CN102041248A - 植物耐逆性相关蛋白GmSIK1及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白GmSIK1及其编码基因与应用。该蛋白，选自如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。将所述蛋白的编码基因导入植物细胞，可以得到耐逆性增强的转基因植株。本发明的蛋白及其编码基因对培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫如耐干旱和/或耐盐植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。

Description

植物耐逆性相关蛋白GmSIK1及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白GmSIK1及其编码基因与应用，特别是来源于大豆的耐逆性相关蛋白GmSIK1及其编码基因与应用。
背景技术
植物的生长发育与外界环境密切相关，植物的各个生长发育阶段都会经受各种逆境胁迫，包括生物胁迫和非生物胁迫。非生物胁迫如干旱、盐渍、低温等是制约植物生长、降低农作物产量与质量的重要因素。在农业生产中，由非生物胁迫造成的作物产量的损失使得全球主要农作物的平均产量减少50％以上。经过漫长的进化过程，植物具备了适应不同逆境的机制。其中重要的机制之一就是诱导相关基因的表达。参与非生物胁迫应答的基因通常可分为两大类，一类是功能性基因，它们编码那些直接保护植物细胞免受逆境伤害的效应蛋白，如生物合成渗透保护剂涉及的酶类、晚期胚胎富集蛋白(LEA)、抗冻蛋白、伴侣蛋白、解毒蛋白、水孔蛋白等；另一类则是调控基因，它们的产物调控植物在非生物胁迫反应中的基因表达和信号传递，包括转录因子、蛋白激酶和参与磷酸肌醇代谢的相关酶类。
受体类激酶是植物蛋白激酶家族中最大的一个基因家族。植物受体类激酶和胞质激酶同属于受体类激酶基因家族。受体类激酶家族是根据其各成员激酶结构域的系统进化关系进行分类的。目前，已在超过20种开花植物中克隆到全长的受体类激酶基因。植物受体类激酶按其功能可分为两大类。一类为在正常生长情况下，参与调控植物体的生长发育过程。另一类为参与逆境胁迫应答和植物与微生物的相互作用。
认识植物中逆境胁迫信号的传递过程是了解与调控植物耐逆性的关键，而蛋白激酶尤其是受体类激酶在信号传递过程中起着关键的作用，但是由于对植物受体类激酶的认识较晚，有关它作用机制的资料还相当缺乏。因此，研究受体类激酶的耐逆机制，具有重要的理论意义。
大豆作为最重要的油料作物和植物蛋白质的主要来源，提高其耐逆性具有重要的理论及现实意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种与植物耐逆性相关的蛋白及其编码基因。
本发明所提供的蛋白，名称为GmSIK1(Stress Inducible Kinase 1)，来源于大豆，具体为如下(a)、(b)、(c)或(d)所示的蛋白：
(a)序列表中序列2所示的氨基酸序列自N端起第34-714位氨基酸残基组成的蛋白质；
(b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(c)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质；
(d)由与序列表中序列2所示的氨基酸序列至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的氨基酸序列组成的且与植物耐逆性相关的蛋白质。
序列表中的序列2由714个氨基酸残基组成，包含信号肽(自氨基末端第1至33位氨基酸残基)，3个跨膜区(分别自氨基末端第5至27、294至313、333至355位氨基酸残基)和胞内激酶结构域(自氨基末端第392至662位氨基酸残基)。具有受体类激酶结构的典型特征。受体类激酶家族根据激酶结构域的进化关系可分为不同的亚家族，按照这种分类方法，GmSIK1属于LRK-10L亚家族，其胞外没有已知的结构域。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在(a)或(b)所述序列的任何位置进行取代和/或缺失和/或添加，优选为1-20个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，更优选为1-15个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，更优选为1-10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，最优选为1-5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
为了使(a)、(b)、(c)或(d)的蛋白便于纯化，可在所述蛋白的N端或C端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
  标签   残基   序列
  Poly-Arg   5-6(通常为5个)   RRRRR
  Poly-His   2-10(通常为6个)   HHHHHH
  FLAG   8   DYKDDDDK
  Strep-tag II   8   WSHPQFEK
  c-myc   10   EQKLISEEDL
上述(a)、(b)、(c)或(d)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(c)或(d)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述蛋白的氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代、替换和/或添加，有的是由于自然发生的变异引起的，有的是由人工诱变处理引起。
本发明所提供的编码基因具体可为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子特异性杂交且编码所述植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
所述特异性杂交条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2X SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1X SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5X SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1X SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1X SSC，0.1％SDS中漂洗。
