EREBP/AP2是植物特有的一类转录因子，它们共同的结构是含有一个具三个B折叠的区域－EREBP/AP2区，一般为60个左右的氨基酸，是DNA的结合区，它对AP2基因的功能是必需的。该区域最早是在APETALA2蛋白中发现的。APETALA2基因在拟南芥的花和种子发育过程中起重要作用。目前，在许多植物的调节基因中都发现了EREBP/AP2结构域，例如拟南芥的TINY、DREBPs、CBF家族和烟草的Tsil。

AP2/EREBP家族有两个亚家族，AP2亚家族含两个AP2区，EREBP亚家族只含一个AP2区。AP2亚家族主要在植物发育中起作用，而EREBP亚家族主要在植物的环境胁迫中起作用。如干旱、盐害和低温伤害等。这类基因包括番茄的Pti，拟南芥的CBF1和DREB等。

拟南芥中，DREB1A基因的表达受低温诱导，而DREB2A基因的表达受干旱诱导。2003年从水稻中分离到五个DREB同源基因：OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D和OsDREB2A。它们过表达提高了植株的耐逆性。

大豆是重要的油料作物，是植物蛋白质的主要来源，阐明其耐逆机理，进而改善其耐逆性，具有重要的理论及现实意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供GmDREBL蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体的应用。

本发明提供了GmDREBL蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在调控植物耐逆性中的应用；

所述GmDREBL蛋白是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列2衍生的蛋白质。

上述一个或几个氨基酸残基为不超过10个氨基酸残基。

上述应用中，所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性。

上述应用中，所述耐逆性为耐旱性。

上述应用中，所述GmDREBL蛋白编码基因为是如下(1)-(4)中任一种的DNA分子：

(1)编码区为序列表中的序列1所示的DNA分子；

(2)编码区为序列1自5’末端第1-633位核苷酸所示的DNA分子；

(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且与植物耐逆性相关的蛋白的DNA分子；

(4)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且与植物耐逆性相关的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65oC下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

上述应用中，所述重组载体为将所述GmDREBL蛋白编码基因插入表达载体中，得到表达GmDREBL蛋白的重组载体。

上述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用GmDREBL构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以干旱处理筛选转化植株。

在本发明的实施例中，表达载体为pGWB412，应用Invitrogen公司生产的Gateway系统的pCR8/GW/TOPOTA Cloning试剂盒,入门载体TOPO和目的载体pGWB412都有同源重组位点attL1和attL2，连有目的基因的载体TOPO与载体pGWB412在重组酶的作用下进行同源重组，构建重组载体pGWB412-GmDREBL，其为将序列表中序列1所示的DNA分子通过Gateway同源重组到载体pGWB412中。

上述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。在本发明的实施例中，双子叶植物为拟南芥，具体为Col-0.

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将所述GmDREBL蛋白编码基因导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物耐逆性高于所述目的植物。

上述方法中，所述耐逆性为耐旱性。

上述方法中，所述GmDREBL蛋白编码基拟南芥因导入目的植物通过所述重组载体导入目的植物中。

上述方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的大豆AP2/EREBP家族转录因子GmDREBL的编码基因导入植物细胞，可获得对干旱逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：大豆、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明实验证明，本发明将GmDREBL的编码基因导入野生型拟南芥中，得到转基因拟南芥，经过耐旱胁迫，发现转基因拟南芥的耐旱性高于野生型拟南芥，表明GmDREBL蛋白及其编码基因与植物耐旱相关，能显著提高植物的耐旱性。本发明的耐旱性相关蛋白及其编码基因对培育耐旱植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为GmDREBL在大豆干旱胁迫时的表达特征

图2为克隆载体和植物表达载体pGWB412–GmDREBL示意图

图3为过表达GmDREBL植株的耐旱性鉴定

A,为对照植株和转GmDREBL基因植株在干旱胁迫下的生长比较；B,转基因株系的分子鉴定；C,转基因株系和对照经干旱胁迫后的干重比较，图中的数据为三次重复实验的平均值±标准差。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用引物均由三博生物公司合成。

大豆材料：大豆黑农44(HN44)记载在如下文献中：满为群等，大豆新品种黑农44的选育及不同种植方式对其产量和品种的影响，黑龙江农业科学2004年5期，1-5；公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；该大豆2006年获自黑龙江农业科学院大豆研究所；由黑龙江农业科学院大豆研究所2002年经黑龙江省农作物品种审定委员会审定的大豆品种，第一育成人为杜维广研究员，专利号为：CNA20020216.2，审定号为：黑审豆2002003。

表达载体pGWB412记载在如下文献中：Department of Molecular and FunctionalGenomics,Shimane University,Aatsue,Shimane690-8504,Japan,E.mail:tnakagawlife.shimane-u.ac.jp Isuyoshi Nakagawa,et al.,Gatway Vectors forPlant Transformation,Plant Biotechnology,2009,26,275-284。由TsuyoshiNakagawa博士提供，公众得到Tsuyoshi Nakagawa博士同意后可从中科院遗传与发育生物学研究所获得。

