CN109161549A - 调控番茄侧芽发育的arf8.1和arf8.2基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了调控番茄侧芽发育的ARF8.1和ARF8.2基因及其应用，ARF8.1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；ARF8.2基因的序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明通过实验证明ARF8.1和ARF8.2基因是控制植物侧芽发育的关键调节因子，使用维管组织特异性启动子替换组成型强启动子驱动ARF8.1和ARF8.2基因温和过表达，不仅能够改变侧芽的发生方式和提高植物侧芽发生率，而且能维持植株形态不改变，为草本（木本）植物的侧芽发育的调控提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

Description

调控番茄侧芽发育的ARF8.1和ARF8.2基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及调控番茄侧芽发育的ARF8.1和ARF8.2基因及其应用。

背景技术

植物的侧枝是从枝条顶端分生组织(shoot apical meristems，SAM)分化而来的，在胚胎发生期就产生了SAM。侧枝的发生包括两个步骤，首先由叶腋处的枝条顶端分生组织(SAM)分化产生侧芽原基，侧芽原基进一步长成侧芽，侧芽发育形成侧枝。研究发现在叶腋处产生的侧芽有如下发育结果：有的侧芽直接生长发育成侧枝，如果侧芽的生长受到顶芽的抑制或者条件不适宜时侧芽就会进入过渡生长期，暂时为休眠芽，而当顶芽对侧芽的抑制解除或者外界环境因子适宜及控制侧芽发育的基因得到表达时，侧芽解除休眠生长、发育，但当遇见不利生长的因子时发育的侧芽又会进入临时休眠状态。因此侧芽常常会受到抑制进入休眠状态。

植物地上部分形态的多样性很大程度上取决于植物的分枝情况，分枝情况对植物的很多方面有重要影响，包括植物株型，光吸收效率以及对资源的适应能力。在景观园林领域，增加侧芽数目，可以增加冠幅，起到遮阴的效果。在农业生产上，作物分枝对农作物的产量具有重要影响，在实际生产中人们通过棉花、万寿菊、葡萄、茄子等打顶，果树修剪，增加水稻、小麦分蘖数等措施来去除顶端优势增加侧芽，进而达到增产的目的，由于目前全球粮食紧张的现状日益恶化，因此通过各种手段增加农作物的产量已经成为生物学的一个重要研究内容，而通过改变作物分枝数目从而改变作物的产量具有重要的应用意义。

植物的分枝发育受到各种外界环境条件、遗传因素和植物激素的影响。近几年来，科学家通过遗传学，分子生物学等手段，对植物分枝发育调控分子机制的认识不断深入，通过研究侧枝的产生与发育，相继发现了一些调控侧芽、侧枝发育的基因，如在生长素信号通路识别途径中，目前已发现， IAA3, IAA9, SlTPL1，SlTPL6， SlARF2a( Xu T, Liu X,Wang R, Dong X, Guan X, Wang Y, Jiang Y, Shi Z, Qi M, Li T. SlARF2a plays anegative role in mediating axillary shoot formation. Sci Rep.2016 Sep 20;6:33728. )等与侧芽发育相关，是侧芽发育的抑制因子，通过下调其表达，可以促进侧芽的发育。然而，有关侧芽发育的促进因子目前鲜有研究报道，研究促进侧芽发育的促进因子，可以弥补现状的不足。

在植物基因工程中常用的组成型启动子，如来源于花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子启动表达具有持续性，其所启动的基因不受外界因素的诱导，在不同的发育阶段和组织表达强度大，无明显差异，因此，采用该类启动子用于基因工程中对某些基因的研究时，不仅不能控制基因的精确表达，而且可能会导致对转基因植株的明显影响，而在植物侧芽发育调控基因中，如某些基因所编码的转录因子、植物激素等在植物生长调节、信号转导等方面的调节作用往往很强，需要对基因表达的部位及表达量进行精确控制；因此需要寻找一些更为有效的特异性启动子代替组成型启动子，以期更好地调控植物基因的表达，不至于影响植物正常的生长发育和引起植物体内营养物质的分配异常或浪费。

