CN110042109A

CN110042109A - 与番茄叶片衰老相关的基因及其应用

Info

Publication number: CN110042109A
Application number: CN201910398741.2A
Authority: CN
Inventors: 符勇耀; 杨利平; 徐文姬; 雷美艳
Original assignee: Yangtze Normal University
Current assignee: Yangtze Normal University
Priority date: 2019-05-14
Filing date: 2019-05-14
Publication date: 2019-07-23
Anticipated expiration: 2039-05-14
Also published as: CN110042109B

Abstract

本发明公开了与番茄叶片衰老相关的基因及其应用，所述基因为ARF8或ARF6，所述ARF8和ARF6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示，或为在SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且同样与番茄叶片衰老相关的核苷酸序列。本发明通过功能基因组学试验证明ARF8和ARF6基因是调控番茄叶片衰老过程的调节因子，在转基因番茄中过表达ARF8或ARF6基因，使得番茄叶片的叶绿素含量增多（更加深绿），其衰老起始时间相对于野生型对照延迟了30天以上，并且具有显著的对抗乙烯诱导的衰老，为草本植物叶片衰老的调控提供了一种有效的技术手段，尤其在园艺领域观叶植物中具有广泛的应用前景和潜在的市场价值。

Description

与番茄叶片衰老相关的基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及与番茄叶片衰老相关的基因及其应用。

背景技术

衰老是叶片发育的最后一个阶段，是一个主动的生理过程。延缓衰老与农作物的增产和品质改良密切相关，对于粮食作物和多数经济作物来说，伴随着产量器官的发育和品质性状的逐渐形成，功能叶片中的同化产物和衰老叶片中积累的营养物质不断向产量器官转运。作物过早衰老必定影响产品产量和品质，某些杂交水稻在发育后期叶片和功能早衰导致结实率低，严重影响了杂交水稻产量潜力的进一步发挥。绿叶类作物的叶片衰老进程不仅影响到产量和品质等要素的形成，而且还会直接影响到采收产量、采后品质和货架寿命。据报道，目前我国的蔬菜采后损失率高达30%~50%（赵瑞平, 夏向东. 不同贮藏措施对鸭梨贮藏品质的影响[J]. 河北北方学院学报(自然科学版), 1999(1):38-41.）。对于花卉植物而言，叶片和花器官的衰老进程直接影响到其观赏价值和销售价格。综上所述，改善植物的衰老进程几乎可以影响到所有主要作物的产量和品质。因此，如何高效调控作物衰老正在成为农艺学家解决作物高产高品质的有效途径之一。

植物叶片衰老是一个复杂的生物学过程，同时受到内部信号（如叶龄相关信号和内源激素的水平等）和各种环境因子（如温度，光照，逆境等）的协调控制，而植物内源激素是影响叶片衰老的主要因子之一。近年来，随着分子生物学技术的发展，很多衰老相关基因被克隆，通过分子遗传手段延缓某些植物叶片衰老的成功显示出诱人的前景。Gan等在烟草叶片衰老过程中特异性表达细胞分裂素合成途径的关键基因-异戊烯基转移酶（IPT）基因显著延缓了转基因烟草植株的衰老，其中SAG12-IPT转基因烟草的种子产量和干重提高了50%（Gan SS et al. 1995.）；袁政等将融合基因SAG12-IPT导入青菜，转基因植株表现出衰老延迟的生理现象，增加青菜采收产量的同时，也可保持商品的新鲜程度，为绿叶类蔬菜的耐储存育种提供了新的思路（Yuan Z et al. 2002.）。发明专利CN201811636548.X公开了一种水稻叶片衰老和穗型调控基因HK73及其编码的蛋白质、分子标记与应用，在水稻中克隆HK73基因，该基因编码一个ATP功能域包含蛋白，调控水稻叶片衰老进程和穗大小。但影响叶片衰老的诸多因素是一个极为复杂的交叉网络，不同调控因子之间相互作用的机理目前也仍未清楚。因此，需要我们分离鉴定更多与叶片衰老/持绿相关的基因，筛选出生产上有利用价值的叶片持绿基因，以阐明调控叶片衰老的分子网络，对植物的高产育种具有重要的意义。