农杆菌GV3101，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载在如下文献中：Lee CW等，Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction bymodulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana,Plant Cell,2009,21(9),2948-62。

实施例1、大豆耐旱相关蛋白GmDREBL编码基因GmDREBL的筛选及其cDNA克隆

一、编码基因GmDREBL的获得

在研究大豆油脂代谢调控过程中，发现GmDREBL不仅参与了大豆种子的油脂代谢调控，对干旱胁迫也有应答反应。用常规方法从以干旱处理及未处理的3周大豆南农1138-2幼苗中提取总RNA，经RT-PCR方法分析GmDREBL基因在干旱处理时的表达特征，表明其对干旱胁迫有应答反应。GmDREBL基因的表达明显受干旱胁迫诱导。因此对该基因与耐旱的相关性作进一步研究。

提取黑农44幼苗的总RNA，将RNA用逆转录酶反转录合成cDNA。

根据在PlantGDB的大豆基因组序列中GmDREBL全长cDNA序列的信息，设计引物，引物序列如下：

GmDREBL-up：5’-ATGCACATGTTAGTGAAAAACC(序列3)；

GmDREBL-dp：5’-AGACAATGAAAGATAGGAAGAAC(序列4)

以HN44的cDNA为模板，用GmDREBL-up和GmDREBL-dp为引物，进行PCR扩增,得到约1Kb的PCR产物。

经过测序，该PCR产物为636bp,具有序列表中序列1自5’末端第1-633位核苷酸，该核苷酸所示的基因为GmDREBL，该基因编码的蛋白命名为GmDREBL，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

二、逆境胁迫处理下大豆GmDREBL基因的表达特征

将大豆南农1138-2种子种在盆中，生长2个星期后取幼苗进行渗透胁迫处理。将豆苗根部小心的吸去水分，置于滤纸上暴露于室温空气中，在0、0.5、1、2、4小时分别收集新鲜叶片1g在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀得到总RNA，用逆转录酶反转录合成cDNA。引物为：5’-TTCTCCAGCTGCTGCTTACC和5’-CTGCTGCATCTCCACCAGAA，进行Real Time-PCR鉴定。大豆Tublin基因为内标，所用引物为Primer-TF：5’-AACCTCCTCCTCATCGTACT，和Primer-TR：5’-GACAGCATCAGCCATGTTCA-3’。

结果如图1所示，空白为未处理，黑色为渗透胁迫处理；可以看出，与未处理对照比较，未处理材料中GmDREBL基因的转录均很低，而在脱水处理0.5小时时，GmDREBL基因的表达量迅速上升至峰值，1小时时下降，至4小时时再次明显上升，因此GmDREBL基因受干旱处理诱导。

实施例2、GmDREBL基因在植物耐逆性中的应用

一、转GmDREBL拟南芥的获得

1、植物表达载体构建

基因克隆使用invitrogen公司提供的Gateway系统，载体3′-T突出端，用于直接连接Taq酶扩增的PCR产物。

将实施例1的一得到的633bp的PCR产物GmDREBL运用TA克隆的原理克隆与载体pCR8/GW/TOPO(pCR8？GW？TOPOTA Cloning Kit,Catalog number:K2500-20,Invitogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)连接，得到中间载体，载体示意图见图2A。

由于pCR8/GW/TOPO载体和过表达载体pGWB412上均带有重组位点attL1和attL2，因此连接目的基因的中间载体可以与过表达载体pGWB412在重组酶的作用下进行LR重组反应，最终目的基因GmDREBL成功构建到过表达载体pGWB412上，得到重组载体。

具体方法如下：1ul pCR8？GW？TOPO-gene,1ul pGWB412,1ul LR buffer,1ulLR Enzyme mix,1ul TE buffer PH8.0,25℃6h,加0.5ul蛋白酶K后，37℃，10min,得到重组载体(详细操作见公司提供的说明书或参照上述文献)。

重组载体经过测序，该载体为将序列表中序列1自5’末端第1-633位核苷酸所示的DNA分子同源重组到载体pGWB412中，得到的载体，命名为pGWB412-GmDREBL(部分结构示意图如图2B)。

2、重组农杆菌的获得

将上述1得到的重组载体pGWB412-GmDREBL用电击法导入农杆菌GV3101中，得到重组农杆菌(提取质粒，送去测序，为pGWB412-GmDREBL，则该重组农杆菌为阳性)。

挑取阳性重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为GV3101/GmDREBL。

3、转GmDREBL拟南芥的获得及鉴定

将重组农杆菌GV3101/GmDREBL培养至对数期，然后用抽真空法将其转化哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0，以下简称野生型拟南芥)中,种子购自ArabidopsisBiological Resource Center(ABRC)。经培育后收获种子，将种子播于含卡那霉素(50mg/L)的MS筛选培养基上，得到T₁代转GmDREBL拟南芥。

