CN111187776B

CN111187776B - 一种球根花卉休眠解除相关基因及其应用

Info

Publication number: CN111187776B
Application number: CN202010056240.9A
Authority: CN
Inventors: 王艳平; 产祝龙; 赵慧敏
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-01-18
Filing date: 2020-01-18
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2040-01-18
Also published as: CN111187776A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种球根花卉休眠解除的相关基因及其应用，所述基因为DRR1基因，DRR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还涉及DRR1基因的启动子的克隆。通过农杆菌介导的稳定转化拟南芥植株的表型分析，结果表明该基因具有替代低温打破植物休眠、调控种子萌发和花芽生长的显著功能。DRR1基因的发现，为百合科球根花卉培育无需低温处理或低温需求量少的新品种提供了新的基因资源；同时为观赏园艺提供新的遗传资源，该基因的利用大大缩短了球根花卉的生长周期，降低了种球采后处理和促成栽培的经济成本。

Description

一种球根花卉休眠解除相关基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种球根花卉休眠解除的相关基因及其应用。

背景技术

郁金香等球根花卉是重要的秋植球根花卉，在国际花卉贸易中具有重要地位。在世界范围内，郁金香的生产和消费一直处于高速发展的态势。2017 年我国共进口郁金香种球约3.5亿粒，而国产的郁金香种球不足500万粒。同时由于采后处理技术不过关，导致国产郁金香种球盲花或花期不一致，观赏效果较差，进一步限制了国产种球的应用空间。在种球采后处理阶段，温度是影响郁金香种球花芽分化的关键因素。郁金香种球采收后，由于环境温度的变化诱导其顶端分生组织由营养生长转变为生殖生长(即成花诱导)继而完成花器官的发育及休眠诱导。花芽分化完成之后进入休眠阶段，定植前需要一定时间段的低温处理才能打破花芽休眠启动开花和花茎生长。不同郁金香品种对低温的需求量有显著差异，大部分品种需要12星期以上的低温处理(5～9℃)才能正常开花。如果低温处理不够，会导致郁金香盲花率较高或者花茎生长受到显著抑制。低温处理过程中人力和物力的耗费增加了郁金香产业推广的成本，同时也延长了郁金香的生长周期。除此之外，低温处理也是郁金香种子萌发的前提条件，郁金香种子萌发和早期幼苗生长的最适温度为5～10℃，高温会大大抑制种子的萌发，并延缓幼苗生长。目前关于郁金香花芽和种子如何响应低温，并介导品种间低温需求量差异的分子机理却知之甚少。因此，对郁金香调控低温响应和花芽休眠解除相关的关键基因进行探究，并解析其在介导低温响应和休眠解除中的分子机理，相关研究的开展和基因资源的获得为百合科球根花卉培育无需低温处理或低温需求量少的新品种提供了新的基因资源，同时为观赏园艺提供新的遗传资源，该资源的利用大大缩短了球根花卉的生长周期，降低了种球采后处理和促成栽培的经济成本，在球根花卉的育种、栽培和采后处理领域具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种球根花卉休眠解除的相关基因及其应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种球根花卉休眠解除的相关基因，即Dormancy-Release-Related 1(DRR1) 基因，所述基因的序列为SEQ ID NO：1。

进一步的，球根花卉休眠解除的相关基因对应的蛋白质序列为SEQ ID NO：2。

进一步的，所述球根花卉休眠解除的相关基因的特异性启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

进一步的，所述的球根花卉为百合科郁金香属作物郁金香或百合属作物百合等需要低温解除休眠的球根花卉。

进一步的，所述球根花卉休眠解除的相关基因在球根花卉作物育种中的应用。以上所述的应用中，优选的，所述的植物包括拟南芥、郁金香和百合。

本发明的有益效果为：本发明首次提出了郁金香等球根花卉休眠解除关键基因，该基因作为控制郁金香等球根花卉种子和花芽休眠解除的正向调控因子，该基因的功能解析为了解百合科球根花卉如何响应低温、解除休眠的分子机制提供了关键证据。该基因的发现，为百合科球根花卉遗传改良和新品种培育提供新的基因资源，相关新品种的培育和推广将大大缩短球根花卉的生长周期、降低采后生产成本，具有重要的理论意义和应用潜力。

郁金香等球根花卉休眠解除相关基因DRR1在植物育种中的应用，利用常规生物技术，将该基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)在植物中超量表达，可以替代低温打破休眠，显著提高植物种子萌发率和幼苗生长速率。该基因可应用于百合科球根花卉作物种遗传改良和新品种培育。