上述特异性杂交条件也可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
序列表中的序列1由2145个脱氧核糖核苷酸组成。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体具体可为在pBin438的BamHI和KpnI位点间插入自序列表中序列1的自5’末端的第1-2145位脱氧核苷酸得到的。
可用现有的植物表达载体构建含有GmSIK1基因的重组表达载体。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
扩增上述任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述引物对具体可为如下1)、2)或3)或4)：
1)一条引物的序列如序列表中序列7所示，另一条引物的序列如序列表中序列8所示；此引物是扩增基因全长的引物；
2)一条引物的序列如序列表中序列9所示，另一条引物的序列如序列表中序列10所示；此引物是扩增基因部分片段的引物；
3)一条引物的序列如序列表中序列3所示，另一条引物的序列如序列表中序列4所示；此引物是扩增基因部分片段的引物；
4)一条引物的序列如序列表中序列5所示，另一条引物的序列如序列表中序列6所示。此引物是扩增基因部分片段的引物。
本发明的最后一个目的是提供一种培育耐逆性植物的方法。
本发明所提供的培育耐逆性植物的方法，是向植物中导入上述任一所述的编码基因，培育，得到耐逆性植物。
上述任一所述蛋白或上述任一所述的编码基因在培育耐逆性植物中的应用也属于本发明的保护范围。
上述方法和应用中，所述耐逆性为耐盐和/或耐干旱；所述植物为双子叶植物，优选为大豆、苜蓿、百脉根或拟南芥。
转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。
本发明中所述的“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“编码序列”、“开放阅读框(ORF)”等包括单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。
本发明基因可通过如下方式导入宿主中：将本发明基因插入表达盒中，再将表达盒通过植物表达载体、非致病自我复制的病毒或弄杆菌导入宿主。携带本发明基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。
所述耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性，如耐盐和/或耐干旱。
上述任一所述方法和应用中，所述植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于玉米，小麦，大麦，黑麦，甘薯，豆，豌豆，菊苣，莴苣，甘蓝，花椰菜，花茎甘蓝，芜菁，萝卜，菠菜，芦笋，洋葱，大蒜，胡椒，芹菜，笋瓜，南瓜，大麻，夏南瓜，苹果，梨，温桲，瓜，李子，樱桃，桃子，油桃，杏，草莓，葡萄，木莓，黑莓，菠萝，鳄梨，蕃木瓜，芒果，香蕉，大豆，番茄，高粱，甘蔗，甜菜，向日葵，菜籽油菜，三叶草，烟草，胡萝卜，棉花，苜蓿，稻，马铃薯，茄子，黄瓜，拟南芥属和木本植物如针叶树和落叶树。特别优选的是水稻、小麦、大麦、玉米、燕麦、黑麦、百脉根、拟南芥、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿。
转入本发明基因的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。
转入本发明基因的植物中，会有相应的本发明的植物耐逆性相关蛋白的生物合成，进而使转入本发明基因的植物产生改良性状。
本发明的基因可以在序列1的基础上进行以下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果：
1)为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列，本发明核苷酸序列可根据实际需要进行修饰和优化。如可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。而且，优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％，优选为多于45％，更优选为多于50％，最优选多于约60％。
2)为了翻译的有效起始，可以修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列。例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰。
3)将本发明基因与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达。所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子。启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种。例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期耐逆而定。尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达。
优选的组成型启动子包括CaMV 35S和19S启动子。所述启动子还可为来源于在大多数细胞类型中表达的几种肌动蛋白基因中的启动子。另一个优选的组成型启动子为泛素启动子。
上述启动子还可为在根、木髓、叶或花粉中引导表达的启动子，即组织特异性启动子。棉花核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子(美国专利US6,040,504)、水稻蔗糖合酶启动子(美国专利US 5,604,121)、夜香树黄化叶卷曲病毒启动子(WO 01/73087)。
化学诱导型启动子可为Rab29A启动子(美国专利US 5,614,395)。
4)将本发明基因与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率。例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9。任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。
5)可向本发明基因中引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。
在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。
