CN107653253B

CN107653253B - 一种调控烟草开花时期NtMADS2基因及其克隆方法与应用

Info

Publication number: CN107653253B
Application number: CN201711213379.4A
Authority: CN
Inventors: 白戈; 谢贺; 邹保红; 姚恒; 杨大海; 李永平; 肖炳光; 李军营; 张谊寒
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date: 2017-11-28
Filing date: 2017-11-28
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2037-11-28
Also published as: CN107653253A

Abstract

本发明公开了一种烟草开花期调控基因NtMADS2及其克隆方法与应用。所述烟草开花期调控基因NtMADS2包含的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其编码的多肽包含的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。在烟草中敲低NtMADS2基因的表达可延迟烟草的开花期，另外，通过比对NtMADS2蛋白质序列，寻找相同功能的同源基因，并利用VIGS技术验证同源基因的功能。因此，NtMADS2基因具有广阔的应用前景。本发明的烟草开花期调控基因为烟草优化开花时期育种提供基因与技术的支持。

Description

一种调控烟草开花时期NtMADS2基因及其克隆方法与应用

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种调控烟草开花时期基因NtMADS2及其克隆方法与应用。

背景技术

低温是限制农作物生产的最主要的环境因素之一，低温胁迫可以改变植物的花期，从而影响作物产量及一些花卉植物的经济价值。在我国南部地区，低温胁迫诱导的烟草早花现象现象严重影响烟叶生产和农民增收。

烟草起源于南美洲，是典型喜温短日作物，生长发育适温为25-28℃，在零下2-3℃时，烟株就会死亡，地下部最适宜的生长温度是31℃。烟草在6-7叶龄时，如果受到两周左右的12℃低温胁迫就会发生早花现象（项目组田间数据）。烟草早花指烟草植株未能达到正常生长应具有的高度和叶数，花芽就提早分化，现蕾开花的现象。发生早花的烟株过早地从营养生长转入生殖生长，导致生长势弱，叶片数减少，叶片窄小，叶片的产量和质量降低。因此，烟草早花将给烟农带来重大经济损失，影响边远山区农民收入。

目前，生产上主要通过农艺措施（如打顶留杈）来解决低温胁迫诱导花芽提前分化的问题，但这仅是一种极为耗费人力的补救措施。解决低温胁迫诱导早花的根本途径是通过对低温胁迫诱导烟草早花的分子机理研究，培育出耐低温抗早花的烟草新品种，提高烟叶产量。

植物在营养生长的初期，经过一段时间的低温处理诱导成花作用被称为春化作用，此过程主要有几个MADS转录因子所调控。低温胁迫主要影响拟拟南芥FRI(FRIGIDA)和FLC基因的表达。FRI位于FLC的基因上游，促进FLC的表达，通过FLC蛋白介导春化过程。FLC基因编码一个MADS转录因子，介导自主开花/春化途径，是开花路径的负调控因子。FLC蛋白通过结合SOCI基因及FT基因启动子上CArG box直接抑制SOC1和FT基因的转录，SOC1蛋白又能够调控LFY基因的转录。过表达FLC基因能够抑制植物中SOC1和FT基因的转录，从而抑制开花。春化作用导致FLC基因转录和翻译水平均显著降低，因此春化作用通过抑制茎顶端分生组织中FLC基因的表达促进开花。

因此，本发明旨在寻找到一种能开调控烟草开花期的功能基因，通过调控该基因的表达来调节烟草开花期，以达到增产增益的目的。另外，将该基因作为目的片段，构建VIGS载体，寻找具有相同功能的同源基因。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种烟草开花期调控基因NtMADS2，所述的调控烟草开花期基因NtMADS2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述NtMADS2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

第二目的在于提供所述的烟草调烟草开花期基因NtMADS2的克隆方法，所述克隆方法包括以下步骤：

A．烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；

B．NtMADS1基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtMADS1基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。

本发明的第三目的在于提供所述的调控烟草开花期基因NtMADS2的应用，在烟草植株体内降低所述NtMADS2基因的表达，可延迟烟草开花期。

本发明的第四目的在于提供所述的调控烟草开花期基因NtMADS2的应用，在NCBI上通过NtMADS2多肽序列比对，获得同源序列，再通过构建含有所述NtMADS2基因同源序列的VIGS载体和农杆菌转化体系，验证所述同源序列调控烟草开花期的功能。

