CN113150088B

CN113150088B - 智能应答胁迫信号的高效抗逆模块SyDcw及其在作物育种中的应用

Info

Publication number: CN113150088B
Application number: CN202011128242.0A
Authority: CN
Inventors: 林敏�; 王劲; 周正富; 燕永亮; 左开井
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-10-20
Filing date: 2020-10-20
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2040-10-20
Also published as: CN113150088A; WO2022082864A1

Abstract

本发明利用合成生物学方法设计创建了一种具有提高宿主细胞抵抗高盐、干旱胁迫能力的功能模块SyDcw。本发明构建了该抗逆功能模块的重组载体，通过农杆菌介导侵染转化的方法将其在模式植物油菜中整合重建。实验证明，所述功能模块在模式植物宿主细胞中表达后，能显著增强作物的耐高盐和抗干旱的能力，可用于农作物新品种抗逆性改良。

Description

智能应答胁迫信号的高效抗逆模块SyDcw及其在作物育种中的应用

技术领域

本发明属于合成生物学领域，涉及一种人工智能应答胁迫信号的高效抗逆模块在培育提高生物抵抗干旱和高盐胁迫能力的品种中的应用。

背景技术

据保守估计，我国主要农作物因干旱、盐碱等环境胁迫因素造成的减产每年高达总产的8-15％，严重的年份甚至可以导致作物绝收。由于作物耐盐抗旱性是一个复杂的性状，同时受到多个基因和因素的影响，传统单基因的基因工程育种策略并不理想，培育的耐逆性提高植物在无压力条件下表现不佳。进入新世纪以来，新一代合成生物学的原始创新与集成应用加快突破，全基因组设计育种技术促进传统农业品种升级换代，孕育新一轮农业科技革命和产业变革。当前，以大数据、人工智能为代表的新兴科技交叉融合加速，以基因智能改造与定向表达为核心的新一代合成生物学工程技术进入一个日新月异、产业蓬勃发展的新阶段，在工农业生产、环境保护、健康保健等领域具有巨大应用前景。

发明内容

本发明的目的是创建一种抗逆功能模块能够提高生物抵抗干旱和高盐胁迫的能力。

本发明利用现代合成生物学设计方法，优化改造抗逆元件。通过蛋白质功能元件的人工优化、启动子的组织特异性和逆境响应设计，人工构建具有特异性响应逆境胁迫信号并组织特异性高效抗逆的功能模块，命名为SyDcw。

通过如下研究，首次鉴定了抗逆功能体系SyDcw具有提高模式植物抗旱耐盐能力，可用于新一代抗逆作物新品种的培育。具体研究工作如下：

1、人工设计抗逆功能体系SyDcw的构建

利用合成生物学设计逆境胁迫应答功能模块，通过蛋白质功能元件的人工优化、启动子的组织特异性和逆境响应设计，人工构建具有特异性响应逆境胁迫信号并组织特异性高效抗逆的功能模块，命名为SyDcw。利用人工化学合成的方法获得了抗逆功能模块SyDcw 全长核酸序列。将抗逆模块SyDcw连接于pBI-121载体上，构建植物表达载体pBI-SyDcw，将该表达载体转化根癌农杆菌EHA105(详见实施例1)；

2、转抗逆功能模块SyDcw油菜的获得

通过农杆菌介导的转基因植物构建方法，将抗逆功能体系SyDcw与模式植物油菜整合重组，通过抗性筛选和PCR验证的方法，培养得到稳定遗传的阳性转基因植株(详见实施例2)。

3、转抗逆功能模块SyDcw油菜的耐盐性与抗旱性分析

分别以NaCl和聚乙二醇PEG-6000作为添加物质来模拟盐胁迫和干旱胁迫，采取浇灌的方式进行胁迫处理。将获得的已鉴定为阳性的转基因种子与野生型种子培养出苗，长出5-6片真叶进行逆境处理。每天为植株浇灌等量的胁迫液，分别在胁迫处理的0,1,3,7,14d 取样拍照，观测生长状态测定生理指标。

实验结果表明：正常条件下，抗逆功能体系SyDcw对宿主植株生长发育无影响，逆境条件下具有显著提高模式植物抗旱耐盐能力的功能，可用于新一代抗逆作物新品种的培育序列表信息

SEQ ID NO.1：抗逆功能模块SyDcw的核苷酸序列。

SEQ ID NO.2：功能模块编码元件的氨基酸序列。

附图说明：

图1Bn-SyDcw模块载体构建图；

图2转基因油菜Bn-SyDcw和非转基因油菜(WT)耐盐实验对比；

图3转基因油菜Bn-SyDcw和非转基因油菜(WT)抗旱实验对比。

具体实施方式

以下实施例中所举的质粒、菌株、模式植物只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株、植株来源如下：