上述重组载体中的出发载体可根据所使用的转化技术及靶植物物种的特性进行选择。上述选择可体现在载体中的抗性标记的选择上。对于一些靶物种，可以优选不同的抗生素或除草剂选择性标记。通常用在转化中的选择性标记包括赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因，和提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
在另一个优选的实施方式中，将本发明的核苷酸序列直接转化到质体基因组中。质体转化的主要优点是质体通常不需要实质修饰就能表达细菌基因，并且质体能表达单启动子控制下的多个开放读框。通过同源重组将基因插入每个植物细胞中存在的所有几千个环形质体基因组拷贝中的质体表达利用了拷贝数大大高于核表达基因的优势，使得表达水平可以容易地超过总可溶植物蛋白质的10％。将本发明基因插入到质体靶向载体中，并且转化进入期望的植物宿主质体基因组中。获得了对于含有本发明核苷酸序列的质体基因组而言属同质的植物，该植物具有高水平地表达核苷酸序列的能力。
实验证明，本发明的蛋白及其编码基因能显著提高植株的耐盐性和耐旱性，转入本发明基因的植物的抗逆性明显高于未转入本发明基因的植物，如转基因百脉根，经过高盐处理或干旱处理后，转基因植物的恢复情况明显好于未转基因百脉根，且存活率都较对照组有显著提高。本发明的耐逆性相关蛋白及其编码基因对培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫如耐干旱和/或耐盐植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。因此，本发明蛋白及其编码基因在培育抗逆性植物、作物育种等领域中将有广阔的应用前景。
附图说明
图1为5’-RACE(左)和3’-RACE(右)获得的片段的电泳结果。
图2为GmSIK1蛋白的结构示意图。
图3为GmSIK1基因在不同组织器官中的表达特征。
图4为GmSIK1基因在不同逆境胁迫下的表达特征。
图5为植物过量表达载体pBin438-GmSIK1示意图。
图6为GmSIK1高表达的转基因百脉根RT-PCR检测。
图7为转GmSIK1基因百脉根正常条件下的生长情况。
图8转GmSIK1基因百脉根盐胁迫下的生长状况和存活率。
图9为转GmSIK1基因百脉根干旱胁迫下的生长状况和存活率。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
大豆[Glycine max(L.)Merr]南农1138-2的种子，获取途径：植物，赠送；直接来源：为非采集方式，获取时间为1998年6月，提供者名称为南京农业大学国家大豆改良中心，提供者联系方式为025-84395331，提供者地址为中国南京玄武区卫岗1号。原始来源不清楚。
大豆[Glycine max(L.)Merr]南农1138-2的种子(罗庆云、於丙军、刘友良，大豆苗期耐盐性鉴定指标的检验，大豆科学，2001 20(3))(中国科学院遗传与发育生物学研究所)；
pBIN438载体上(李太元，田颖川，秦晓峰，等.高效抗虫转基因烟草的研究，中国科学(B辑)，1994，24(3)：276-282.)(中国科学院遗传与发育生物学研究所)；
农杆菌GV3101菌株(徐品三 刘岚 夏秀英，农杆菌介导东方百合″西伯利亚″遗传转化体系建立，大连理工大学学报，2008 48(5))(中国科学院遗传与发育生物学研究所)；
百脉根(Lotus corniculatus L.)Leo的种子(关宁、王涌鑫、李聪、苗丽宏、张博，含硫氨基酸基因植物表达载体的构建及对百脉根的转化，分子植物育种，2009年，第7卷，第2期，第257-263页)(中国科学院遗传与发育生物学研究所)。
实施例1、大豆耐逆性相关受体激酶基因GmSIK1的筛选及其cDNA的克隆
一、GmSIK1的筛选
大豆基因组测序工作的完成为研究发现新的耐逆境基因提供了有利条件。根据发明人测定的3万条EST序列和GenBank下载的28万多条序列一起进行EST聚类，得到56,147个单一基因(unigenes)，其中包括32,278个重叠群(Contigs)和23,869个单拷贝序列(singleton)。在拟南芥已有的单一基因(unigenes)注释的基础上，对大豆的单一基因(unigenes)的功能进行分类注释。根据已知的大豆受体类激酶序列与大豆单一基因(unigenes)进行比对，得到了486个大豆受体类激酶候选基因。选择序列较完整的338个基因片段设计RT-PCR引物，分析它们在盐、干旱、冷和ABA处理等胁迫下的应答反应。筛选得到一种基因片段，其表达明显受盐胁迫的诱导。
二、GmSIK1的获得
1、GmSIK1拼接序列的获得
经EST拼接得到的基因片段长度为1315bp，根据1315bp序列设计用于5’-RACE和3’-RACE的基因嵌套特异引物如下：
用于5’-RACE基因特异引物：
引物1：GmSIK1-GSP：5’-TAGACGTGTAGCTCAAAGAGCGCACCAA-3’(序列3)；
引物2：GmSIK1-NGSP：5’-TGT GGG AAA GGC GTA GCC AGG GAT GTTT-3’(序列4)。
用于3’-RACE基因特异引物：
引物3：GmSIK1-GSP：5’-CCT CAC ACA GAG CAC TCA AGC CAA CAT TTC-3’(序列5)；
引物4：GmSIK1-NGSP：5’-ATT CAC ATG GAA GAG GTC TCG GAA GAGG-3’(序列6)。
将大豆[Glycine max(L.)Merr]南农1138-2种子置于培养皿中，培养室中生长2-3周，收集1g新鲜叶片，在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA。
将RNA用逆转录酶合成cDNA。采用RACE方法克隆基因片段的5’和3’端未知序列，具体操作依照SMART RACE(CLONTECH)试剂盒进行。具体步骤如下：
1)逆转录
5’-RACE为：1μl大豆总RNA、引物1和引物2各1μl、1μl SMART II oligo引物(10μM)和2μl灭菌水。3’-RACE为：1μl大豆总RNA、引物3和引物4各1μl、和3μl灭菌水。混匀后，70℃加热2min，置冰上冷却2min。加入2μl 5×缓冲液，1μl DTT(20M)，1μl dNTP(10M)和1μl powerscript逆转录酶。42℃逆转录90mins，72℃加热2min终止反应。
2)PCR扩增
以通用引物混合物UPM和基因特异引物进行“Touchdown”PCR扩增。在Perkin-Elmer(PE)DNA Thermal Cycler 9600启动PCR反应，条件为：5×(94℃30s，72℃3min)，5×(94℃30s，70℃30s，72℃3min)，25×(94℃5s，68℃10s，72℃2min)。将第一次扩增的产物稀释20倍后作为第二次扩增的模板。