Ulmasov等（1997）首先采用由四个5’-TGTTCTC-3’串联组成的人工AuxRE作为诱饵，对拟南芥DNA文库进行酵母双杂交检测，鉴定出生长素反应因子ARF1蛋白。随后在拟南芥中鉴定了23个AtARF基因（Liscum和Reed，2002）。研究揭示AtARF8在下胚轴的延伸，根的生长习性，花的发育以及果实形成过程中扮演了重要的角色（Tian CE, Muto H, HiguchiK, Matamura T, Tatematsu K, Koshiba T, Yamamoto KT. Disruption andoverexpression of auxin response factor 8 gene of Arabidopsis affecthypocotyl elongation and root growth habit, indicating its possibleinvolvement in auxin homeostasis in light condition. Plant J. 2004 Nov;40(3):333-43；Nagpal P, Ellis CM, Weber H, Ploense SE, Barkawi LS, Guilfoyle TJ,Hagen G, Alonso JM, Cohen JD, Farmer EE, Ecker JR, Reed JW. Auxin responsefactors ARF6 and ARF8 promote jasmonic acid production and flower maturation.Development. 2005 Sep;132(18):4107-18；Goetz M, Vivian-Smith A, Johnson SD,Koltunow AM. AUXIN RESPONSE FACTOR8 is a negative regulator of fruitinitiation in Arabidopsis. Plant Cell. 2006 Aug;18(8):1873-86.）。在番茄中研究显示，生长素反应因子ARF8对番茄座果、单性结实及果实发育过程也具有重要的调控作用（杨迎伍，番茄Sly-miR167的克隆、鉴定及其对座果和单性结实的影响研究，重庆大学博士学位论文，2010）。但迄今，生长素反应因子ARF8对于调控侧芽发育的功能还鲜有研究报道。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供调控番茄侧芽发育的ARF8.1和ARF8.2基因及其应用，提供了促进侧芽发育的促进因子，在促进侧芽发生率的同时保持植株的原有形态，为植物的遗传改造提供了理想的选择。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：调控番茄侧芽发育的ARF8.1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；调控番茄侧芽发育的ARF8.2基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

进一步，所述调控番茄侧芽发育的ARF8.1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示；所述调控番茄侧芽发育的ARF8.2基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

一种表达盒，自5’端到3’端依次包含启动子、由所述启动子启动表达的ARF8.1或ARF8.2基因，以及终止子。

进一步，所述启动子控制基因在植株维管组织中特异表达，并且温和过表达，所述温和过表达是指含有上述表达盒的转基因植株中ARF8.1或ARF8.2的表达水平高于野生型植株中ARF8.1或ARF8.2的表达水平，且不超过野生型植株中ARF8.1或ARF8.2的表达水平的10倍。

这样，该启动子能使目的基因ARF8.1或ARF8.2在植物体内温和过量表达，并且可以驱动基因ARF8.1或ARF8.2在植物茎的维管组织以及茎与叶柄交汇的地方（侧芽发生处）特异性表达，能明显提高侧芽发生率，同时维持植株形态不变。避免组成型强启动子使目的基因ARF8.1或ARF8.2非特异在植物体内强烈过表达，造成植株体内营养物质的浪费和激素异常，进而导致植株矮化。

所述启动子为来源于番茄的ARF8.1或ARF8.2基因的启动子；所述来源于番茄的ARF8.1基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述来源于番茄的ARF8.2基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

含有所述表达盒的重组植物表达载体。

含有所述重组植物表达载体的植物细胞系或植物转化体。

ARF8.1或ARF8.2基因在促进植物侧芽发育中的应用，所述植物为拟南芥、番茄或毛白杨等。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明番茄生长素响应因子基因ARF8.1和ARF8.2，能促进植物侧芽的发生方式由顶端发生转变为基端发生，并且显著增加了侧芽的数目，表明基因ARF8.1和ARF8.2是控制植物侧芽发育的关键调节因子，在未来植物基因工程、农业生产和景观园林领域有重要应用价值。

2、本发明通过构建ARF8.1和ARF8.2启动子（pARF8.1和pARF8.2）与GUS融合表达分析发现，pARF8.1和pARF8.2具有驱动基因在植物维管组织特异性表达的特性。并且本发明使用维管组织特异性启动子替换组成型强启动子驱动ARF8.1和ARF8.2基因温和过表达，实现了对pARF8.1和pARF8.2基因表达的部位及表达量的精确控制，不仅能够改变侧芽的发生方式和提高植物侧芽发生率，而且能维持植株形态不改变，避免影响植物正常的生长发育和引起植物体内营养物质的分配异常或浪费，具有更强的实际应用价值，对植物侧芽发育调控具有重要科学意义。

3、本发明在番茄和毛白杨中过表达番茄生长素响应因子基因ARF8.1和ARF8.2，均能明显提高番茄和毛白杨的侧芽发生率，说明本发明的ARF8.1和ARF8.2基因既能应用于草本植物又能应用于木本植物，为草本（木本）植物的侧芽发育的调控提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

附图说明

图1为重组表达载体pARF8.1-GUS/pARF8.2-GUS的图谱示意图；

图2从左到右分别是启动子pARF8.1和pARF8.2驱动GUS在番茄幼苗中的表达示意图；

图3从左到右分别是启动子pARF8.1和pARF8.2驱动GUS在番茄茎和叶柄中的表达示意图；

图4为重组表达载体pBI121-35S:ARF8.1-NOS和pBI121-35S:ARF8.2-NOS的图谱示意图；

图5 为ARF8.1和ARF8.2基因在番茄中过表达对植株表型的影响；

图A从左到右分别是野生型番茄植株与含有表达载体pBI121-35S:ARF8.2-NOS和pBI121-35S:ARF8.1-NOS的转基因植株；图B从左到右分别是野生型番茄植株、含有重组表达载体pBI121-pARF8.1:ARF8.1-NOS和pBI121-pARF8.2:ARF8.2-NOS的转基因植株；