克隆载体pJET：为ThermoFisher公司市售产品；

穿梭载体：pBI-121：本实验室保存；

根癌农杆菌EHA105：本实验室保存；

甘蓝型油菜材料：油菜种子84100-18为本实验室保存。

实施例1抗逆功能模块SyDcw的设计与重组根癌农杆菌的构建

一、实验材料

克隆载体pJET：为ThermoFisher公司市售产品；

穿梭载体：pBI-121：本实验室保存；

根癌农杆菌EHA105：本实验室保存。

二、实验方法

利用合成生物学设计逆境胁迫应答功能模块，通过蛋白质功能元件的人工优化、启动子的组织特异性和逆境响应设计，人工构建具有特异性响应逆境胁迫信号并组织特异性高效抗逆的功能模块，命名为SyDcw。利用人工化学合成的方法获得了抗逆功能体系SyDcw 全长核酸序列。其大小为2828bp，将其克隆于载体pJET上，构建了含有完整抗逆功能模块SyDcw的重组克隆质粒pJET-SyDcw，并测序验证；然后通过EcoRI和HindIII双酶切获得含有粘性末端的抗逆模块SyDcw片段及穿梭载体pBI-121载体片段，将抗逆模块SyDcw连接于pBI-121载体上，构建植物表达载体pBI-SyDcw，将该表达载体转化根癌农杆菌 EHA105，利用卡那霉素抗生素抗性筛选阳性重组菌株，并通过菌落PCR测序验证。

三、实验结果

利用人工化学合成的方法获得了抗逆功能模块SyDcw全长核酸序列，成功构建将含有功能模块SyDcw的植物表达载体pBI-SyDcw，并转化根癌农杆菌EHA105。经PCR、酶切，测序验证插入序列正确，将该菌株命名为EHA-SyDcw。

四、实验结论

完成表达抗逆功能模块SyDcw的重组根癌农杆菌EHA-SyDcw的构建。

实施例2农杆菌介导的转抗逆功能模块SyDcw油菜的获得

一、实验材料

重组菌株EHA-SyDcw：实施例1获得

甘蓝型油菜材料：油菜种子84100-18为本实验室保存。

二、实验方法

去油菜种子，分别用75％乙醇和0.1％的HgCl2浸泡消毒，均匀放置于植物组织培养基，24℃组织培养室培养一周。用消毒手术剪取油菜幼苗的下胚轴，置于预培养基上，光照培养2-3天，预培养外植体。

转接活化表达抗逆模块的重组农杆菌菌株EHA-SyDcw，离心收集菌株重悬至OD600＝1.0。将预培养的外植体浸泡于农杆菌菌液中90s，晾干后转移至共培养基上，暗培养2-3d。随后将生长良好的外植体转移至诱导培养基上培养。

选取愈伤组织长势良好的外植体转移到添加抗生物的筛选培养基上，光照培养45-50d，在分化出芽。将分化出芽的愈伤组织转移到生根培养基，光照培养2周，待根系出现茎干长出4-5cm，转移至培养土中进行练苗，经驯化后移栽至温室，PCR检测阳性油菜苗。

三、实验结果

利用农杆菌介导的外植体共培养法，将抗逆功能模块SyDcw转化油菜，经过侵染油菜外植体经过诱导培养、筛选培养、生根培养与练苗移植等步骤，经过PCR验证，最终得到表达抗逆功能模块的转基因油菜Bn-SyDcw，可用于后续抗逆性能研究。