图1为5’-RACE和3’-RACE获得的片段的电泳结果，其中，1：marker；2：5’-RACE获得的片段；3：3’-RACE获得的片段。
5’-RACE得到约800bp单一条带，3’-RACE得到约350bp的单一条带。从胶中回收两个片段，纯化后连接到pGEM-T Easy载体进行测序。所测序列与已知序列进行拼接，获得拼接序列S。
在成熟mRNA 3’端普遍存在PolyA的尾巴，在拼接序列S的3’端有PolyA序列。经SMART软件分析，拼接序列S的5’端有信号肽。从NCBI BLAST分析进行验证，拼接序列S为全长基因序列。
获得的GmSIK1序列2275bp，其中5’非编码区为43bp，3’非编码区为87bp，编码区由2145个脱氧核糖核苷酸组成。其编码的蛋白含714个氨基酸。
2、GmSIK1 cDNA的克隆
根据全长基因序列设计一对特异引物如下：
引物GmSIK1FL5’-CGC GGA TCC ATG TGT GTC TTA CTT CCT TCC-3’(序列7)和GmSIK1FR 5’-CGG GGT ACC TCA AGA GTT GTT CTC CAG TG-3’(序列8)扩增出2145bp GmSIK1全长基因。
以大豆南农1138-2幼苗的叶片cDNA为模板进行PCR扩增，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为2.7kb的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy(Promega)连接，参照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69：2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定。测序结果表明，扩增到的基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，该基因由2145个脱氧核糖核苷酸组成，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。将序列1所示所示的基因命名为GmSIK1，将序列2所示的蛋白命名为GmSIK1，将含有序列1所示基因的pGEM-T Easy载体命名为pTE-GmSIK1。GmSIK1蛋白由714个氨基酸组成；用SMART软件预测该蛋白的结构域，表明，GmSIK1蛋白包含信号肽(自氨基末端第1至33位氨基酸残基)，3个跨膜区(分别自氨基末端第5至27、294至313、333至355位氨基酸残基)和胞内激酶结构域(自氨基末端第392至662位氨基酸残基)，具有受体类激酶结构的典型特征，。受体类激酶家族根据激酶结构域的进化关系可分为不同的亚家族，按照这种分类方法，GmSIK1属于LRK-10L亚家族，其胞外没有已知的结构域(图2)。
实施例2、GmSIK1在不同组织器官中的表达特征
分别提取两周龄大豆南农1138-2的幼苗的根、茎、叶和田间大豆南农1138-2的花和豆荚的RNA，RT-PCR分析GmSIK1的表达量。用tubulin基因作为对照，引物为：5’-AAC CTC CTC CTC ATC GTA CT-3’(序列9)和5’-GAC AGC ATC AGC CATGTT CA-3’(序列10)。
GmSIK1基因在不同组织器官中的表达特征见图3。其中，1：根；2：茎；3：花；4：叶；5：豆荚。
结果表明，GmSIK1在叶中表达很强，在其它组织器官中表达较弱。
实施例3、不同逆境胁迫下大豆GmSIK1基因的表达特征
将大豆南农1138-2[Glycine max(L.)Merr]播种于装满蛭石的花盆中，生长2个星期(长出5-6片真叶)后取幼苗进行如下胁迫处理：
1)脱落酸(ABA)处理：将根完全浸入100μM ABA溶液中；2)水杨酸(SA)处理：用2mM水杨酸喷洒幼苗的叶片；3)干旱胁迫处理：将大豆幼苗放置于室温空气中干旱；4)低温(4℃)胁迫处理：将根完全浸入水溶液中，水溶液保持4℃；5)盐胁迫处理：将根完全浸入200mM NaCl溶液中。6)对照：将根完全浸入水溶液，水溶液保持室温。
经过上述各处理后，进行光照培养，分别在上述各种处理0、1、3、6、12、24小时时取叶片，提取RNA，用tubulin基因作为对照，RT-PCR分析GmSIK1的表达量。
引物为：5’-AAC CTC CTC CTC ATC GTA CT-3’(序列9)和5’-GAC AGC ATC AGCCAT GTT CA-3’(序列10)。
GmSIK1基因在不同胁迫下的表达特征见图4。其中：A：脱落酸处理；B：水杨酸(SA)处理；C：干旱胁迫处理；D：低温胁迫处理；E：盐胁迫处理；F：对照。
结果表明：1)ABA处理：GmSIK1的表达在3小时时即至峰值，然后下降；2)水杨酸处理：GmSIK1的表达1小时即有升高，之后下降至24小时时猛增到高峰；3)旱胁迫：GmSIK1在胁迫1小时时即明显升高，至12小时达到高峰，24小时略下降；4)低温胁迫：GmSIK1的表达在1小时升高至3小时达到最大值，之后有所降低，至24小时回升；5)盐胁迫：GmSIK1的表达自胁迫1小时始明显逐步上升，至12小时达到最高，24小时略有下降；6)GmSIK1的表达在加水对照组几无变化。
实施例4、转GmSIK1基因植株的获得和耐逆性鉴定
一、GmSIK1表达载体pBin438-GmSIK1的构建
用限制性内切酶BamH I和Kpn I从重组载体pTE-GmSIK1切下GmSIK1基因，并将其正向插入pBIN438载体的BamH I和Kpn I位点，使目的基因在双CAMV35S启动子和Ω序列引导下表达，将正确插入基因GmSIK1得到的重组质粒命名为pBIN438-GmSIK1，该重组载体的结构见图5。酶切和测序验证，结果表明构建的重组载体pBIN438-GmSIK1中插入的基因GmSIK1的方向及序列正确。
二、转GmSIK1基因百脉根的获得和耐逆性鉴定
1、转GmSIK1基因百脉根的获得
将pBIN438-GmSIK1用电转化的方法转入农杆菌GV3101菌株中。用转入重组载体pBIN438-GmSIK1的农杆菌转化百脉根Leo(lotus corniculatus L.)。
转化方法为：取生长状态良好的无菌苗的茎节，用农杆菌侵染20-30min后，转入诱导培养基，25℃暗培养3天。然后转入MS筛选培养基培养30天，再更换到含卡那霉素80mg/mL的MS筛选培养基。筛选到的抗性植株经诱导生根，移到温室，待到季节合适时移到农场。共筛选获得70株抗性株系。
MS培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司，品牌：青岛海博，型号：HB8469。
诱导培养基的组成：向MS培养基中添加蔗糖至浓度为30g/L、萘乙酸(NAA)和6-苄氨基嘌呤(BAP)，萘乙酸(NAA)在诱导培养基中的浓度为0.5mg/L，BAP在诱导培养基中的浓度为0.5mg/L；