附图说明

图1为NtMADS2的PCR产物电泳图；

图2本氏烟中的NibenMADS2基因RNAi片段图；

图3为pDONR-Zeocin载体图；

图4为VIGS载体pTRVl和pTRV2图；

图中，A为pTRVl；B为pTRV2；

图5 为在本氏烟中VIGS敲低NtMADS2同源基因后开花时期统计图；

图中，横坐标为开花期，纵坐标为CK（对照）和NibenMADS2基因。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的烟草开花期调控基因NtMADS2包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；或者在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；或者与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

所述NtMADS2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述多肽还可能为由SEQ ID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

本发明所述的烟草开花期调控基因NtMADS2的克隆方法包括以下步骤：

A. 烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；

B. 栽培烟草中NtMADS2基因的PCR扩增：以栽培烟草烟草叶片cDNA为模板，根据NtMADS2基因序列设计引物，进行PCR扩增，PCR扩增体系和条件如表1所示。回收和纯化PCR扩增产物，并测序。

作为本发明的一种优选，所述引物为：

正向引物：5’- ATGGTGAGAGGAAAGGTACAAATG-3’;

反向引物：5’- CTATGAGCAGCGCATTACAGGAAG-3’。

表1 PCR反应体系与条件

回收和纯化PCR扩增产物的具体操作如下：凝胶电泳后，用干净的刀片将带有目的片段的胶切割下来，放入到离心管中，胶不要切得过大，以避免回收时DNA片段溶液含有大量的杂质；向离心管中加入3倍体积的QG溶液后，在50℃条件下温浴10 min，直到胶完全融化；将离心管中的溶液移到2 mL的吸附柱中，离心1 min，弃去液相；再次向吸附柱中加入0.5 mL的QG溶液，离心1 min，弃去液相；向吸附柱加入0.75 mL的PE溶液，离心1 min，弃去液相；再次离心1 min后，将吸附柱放置在一个新的离心管上，加入50 μL的溶解液，静置1min，最后离心1 min，得到的液相即为回收的DNA溶液。

本发明所述的烟草开花期调控基因NtMADS2的应用为在烟草植株体内降低所述NtMADS2基因的表达，可延迟烟草开花期。现有技术领域内常用的降低基因表达或者基因沉默的方法均适用于本发明，如植物病毒载体介导基因过表达的方法，农杆菌介导转化过表达载体，对基因编码匡进行优化修改，对该基因启动子进行优化以达到过表达效果等方法实现。本发明敲低表达基因的方法并不限于上述几种方法，只要能降低NtMADS2表达即可。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以开花时期改变来筛选转化植株。携带有本发明NtMADS2基因或同源基因的干扰载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

本发明所述的烟草开花期调控基因NtMADS2的第二个应用，在NCBI上通过NtMADS2多肽序列比对，所述的NtMADS2多肽序列如SEQ ID No：2所示，获得同源序列，再通过构建含有所述NtMADS2基因同源序列的VIGS载体和农杆菌转化体系，验证所述同源序列调控烟草开花期的功能。

本发明在NCBI上以NtMADS2多肽序列为比对序列，采用BlastP进行同源序列比对，获得同源性最高的本氏烟多肽序列NibenMADS2，通过构建含有NibenMADS2基因的VIGS载体和农杆菌转化体系，验证所述NibenMADS2基因具有延迟烟草开花期的功能。所述NibenMADS2基因的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，其编码的多肽氨基酸序列如SEQ IDNo：4所示。

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)属于转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS), 是植物体内存在的一种防御病毒入侵的自然机制。近年来随着分子生物技术的发展, 许多植物的全基因组测序工作正陆续完成, 但是由于基因的种类复杂多样, 需要进一步鉴定其具体功能。传统的基因功能鉴定方法有反义转基因技术和基因敲除技术, 但是这些方法操作复杂、耗时较长，而VIGS技术凭借快速、高效、高通量的特点成为鉴定基因功能的有力工具。构建含有所述烟草开花期调控基因NtMADS2在本氏烟中同源基因的VIGS载体及其农杆菌转化体系，能够快速寻找并鉴定具有相同功能的基因。