图6为ARF8.1和ARF8.2基因在番茄的茎和叶片中表达量分析图；

图A中OX-1和OX-2含有表达载体pBI121-35S:ARF8.1-NOS转基因植株；OX-3和OX-3含有表达载体pBI121-35S:ARF8.2-NOS的转基因植株；

图B中L1和L2含有表达载体pBI121-pARF8.1:ARF8.1-NOS转基因植株；L3和L4含有表达载体pBI121-pARF8.2:ARF8.2-NOS的转基因植株；

图7是转基因植株与野生型植株的侧芽数目观察与统计分析；

图A从左到右分别是野生型番茄植株、含有重组表达载体pBI121-pARF8.1:ARF8.1-NOS和pBI121-pARF8.2:ARF8.2-NOS的转基因植株；图B中L1和L2含有表达载体pBI121-pARF8.1:ARF8.1-NOS转基因植株；L3和L4含有表达载体pBI121-pARF8.2:ARF8.2-NOS的转基因植株；图C是转基因植株与野生型植株的侧芽发育模式图；

图8为ARF8.1和ARF8.2基因在毛白杨中过表达对植株表型的影响；

从左到右分别是野生型植株、含有重组表达载体pBI121-pARF8.1:ARF8.1-NOS和pBI121-pARF8.2:ARF8.2-NOS的转基因植株的表型；

图9为ARF8.1和ARF8.2基因在毛白杨中表达情况分析；

图A是野生型植株与转pARF8.1:ARF8.1和pARF8.2:ARF8.2基因植株的侧芽数目图；图B是野生型植株与转基因植株的茎中ARF8.1和ARF8.2基因的表达量分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。实施例中所述原料如无特殊说明，即为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

实施例1 番茄基因ARF8.1和ARF8.2的启动子的克隆及GUS组织化学染色分析

（1）ARF8.1和ARF8.2基因启动子的克隆

采用CTAB法（RTG2405-01，中科泰瑞）提取番茄基因组DNA，根据SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的pARF8.1和pARF8.2启动子的核苷酸序列，设计引物pARF8.1-F、pARF8.1-R、pARF8.2-F和pARF8.2-R，以提取的基因组DNA为模板，以pARF8.1-F（正向引物）和pARF8.1-R（反向引物）为引物进行启动子pARF8.1的扩增，以pARF8.2-F（正向引物）和pARF8.2-R（反向引物）为引物进行启动子pARF8.2的扩增。

所述引物序列如下：

pARF8.1-F：5’-TTTACCATGTCCCTACCCTCT-3’

pARF8.1-R：5’-CTTTCTCCAAGACCTCCATT-3’

pARF8.2-F：5’-AACCACCCCACCCTGGCTCTG-3’

pARF8.2-R：5’-GCTACTCTTTCTCCAATACTTCCA-3’

PCR扩增体系：高保真扩增酶Prime STAR HS (R010A, TaKaRa) 0.25 μL，5×PrimeSTAR Buffer (Mg²⁺ Plus) 5 μL，正向引物(10μM) 0.5μL，反向引物(10μM) 0.5μL，模板（DNA）1μL，dNTP (2.5mM) 2μL，无菌ddH₂O补足至25μL。

反应程序：预变性95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，1min30s，35个循环；72℃,7min。

将得到的PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳分析，按照胶回收试剂盒（9672，Takara）纯化pARF8.1和pARF8.2启动子全长序列备用。

（2）利用TA克隆技术构建重组表达载体

用XcmI单酶切处理表达载体pCXGUS-P，酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收表达载体pCXGUS-P大片段。再将纯化的pARF8.1和pARF8.2启动子片段末端加A，然后利用TA克隆技术与表达载体pCXGUS-P大片段连接，最后将连接产物转化大肠杆菌DH5a，从含有卡纳霉素（100mg/L）的筛选LB培养板上挑取阳性克隆并进行PCR检测及测序验证，即得到重组表达载体pARF8.1-GUS和pARF8.2-GUS（图1）。

单酶切体系为：pCXGUS-P vector 5μL；XcmI 1μL；Buffer 2μL；无菌ddH₂O补足至20μL。37℃反应3h。

加A反应体系：回收的pARF8.1或pARF8.2片段100ng；dATP 0.25μL；A-overhangenzyme 0.25μL；10×Buffer 1μL；无菌ddH₂O补足至10μL；65℃反应40min。

连接反应体系：加A反应的产物3μL;Linearized vector (pCXGUS-P回收大片段)1-2μL；Solution I 5μL；无菌ddH₂O补足至10μL。16℃连接反应30min。

（3）重组表达载体的遗传转化和GUS染色分析

通过常规冻融法将构建的重组表达载体pARF8.1-GUS或pARF8.2-GUS转入农杆菌EHA105中，再通过农杆菌介导方法将pARF8.1-GUS或pARF8.2-GUS转入野生型番茄（MicroTom），具体步骤如下：