MS筛选培养基的组成：向MS培养基中添加BAP、头孢霉素和卡那霉素得到的；BAP在MS筛选培养基中的浓度为0.2mg/L，头孢霉素在MS筛选培养基中的浓度为500mg/L，筛选剂卡那霉素在MS筛选培养基中的浓度为50mg/L；
同时，将转空载体pBIN438转化百脉根作为对照株系(记作(CK))，方法同转基因植株制备。
RT-PCR鉴定上述70株抗性株系(此70株系为T1代)，RT-PCR鉴定方法如下：取各植株的叶片，提取RNA，然后进行RT-PCR，引物如下：
5’-AAC CTC CTC CTC ATC GTA CT-3’(序列9)
5’-GAC AGC ATC AGC CAT GTT CA-3’(序列10)
结果，从上述70株抗性株系中鉴定出7个株系有GmSIK1基因的过量表达，进一步筛选出表达量较高但有不同的3株(分别记作1#株系、2#株系和3#株系)(此3株系为T1代)进一步作功能试验。此3株系的RT-PCR鉴定结果如图6(CK表示对照，1、2、3分别表示1#株系、2#株系和3#株系)。所选择的3个转基因植株中基因GmSIK1均有不同程度的异源过量表达，转空载体对照植株中没有GmSIK1基因的表达。
2、转GmSIK1基因植株在正常条件下的生长情况
大田生长的1#株系、2#株系、3#株系和转空载体对照的植株(CK)，取13-15cm长的新生侧枝若干，放在瓶中水培养，七天后长出幼根。
第8天植株的生长状况见图7，结果显示，正常条件下，转基因的3个株系、与转空载体对照植株生长状况无明显差异。
百脉根侧枝水培养的方法：剪取相似位置的侧枝，浸泡于水中七天后即可长出幼根。
3、转GmSIK1基因植株的耐逆性检测
以下分别检测1#株系、2#株系、3#株系和转空载体对照植株在逆境胁迫下的生长状况。
1)耐盐性试验
将大田生长的3个转基因株系(1#株系、2#株系、3#株系)植株和转空载体对照植株(CK)，取13-15cm长的新生侧枝若干，放在瓶中水培养，七天后长出幼根。分别将幼根移入100mM NaCl溶液，处理24天后，再置于正常条件下恢复生长3天，观察表型并拍照同时进行存活率统计。实验共设三次重复，每次重复每个株系检测10株，试验数据为三次重复实验的平均值±标准差。
每次重复存活率的计算公式：存活率＝存活的植株数目/10株×100％。
结果如图8所示(CK和对照均表示对照组，1、2、3分别表示1#株系、2#株系、3#株系)，A图为盐处理24天后植株的表型照片；B图为植株的存活率比较。
结果表明，NaCl处理24天后，对照植株大部分叶片枯萎，顶端新生叶枯死；而转基因植株中只有少部分侧枝出现枯萎，大部分植株虽出现叶片增厚，叶子变黄，但植株仍在生长，表现为较好的耐盐性；GmSIK1转基因株系1#株系、2#株系、3#株系的存活率依次为80％、80％、52％，均在50％以上，而对照仅约10％。
2)耐旱性鉴定
用PEG水溶液来模拟土壤干旱环境。PEG作为渗透调节物质，分子量大不会透过细胞壁对细胞，产生类似于土壤干旱的脱水效应。将大田生长的3个转基因株系(1#株系、2#株系、3#株系)植株和转空载体对照植株(CK)，取13-15cm长的新生侧枝若干，放在瓶中水培养，七天后长出幼根。分别将幼根浸入40％PEG溶液中，1天后观察并拍照。然后恢复浇水5天，观察表型并拍照，同时进行存活率统计。实验共设三次重复，每次重复每个株系检测10株，试验数据为三次重复实验的平均值±标准差。
每次重复存活率的计算公式：存活率＝存活的植株数目/10株×100％。
结果如图9(CK和对照均表示对照组，1、2、3分别表示1#株系、2#株系、3#株系)，A图为PEG处理1天(上)和复水5天后(下)植株的表型照片；B图为植株的存活率比较。
结果表明，PE6处理后，所有的材料叶片出现脱水萎蔫，表型无明显差异。复水后，约80％的对照材料叶片由于脱水导致干枯，顶端不能继续生长；在转基因植株中，受PEG脱水而萎蔫的叶片大部分能重新吸收水分，恢复正常生长，三个株系(1#株系、2#株系、3#株系)的存活率分别约为75％、68％和60％，而对照的存活率仅为20％。
上述实验表明，GmSIK1在百脉根中的异源表达提高了转基因植株的耐旱、耐盐性。GmSIK1参与了植物耐逆性信号传导。
序列表
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>植物耐逆性相关蛋白GmSIK1及其编码基因与应用
<160>10
<210>1
<211>2145
<212>DNA
<213>大豆属大豆(Glycine max(L.)Merr)
<400>1
atgtgtgtct tacttccttc cttcctcttt tcagaatcaa tggttacctc tctggctatc      60
ataattcttg tgctgctatt ccaacaaact tgccttgcca agcagcacca ccaccaccca     120
ccctgttatt cttcatgtgg cgaaattcac aacataacgt atccatttcg actaaaaggc     180
gacccaatcg gctgcggcga tcaagattac gaattagatt gcgttgaaaa cgtgacagta     240
atgactctat tttcagggaa attccacgtg caggaaataa attacaagag gtacgagatc     300
cggttgaccg atgctggtgt ggtggaggac attgcttgct caattcctcg ttatttcttt     360
aatctctaca atttcactta catcggtggt cttaactatt ctgcatatgg tccgttaagt     420
ttctcggggt atcctcagta tgcggtgttt ctaaactgca ctaccccagt caccgatgat     480
cctcgatacg tagctgtgaa ggtcaacggt aattgtgatt cgagttccgt aggccatatc     540
tatgccattc tggtcacaga cgatgatgat cgctttgggt ttacactgac ggacatcaag     600
gttgggtgcc gattgaaggt tgctacattt gcaaactgga aatataataa cagggaggtt     660
aacgtttctt attctgatat caacaagtgg ctgcaccacg gaatttggat gtcttggttc     720
tttccagtta tttgtaggga ccgatgcgga aagggtgtga gttgctacat cgatcaaacc     780
acgcgagaaa ctcgatgtgc agatagctac tgccaaatct ttggcattca aacatacaag     840