因此，本发明所述的烟草开花期调控基因NtMADS2的为农作物尤其是烟草优化开花时期育种提供基因与技术的支持。

实施例1：克隆NtMADS2基因

以烟草叶片cDNA为模板，根据烟草基因组数据库信息设计引物，进行NtMADS2基因的全长片段PCR扩增，PCR反应体系和扩增条件如表1所示；得到PCR扩增产物。

引物为：

NtMADS2-F：5’- ATGGTGAGAGGAAAGGTACAAATG-3’；

NtMADS2-R：5’- CTATGAGCAGCGCATTACAGGAAG-3’。

将扩增获得的PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶电泳，获得650 bp大小的片段，凝胶电泳结果如图1所示。电泳结束后，用干净的刀片将带有目的片段的胶切割下来，放入到离心管中，胶不要切得过大，以避免回收时DNA片段溶液含有大量的杂质；向离心管中加入3倍体积的QG溶液后，在50℃条件下温浴10 min，直到胶完全融化；将离心管中的溶液移到2 mL的吸附柱中，离心1 min，弃去液相；再次向吸附柱中加入0.5 mL的QG溶液，离心1 min，弃去液相；向吸附柱加入0.75 mL的PE溶液，离心1 min，弃去液相；再次离心1 min后，将吸附柱放置在一个新的离心管上，加入50 μL的溶解液，静置1 min，最后离心1 min，得到的液相即为回收的DNA溶液。并送Invitrogen测序，验证序列结果。

实施例2：获得同源基因

在NCBI上以NtMADS2多肽序列为比对序列采用BlastP进行同源序列比对，挑选同源性最高的本氏烟多肽序列NibenMADS2。在本氏烟获得的NibenMADS2基因序列如SEQ IDNo：3所示，其编码的多肽氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。

实施例3：本氏烟草的培养

将饱满健康的本氏烟草种子播散在含有基质（营养土：蛭石1:4体积比配置）的直径10厘米的方形塑料培养盆中，每盆播种1-2粒种子。将播种好的盆放入温度22℃，光照白天16小时/晚上8小时，湿度60%培养箱中培养至2~3叶期备用。在培养的过程中每2周浇水1次。

实施例4：敲低NibenMADS2基因

利用primer 5软件设计VIGS靶标片段的上下游引物，设计扩增片段大小为500 bp左右。提取本氏烟草的RNA，并将其逆转录合成cDNA。以上述本氏烟草cDNA为模板，通过PCR扩增获得VIGS靶标片段（图2）。

gateway反应引物序列如下：

NibenMADS2-gateway-F: ’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGCAGCACTTGAAGCATGAG-3’；

NibenMADS2-gateway-R: ’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATAAGCAGCGCATTGCAGG-3’。

1、构建载体：

根据获得的本氏烟中的NibenMADS2基因序列设计引物，并根据Gateway系统中的BP反应要求，在正向引物前加上5’- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3’序列，在反向引物前加5’- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3’序列。PCR反应均采用Phusion高保真聚合酶进行PCR克隆。

将NibenMADS2基因片段通过BP反应克隆到pDONR-Zeocin载体（图3）中，然后通过LR反应将片段克隆到沉默载体pTRV2（图4）中。具体步骤如下：

BP反应：

（1）在200 μL离心管中准备8 μL的反应体系，包括：1~7 μL的attB-PCR产物（约15-150 ng，浓度≥10 ng/μL）、1 μL的pDONR载体（150 ng/μL）和适量的TE缓冲液（pH 8.0），在室温下混匀；

（2）将BP Clonase™ II酶混合物在冰上静置2 min融化，轻轻震荡2次，混匀待用；

（3）向（1）准备的样品中加入2 μL的BP Clonase™ II酶混合物，轻轻地将体系混匀；

（4）将BP Clonase™ II酶混合物放回到-20°C或者-80°C保存；

（5）将反应体系放在25°C温浴1h；

（6）向反应体系中加入1 μL的蛋白酶K溶液，轻轻震荡，然后将样品放在37°C温浴10 min，以便终止BP反应；

（7）将混合液转化大肠杆菌后，取转化菌液涂在含Zeocin抗性的LB平板上，挑取菌落至含相应抗生素培养基溶液中摇菌培养，确认后提取阳性克隆的质粒备用。

LR反应：

（1）在200 μL离心管中准备8 μL的反应物，包括：1 - 7 μL的BP反应获得的pDONR-Zeocin质粒（50-150 ng）、1 μL的pTRV2载体（150 ng/μL）和适量的TE缓冲液（pH 8.0），在室温下混匀；