至今为止，人们在发现了多个物种的ARF基因家族成员，23个AtARFs（Guilfoyleand Hagen. 2007），25个OsARFs（Wang et al. 2007）。研究表明，在拟南芥的23个ARF基因中，AtARF1和AtARF2基因与拟南芥叶片的寿命长短和叶形相关，并且参与花器官的脱落(Ellis et al. 2005)。其中，AtARF2还参与调控种子的生长发育（Schruff et al. 2006）；AtARF3和AtARF4与维管束发育相关（Zhou et al. 2007）；此外，AtARF2，AtARF3和AtARF4还参与侧根生长（Marin et al. 2010），AtARF5与叶片发生，叶脉形成以及种子萌发时期侧根的形成有关（Garrett et al. 2012; Schlereth et al. 2010）。AtARF6和AtARF8参与调控雄蕊和雌蕊的生殖能力（Tabata et al. 2010; Wu et al. 2006），并且，AtARF8还与果实形态相关（Goetz et al. 2006）。在番茄中研究显示，生长素反应因子ARF6和ARF8对番茄座果、单性结实及果实发育过程也具有重要的调控作用（唐雨微，番茄生长素响应因子SlARF6在果实形成和发育过程中的功能研究，重庆大学硕士学位论文，2016；杨迎伍，番茄Sly-miR167的克隆、鉴定及其对座果和单性结实的影响研究，重庆大学博士学位论文，2010）。关晓溪等发现番茄SlARF2-RNAi植株叶片叶色鲜绿，侧生叶间小叶数量减少（关晓溪，2018），但基因ARF2作为叶片衰老发育的促进因子，通过下调其表达，可以延缓叶片衰老的进程。然而，关于叶片衰老过程的抑制因子目前鲜有报道，挖掘影响植物叶片衰老过程的抑制因子，可以弥补现状的不足。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于与番茄叶片衰老相关的基因及其应用，提供了可以抑制叶片衰老进程的新的调控因子，为园艺植物尤其是观叶植物的遗传改良提供了理想的选择。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：与番茄叶片衰老相关的基因，所述基因为ARF8或ARF6，所述ARF8和ARF6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示，或为在SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且同样与番茄叶片衰老相关的核苷酸序列。

本发明还提供了基因ARF8或ARF6编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了含有基因ARF8或ARF6的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。其中所述表达盒，自5’端到3’端依次包含启动子、由所述启动子启动表达的ARF8或ARF6基因，以及终止子。所述启动子为组成型表达的启动子或叶片组织特异性启动子，其控制基因在植株叶片组织中过表达。所述组成型表达的启动子可以为CaMV35S、CaMV19S、Actin promoter、Ubiquitin promoter、Cytochrome c1 promtoter和eIF4A-10 promoter等；所述的叶片组织特异性启动子可以为AtML1 promoter、AtACD6 promoter、GhLSPpromtoer、SAG39 promoter等。

本发明还提供了基因ARF8或ARF6在调控植物叶片衰老中的应用。

本发明还提供了基因ARF8或ARF6在提高植物叶片叶绿素含量中的应用。

本发明还提供了基因ARF8或ARF6在提高植物对抗乙烯诱导衰老中的应用。

进一步，是将基因ARF8或ARF6导入目的植物中，在目的植物中过表达所述基因，提高目的植物中蛋白ARF8或ARF6的表达量和/或活性。

进一步，所述植物为观叶草本植物，如玉簪、红掌、细茎针茅、蓝羊茅、豆瓣绿或普通针毛蕨等。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明首次公开番茄生长素响应因子基因ARF8和ARF6具有延缓植物叶片衰老进程的生物学功能，表明ARF8和ARF6基因是控制植物叶片衰老的关键调节因子，可以应用于作物遗传改良，对创制持绿品种、延长观赏植物的观赏周期具有重要意义。因此，本发明不仅为理论研究植物叶片衰老的分子机制提供支持，而且在未来植物基因工程、农业生产和园艺领域也具有重要应用价值。

2、本发明通过构建ARF8和ARF6启动子（pARF8和pARF6）与GUS融合表达分析发现，ARF8和ARF6基因在番茄幼嫩时期位于叶片中表达，成熟后期主要在叶脉中表达，暗示它们参与叶片组织的形成和发育调控。通过在转基因番茄中过表达ARF8或ARF6基因，与野生型对比发现，转基因植株的叶片的叶绿素含量增多（更加深绿），衰老期延迟30天以上，效果非常明显；进一步发现过表达ARF8或ARF6的转基因叶片具有抗乙烯诱导衰老的功能。本发明为草本植物叶片衰老的调控提供了一种有效的技术手段，尤其在园艺领域观叶植物中具有广泛的应用前景和潜在的市场价值。

附图说明

图1为重组表达载体pARF8-GUS和pARF6-GUS的图谱示意图；

图2为启动子pARF8和pARF6在叶片组织中的GUS染色分析；

图A从左到右分别是野生型（WT）、启动子pARF8和pARF6驱动GUS在番茄幼嫩叶片中的表达示意图；图B从左到右分别是野生型（WT）、启动子pARF8和pARF6驱动GUS在番茄成熟叶片中的表达示意图；

