CN111635905B - 枣疯病植原体效应因子基因Zaofeng6及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了枣疯病植原体效应因子基因Zaofeng6及应用，其中枣疯病植原体效应因子基因Zaofeng6的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因具有矮化植物、使植物形成丛枝表型以及使植物产生小叶症状的功能，本发明通过PCR技术克隆得到Zaofeng6，将其利用农杆菌介导的方法转入Columbia型拟南芥进行功能验证，有利于从分子机制上阐明枣疯病症状发生过程中植原体对寄主的侵染机制，对进一步实现枣疯病的防治具有积极的指导作用。

Description

枣疯病植原体效应因子基因Zaofeng6及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及枣疯病植原体效应因子基因Zaofeng6及应用。

背景技术

植物病原菌在侵染寄主植物时，会激活植物自身的防卫反应，从而抑制病原菌的侵染；然而病原菌会分泌效应因子来抑制寄主的防卫反应，以保证病原菌更好的侵入植物，获取营养。效应因子是通过哪种方式共同合作来破坏植物的防卫反应从而达到病原菌成功侵染的目的需要不断去探索。在分子水平上，对病原菌致病靶标的研究，为抗病品种的选育及生态农药的研发提供理论基础，有效解决传统化学防治病害造成的病原菌抗药性增强和药害残留所引发的食品安全问题。随着测序技术的不断发展，重要病原菌的全基因组测序工作将逐步完成，在细菌、卵菌、真菌和线虫中会发现越来越多的效应因子，了解病原物与寄主的相互作用将更加透彻，这将为植物病害的有效防治开辟新的途径。

枣(Ziziphus jujuba)是我国重要的经济林树种。枣疯病(Jujube witches’broom，JWB)是影响枣产业发展的严重病害之一，近年来对我国枣产业造成了重大打击。枣树感染枣疯病后，表现出丛枝、小叶簇生、植株矮化、花器官畸形及花变叶等异常发育表型，严重时整株枯死。其昆虫介体体长通常不超过5mm，流动性强，极易造成较大范围传播。枣疯病病原是植原体(Candidatus phytoplasma ziziphi)，专性寄生在植物韧皮部筛管细胞，由于生长条件苛刻无法离体培养，枣疯病植原体的致病机理仍不明晰。

阐明枣疯病植原体致病机理是有效防治枣疯病的重要环节。随着越来越多植原体基因组被测序分析，发现效应因子是植原体导致寄主植物病症发生的核心要素。研究表明植原体通过分泌效应因子调控植物形态建成及防御系统，使寄主代谢失常，出现各种病症，其中小叶、丛枝及矮化表型最为典型。因此枣疯病植原体效应因子的鉴定是解析枣疯病发生机理、制定防控技术、培育抗病品种的关键。2018年，枣疯病植原体基因组测序完成为效应因子鉴定提供了良好的基础。研究枣疯病植原体的致病机制，对新型杀菌剂的研发以及卵菌病害的有效防治有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供枣疯病植原体效应因子基因Zaofeng6及应用。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

枣疯病植原体效应因子基因Zaofeng6，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或能够与序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述枣疯病植原体效应因子基因Zaofeng6编码的蛋白选自，

(1)其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

(2)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个((如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；如5个，3个))氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)蛋白功能的由(1)衍生的蛋白；或

(3)与(1)限定的蛋白序列有80％((较佳地90％以上，如95％，98％，99％或更高))以上同源性且具有(1)蛋白功能的由(1)衍生的蛋白。

也就是说本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述枣疯病植原体效应因子基因Zaofeng6，还包括与SEQ ID NO：1具有较高同源性(如同源性高于40％；较佳地高于50％；较佳地高于60％；更佳地高于70％；更佳地高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％)的同源基因。

其中，序列中的SEQ ID NO.1由243个碱基组成，自5’端第1位碱基为转录起始位点，第240-243位碱基为终止密码子，编码框为240个碱基，共编码80个氨基酸。

并且含有上述基因的表达载体、重组载体或转基因细胞系以及含有所述载体的宿主细胞也落入本发明的保护范围之内。

本发明中术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。其中，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株。

本发明的最主要的目的是在分子水平上对枣疯病植原体效应因子进行鉴定，从而对解析枣疯病发生机理、制定防控技术、培育抗病品种以及生态农药的研发提供理论基础。

另外，由于发现枣疯病植原体的典型症状是小叶，丛枝和矮化，虽然对某些植物来讲属于病害，但是对于一些需要矮化栽培的植物来讲，通过转基因技术通过将枣疯病植原体效应因子基因Zaofeng6转入植物细胞、组织、器官或种子中，从而获得转基因植物，也为一部分需要矮化的植物育种提供一种方式。