1）转化材料的培养

将番茄组培苗在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为10000-12000lux的条件下培养30-40天后，选取长势良好的组培苗的叶片用于遗传转化。

2）转化

将含有pARF8.1-GUS或pARF8.2-GUS表达载体的农杆菌，接种于含有卡纳霉素（100mg/L）的液体LB培养基中，28℃，200rpm培养至OD600约为0.8～1.0之间，然后将培养好的菌液于4000rpm，离心5min，将收集的菌体用KCMS液体培养基稀释到OD600约为0.05-0.1之间；再放入待转化番茄组培苗的叶片，其中叶片切出伤口，农杆菌侵染大约20-30min；用灭菌滤纸吸干菌液，将叶片在KCMS固体培养基中暗培养2-3天。

3）初筛培养

将番茄叶片转移到含有25mg/L潮霉素和相应激素的初筛培养基ZR中，使侵染后的外植体（叶片）伤口处诱导出愈伤组织，随后诱导分化不定芽。2周更换一次新培养基。

4）生根培养

将外植体细胞分化出的不定芽切下，插入含有25mg/L潮霉素和相应激素的生根培养基ENR，再将其放入光照培养箱培养直至生根；当不定芽生根后，将其移栽到土里继续生长，即得到T0代转基因番茄植株，观察其表型变化。

5）转基因株系GUS组织化学染色鉴定

对转化有pARF8.1或pARF8.2启动子驱动的GUS转基因番茄进行组织化学染色分析。收集新鲜的转基因番茄幼苗，用无菌水清洗干净，将整株幼苗浸泡在含有0.2mM X-Gluc的GUS染色液中， 37℃处理2h以上；取出幼苗，室温条件下，依次在30%、50％和75%的酒精中分别浸泡5-6h进行脱色处理；然后直接在显微镜下进行组织水平观察。GUS染色缓冲液含有50mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)、0.2％Triton X-100、2mM亚铁氰化钾和2mM铁氰化钾。

将番茄pARF8.1和pARF8.2分别导入pCXGUS-P载体中，番茄pARF8.1和pARF8.2与GUS标记基因融合，驱动GUS表达，通过对转基因植物染色，可以观察GUS的表达情况，进而清楚的观察番茄ARF8.1和ARF8.2基因的时空表达特异性。

染色结果如图2所示，pARF8.1-GUS和pARF8.2-GUS均在番茄幼苗的维管组织中大量表达，比如茎和着生在茎上的叶柄；如图3所示，在已长大的番茄植株中pARF8.1-GUS和pARF8.2-GUS主要在茎中维管组织以及在茎和侧枝交汇的地方（侧芽发生处）过量表达，由此说明，ARF8.1和ARF8.2基因启动子可以驱动基因在植物茎的维管组织以及茎与叶柄交汇的地方（侧芽发生处）特异性表达的特性，暗示ARF8.1和ARF8.2基因参与调控维管组织形成与侧芽的发育。

实施例2 番茄基因ARF8.1和ARF8.2的克隆及表达载体的构建

（1）基因ARF8.1和ARF8.2的克隆

取Micro Tom番茄不同组织（根、茎、叶和花）的混合样为材料，采用RNAiso Plus(9108,Takara)试剂盒和Recombinant DNase I（RNase-free）试剂盒（2270A，Takara），按说明书步骤提取番茄总RNA，用微量分光光度计测定RNA的浓度，备用。

取约2.0μg番茄总RNA，采用PrimeScript II first-strand cDNA synthesis kit(6210A, Takara)，并按照说明书步骤合成cDNA第一链。

根据番茄ARF家族基因序列（NCBI登录号：NM_001247623 和XM_004231585），设计引物ARF8.1-F、ARF8.1-R、ARF8.2-F和ARF8.2-R，引物中引入In-fusion克隆载体接头序列和酶切位点序列。以合成的cDNA为模板，以ARF8.1-F（正向引物）和ARF8.1-R（反向引物）为引物进行基因ARF8.1的扩增，以ARF8.2-F（正向引物）和ARF8.2-R（反向引物）为引物进行基因ARF8.2的扩增。

所述引物序列如下：

ARF8.1-F：5’-GGACTCTAGAGGATCCATGAAGCTTTCAACATCAGG-3’；

ARF8.1-R：5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCGTAATCAAGTGATCCTATAG-3’；

ARF8.2-F：5’-GGACTCTAGAGGATCCATGAAGCTTTCAACATCAGGAATGG-3’；

ARF8.2-R：5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCTCAGTACTCCAGCGATCCAAGAG-3’。

其中，ARF8.1-F和ARF8.2-F的加粗序列为BamHI酶切位点，ARF8.1-R和ARF8.2-R的加粗序列为SacI酶切位点。下划线处为In-fusion克隆载体接头序列。

PCR反应体系：高保真扩增酶PrimeSTAR HS (R010A, TaKaRa) 0.5μL，5xPrimeSTAR Buffer (Mg²⁺ Plus) 10μL，正向引物(10μM) 1μL，反向引物(10μM) 1μL，模板(cDNA) 1μL，dNTP (2.5mM) 4μL，无菌ddH₂O补足至50μL。