图3为重组表达载体pBI121-35S:ARF6/ARF8-NOS的图谱示意图；

图4为ARF6和ARF8基因在转基因番茄叶片中的半定量PCR分析图；

图5为过表达ARF8基因对番茄植株叶片衰老的影响；

图A从左到右分别是野生型番茄植株与过表达ARF8基因的转基因植株在生长4个月左右的叶片表型；图B为野生型番茄与过表达ARF8基因的转基因番茄植株中叶片的叶绿素含量比较；星号（*）代表t-检验的差异显著性分析，**P<0.01；

图6为过表达ARF6基因对番茄植株叶片衰老的影响；

图A从左到右分别是野生型番茄植株与过表达ARF6基因的转基因植株在生长4个月左右的叶片表型；图B为野生型番茄与过表达ARF6基因的转基因番茄植株中叶片的叶绿素含量比较；星号（*）代表t-检验的差异显著性分析，**P<0.01；

图7从左到右分别是野生型植株和过表达ARF6的转基因番茄受乙烯处理后的植株表型图；

图8 从左到右分别是野生型植株和过表达ARF8的转基因番茄受乙烯处理后的植株表型图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。实施例中所述原料如无特殊说明，即为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

实施例1

番茄基因ARF6和ARF8的启动子的克隆及GUS组织化学染色分析

（1）ARF6和ARF8基因启动子的克隆

采用CTAB法（RTG2405-01，中科泰瑞）提取番茄基因组DNA，根据SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的pARF8和pARF6启动子的核苷酸序列，设计引物pARF8-F、pARF8-R、pARF6-F和pARF6-R，以提取的基因组DNA为模板，以pARF8-F（正向引物）和pARF8-R（反向引物）为引物进行pARF8启动子的扩增，以pARF6-F（正向引物）和pARF6-R（反向引物）为引物进行pARF6启动子的扩增。

所述引物序列如下：

pARF8-F：5’-TTTACCATGTCCCTACCCTCT-3’

pARF8-R：5’-CTTTCTCCAAGACCTCCATT-3’

pARF6-F：5’-CGAGATCATTAAGATGTATTTTTGTG-3’

pARF6-R：5’-TCCCTCAAATCAACAAACTC-3’

PCR扩增体系：高保真扩增酶Prime STAR HS (R010A, TaKaRa) 0.25 μL，5×PrimeSTAR Buffer (Mg²⁺ Plus) 5 μL，正向引物(10μM) 0.5μL，反向引物(10μM) 0.5μL，模板（DNA）1μL，dNTP (2.5mM) 2μL，无菌ddH₂O补足至25μL。

反应程序：预变性95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，1min15s，35个循环；72℃,10min。

将得到的PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳分析，按照胶回收试剂盒（9672，Takara）纯化pARF8和pARF6启动子序列备用。

（2）利用TA克隆技术构建重组表达载体

用XcmI单酶切处理pCXGUS-P表达载体(Chen et al., 2009. A Versatile ZeroBackground T-Vector System for Gene Cloning and Functional Genomics. PlantPhysiology, 150:1111-1121.)，酶切后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收表达载体pCXGUS-P大片段。再将纯化的pARF8和pARF6启动子片段末端加A，然后利用TA克隆技术与表达载体pCXGUS-P大片段连接，最后将连接产物转化大肠杆菌DH5a，从含有卡纳霉素（100mg/L）的筛选LB培养板上挑取阳性克隆并进行PCR检测及测序验证，即得到重组表达载体pARF8-GUS和pARF6-GUS（图1）。

单酶切体系为：pCXGUS-P vector 5μL；XcmI 1μL；10XBuffer 2μL；无菌ddH₂O补足至20μL。37℃反应3h; 65℃, 20min。

加A反应体系：回收的pARF8或pARF6片段 100ng；dATP 0.25μL；A-overhangenzyme 0.25μL；10×Buffer 1μL；无菌ddH₂O补足至10μL；65℃反应40min。

连接反应体系：加A反应的产物3μL；Linearized vector (pCXGUS-P回收大片段)1-2μL；Solution I 5μL；无菌ddH₂O补足至10μL。16℃连接反应2h。

（3）重组表达载体的遗传转化和GUS染色分析

通过常规冻融法将构建的重组表达载体pARF8-GUS或pARF6-GUS转入农杆菌EHA105中，再通过农杆菌介导方法将pARF8-GUS或pARF6-GUS转入野生型番茄（Micro Tom），具体步骤如下：

1）转化材料的培养

将番茄组培苗在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为10000-12000lux的条件下培养30-40天后，选取长势良好的组培苗的叶片用于遗传转化。