收集T₁代转GmDREBL拟南芥的新鲜叶片，提取RNA，反转录得到cDNA作为模板，引物为：5’-TTCTCCAGCTGCTGCTTACC和5’-CTGCTGCATCTCCACCAGAA，进行RealTime-PCR鉴定。以野生型拟南芥(Col-0)为对照。拟南芥AtActin2基因为内标，所用引物为Primer-TF：5’-ATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3’，和Primer-TR：5’-TGCTCATACGGTCAGCGATA-3’。

结果如图3A所示，T₁代转GmDREBL拟南芥株系OE-2、OE-4和OE-25中的GmDREBL相对表达量分别约为0.05、0.075、和0.087，野生型拟南芥(Col-0)中未能检测出GmDREBL的表达T₁代转GmDREBL拟南芥株系OE2、OE4、OE25为阳性T₁代转GmDREBL拟南芥。GmDREBL基因在T₁代转GmDREBL拟南芥株系OE2、OE4、OE25表达量比野生型拟南芥(对照)高。

上述结果进一步证明，GmDREBL转入拟南芥中，且得到表达，OE2、OE4、OE25为过表达GmDREBL株系。

取阳性T₁代转GmDREBL拟南芥，待长至4-6叶时移到蛭石上生长，收获T₁代单株，各单株种子分别播种，用相同的MS筛选培养基继续筛选以观察T₂代的分离情况，如此重复数代直至获得遗传稳定的转基因纯合株系，共获得14个转GmDREBL拟南芥纯系。用上述Real Time-PCR方法，鉴定纯系植株，选取OE-2、OE-4、和OE-25做进一步功能鉴定，得到T₂代转GmDREBL拟南芥株系OE-2、OE-4和OE-25。

采用同样的方法，将空载体pGWB412转入野生型拟南芥中，得到T₀代转pGWB412拟南芥，采用同样的方法进行验证，GmDREBL表达量与野生型无显著差异，培育T0代，直到得到T₂代转pGWB412拟南芥。

二、转GmDREBL拟南芥的耐旱性鉴定

正常条件：T₂代转GmDREBL拟南芥株系OE-2、OE-4和OE-25、T₂代转pGWB412拟南芥和野生型拟南芥在正常条件下培养，从幼苗期开始观察转基因植物与野生型之间的差别，地上部分不论叶片形状、叶片大小、抽苔时期和抽苔高度等性状，OE-4和OE-25与野生型植物均无明显差别，而OE-2植株显得发育延缓,可能与外源基因GmDREBL的插入位点有关(图3B)。T₂代转pGWB412拟南芥和野生型拟南芥无显著差异。

耐旱性试验：T₂代转GmDREBL拟南芥株系OE-2、OE-4和OE-25、T₂代转pGWB412拟南芥和野生型拟南芥同时播种在MS平板上，春化3天，放在温室培养7天，挑选生长情况相似的幼苗移栽到蛭石中继续培养。在移栽前每盆含相同重量，即950克蛭石，每32盆置于含2.5升的大盆中使蛭石吸足水分。一部分苗正常浇水，一部分苗从移苗后就不再浇水，至25天，野生型拟南芥和OE-2、OE-4和OE-25的生长状态显示明显差异，将苗剪下放到管中，置于65°烘箱烘干2天，称重。

实验共设三次重复，每次重复中，所测试的各株系植株分别为15株。

结果如图3C可见，在干旱处理后，野生型拟南芥、OE-2、OE-4和OE-25的平均单株干重约为0.13、0.14、0.18和0.21克，其中OE-4株系的单株干重明显高于野生型拟南芥，而OE-25株系单株干重与野生型拟南芥的差异达到极显著。

干旱处理时的生长状态与转基因株系中GmDREBL基因的表达水平相关，在3个转基因株系中，OE-2中的表达量最低、OE-4中次之，OE-25中最高，耐旱性实验结果显示，OE-2株系的耐旱性与野生型拟南芥无明显差异，OE-4株系的耐旱性与野生型拟南芥有显著差异，而OE-25株系植株的耐旱性最高，与对照相比有极显著差异。

T₂代转pGWB412拟南芥和野生型拟南芥结果无显著差异。

说明过表达GmDREBL基因能提高植株的耐旱性。

Claims

1.GmDREBL蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在调控植物耐逆性中的应用；

所述GmDREBL蛋白是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐旱性。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：

所述GmDREBL蛋白编码基因为是如下(1)-(4)中任一种的DNA分子：

(1)编码区为序列表中的序列1所示的DNA分子；

(2)编码区为序列1自5’末端第1-633位核苷酸所示的DNA分子；

5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：

所述重组载体为将所述GmDREBL蛋白编码基因插入表达载体中，得到表达GmDREBL蛋白的重组载体。

6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：

所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

7.一种培育转基因植物的方法，为将所述GmDREBL蛋白编码基因导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物耐逆性高于所述目的植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐旱性。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：

所述GmDREBL蛋白编码基因导入目的植物通过所述重组载体导入目的植物中。

10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：

所述植物为双子叶植物或单子叶植物。