PCR反应条件：预变性95℃，3min；95℃，30s；56℃，40s；72℃，2min30s，38个循环；72℃, 10min。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。扩增得到的目的片段与预期片段大小相同，按照胶回收试剂盒（9672，Takara）的说明书步骤回收纯化基因ARF8.1和ARF8.2，即获得目的基因ARF8.1和ARF8.2的片段。

（2）构建重组表达载体pBI121-35S:ARF8.1-NOS/pBI121-35S:ARF8.2-NOS

分别用BamHI和SacI双酶切处理植物表达载体pBI121。酶切体系为：pBI121 vector 5μL；BamHI 0.5μL；SacI 0.5μL；Buffer 10XM 1μL；无菌ddH₂O补足至20μL；37℃反应3h。酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收表达载体pBI121大片段。

利用新一代无缝克隆技术（In-fusion HD Cloning Kit，Takara）构建番茄ARF8.1和ARF8.2基因的过量表达载体。

重组反应体系为：Purifed PCR fragment(回收的ARF8.1或ARF8.2片段)50ng；Linearized vector (pBI121 回收大片段)100ng；5X In-fusion HD Enzyme Premix 2μL;无菌ddH₂O补足至10μL。然后按照分子克隆实验指南将上述重组反应体系转化大肠杆菌DH5a，并涂布于含有卡纳霉素（100 mg/L）筛选培养板上，通过筛选和测序，获得正确的含ARF8.1或ARF8.2基因片段的重组表达载体pBI121-35S:ARF8.1-NOS/pBI121-35S:ARF8.2-NOS（图4A和图4B），重组表达载体中目的基因ARF8.1或ARF8.2的5’端位于组成型强启动子P35S下游，它能使目的基因在植物体内高效表达；ARF8.1或ARF8.2的3’端组装有NOS终止子，可以有效终止目的基因的转录。在重组表达载体上组装有NPT-II基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用卡纳霉素进行转基因植株的筛选。在重组表达载体上组装有LB和RB序列，促使组装于其间的目的基因ARF8.1和ARF8.2的表达框架和筛选标记基因NPT-II整合至植物受体染色体上。

（3）构建重组表达载体pBI121-pARF8.1:ARF8.1-NOS/pBI121-pARF8.2:ARF8.2-NOS

分别用HindIII和BamHI双酶切处理（2）中构建的重组表达载体pBI121-35S:ARF8.1-NOS/pBI121-35S:ARF8.2-NOS。

酶切体系为：pBI121-35S:ARF8.1-NOS/pBI121-35S:ARF8.2-NOS vector 5μL；BamHI 0.5μL；SacI 0.5μL；Buffer 10XM 1μL；无菌ddH₂O补足至20μL；37℃反应3h。酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收表达载体片段。

设计引物pARF8.1-F2、pARF8.1-R2、pARF8.2-F2和pARF8.2-R2，引物中引入In-fusion克隆载体接头序列和酶切位点序列。以合成的cDNA为模板，以pARF8.1-F2（正向引物）和pARF8.1-R2（反向引物）为引物进行基因pARF8.1的扩增，以pARF8.2-F2（正向引物）和pARF8.2-R2（反向引物）为引物进行基因pARF8.2的扩增。

所述引物序列如下：

pARF8.1-F2：5’- tgattacgccaagcttTTTACCATGTCCCTACCCTCT-3’

pARF8.1-R2：5’-gaccacccggggatccCTTTCTCCAAGACCTCCATT-3’

pARF8.2-F2：5’-tgattacgccaagcttAACCACCCCACCCTGGCTCTG-3’

pARF8.2-R2：5’-gaccacccggggatccGCTACTCTTTCTCCAATACTTCCA-3’

其中，pARF8.1-F和pARF8.2-F的加粗序列为HindIII酶切位点，pARF8.1-R和pARF8.2-R的加粗序列为BamHI酶切位点。下划线处为In-fusion克隆载体接头序列。

利用无缝克隆技术（In-fusion HD Cloning Kit，Takara）构建过量表达载体。具体操作步骤同（2）中所述，最终获得pBI121-pARF8.1:ARF8.1-NOS和 pBI121-pARF8.2:ARF8.2-NOS载体。即重组表达载体pBI121-35S:ARF8.1-NOS/pBI121-35S:ARF8.2-NOS中组成型强启动子35S替换成pARF8.1/pARF8.2启动子，该启动子能使目的基因ARF8.1或ARF8.2在植物体内温和过量表达，并且可以驱动基因ARF8.1或ARF8.2在植物茎的维管组织以及茎与叶柄交汇的地方（侧芽发生处）特异性表达；ARF8.1或ARF8.2的3’端组装有NOS终止子，可以有效终止目的基因的转录。