2）转化

将含有pARF8-GUS或pARF6-GUS表达载体的农杆菌，接种于含有卡纳霉素（100mg/L）的液体LB培养基中，28℃，200rpm培养至OD600约为0.8～1.0之间，然后将培养好的菌液于4000rpm，离心5min，将收集的菌体用KCMS液体培养基稀释到OD600约为0.05-0.1之间；再放入待转化番茄组培苗的叶片，其中叶片切出伤口，农杆菌侵染大约20-30min；用灭菌滤纸吸干菌液，将叶片在KCMS固体培养基中暗培养2-3天。

3）初筛培养

将番茄叶片转移到含有15mg/L潮霉素和相应激素的初筛培养基ZR中，使侵染后的外植体（叶片）伤口处诱导出愈伤组织，随后诱导分化不定芽。2周更换一次新培养基。

4）生根培养

将外植体细胞分化出的不定芽切下，插入含有15mg/L潮霉素和相应激素的生根培养基ENR，再将其放入光照培养箱培养直至生根；当不定芽生根后，将其移栽到土里继续生长，即得到T0代转基因番茄植株，观察其表型变化。

5）转基因株系GUS组织化学染色鉴定

对转化有pARF8或pARF6启动子驱动的GUS转基因番茄进行组织化学染色分析。收集在土壤中生长3周和8周左右的新鲜转基因番茄叶片，用无菌水清洗干净，将其浸泡在含有0.2mM X-Gluc的GUS染色液中，37℃处理2h以上；取出幼苗，室温条件下，依次在30%、50％和75%的酒精中分别浸泡5-6h进行脱色处理；然后直接在显微镜下进行组织水平观察。GUS染色缓冲液含有50mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)、0.2％Triton X-100、2mM亚铁氰化钾和2mM铁氰化钾。

将番茄pARF8和pARF6分别导入pCXGUS-P载体中，番茄pARF8和pARF6与GUS标记基因融合，驱动GUS表达，通过对转基因植株叶片染色，可以观察GUS的表达情况，进而清楚的观察番茄ARF8和ARF6基因在叶片中的时空表达特异性。

染色结果如图2A所示，pARF8-GUS和pARF6-GUS均在番茄幼嫩时期的叶片中大量表达；如图2B所示，在已长大的成熟番茄植株中pARF8-GUS和pARF6-GUS主要在叶片维管组织即叶脉中大量表达；由此说明，ARF8和ARF6基因启动子可以驱动基因在植物叶片中表达，并且幼嫩时期更高，到成熟时期降低，暗示ARF8和ARF6基因参与调控叶片的形成和发育。

实施例2 番茄基因ARF6和ARF8的克隆及表达载体的构建

（1）ARF8和ARF6基因的克隆

取Micro Tom番茄叶片组织为材料，采用RNAiso Plus (9108,Takara)试剂盒和Recombinant DNase I（RNase-free）试剂盒（2270A，Takara），按说明书步骤提取总RNA，并用微量分光光度计测定RNA的浓度，备用。

取约2.0μg番茄总RNA，采用PrimeScript II first-strand cDNA synthesis kit(6210A, Takara)，并按照说明书步骤合成cDNA第一链。

根据番茄ARF8和ARF6基因序列，设计特异引物ARF8-F、ARF8-R、ARF6-F和ARF6-R，引物中引入In-fusion克隆载体接头序列和酶切位点序列。以合成的cDNA为模板，以ARF8-F（正向引物）和ARF8-R（反向引物）为引物进行基因ARF8的扩增，以ARF6-F（正向引物）和ARF6-R（反向引物）为引物进行基因ARF6的扩增。

所述引物序列如下：

ARF8-F：5’-GGACTCTAGAGGATCCATGAAGCTTTCAACATCAGG-3’；

ARF8-R：5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCGTAATCAAGTGATCCTATAG-3’；

ARF6-F：5’-GGACTCTAGAGGATCCATGAAGGTATCTACTTCTGGCTTC-3’；

ARF6-R：5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAGTACTCAAGTGATCCCAGAGG-3’

其中，ARF8-F和ARF6-F的加粗序列为BamHI酶切位点，ARF8-R和ARF6-R的加粗序列为SacI酶切位点。下划线处为In-fusion克隆载体接头序列。

PCR反应体系：高保真扩增酶PrimeSTAR HS (R010A, TaKaRa) 0.5μL，5xPrimeSTAR Buffer (Mg²⁺ Plus) 10μL，正向引物(10μM) 1μL，反向引物(10μM) 1μL，模板(cDNA) 1μL，dNTP (2.5mM) 4μL，无菌ddH₂O补足至50μL。

PCR反应条件：预变性95℃，5min；95℃，30s；56℃，40s；72℃，2min30s，35个循环；72℃, 10min。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。扩增得到的目的片段与预期片段大小相同，按照胶回收试剂盒（9672，Takara）的说明书步骤纯化回收ARF8和ARF6基因，即获得目的基因ARF8和ARF6的片段。