本发明还公开了上述枣疯病植原体效应因子基因Zaofeng6在如下方面的应用：

(1)矮化植物；

(2)使植物形成丛枝表型；

(3)使植物产生小叶表型。

上述应用通过转基因方式来获得矮化、丛枝和/或小叶症状的植物。

其中，矮化表现包括平均抽薹高度降低，丛枝表现包括抽薹分枝增加，小叶症状包括莲座叶以及薹上叶片的长和宽均变小。并且所述应用还包括降低果荚的长度。

作为本发明的一种实施方式，将多核苷酸通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述Zaofeng6蛋白到植物细胞中，使所述的植物细胞表达Zaofeng6蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达Zaofeng6蛋白的植物。优选的，利用农杆菌转化法将Zaofeng6蛋白的编码基因转入植物中。

本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。

作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：鼠李科。比如，所述的“植物”包括但不限于：茄科的烟草；十字花科的拟南芥；鼠李科的枣树等。

尤其适用于需要矮化的植物，比如果树和观赏植物，包括苹果、梨、甜樱桃、柑橘、海棠等。

本发明具有如下优点：

(1)本发明首次筛选出枣疯病效应因子，通过克隆得到Zaofeng6，其基因序列与其他种类植原体的效应因子序列同源性很低，是一种新的植原体效应因子。

(2)发明人利用农杆菌介导的方法转入Columbia型拟南芥中验证目的基因的功能，有利于从分子机制上阐明Zaofeng6在调控枣形态建成方面的作用，对进一步阐明枣疯病致病机制，枣品质和性状改良，培育抗病新品种具有积极的指导作用，并且为生态农药的研发提供理论基础。

(3)相对于其它效应因子引起植物表型的局部改变，如叶片形态、腋芽抽枝或植株高度单方面改变，Zaofeng6基因可同时诱导整株拟南芥各器官的畸形发育，出现小叶，丛枝及矮化等症状。这也体现了Zaofeng6在枣疯病植原体侵染枣的进程中扮演的关键作用。

(4)对于一些需要矮化的植物如果树和观赏植物(减少不必要的养分消耗，以便充分利用光能，地力，提早结果、提高产量或增加观赏效果)，可以通过转基因的方式将Zaofeng6蛋白的编码基因转入植物中，为植物矮化育种提供一种新的途径。

附图说明

图1是枣疯病植原体效应因子Zaofeng6的PCR扩增电泳图；

图中1-6泳道样品为Zaofeng6 PCR扩增产物，图中左侧条带的M为DL 2000marker，基因Zaofeng6基因片段大小为240bp；

图2是pSAK277-Zaofeng6重组质粒的PCR扩增电泳图；

图中1-3泳道样品为pSAK277空载质粒PGR扩增产物，图中4-7泳道样品为pSAK277-Zaofeng6重组质粒PCR扩增产物。图中左侧条带的M泳道样品为DL2000 marker，pSAK277-Zaofeng6扩增片段大小为740bp左右；

图3是转Zaofeng6阳性拟南芥PCR-凝胶电泳检测图；

图中1-9分别代表不同转Zaofeng6的拟南芥株系，pSAK277代表转空载拟南芥株系；

图4是野生型拟南芥株系(WT)，过表达pSAK277空载拟南芥株系(EV)和过表达Zaofeng6拟南芥株系(Zaofeng6)在苗期表型观察图；

图5是野生型拟南芥株系(WT)，过表达pSAK277空载拟南芥株系(EV)和过表达Zaofeng6拟南芥株系(Zaofeng6)生育指标调查。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明中用于Zaofeng6基因扩增的感染枣疯病的病枣品种为灰枣，由河南农业大学园艺学院果树重点实验室提供。品种详细信息可以参见Chen et al.，2019。

发明人通过生物信息学技术在枣疯病植原体基因组基础上筛选得到枣疯病植原体效应因子Zaofeng6。本发明将其与植物过表达载体连接后导入野生型拟南芥进行致病性鉴定。

实施例一枣疯病植原体效应因子Zaofeng6基因的分离和功能鉴定

试验方法

1、基因Zaofeng6的分离

利用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程股份有限公司，上海)提取疯枣叶片总DNA，以DNA为模版，以下述序列为引物，通过PCR获得基因Zaofeng6的全长序列，PCR扩增电泳图如图1所示。基因Zaofeng6的全长序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，共243bp，共编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，共80个。