tgcggaattc gtaatcagat tcttgaatat atgcggcaaa ttcttggcta cacagtaggt     900
tatcttaaaa gcgttataat gggatatgta aatagaataa gatatcgcga gcaactaaca     960
agctgggata gtgaagcaga attctttgaa caaaatgcta tagcaatatt cctggcaacc    1020
agattgctat ttggaatcac acttttacta atgctatata tctatatgtg gcgacgtaga    1080
cattattcaa tgtatgaaaa cattgaaatt tttttgctag atagcaatct aaatcctatt    1140
aggtatgaat acagagaaat aaaaaaaatg accaaagatt tcaaagtgaa attgggtgaa    1200
ggaggtttcg gctctgtata caaaggaaaa cttcgaagcg ggctagatgt ggcaataaag    1260
atgttgacca aatccaaaac tagaggacaa gattttatca gtgaagtggc tacaattgga    1320
agaatacatc acgtgaatgt ggtgcgtctt attggatatt gtgctgaagg agaaaagcat    1380
gctctagttt atgaattcat gcctaatggt tcattggata aatacatttt ctctaaagaa    1440
gaaagtgtct ccttaagtta tgacaaaaca tatgaaatat gtcttggcat agctcgtggg    1500
attgcttatt tgcatcaaga ttgtgatgtg caaattctac attttgatat caagcctcat    1560
aatattcttc tagatgataa cttcattcca aaggtttcgg attttggact tgcaaagcta    1620
tatcctatca aagataagtc aattatttta actggactaa gaggaacttt tggttacatg    1680
gctccagaat tattctacaa aaatattggt ggagtgtcat ataaggcaga cgtctatagc    1740
tttggaatgc ttttgatgga aatgggaagt agaaggagga actcaaatcc tcacacagag    1800
cactcaagcc aacatttctt ccccttttgg atctatgatc attttatgga agaaaaggat    1860
attcacatgg aagaggtctc ggaagaggat aagattctag tgaaaaagat gttcatagtt    1920
tccctttggt gtatacaatt aaaaccaaat gatcgtcctt caatgaagaa ggttgtagag    1980
atgcttgaag gaaaggttga aaatattgat atgcctccaa agcctgtttt ttatccccat    2040
gaaacaacaa tcgactctga tcaagcatca tggagtgatt caactagttc ttgcaagaac    2100
attgacaaaa ccaagtccaa tttttcactg gagaacaact cttga                    2145
<210>2
<211>714
<212>PRT
<213>大豆属大豆(Glycine max(L.)Merr)
<400>2
Met Cys Val Leu Leu Pro Ser Phe Leu Phe Ser Glu Ser Met Val Thr
1               5                   10                  15
Ser Leu Ala Ile Ile Ile Leu Val Leu Leu Phe G1n Gln Thr Cys Leu
            20                  25                  30
Ala Lys Gln His His His His Pro Pro Cys Tyr Ser Ser Cys Gly Glu
        35                  40                  45
Ile His Asn Ile Thr Tyr Pro Phe Arg Leu Lys Gly Asp Pro Ile Gly
    50                  55                  60
Cys Gly Asp Gln Asp Tyr Glu Leu Asp Cys Val Glu Asn Val Thr Val
65                  70                  75                  80
Met Thr Leu Phe Ser Gly Lys Phe His Val Gln Glu Ile Asn Tyr Lys
                85                  90                  95
Arg Tyr Glu Ile Arg Leu Thr Asp Ala Gly Val Val Glu Asp Ile Ala
            100                 105                 110
Cys Ser Ile Pro Arg Tyr Phe Phe Asn Leu Tyr Asn Phe Thr Tyr Ile
        115                 120                 125
Gly Gly Leu Asn Tyr Ser Ala Tyr Gly Pro Leu Ser Phe Ser Gly Tyr
    130                 135                 140
Pro G1n Tyr Ala Val Phe Leu Asn Cys Thr Thr Pro Val Thr Asp Asp
145                 150                 155                 160
Pro Arg Tyr Val Ala Val Lys Val Asn Gly Asn Cys Asp Ser Ser Ser
                165                 170                 175