（2）构建重组表达载体pBI121-35S:ARF8-NOS/pBI121-35S:ARF6-NOS

分别用BamHI和SacI双酶切处理植物双元表达载体pBI121（Chen et al., 2003.Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloningT-DNA insertion from transgenic plants. Molecular Breeding, 11:287-293）。酶切体系为：pBI121 vector 5μL；BamHI 0.5μL；SacI 0.5μL；Buffer 10XM 1μL；无菌ddH₂O补足至20μL；37℃反应3h。酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收表达载体pBI121大片段。

利用无缝克隆技术（In-fusion HD Cloning Kit，Takara）构建番茄ARF8和ARF6基因的过量表达载体。

重组反应体系为：Purifed PCR fragment（回收的ARF8或ARF6片段）50ng；Linearized vector (pBI121 回收大片段)100ng；5X In-fusion HD Enzyme Premix 2μL；无菌ddH₂O补足至10μL。然后按照分子克隆实验指南将上述重组反应体系转化大肠杆菌DH5a，并涂布于含有卡纳霉素（100 mg/L）筛选培养板上，通过筛选和测序，获得正确的含ARF8或ARF6基因片段的重组表达载体pBI121-35S:ARF8-NOS/pBI121-35S:ARF6-NOS（图3），重组表达载体中目的基因ARF8或ARF6的5’端位于组成型强启动子P35S下游，它能使目的基因在植物体内高效表达；ARF8或ARF6的3’端组装有NOS终止子，可以有效终止目的基因的转录。在重组表达载体上组装有NPT-II基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用卡纳霉素进行转基因植株的筛选。在重组表达载体上组装有LB和RB序列，促使组装于其间的目的基因ARF8和ARF6的表达框架和筛选标记基因NPT-II整合至植物受体染色体上。

实施例3 农杆菌介导ARF8和ARF6基因转化及转基因阳性系筛选

通过常规冻融法将实施例2中构建的重组表达载体pBI121-35S:ARF8-NOS和pBI121-35S:ARF6-NOS分别转入农杆菌EHA105中，再通过农杆菌介导方法将它们转入野生型番茄（Micro Tom），具体步骤如下：

1）转化材料的培养

2）转化

将含有重组表达载体pBI121-35S:ARF8-NOS和pBI121-35S:ARF6-NOS的农杆菌，分别接种于含有卡纳霉素（100mg/L）的液体LB培养基中，28℃，200rpm培养至OD600约为0.8～1.0之间，然后将培养好的菌液于4000rpm，离心5min，将收集的菌体用KCMS液体培养基稀释到OD600约为0.05-0.1之间；再放入待转化番茄组培苗的叶片，其中叶片切出伤口，农杆菌侵染大约20-30min；用灭菌滤纸吸干菌液，将叶片在在KCMS固体培养基中暗培养2-3天。

3）初筛培养

将番茄叶片转移到含有50mg/L卡纳霉素和相应激素的初筛培养基ZR中，使侵染后的外植体（叶片）伤口处诱导出愈伤组织，随后诱导分化不定芽。2周更换一次新培养基。

4）生根培养

将外植体细胞分化出的不定芽切下，插入含有50mg/L卡纳霉素和相应激素的生根培养基ENR，再将其放入光照培养箱培养直至生根；当不定芽生根后，将其移栽到土里继续生长，即得到T0代转基因番茄植株，观察其表型变化。

5）鉴定转基因株系

从转基因T0代番茄中收取种子，继续播种，直到获得T2或T3代稳定株系。使用Takara试剂盒RNAiso Plus (9108, Takara)分别从野生型和转基因番茄叶片中提取总RNA，反转录成cDNA，以Ubiquitin基因为内参，通过半定量RT-PCR方法分析转基因株系与野生型中ARF8或ARF6基因的表达水平。以1μL 叶片cDNA为模板，PCR反应条件：预变性95℃，3min；95℃，30s；56℃，40s；72℃，2min，25，30或者35个循环；72℃, 10min。

检测Ubiquitin基因引物为：

Ubiquitin-F: 5'-CTAACGGGGAAGACGATCACCC -3'

Ubiquitin-R:5'-TCCCAAGGGTTGTCACATACATC -3'

检测目的基因引物为：

ARF8-F2：5’-ATGAAGCTTTCAACATCAGG-3’；

ARF8-R2：5’-GTAATCAAGTGATCCTATAG-3’；

ARF6-F2：5’-ATGAAGGTATCTACTTCTGGCTTC-3’；

ARF6-R2：5’-TTAGTACTCAAGTGATCCCAGAGG-3’

琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示，与野生型植株(WT)相比，转基因代表株系(OX-L1和OX-L2)中目的基因ARF8或ARF6的表达水平均显著上调，表明ARF8或ARF6已经导入番茄基因组并成功转录表达。