四、实验结论

通过农杆菌介导转化方法，最终获得转抗逆功能模块SyDcw的油菜Bn-SyDcw 实施例3转抗逆功能模块SyDcw油菜的抗逆性分析

一、实验材料

转基因油菜：Bn-SyDcw

对照：非转基因油菜

二、实验方法

转抗逆功能模块油菜Bn-SyDcw的盐胁迫和干旱胁迫抗性实验

分别以NaCl和聚乙二醇PEG-6000作为添加物质来模拟盐胁迫和干旱胁迫，采取浇灌的方式进行胁迫处理。

将获得的已鉴定为阳性的转基因油菜种子与野生型种子在MS固体培养中，待苗长出真叶后移栽到装有基质的塑料盆中，浇灌MS营养液待幼苗长出5-6片真叶进行逆境处理。

每天为植株浇灌等量的胁迫液，分别在胁迫处理的0,1,3,7,14d取样拍照，观测生长状态测定生理指标。

三、实验结果

生长状态观测结果显示：

无胁迫的正常生长情况下，转基因油菜Bn-SyDcw与野生型油菜生长状态无差异，农艺性状未受影响。

1、高盐胁迫实验

300mM NaCl胁迫处理7天，野生型油菜出现严重失水干枯的情况，转基因油菜 Bn-SyDcw生长状况未受到影响，显著好于野生型。

高盐处理14天，野生型油菜已经基本干枯死亡，转基因油菜Bn-SyDcw叶片出现卷曲，茎干略有萎蔫生长变缓(图2)。

2、干旱胁迫实验

15％重度干旱胁迫下7天时，野生型油菜已经落叶，植株基本干枯萎蔫，转基因油菜 Bn-SyDcw生长未受影响；

干旱处理14天时，野生型油菜已经干枯死亡，转基因油菜生长变缓，仅少量叶片出现卷曲(图3)。

四、实验结论

逆功能模块SyDcw在模式植物油菜中表达，显著提高了宿主植物耐盐性能和抗旱性能，具有重大育种应用潜力。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 智能应答胁迫信号的高效抗逆模块SyDcw及其在作物育种中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 2828

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aatgtatttt tataccataa aatattggtt tttttgtata catagttata gaatatgtgt 60