（2）将LR Clonase™ II酶混合物静置在冰上2 min融化，轻轻震荡2次以混匀；

（3）加入2 μL的LR Clonase™ II酶混合物，轻轻震荡将体系混匀；

（4）将LR Clonase™ II酶混合物放回到-20°C或者-80°C冰箱保存；

（5）将反应体系放在25°C温浴反应1 h；

（6）向反应体系中加入1 μL蛋白酶K溶液以终止LR反应，轻轻震荡后，将样品放在37°C静置10 min；

（7）将LR反应产物转化大肠杆菌后涂板、筛选阳性克隆、提取质粒，然后进行农杆菌转化等实验。

2、农杆菌转化：

提取目的克隆的质粒，并通过转化将带有靶标片段TRV2 -VIGS目的载体转入农杆菌GV3101感受态细胞。

(1)转化前1天，接种pTRVl，pTRV2和pTRV2- NibenMADS2菌液到4 mL的含有Kan和乙酰丁香酮的LB液体培养基，28℃恒温培养箱，200 r/min摇菌，过夜。

(2)转化当天，4000 r/min，2 min离心收集菌体，加入等体积的含有10 mmol/LMgCl2，pH 5.5，10 mmol/L MES溶液悬浮细胞。

(3)分光光度计测量(OD600)农杆菌菌液浓度，调节农杆菌的终浓度梯度OD600值为0.3，向pTRVl中加入体积比1/1000浓度为400 μmol/L的乙酰丁香酮。

(4)1：1比例的混合pTRVl和pTRV2以及pTRVl和pTRV2- NibenMADS2菌悬液。

3、烟草侵染

选用2-3叶期的本氏烟草，用注射器针头将烟草最大的两片叶子扎一个小孔，取下注射器针头，利用注射器将菌液轻轻注射到烟草叶片中（烟草叶片大部分表现水渍状）。接种完的植株迅速培养箱培养。接菌2~3周后，记录接菌pTRV2- NibenMADS2沉默成功的烟草植株的开花时间。

试验结果表明：将本氏烟中的NibenMADS2基因通过VIGS方法敲低后，可以看到敲低基因表达的本氏烟的开花时间与转化空载体的烟株延后开花5天左右（图5），考虑到本氏烟的开花时期大约在50天左右，可以认为开花时间明显推迟。

综上所述，NtMADS2基因在调控烟草开花期方面具有广阔的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种调控烟草开花时期NtMADS2基因及其克隆方法与应用