实施例4 转基因植株的叶片观察及ARF8对抗乙烯诱导的衰老验证

在温室中正常培养4个月的番茄表型观察如图5A和图6A所示，与野生型比较，转ARF8或ARF6基因番茄的叶片表现出更加深绿，并且野生型番茄叶片少部分已经开始变黄，开始衰老，而转ARF8或ARF6基因番茄的叶片仍然保持绿色。

采用常规生化方法，分别取转基因番茄和野生型各0.3g对应叶片，加碳酸钙粉和石英砂少许，加入3-5mL 95%乙醇，研磨至组织变白；漏斗过滤，用少量乙醇冲洗研钵几次，一并加入漏斗过滤；滤液最终定容至25mL。以95%乙醇作为对照组，在波长OD₆₆₃nm和OD₆₄₅nm处分别测吸光值。然后根据叶绿素含量计算方法（胡秉芬, 黄华梨, 季元祖, 赵晓芳, 戚建莉, 张露荷, 张广忠. 分光光度法测定叶绿素含量的提取液的适宜浓度. 草业科学,2018, 35(8): 1965-1974.），测定转基因番茄和野生型滤液中的叶绿素含量，结果如图5B和图6B所示。由图中可以看出，与野生型对照相比，转ARF6基因番茄株系中叶绿素的含量提高了约2.9倍和2.5倍；转ARF8基因番茄株系中叶绿素的含量提高了约3.8倍和3.2倍。因此表明，在转基因番茄中过表达ARF8或ARF6基因将明显提高叶片叶绿素含量。

进一步观察发现，在温室中正常生长5个月后，转ARF8或ARF6基因的番茄植株叶片部分开始变黄，其衰老起始时间比野生型叶片延迟了1个月以上；并且野生型番茄叶片在5个半月到6个月左右基本全部枯萎，而转ARF8或ARF6基因的番茄叶片可以延迟到7~8个月。因此表明，番茄ARF8或ARF6是限制番茄叶片衰老的重要调节因子。

乙烯是催化植物衰老的重要激素，我们将野生型番茄植株和转ARF8或ARF6基因番茄植株放入1个密闭且透明的容器中，通过注射器注入约50 ppm的乙烯气体，处理2h后将野生型植株和转基因番茄植株同时取出，正常培养2天后观察发现（图7和图8），野生型植株的叶片表现出明显的乙烯响应，包括叶片卷缩，叶片变黄并出现黑色斑点，然而转ARF8基因番茄植株的叶片没有明显改变，转ARF6基因番茄植株叶片仅有轻微卷缩。该实验证明，转ARF8和ARF6基因番茄植株具有对抗乙烯诱导衰老的明显作用；也进一步表明了番茄ARF8或ARF6是控制番茄叶片衰老的关键因子。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 长江师范学院；