ttaaatcttt aatagtaggg aacaagctag ggaaattttg tcttaagctc ctttcgaaat 120

ttcaaaccag caatttaatc ttttttagct tttaattaaa tgataaaatt ggtaaaaact 180

cctctttagc ccctttcaat tttgatattg agcaaattgg tctttgtaat aaaatggagc 240

aatttaatct ctgttaattt tgaaagtgag caactaagga caattaatta ccttgttaat 300

gtttcctacc aattgtacat aattttgatt tgtagaataa caaatttagt ctttgatatt 360

tatatattat gtaaatattg ataaaatgtg aaagtattgc gggataaatt tgttaaatca 420

agatcaaatt gatagaatat gtaaatatta tgggccaaat atgttaaatc aagaccaaat 480

tgacaaaatg cgtgaatttt gacggctaaa tttattttta taaaatatat ataattgaca 540

aaacatatta acactacaat taatcgtcct tagttgcttg ctttcgagat tgacatatat 600

ttttaggggg accaatttgc tcaatattga attgagagga ccaaagaagg ctttttacca 660

aaaaatttca ttaggtaggg ctcttggcct ccctggctaa aggggaaatt ttcttttaag 720

ctccttccaa aatttcaaac aatcaattta atcctttgaa taaaattcat taaattcatt 780

tttgacttct ttgaaaaata ataatttcat ttaacacaaa ttttatactt ttctcctttc 840

aaaattttat aataatttta tctcgagctg ttaaataaaa atttcccttg aatttcgagc 900

tggataccta tacaaccccc tgaccatctc tctattaaga aaatatatag ctttgtaaat 960

tgcagttgag gtccaagatg agggactgag tcattggccc aaattggctt ccacgaggaa 1020

caaaattgag ttcgatccaa taatataaaa aaatcttgga gcttcgacga aatcatccat 1080

ggaagctcaa aacctgacat aacaacaaca acaacaaaaa gcccattttt cttcatttcc 1140

ttatctaaca aaatccctga aaatatctag caacttgcgt ggcaaaatct tatgcaagga 1200

aaatatcatg tgggcccaac aattcagaca atcgacggct gaggaaggaa gacaagctcc 1260

tttcggcatc tgaaacgacc acttgtctgg aaacatggag aactttccag aacttttgtt 1320

tccttttcga caaatggcag aaacttctta caatgcctta acacataatc tctctctcta 1380

gaaccttctt ctccaccgcc ttgtatatat atgtacgtca ctcccacggt acacgcaacg 1440

aacattctct cagggttcat tgtttttcct tcaaaatttg ataactttca gacagaacag 1500

cgaaatgaag tgaagtgaaa cgaagtctca aatgagtgcg gatatggtta aagagatgag 1560

tgacgacggc ggcctgaagc gagtgaccgg cttggtgaag tggttcgatc ccgcaaaggg 1620

atacgggttc attttggacg aatcgggtgg caccgacatc cttctgcacg cgaacgtgct 1680

gaggaatttc gggcgcagtt ctgtggcgga ccagtcccgg gtcaccgtga tggtgcagga 1740

aacgcggcgc ggggtgcagg cggccgaggt catttccatc gatccccccc agacggacgg 1800

gcatccgccc attgccgatc tggacatgga ggtgatcgag catctggaca gtctccctct 1860

gcgtcctgcc cgggtgaaat ggttcgacaa atccaagggc tttggctttg cgaacatctt 1920

tggacatcct gaggatgttt tcatccatat cgaagtggtg cgccattcag gttttgctga 1980

cctcatgatc ggggaagcca tctgcttgcg tgtggtagag gggccgcgcg ggctgatggc 2040

ggcacaggtg tcagcctggg acaccgcact tgtcgcggaa agcaacactc cgaccgaaca 2100

ggacgccgcg tcgattcggg actttctggc ccatgtcgcc gagcaactcc tgaacttcga 2160

cctgctcaag ttggcgggag acgttgagtc caaccctggg cccgcgatgt ctttctcagg 2220

agctgttctc actggtatgg cttcttcttt ccacagcgga gccaagcaga gcagcttcgg 2280

cgctgtcaga gtcggccaga aaactcagtt cgtcgtcgtt tctcaacgca agaagtcgtt 2340

gatctacgcc ttgacgtcct tgactctgcc cggagggttt ggcagcgcgc ctgtggccaa 2400

tttgtcgatg actttggaag taaccaaccc caatcctctg ccgttgcgaa tggctaatat 2460

tgctggggcg ctcattatcg atggggccgc cgttggcgat gtgtcatttc ctaacgtaga 2520

catagcggct aggggggtat ccacacaaag ggcggattta tctatacctg tgaccctaaa 2580

tacagccgca tcattcttga aggttgcccg tgggcagttg gttacttata gagttgatgg 2640

tggatttact tgatttctcc ataataatgt gtgagtagtt cccagataag ggaattaggg 2700

ttcctatagg gtttcgctca tgtgttgagc atataagaaa cccttagtat gtatttgtat 2760

ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa accaaaatcc agtactaaaa 2820

tccagatc 2828

<210> 2

<211> 373

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

MET Ser Ala Asp MET Val Lys Glu MET Ser Asp Asp Gly Gly Leu Lys

1 5 10 15

Arg Val Thr Gly Leu Val Lys Trp Phe Asp Pro Ala Lys Gly Tyr Gly

20 25 30

Phe Ile Leu Asp Glu Ser Gly Gly Thr Asp Ile Leu Leu His Ala Asn

35 40 45

Val Leu Arg Asn Phe Gly Arg Ser Ser Val Ala Asp Gln Ser Arg Val

50 55 60

Thr Val MET Val Gln Glu Thr Arg Arg Gly Val Gln Ala Ala Glu Val

65 70 75 80

Ile Ser Ile Asp Pro Pro Gln Thr Asp Gly His Pro Pro Ile Ala Asp

85 90 95

Leu Asp MET Glu Val Ile Glu His Leu Asp Ser Leu Pro Leu Arg Pro

100 105 110

Ala Arg Val Lys Trp Phe Asp Lys Ser Lys Gly Phe Gly Phe Ala Asn

115 120 125

Ile Phe Gly His Pro Glu Asp Val Phe Ile His Ile Glu Val Val Arg

130 135 140

His Ser Gly Phe Ala Asp Leu MET Ile Gly Glu Ala Ile Cys Leu Arg

145 150 155 160

Val Val Glu Gly Pro Arg Gly Leu MET Ala Ala Gln Val Ser Ala Trp

165 170 175

Asp Thr Ala Leu Val Ala Glu Ser Asn Thr Pro Thr Glu Gln Asp Ala

180 185 190

Ala Ser Ile Arg Asp Phe Leu Ala His Val Ala Glu Gln Leu Leu Asn

195 200 205

Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

210 215 220

Ala MET Ser Phe Ser Gly Ala Val Leu Thr Gly MET Ala Ser Ser Phe

225 230 235 240

His Ser Gly Ala Lys Gln Ser Ser Phe Gly Ala Val Arg Val Gly Gln

245 250 255

Lys Thr Gln Phe Val Val Val Ser Gln Arg Lys Lys Ser Leu Ile Tyr

260 265 270

Ala Leu Thr Ser Leu Thr Leu Pro Gly Gly Phe Gly Ser Ala Pro Val

275 280 285

Ala Asn Leu Ser MET Thr Leu Glu Val Thr Asn Pro Asn Pro Leu Pro

290 295 300

Leu Arg MET Ala Asn Ile Ala Gly Ala Leu Ile Ile Asp Gly Ala Ala

305 310 315 320

Val Gly Asp Val Ser Phe Pro Asn Val Asp Ile Ala Ala Arg Gly Val

325 330 335

Ser Thr Gln Arg Ala Asp Leu Ser Ile Pro Val Thr Leu Asn Thr Ala

340 345 350

Ala Ser Phe Leu Lys Val Ala Arg Gly Gln Leu Val Thr Tyr Arg Val

355 360 365

Asp Gly Gly Phe Thr

370

Claims

1.SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的功能模块提高油菜抗逆功能的应用。

2.含有SEQ ID NO:1所示功能模块的质粒提高油菜抗逆功能的应用。

3.权利要求1或2所述的应用，所述抗逆，是提高油菜对干旱、高盐胁迫的能力。

4.含有SEQ ID NO:1所示功能模块的重组工程菌株在提高油菜抵抗干旱、高盐胁迫能力的应用。

5.核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的功能模块。

6.权利要求5所述的功能模块编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。