郁金香等球根花卉DRR1基因启动子在植物休眠解除中的应用，利用常规生物技术，将该启动子驱动DRR1并转化到相关植物中，可显著缩短相关植物在休眠解除过程中的低温需求量。

附图说明

图1、郁金香DRR1基因结构。

图2、郁金香DRR1基因在植物休眠解除领域中的应用示例。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

郁金香休眠解除相关基因DRR1的获得：

我们通过对郁金香不同品种间低温需求量筛选以及差异品种的转录组学等分析，发现DRR1在转录水平上受低温、脱落酸和赤霉素调控，然后克隆了DRR1基因及其启动子。异源超表达DRR1能够替代低温，提前打破拟南芥种子休眠，在不春化处理的情况下显著提高拟南芥种子萌发率。该基因编码一个bHLH转录因子，序列进化树分析显示该基因为百合科特有基因，其他物种中没有该基因的直系同源基因，也没有关于该基因的报道。BLAST序列分析显示DRR1氨基酸序列与其他单子叶植物中同源性均低于50％。该百合科特有的控制花芽和种子休眠的关键基因DRR1的CDS序列如SEQ ID NO.1 所示，包括897个碱基，蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，编码298个氨基酸。本发明还包括DRR1基因的启动子的获得，我们利用TAIL-PCR获得了DRR1 基因的启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

郁金香休眠解除相关基因DRR1(Dormancy Release Related 1)的获得：

1.DRR1基因的克隆

本研究对郁金香两个低温需求量具有显著差异的品种进行转录组分析，获得差异表达基因DRR1，然后根据郁金香三代全长转录组测序结果，设计引物以cDNA为模板对DRR1序列进行克隆。测序结果表明，DRR1基因的CDS 区域与郁金香GBOF-1基因(GenBankNo.AAD56411.1)序列高度同源(96.21％同源性)。然后以郁金香基因组DNA为模板，克隆得到DRR1的基因组序列，序列分析结果发现DRR1含有5个外显子，4个内含子，其基因的结构示意图见图1。蛋白序列分析结果表明DRR1编码一个bHLH转录因子，在酵母中具有转录激活活性，且其活性区域在蛋白的C末端。

2.DRR1基因启动子的克隆

利用TAIL-PCR方法对DRR1基因的启动子序列进行克隆。首先在DRR1 基因靠近N段区域设计特异性引物，然后和简并引物组合进行连续的PCR循环获得目标片段并进行测序分析，共扩增得到1898bp的启动子序列(SEQ ID NO.3)。序列分析结果表明启动子序列中存在低温、生长素等响应元件，而低温和生长素参与介导郁金香的休眠解除途径，推测DRR1基因在转录水平上受低温和生长素调控。

实施例2：

郁金香DRR1基因在植物休眠解除领域中的应用：

将DRR1基因的CDS序列(SEQ ID NO.1)构建到pCAMBIA1300载体，并转化农杆菌GV3101，利用浸花法进行拟南芥遗传转化，获得多个超表达DRR1 转基因植株，然后利用种子萌发实验检测郁金香DRR1基因在拟南芥种子休眠中的调控作用。实验结果如图2所示，图中OX-1和OX-3代表两个独立的 DRR1超表达拟南芥转基因株系，用于说明结果的可重复性，WT代表未经过转基因处理的普通拟南芥对照例。由图2中可看出，OX-1和OX-3转基因植株在低温春化处理或不经过低温春化处理的情况下，萌发率均很好，特别是在不经过低温春化的情况下，超表达DRR1的转基因植株在播种后早期萌发率远高于对比例WT的萌发率，说明超表达DRR1基因能够提前打破种子休眠，促进拟南芥种子萌发，且不依赖于低温处理。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种球根花卉休眠解除的相关基因及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 897

<212> DNA

<213> 郁金香(Tulipa gesneriana)

<400> 1

atggcagctt tctcatataa gcagcaacaa caccaaacca acttgctttt agagtcaact 60

gatcatcatc atctgtcttt ccaattccaa gacctgatga ccaattcaac ttctcccttc 120

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<210> 2

<211> 298

<212> PRT

<213> 郁金香(Tulipa gesneriana)