<120> 与番茄叶片衰老相关的基因及其应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2535

<212> DNA

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 1

atgaagcttt caacatcagg aatgggtcag caagctcatg aaggagagaa caagtgtttg 60

aattcagaac tatggcatgc ttgtgctggt ccccttgttt gtctaccaac ggtagggagt 120

cgagtggttt actttcctca gggtcacagt gaacaggttg cggcgacaac taataaagaa 180

gtcgatattc acatacctaa ttacccgaac ttgccaccac agttgatctg tcaactccac 240

aatgtcacaa tgcatgcaga tgttgaaacg gatgaagtat atgctcagat gacattgcaa 300

cccttgacac tgcaagaaca aaaggacacg tatcttcctg ttgaattggg tattcctagc 360

aggcagccta ctaattattt ttgcaagaca ctcactgcaa gtgataccag tacgcatggc 420

ggcttttctg ttcctcgtcg tgctgcagag aaagttttcc ctcctttgga tttctcacag 480

acaccaccct gtcaagaatt aattgcgagg gatctgcatg acatcgaatg gaaattcagg 540

catattttcc gaggacagcc taagcggcat cttctgacga ctggctggag tgtgtttgtt 600

agtgctaaga gacttgttgc cggagattca gttcttttca tctggaatga gaaaaatcag 660

ctttttttgg gaattcgtcg tgcaactcga cctcagactg tgatgccatc atctgttctg 720

tctagcgaca gcatgcacat tggattactt gctgctgctg ctcatgctgc ctctaccaat 780

agctgtttca ttgttttctt taacccaagg gctagcccat ccgagtttgt tataccactt 840

tcaaaataca tcaaagctgt gtatcacaca cgtgtttctg ttggaatgcg tttccggatg 900

ctatttgaga ctgaagaatc aagtgttcga aggtacatgg gcacaattac tggcattggt 960

gacttagatc cagttcgctg ggccaactct cactggcggt ctgtcaaggt tggttgggat 1020

gagtcaacgg caggcgagag gcaacctagg gtttcactat gggagataga gcctttgact 1080

acttttccaa tgtatccatc tttgttccct cttaggctaa agcggccttg gtatccagga 1140

acttcatctt ttcaagaaaa taacagcgaa gctattaatg gaatgacatg gttgagaggg 1200

gaaagtagtg agcaaggacc acatctactg aatcttcaat cttttggtgg catgttcccc 1260

tggatgcaac aaagagttga tccaacaatg ctccgaaatg atcttaacca gcagtatcaa 1320

gctatgctgg ctagcggttt gcaaaatttt gggagcggag atctgatgaa acaacaactg 1380

atgcagtttc cacagcccgt ccaatatgtt cagcatgcag gcagtgttaa tcctcaactg 1440

cagcagcagc aacaacaaca agaaacaatg cagcagacaa ttcatcacca tatgttgcct 1500

gcacaaactc aagataacct tcaaaggcaa caacagcaac acgttagcaa tcagacagag 1560

gagcaatctc atcaacattc ttaccaggat gcgtaccaaa taccaaacag ccagctccag 1620

cagaagcaac catcaaatgt tccttctcca tcattttcaa agccagatat agcagatcca 1680

agctccaagt tctcggcatc cattgctcca tcaggcatgc caacagcgct gggttcttta 1740

tgttcggaag gaactactaa ctttttgaat ttcaatataa ttggtcagca gcctgtgatc 1800

atggagcagc agcagcagca gaaatcttgg atggcaaaat tcgcaaattc acaattgaac 1860

atgggctcca gttcaccctc tctctctgga tatgggaaag aaacttccaa ttcacaggaa 1920

acatgtagtc tagatgccca gaatcaatct ctttttggtg ctaatgttga ttcttcaggg 1980

cttctcctcc ctacaactgt gtctaacgtc gctactacat caattgatgc tgatatatcc 2040

tctatgccac tagggacttc tggatttccg aatcccttgt atagttatgt gcaagattct 2100

actgacttgt tgcataatgt agggcaagct gatgcacaaa ctgtgccccg tacatttgtc 2160

aaggtttaca aatcagcgtc ccttgggagg tcattggaca tcactcggtt caatagctat 2220

catgagctac gacaggaact tggacagatg ttcgggatcg aagggtttct tgaaaaccct 2280

caaagatcag gctggcagct tgtatttgtt gacagggaga atgatgtcct tctccttgga 2340

gacgatccgt gggaggaatt tgtcaataat gtttggtaca tcaaaattct ttcacccgag 2400

gatgtgcaga aactggggaa agaggaggtt ggatccctaa accgcggtcc acctgaaagg 2460

atgagcagta ataatagtgc tgatggtcga gatttcatgt ccggacttcc atctatagga 2520

tcacttgatt actga 2535

<210> 2

<211> 844

<212> PRT

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 2

MKLSTSGMGQ QAHEGENKCL NSELWHACAG PLVCLPTVGS RVVYFPQGHS EQVAATTNKE 60

VDIHIPNYPN LPPQLICQLH NVTMHADVET DEVYAQMTLQ PLTLQEQKDT YLPVELGIPS 120

RQPTNYFCKT LTASDTSTHG GFSVPRRAAE KVFPPLDFSQ TPPCQELIAR DLHDIEWKFR 180

HIFRGQPKRH LLTTGWSVFV SAKRLVAGDS VLFIWNEKNQ LFLGIRRATR PQTVMPSSVL 240

SSDSMHIGLL AAAAHAASTN SCFIVFFNPR ASPSEFVIPL SKYIKAVYHT RVSVGMRFRM 300