引物序列为：

Zaofeng6-F：5′-TCCAAAGAATTCCCCGGTACCATGTTAAAATTTAAACATAATTT-3′；

Zaofeng6-R：5′-ATGATCTTTGTAATCCTCGAGTTATTTTTTTAAATTATCAGG-3′。

PCR的退火温度为52℃。

2、Zaofeng6基因的功能鉴定试验

为研究Zaofeng6基因在枣疯病症状发生过程中是否调控了枣的形态建成，通过转基因拟南芥来鉴定其功能。

2.1构建重组载体

将PCR获得的目的片段通过SE无缝克隆试剂盒(庄盟生物科技有限公司)连接到pSAK277植物过表达载体上后转化大肠杆菌，37℃摇菌过夜后提取质粒。使用pSAK277植物表达载体的通用引物对质粒进行检测(图2)，引物如下：

pSAK277-F：5′-CATCGAAAGGACAGTAGAAAAGG-3′；

pSAK277-R：5′-CATTAGAATGAACCGAAACCG-3′。

2.2转基因拟南芥阳性株的筛选

鉴于枣遗传转化体系构建周期长且技术并不完善，故采用模式植物Columbia型拟南芥用于Zaofeng6基因的功能验证。提取经过测序的pSAK277-Zaofeng6载体的质粒，利用液氮冻融法转入农杆菌GV3101中。调整农杆菌菌液浓度OD至0.8-1.0，采用蘸花法浸染转化Columbia拟南芥，待侵染的拟南芥结种后，收获的种子在含有卡那霉素(50mg/L)的MS固体培养基上进行筛选。筛选过程如下：用6.25％次氯酸钠溶液进行表面消毒5min，无菌水漂洗5次干净后，滤纸上晾干。种子播种于pH＝5.8，含有0.7％琼脂的MS培养基中。4℃纯化48h后移至14h/10h光暗，25℃，80％相对湿度、250μmol m-2 s-1光强的组培室中培养。待筛选培养基上长出绿色的小苗4d后移至穴盘中在上述条件下进行培养。待抽薹后提取DNA，常规PCR鉴定阳性植株。收获T0代种子后，继续在含有卡纳霉素的MS培养基上筛选阳性植株。移栽到穴盘后观察与野生型的差别。使用pSAK277通用引物证实片段插入，结果表明，抗性培养共筛选得到11株转Zaofeng6的候选阳性株系，经PCR检测其中有10株为阳性株系(图3)。

2.3转Zaofeng6拟南芥株系表型观察及生长指标测定

图5为野生型拟南芥株系、转pSAK277空载拟南芥株系和转Zaofeng6拟南芥株系的表型观察图。整体看来，与野生型和空载对照相比，转Zaofeng6的拟南芥植株表现出小叶、丛枝及矮化表型，除此之外，Zaofeng6对拟南芥花器官的发育也有明显的抑制作用(图4)。进一步对转Zaofeng6的拟南芥株系的生长指标进行调查，在影响莲座叶的生长方面，Zaofeng6显著抑制莲座叶的大小，表现在与野生型及转空载拟南芥株系相比，转Zaofeng6的拟南芥株系莲座叶的长和宽都要显著小于野生型及空载对照，造成莲座叶小叶表型；抽薹后，转Zaofeng6拟南芥株系的抽薹数目显著多于野生型及空载对照，形成丛枝表型，转Zaofeng6拟南芥株系的平均抽薹高度均显著小于野生型及空载对照，形成矮化表型；Zaofeng6显著抑制薹上叶片的生长，与野生型及空载对照相比，其叶长和叶宽显著降低。此外，Zaofeng6还显著降低了果荚的长度(图5)。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 枣疯病植原体效应因子基因Zaofeng6及应用

<130> 2010

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 243

<212> DNA

<213> Ziziphus jujuba

<400> 1

atggctgcgt ctaaaaacaa tggaaaagat ataatttcat ccaaggaaga agcaaaaaat 60

aatgtaaaaa aatattacga attatataat actcttgaaa attattcaga agaagaaaga 120

aataaaatta ttcaaatgtt atcaaatcca gaaataataa aaacattaga agaaaaaatt 180

aaagaaacta aaactcaaga aaaaggttct ttttccaaaa aacctgataa tttaaaaaaa 240

taa 243

<210> 2

<211> 80

<212> PRT

<213> Ziziphus jujuba

<400> 2

Met Ala Ala Ser Lys Asn Asn Gly Lys Asp Ile Ile Ser Ser Lys Glu

1 5 10 15

Glu Ala Lys Asn Asn Val Lys Lys Tyr Tyr Glu Leu Tyr Asn Thr Leu

20 25 30

Glu Asn Tyr Ser Glu Glu Glu Arg Asn Lys Ile Ile Gln Met Leu Ser

35 40 45

Asn Pro Glu Ile Ile Lys Thr Leu Glu Glu Lys Ile Lys Glu Thr Lys

50 55 60

Thr Gln Glu Lys Gly Ser Phe Ser Lys Lys Pro Asp Asn Leu Lys Lys

65 70 75 80

Claims (6)

1.枣疯病植原体效应因子基因Zaofeng6的应用，其特征在于，所述基因Zaofeng6的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述应用为矮化植物、使植物形成丛枝表型和使植物产生小叶表型。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述枣疯病植原体效应因子基因Zaofeng6编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，矮化表现为平均抽薹枝条的高度降低。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，丛枝表现为包括分枝数目增加。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，小叶表型为包括莲座叶以及薹上叶片的长和宽均变小。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用还包括降低果荚的长度。

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