Val Gly His Ile Tyr Ala Ile Leu Val Thr Asp Asp Asp Asp Arg Phe
            180                 185                 190
Gly Phe Thr Leu Thr Asp Ile Lys Val Gly Cys Arg Leu Lys Val Ala
        195                 200                 205
Thr Phe Ala Asn Trp Lys Tyr Asn Asn Arg 6lu Val Asn Val Ser Tyr
    210                 215                 220
Ser Asp Ile Asn Lys Trp Leu His His Gly Ile Trp Met Ser Trp Phe
225                 230                 235                 240
Phe Pro Val Ile Cys Arg Asp Arg Cys Gly Lys Gly Val Ser Cys Tyr
                245                 250                 255
Ile Asp Gln Thr Thr Arg Glu Thr Arg Cys Ala Asp Ser Tyr Cys Gln
            260                 265                 270
Ile Phe Gly Ile Gln Thr Tyr Lys Cys Gly Ile Arg Asn Gln Ile Leu
        275                 280                 285
Glu Tyr Met Arg Gln Ile Leu Gly Tyr Thr Val Gly Tyr Leu Lys Ser
    29C                 295                 300
Val Ile Met Gly Tyr Val Asn Arg Ile Arg Tyr Arg Glu Gln Leu Thr
305                 310                 315                 320
Ser Trp Asp Ser Glu Ala Glu Phe Phe Glu Gln Asn Ala Ile Ala Ile
                325                 330                 335
Phe Leu Ala Thr Arg Leu Leu Phe Gly Ile Thr Leu Leu Leu Met Leu
            340                 345                 350
Tyr Ile Tyr Met Trp Arg Arg Arg His Tyr Ser Met Tyr Glu Asn Ile
        355                 360                 365
Glu Ile Phe Leu Leu Asp Ser Asn Leu Asn Pro Ile Arg Tyr Glu Tyr
    370                 375                 380
Arg Glu Ile Lys Lys Met Thr Lys Asp Phe Lys Val Lys Leu Gly Glu
385                 390                 395                 400
Gly Gly Phe Gly Ser Val Tyr Lys Gly Lys Leu Arg Ser Gly Leu Asp
                405                 410                 415
Val Ala Ile Lys Met Leu Thr Lys Ser Lys Thr Arg Gly Gln Asp Phe
            420                 425                 430
Ile Ser Glu Val Ala Thr Ile Gly Arg Ile His His Val Asn Val Val
        435                 440                 445
Arg Leu Ile Gly Tyr Cys Ala Glu Gly Glu Lys His Ala Leu Val Tyr
    450                 455                 460
Glu Phe Met Pro Asn Gly Ser Leu Asp Lys Tyr Ile Phe Ser Lys Glu
465                 470                 475                 480
Glu Ser Val Ser Leu Ser Tyr Asp Lys Thr Tyr Glu Ile Cys Leu Gly
                485                 490                 495
Ile Ala Arg Gly Ile Ala Tyr Leu His Gln Asp Cys Asp Val Gln Ile
            500                 505                 510
Leu His Phe Asp Ile Lys Pro His Asn Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe
        515                 520                 525
Ile Pro Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Tyr Pro Ile Lys
    530                 535                 540
Asp Lys Ser Ile Ile Leu Thr Gly Leu Arg Gly Thr Phe Gly Tyr Met
545                 550                 555                 560
Ala Pro Glu Leu Phe Tyr Lys Asn Ile Gly Gly Val Ser Tyr Lys Ala