实施例3 番茄基因ARF8.1和ARF8.2在野生番茄中的表达及转基因植株的表型鉴定

通过常规冻融法将所实施例2中构建的重组表达载体pBI121-35S:ARF8.1-NOS、pBI121-35S:ARF8.2-NOS、pBI121-pARF8.1:ARF8.1-NOS和pBI121-pARF8.2:ARF8.2-NOS分别转入农杆菌EHA105中，再通过农杆菌介导方法将它们转入野生型番茄（Micro Tom），具体步骤如下：

1）转化材料的培养

将番茄组培苗在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为10000-12000lux的条件下培养30-40天后，选取长势良好的组培苗的叶片用于遗传转化。

2）转化

将含有重组表达载体pBI121-35S:ARF8.1-NOS、pBI121-35S:ARF8.2-NOS、pBI121-pARF8.1:ARF8.1-NOS或pBI121-pARF8.2:ARF8.2-NOS的的农杆菌，分别接种于含有卡纳霉素（100mg/L）的液体LB培养基中，28℃，200rpm培养至OD600约为0.8～1.0之间，然后将培养好的菌液于4000rpm，离心5min，将收集的菌体用KCMS液体培养基稀释到OD600约为0.05-0.1之间；再放入待转化番茄组培苗的叶片，其中叶片切出伤口，农杆菌侵染大约20-30min；用灭菌滤纸吸干菌液，将叶片在在KCMS固体培养基中暗培养2-3天。

3）初筛培养

将番茄叶片转移到含有50mg/L卡纳霉素和相应激素的初筛培养基ZR中，使侵染后的外植体（叶片）伤口处诱导出愈伤组织，随后诱导分化不定芽。2周更换一次新培养基。

4）生根培养

将外植体细胞分化出的不定芽切下，插入含有50mg/L卡纳霉素和相应激素的生根培养基ENR，再将其放入光照培养箱培养直至生根；当不定芽生根后，将其移栽到土里继续生长，即得到T0代转基因番茄植株，观察其表型变化。

5）鉴定转基因株系

使用RNAiso Plus (9108, Takara)试剂盒从野生型和转基因植株中提取总RNA，反转录成cDNA，以Actin基因为内参，通过qRT-PCR方法分析转基因株系与野生型中ARF8.1或ARF8.2基因的表达水平。

结果如图5所示，与野生型植株（WT）相比，含有重组表达载体pBI121-35S:ARF8.1-NOS和pBI121-35S:ARF8.2-NOS的转基因植株均表现出生长发育缓慢，导致矮化现象（图5A），而含有重组表达载体pARF8.1:ARF8.1-NOS和pBI121-pARF8.2:ARF8.2-NOS的转基因植株均正常生长，高度与野生型植株相似（图5B）。

将野生型和转基因植株中的ARF8.1和ARF8.2基因进行定量PCR检测，结果如图6所示，含有重组表达载体pBI121-35S:ARF8.1-NOS和pBI121-35S:ARF8.2-NOS的转基因植株的茎和叶片中，ARF8.1或ARF8.2基因均过量表达（图6A），而含有重组表达载体pARF8.1:ARF8.1-NOS和pBI121-pARF8.2:ARF8.2-NOS的转基因植株中ARF8.1或ARF8.2基因仅在茎中过量表达（图6B）。相比而言，ARF8.1或ARF8.2基因在含有重组表达载体pBI121-35S:ARF8.1-NOS和pBI121-35S:ARF8.2-NOS的转基因植株的茎中表达水平更高，是野生型的10倍以上；而在含有重组表达载体pARF8.1:ARF8.1-NOS和pBI121-pARF8.2:ARF8.2-NOS的转基因植株的茎中表达水平为野生型的4倍左右。因此表明，在番茄中强烈过表达ARF8.1或ARF8.2基因会导致植株矮化，可能是由于35S启动子是组成型强启动子，造成番茄植株体内营养物质的浪费。

与野生型相比，含有重组表达载体pARF8.1:ARF8.1-NOS和pBI121-pARF8.2:ARF8.2-NOS的转基因植株中侧芽的发生数目明显增加（图7A），同时侧芽的发生方式被改变，野生型植株中侧芽从植株顶端开始发生，而转基因植株中侧芽从植株基端开始发生，如图7C所示，表明转基因植株的顶端优势显著降低。与野生型番茄植株相比，转基因植株的侧芽数量分别提高了5.6，4.3，4.4和4.6倍（图7B）。综上，在番茄中，利用pARF8.1或pARF8.2驱动ARF8.1或ARF8.2基因温和过表达不仅显著增加了侧芽发生数目，并且不影响植株的营养生长和维持植株原有形态。

实施例4 番茄基因ARF8.1和ARF8.2在毛白杨中的表达及转基因植株的表型鉴定

通过常规冻融法将所实施例2构建的重组表达载体pBI121-pARF8.1:ARF8.1-NOS和 pBI121-pARF8.2:ARF8.2-NOS分别转入农杆菌EHA105中，再通过农杆菌介导方法将ARF8.1或ARF8.2基因转入毛白杨（Populus tomentosa Carr.），具体步骤如下：