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 648

<212> DNA

<213> 烟草

<400> 1

atggtgagag gaaaggtaca aatgaaacga attgagaatt tatcaagcag acaagtaacc 60

ttctcaaagc gccggaatgg acttctgaag aaagctaacg agctatctgt tctttgtgat 120

gctgaagttg ctttgatcat tttctcacag aaaggacgac tctacgattt tgctagctcc 180

aacatgcaga agacaattga gagatatcat gaacgtgcaa gagaaacgat ggtggacaac 240

agcactgaac tccagcaata catggagcac ttgaagcatg agacagctaa catggcaaag 300

aagatagaaa tccttgaagt ttccaaacgg aagctgatgg gacaaggttt agggtcatgt 360

tcaatggatg aactacaaga gattgacagc aagctcgaga ggagcctgga aaatatcagg 420

gccagaaagg ctcaattatt taaggacgaa atagaaagcc taaaagcaag gcagtgtcta 480

ttgctagaag aaaatgcaaa tttacgagaa aagtgccgcc taatgccaac gccatcagca 540

acaccaccaa ctcaacggaa agaaagggga aattgtagca aaaatgccca gaattcggag 600

gtggagactg aattgtttat cggccttcct gtaatgcgct gctcatag 648

<210> 2

<211> 215

<212> PRT

<213> 烟草

<400> 2

Met Val Arg Gly Lys Val Gln Met Lys Arg Ile Glu Asn Leu Ser Ser

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala

20 25 30

Asn Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Ile Phe

35 40 45

Ser Gln Lys Gly Arg Leu Tyr Asp Phe Ala Ser Ser Asn Met Gln Lys

50 55 60

Thr Ile Glu Arg Tyr His Glu Arg Ala Arg Glu Thr Met Val Asp Asn

65 70 75 80

Ser Thr Glu Leu Gln Gln Tyr Met Glu His Leu Lys His Glu Thr Ala

85 90 95

Asn Met Ala Lys Lys Ile Glu Ile Leu Glu Val Ser Lys Arg Lys Leu

100 105 110

Met Gly Gln Gly Leu Gly Ser Cys Ser Met Asp Glu Leu Gln Glu Ile

115 120 125

Asp Ser Lys Leu Glu Arg Ser Leu Glu Asn Ile Arg Ala Arg Lys Ala

130 135 140

Gln Leu Phe Lys Asp Glu Ile Glu Ser Leu Lys Ala Arg Gln Cys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Glu Glu Asn Ala Asn Leu Arg Glu Lys Cys Arg Leu Met Pro

165 170 175

Thr Pro Ser Ala Thr Pro Pro Thr Gln Arg Lys Glu Arg Gly Asn Cys

180 185 190

Ser Lys Asn Ala Gln Asn Ser Glu Val Glu Thr Glu Leu Phe Ile Gly

195 200 205

Leu Pro Val Met Arg Cys Ser

210 215

<210> 3

<211> 396

<212> DNA

<213> 本氏烟

<400> 3

atgcagcact tgaagcatga gacagctaac atggcaaaga agatagaaat ccttgaagtt 60

tccaaacgga agctgatggg ccaaggttta ggatcatgtt caatggatga actacaagag 120

attgacagca agctcgagag gagcctggaa aacattaggg ccagaaaggc tcagttattc 180

aacgacgaaa tagaaagcct aaaagccagg gagagtctat tgcttgaaga aaataaaaat 240

ttaagtgaaa agtgccgcct aatgccaacg ccatcagcac cagcaccagc accaccaact 300

cagctgaaag aaaggggaaa ctgtagcaaa aatactcaga atttggaggt ggagactgaa 360

ttgtttatcg gccttcctgc aatgcgctgc ttatag 396

<210> 4

<211> 212

<212> PRT

<213> 本氏烟

<400> 4

Met Val Arg Gly Lys Thr Glu Met Lys Arg Ile Glu Asn Ala Thr Ser

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Ser Gly Leu Leu Lys Lys Ala

20 25 30

Phe Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe

35 40 45

Ser Pro Lys Gly Lys Leu Tyr Glu Phe Ser Ser Ser Ser Thr Asn Lys

50 55 60

Thr Ile Glu Arg Tyr Gln Lys Asn Asp Lys Tyr Leu Gly Leu Asn Ile

65 70 75 80

Ser Lys Ile Ala Asp Ile Gln Thr Thr Glu His Leu Lys Glu Glu Val

85 90 95

Ala Thr Met Thr Arg Lys Leu Glu Phe Leu Glu Asp Ser Lys Arg Lys

100 105 110

Leu Leu Gly Glu Gly Leu Asp Ser Ser Ser Tyr Asp Glu Leu Gln Gln

115 120 125

Val Glu Lys Gln Leu Glu Arg Ser Leu Ser Cys Ile Arg Ala Arg Lys

130 135 140

Asn Leu Leu Phe Arg Glu Gln Ile Ala His Leu Lys Glu Glu Glu Lys

145 150 155 160

Ile Leu Met Lys Gln Asn Ala Asp Leu Lys Lys Arg Tyr Glu Val Leu

165 170 175

Pro Leu Leu Met Thr Thr Val Pro Gln Glu Lys Glu Asp Thr Glu Arg

180 185 190

Gln Thr Met Glu Val Glu Thr Glu Leu Phe Ile Gly Leu Pro Gln Arg

195 200 205

Gln Arg Ser His

210

Claims

1.一种本氏烟开花期调控基因NibenMADS2的应用，其特征在于，所述本氏烟开花期调控基因NibenMADS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，在本氏烟植株体内降低所述NibenMADS2基因的表达可延迟本氏烟开花期。