<400> 2

Met Ala Ala Phe Ser Tyr Lys Gln Gln Gln His Gln Thr Asn Leu Leu

1 5 10 15

Leu Glu Ser Thr Asp His His His Leu Ser Phe Gln Phe Gln Asp Leu

20 25 30

Met Thr Asn Ser Thr Ser Pro Phe Leu Tyr Tyr Pro Met Pro Thr Ser

35 40 45

Ala Thr Asn Ser Thr Leu Asp Ser Ala Ser Asp Asn Gln Lys Asp Cys

50 55 60

Ser Ser Ser Val Ala Glu Pro Gln Ser Ser Thr Glu Ile Arg Lys Arg

65 70 75 80

Lys Asp Lys Ser Asp Gly Ser Cys Met Thr Thr Val His Ser Lys Gly

85 90 95

Thr Lys Arg Glu Thr Lys Ser Arg Lys Ser Gln Lys Lys Pro Lys Ala

100 105 110

Asn Glu Ser Asp Glu Met Lys Glu Lys Thr Gln Glu Glu Glu Ala Ala

115 120 125

Pro Val Gly Tyr Ile His Val Arg Ala Arg Arg Gly Gln Ala Thr Asp

130 135 140

Ser His Ser Leu Ala Glu Arg Val Arg Arg Glu Lys Ile Ser Glu Arg

145 150 155 160

Met Lys Leu Leu Gln Ala Leu Val Pro Gly Cys Asp Lys Val Thr Gly

165 170 175

Lys Ala Val Met Leu Asp Glu Ile Ile Asn Tyr Val Gln Ser Leu Gln

180 185 190

Asn Gln Val Glu Phe Leu Ser Met Lys Leu Ala Thr Val Ser Pro Met

195 200 205

Leu Tyr Glu Phe Gly Leu Asp Ile Glu Gly Gln Met Asn Asp Leu Glu

210 215 220

Arg Val Gly Ser Phe Pro Gln Asp Ser Gln Leu Leu Val Pro Lys Thr

225 230 235 240

Ile Pro Phe Gln His Arg Val Cys Glu Glu Asp Thr Arg Ser Tyr Ser

245 250 255

Ile Gly Glu Thr Ser Ala Pro Phe Leu Leu His Asp Gln Gly Pro Leu

260 265 270

Ser Phe Ser Gly Ile Pro Phe Ser Val Glu Met Gly Asp Gln Ala Gln

275 280 285

Gly Phe Leu Arg Gln Leu Leu Leu Asn Asn

290 295

<210> 3

<211> 1901

<212> DNA

<213> 郁金香(Tulipa gesneriana)

<400> 3

atgcctcttg gcactggaaa agtatattaa aaatccgtaa acactttata aacaatgtca 60

tcaaatctcc gggactgggc acttctatga acatcatctc tgatccctgg attgagaatt 120

tgccgacttt ccgactttct agtgactgtc ctcctataac ctttaccaac acaaagcctt 180

tgatgtgcaa taatggttcc agctggaatg ttattcttct tagtcaattg ggtttcagtg 240

accagattat caacctgatc aaggcaatgc ctattaactg gagtgctaat caggataagt 300

tcatttggct tcgtaatact aaggggaatt ttaccctcag atctgcttat cgccaagtta 360

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ctgcatctat ttgtaacatt agggttcgat tccacggcca gcatttctca attcctgatg 840

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tagctcgtca ctgttacaca tcagccacta tcttttcaga ctctcaactt gctgttatgt 1140

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tagcactttg gactctcaag gaatcaacgg caataaaata tattccaagg gaacataata 1260

tggaggctca ccaattggca cgacactcac tcagttcagc aagggacgac tgatatgacg 1320

actatagcct ccattctttg actctgctac tttatgctct cgatagttta gaccctcaat 1380

ggctaaatca gcaagcaaca agggatcgtc cagccaggta caatttatga tttatctgcc 1440

tacctccata tctagcttgg tttttttagt tcatctagtc tgtaacctgg ttgtcctttg 1500

gctaatgtaa cttattatca tccactatgt actaaacttt atgctagtta tcaatgcaat 1560

gggttcgccc accttcgaaa aaaaaaatat tcacactttt ttatttttta ttttttgttt 1620

ggtctagttg aggtctcaag ttggatactt cttgtgttct aagtggaaaa ttcctttagt 1680

cgactgagca ggaagagcta cagcccatgc aactagcttg ggctggactt gaggatttgg 1740

gccatttcgg gaggacgata gaggggatca gtaccccgcc ccaaacccca tccctacaat 1800

gttatatata aactagtcca tgccttgtat gaaaacacct ttgggtgagt tctgccaaag 1860

ttatccatct tcatctcctc tctccctctc agtctcccat g 1901

Claims

1.一种球根花卉休眠解除的相关基因，其特征在于，所述基因的序列为SEQ ID NO ：1。

2.权利要求1所述球根花卉休眠解除的相关基因在球根花卉作物育种中的应用。