1）转化材料的培养

将毛白杨组培苗在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为10000-12000lux的条件下培养30-40天后，选取长势良好的组培苗的叶片用于遗传转化。

2）转化

将含有pBI121-pARF8.1:ARF8.1-NOS或pBI121- pARF8.2:ARF8.2-NOS表达载体的农杆菌，接种于含有卡纳霉素（100mg/L）的液体LB培养基中，28℃，200rpm培养至OD600约为0.2～0.4之间，然后将培养好的菌液于5000rpm，离心7min，向收集的菌体中加入10mlMS重悬液，用移液枪混匀，然后加入20～30mlWPM重悬液，移入圆口瓶中，在28℃，200rpm振荡培养1～2h；再放入待转化毛白杨组培苗的叶片，大约10min；用灭菌滤纸吸干菌液，将叶片在共培养基中暗培养2-3天。

3）初筛培养

将毛白杨叶片转移到含有50mg/L卡纳霉素和相应激素的初筛培养基中，使侵染后的外植体（叶片）伤口处诱导出愈伤组织，随后诱导分化不定芽。每隔7~10天更换一次新培养基。

4）生根培养

将外植体细胞分化出的不定芽切下，插入含有50mg/L卡纳霉素和相应激素的生根培养基，再将其放入光照培养箱培养直至生根；当不定芽生根后，将其移栽到土里继续生长，即得到T0代转基因毛白杨植株，观察其表型变化。

5）鉴定转基因株系

使用RNAiso Plus (9108, Takara)试剂盒从野生型和转基因植株中提取总RNA，反转录成cDNA，以18s基因为内参，通过qRT-PCR方法分析转基因株系与野生型中ARF8.1或ARF8.2基因的表达水平。

结果如图8所示，将毛白杨幼苗转入土中3个月左右，可以观察到To代转基因毛白杨的侧芽开始发生，而在野生型对照中无侧芽；毛白杨幼苗转入土中5个月左右，与野生型植株（WT）相比，To代转基因毛白杨中侧芽数目明显增加，转基因植株ARF8.1-OX和ARF8.2-OX的侧芽数量分别增加了3倍左右（图9A）。其中，转基因植株ARF8.1-OX中ARF8.1的表达量是野生型毛白杨植株的4.1倍，转基因植株ARF8.2-OX中ARF8.2的表达量是野生型毛白杨植株的5.1倍（图9B）；可见，通过在毛白杨中温和地过表达番茄ARF8.1或ARF8.2基因时，可以明显提高毛白杨的侧芽发生率，同时不影响植物的生长发育和维持植株原有形态。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 长江师范学院；

<120> 调控番茄侧芽发育的ARF8.1和ARF8.2基因及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2535

<212> DNA

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 1

atgaagctttcaacatcaggaatgggtcagcaagctcatgaaggagagaacaagtgtttg 60

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cttctcctccctacaactgtgtctaacgtcgctactacatcaattgatgctgatatatcc 2040

tctatgccactagggacttctggatttccgaatcccttgtatagttatgtgcaagattct 2100

actgacttgttgcataatgtagggcaagctgatgcacaaactgtgccccgtacatttgtc 2160

aaggtttacaaatcagcgtcccttgggaggtcattggacatcactcggttcaatagctat 2220

catgagctacgacaggaacttggacagatgttcgggatcgaagggtttcttgaaaaccct 2280

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atgagcagtaataatagtgctgatggtcgagatttcatgtccggacttccatctatagga 2520