                565                 570                 575
Asp Val Tyr Ser Phe Gly Met Leu Leu Met Glu Met Gly Ser Arg Arg
            580                 585                 590
Arg Asn Ser Asn Pro His Thr Glu His Ser Ser Gln His Phe Phe Pro
        595                 600                 605
Phe Trp Ile Tyr Asp His Phe Met Glu Glu Lys Asp Ile His Met Glu
    610                 615                 620
Glu Val Ser Glu Glu Asp Lys Ile Leu Val Lys Lys Met Phe Ile Val
625                 630                 635                 640
Ser Leu Trp Cys Ile Gln Leu Lys Pro Asn Asp Arg Pro Ser Met Lys
                645                 650                 655
Lys Val Val Glu Met Leu Glu Gly Lys Val Glu Asn Ile Asp Met Pro
            660                 665                 670
Pro Lys Pro Val Phe Tyr Pro His Glu Thr Thr Ile Asp Ser Asp Gln
        675                 680                 685
Ala Ser Trp Ser Asp Ser Thr Ser Ser Cys Lys Asn Ile Asp Lys Thr
    690                 695                 700
Lys Ser Asn Phe Ser Leu Glu Asn Asn Ser
705                 710
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
tagacgtgta gctcaaagag cgcaccaa                              28
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
tgtgggaaag gcgtagccag ggatgttt                              28
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
cctcacacag agcactcaag ccaacatttc                            30
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
attcacatgg aagaggtctc ggaagagg                              28
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
cgcggatcca tgtgtgtctt acttccttcc                            30
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
cggggtacct caagagttgt tctccagtg                             29
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>9
aacctcctcc tcatcgtact                                       20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>10
gacagcatca gccatgttca                                       20

Claims (10)

1.一种蛋白，选自如下(a)、(b)、(c)或(d)：
(a)序列表中序列2所示的氨基酸序列自N端起第34-714位氨基酸残基组成的蛋白质；
(b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(c)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由(a)衍生的蛋白质；
(d)由与序列表中序列2所示的氨基酸序列至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的氨基酸序列组成的且与植物耐逆性相关的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子特异性杂交且编码所述植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
5.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任意片段的引物对。
6.根据权利要求5所述的引物对，其特征在于：所述引物对为如下1)或2)或3)或4)所示：
1)一条引物的序列如序列表中序列7所示，另一条引物的序列如序列表中序列8所示；
2)一条引物的序列如序列表中序列9所示，另一条引物的序列如序列表中序列10所示；
3)一条引物的序列如序列表中序列3所示，另一条引物的序列如序列表中序列4所示；
4)一条引物的序列如序列表中序列5所示，另一条引物的序列如序列表中序列6所示。
7.一种培育耐逆性植物的方法，是向植物中导入权利要求2或3中所述的编码基因，培育，得到耐逆性植物。
8.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐盐和/或耐干旱。
9.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物，优选为大豆、苜蓿、百脉根或拟南芥。
10.权利要求1中所述蛋白或权利要求2或3所述编码基因在培育耐逆性植物中的应用。
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