tcacttgattactga 2535

<210> 2

<211> 844

<212> PRT

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 2

MKLSTSGMGQ QAHEGENKCL NSELWHACAG PLVCLPTVGS RVVYFPQGHS EQVAATTNKE 60

VDIHIPNYPN LPPQLICQLH NVTMHADVET DEVYAQMTLQ PLTLQEQKDT YLPVELGIPS 120

RQPTNYFCKT LTASDTSTHG GFSVPRRAAE KVFPPLDFSQ TPPCQELIAR DLHDIEWKFR 180

HIFRGQPKRH LLTTGWSVFV SAKRLVAGDS VLFIWNEKNQ LFLGIRRATR PQTVMPSSVL 240

SSDSMHIGLL AAAAHAASTN SCFIVFFNPR ASPSEFVIPL SKYIKAVYHT RVSVGMRFRM 300

LFETEESSVR RYMGTITGIG DLDPVRWANS HWRSVKVGWD ESTAGERQPR VSLWEIEPLT 360

TFPMYPSLFP LRLKRPWYPG TSSFQENNSE AINGMTWLRG ESSEQGPHLL NLQSFGGMFP 420

WMQQRVDPTM LRNDLNQQYQ AMLASGLQNF GSGDLMKQQL MQFPQPVQYV QHAGSVNPLL 480

QQQQQQQETM QQTIHHHMLP AQTQDNLQRQ QQQHVSNQTE EQSHQHSYQD AYQIPNSQLQ 540

QKQPSNVPSP SFSKPDIADP SSKFSASIAP SGMPTALGSL CSEGTTNFLN FNIIGQQPVI 600

MEQQQQQKSW MAKFANSQLN MGSSSPSLSG YGKETSNSQE TCSLDAQNQS LFGANVDSSG 660

LLLPTTVSNV ATTSIDADIS SMPLGTSGFP NPLYSYVQDS TDLLHNVGQA DAQTVPRTFV 720

KVYKSASLGR SLDITRFNSY HELRQELGQM FGIEGFLENP QRSGWQLVFV DRENDVLLLG 780

DDPWEEFVNN VWYIKILSPE DVQKLGKEEV GSLNRGPPER MSSNNSADGR DFMSGLPSIG 840

SLDY 844

<210> 3

<211> 2529

<212> DNA

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 3

atgaagctttcaacatcaggaatgggtcagcaggctcatgaaggaggagagaaaaagtgt 60

ttgaactcagagctatggcatgcttgtgctggtcctctggtgtgcctaccaactgtcgga 120

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<210> 4

<211> 842

<212> PRT

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 4

MKLSTSGMGQ QAHEGGEKKC LNSELWHACA GPLVCLPTVG SRVVYFPQGH SEQVAATTNK 60

EVDAHIPNYP NLSPQLICQL HNVTMHADVE TDEVYAQMTL QPLTPEEQKD TYLPVEFGIP 120

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LSSDSMHIGL LAAAAHAAAT NSCFNVFFNP RASPSEFVIP LSKYIKAVYH TRVSVGMRFR 300

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HQQQQQQQQI MQQAVHQHML PAQTQMLSEN LQRQSQHQSN NQSEEQAHQH TYQEAFQLPH 540

DQLQQRQPSN VTSPFLKADF ADLTSKFSAS VAPSGVQNML GSLCSEGSNN SLNINRTGQS 600

VIIEQSPQQS WMSKFTESQL NTCSNSSSLP TYGKDTSNPR GNCSLDSQNQ ALFGANIDSS 660

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VYKSGCVGRS LDITQFHSYH ELRRELGQMF GIEGFLEDPQ RSGWQLVFVD RENDILLLGD 780

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<210> 5

<211> 1847

<212> DNA

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<210> 6

<211> 1769

<212> DNA

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 6

aaccaccccaccctggctctgaaggcggggggaattaatttatttcaggtaaaagtacag 60

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atttaccattttacgtctatcagttatgaaatagacgaattaaaagtttaaaattttaaa 900

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gtagaggctattattggtttttaattttattaattaaaataaatatttaattaagtatta 1320

gttagatttgcttcttctccccctttccatttgaatattattatatttgaagcaccgtac 1380

tctgacaatgactagtgaaggatgggtagcacatgcctcctgtcaaatcacaactctatt 1440

gaacggccacgatcaaccgtacgattctgtgaacggctgtgatctcctttctcccaagcc 1500

ttcctcagactcactctgataacagcaagaaagagagaaaatgagggcattactattacc 1560

tctcttttctctctctctctcaactgttatcaggtcgaccttggtcgggtggggtataaa 1620

gagactaacagcacaccctttctctctctccctctcttcaaaactgatagtgatatcaga 1680

aaaagctgaagttgagctcagcttagattctatcaacttattgaattgaagaaattacaa 1740

tttaatggaagtattggagaaagagtagc 1769

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tttaccatgtccctaccctc t 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctttctccaagacctccatt 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaccaccccaccctggctct g 21

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gctactctttctccaatacttcca 24

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggactctagaggatccatgaagctttcaacatcagg 36

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gatcggggaaattcgagctcgtaatcaagtgatcctatag 40

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggactctagaggatccatgaagctttcaacatcaggaatg g 41

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gatcggggaaattcgagctctcagtactccagcgatccaa gag 43

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgattacgccaagctttttaccatgtccctaccctct 37

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaccacccggggatccctttctccaagacctccatt 36

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgattacgccaagcttaaccaccccaccctggctctg 37

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gaccacccggggatccgctactctttctccaatacttcca 40

Claims (10)

1.调控番茄侧芽发育的ARF8.1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述调控番茄侧芽发育的ARF8.1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.调控番茄侧芽发育的ARF8.2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.如权利要求3所述调控番茄侧芽发育的ARF8.2基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒自5’端到3’端依次包含启动子、由所述启动子启动表达的如权利要求1或3所述基因，以及终止子。

6.根据权利要求5所述表达盒，其特征在于，所述启动子为来源于番茄的ARF8.1或ARF8.2基因的启动子；所述来源于番茄的ARF8.1基因的启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述来源于番茄的ARF8.2基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

7.含有如权利要求5所述表达盒的重组植物表达载体。

8.含有如权利要求7所述重组植物表达载体的植物细胞系或植物转化体。

9.如权利要求1或3所述基因在促进植物侧芽发育中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述植物为拟南芥、番茄或毛白杨等。