LFETEESSVR RYMGTITGIG DLDPVRWANS HWRSVKVGWD ESTAGERQPR VSLWEIEPLT 360

TFPMYPSLFP LRLKRPWYPG TSSFQENNSE AINGMTWLRG ESSEQGPHLL NLQSFGGMFP 420

WMQQRVDPTM LRNDLNQQYQ AMLASGLQNF GSGDLMKQQL MQFPQPVQYV QHAGSVNPLL 480

QQQQQQQETM QQTIHHHMLP AQTQDNLQRQ QQQHVSNQTE EQSHQHSYQD AYQIPNSQLQ 540

QKQPSNVPSP SFSKPDIADP SSKFSASIAP SGMPTALGSL CSEGTTNFLN FNIIGQQPVI 600

MEQQQQQKSW MAKFANSQLN MGSSSPSLSG YGKETSNSQE TCSLDAQNQS LFGANVDSSG 660

LLLPTTVSNV ATTSIDADIS SMPLGTSGFP NPLYSYVQDS TDLLHNVGQA DAQTVPRTFV 720

KVYKSASLGR SLDITRFNSY HELRQELGQM FGIEGFLENP QRSGWQLVFV DRENDVLLLG 780

DDPWEEFVNN VWYIKILSPE DVQKLGKEEV GSLNRGPPER MSSNNSADGR DFMSGLPSIG 840

SLDY 844

<210> 3

<211> 2643

<212> DNA

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 3

atgaaggtat ctacttctgg cttcaattct cagcctgagg aagcagggga gaagaaaagc 60

ctgaattcag agctgtggca tgcttgtgca gggccactgg tctctcttcc acatgtagga 120

accagagttg tgtattttcc tcaagggcat agtgagcagg ttgcggcatc cacaaacaag 180

gaattaaatg gtcatatccc tagctatcct ggattaccac ctcaacttat ttgtcagcta 240

cacaatgtga ccatggatgc agatgttgag actgatgaag tatatgctca aatgactctg 300

cagccactaa ctccacaaga gcaaaaagat gtgtgccttc taccagctga acttgggacc 360

ccaagtaaac aaccaagtaa ttatttctgc aaaacattga ctgcaagcga taccagtacc 420

catggtggat tctctgtccc tcgacgtgct gcagaaaaag ttttccctcc tctggattac 480

tcgcaacagc ctcctgtgca agagttgatt ggtaaagatc ttcatggaaa tgaatggaag 540

ttccggcata tatttcgcgg ccaaccaaag aggcatctcc tgacgacagg atggagtgtg 600

tttgtaagtg cgaagagact tgttgcaggc gactcagtta tctttatctg gaatgaaaat 660

aatcaattac ttttggggat acgacgtgcc aatcgtccgc aaactgtttt accttcctcg 720

gtattgtcaa gtgatagcat gcacattggt cttctagctg ctgcagctca tgcagctgca 780

acaaatagcc ggtttacaat atttttcaat ccaagggctt gtccatcaga atttgtcata 840

cctctcgcca agtatgctaa agcagtgtat catacgcgag tttctgttgg catgaggttc 900

cgaatgctat ttgaaacaga agaatcaagc atccgtaggt atatgggcac aattactggc 960

atcggtgatc tagatcctgt tcgttggcca aattctcatt ggcagtctgt aaaggttgga 1020

tgggatgaat caactgcagg ggagaggcag cctagagttt cactgtggga aattgaacct 1080

ctgacaacat ttccaatgta tccatctcct ttctccctta ggttgaagcg gccatggcca 1140

cctggactgc cttcatttcc tggtctatca aatggtgata tgactatgaa ttctcagctt 1200

ccatggctgc atggtggcat gggtgatcag gggatacaat cacttaattt ccagggattt 1260

ggtgttactc cattcatgca gccaaggttc gatgcttcta tgctaggttt gcagcctgac 1320

attttgcaag caatggcagc attagattct tctaagcttg caaatcagcc acttatgcag 1380

ttccaacata tccctagtac ttcagcatct tcgattcaga gccagctttt gcatccatcc 1440

aatttgcaac atactttcct ccaaggcctc ccggagaacc aactaatatc tcaggcacag 1500

atgctgcagc agcaattgca gtgccaccaa tcttataata ctcagcagca acagttgcag 1560

cgccagcaat tgtatcatga tcaacaactt caggaacccc atcaagtaca gcgtcaagat 1620

cagcagcaaa ccaaggctca attgtgttca gctactcagt cacagctttc tcatttacag 1680

gtcctaggtt caacgggttc tcaacaaaca ttttctgatt tagttggtca tcatattaat 1740

acatctaaca acagttccac catgcaaagt ctcctgagct cattttccca taatggagca 1800

tccacttccc tgaacatgtc tgagaccaac tccctagtgt ctccttcctc atcatcaaag 1860

cgaattgctc tagaatctca gatcccttca caagctccat acatggtgac acaggctgaa 1920

gttattacag tgcctaatac taaggtctca gatttttcca ctttgttttc accaaatcct 1980

ggcagacaag ttttggatta tcaagctgta gcagttagcc aaaacaatgc gctatttgga 2040

gttaacggta tgtcaaacct gaagggtaac agtccggaga acggatcttt acctgtgcct 2100

tatgctacct ctaccttcac aagtacagtg ggtagcgagt atcccgttaa ttcagacatg 2160

acgacatcaa gttgtgtaga tgaatcaggt gtcttgcagt cctcagaaaa tgtggatcaa 2220

gcaaactcac ttacagaaac ctttgttaag gtttacaaat cagagtcctt tggacgatca 2280

ctggatatct ccaaatttag cagctataat gagctgcgaa gtgagcttgc tcgcatgttt 2340

ggccttgaag gcctgttgga ggatcctgag agatcaggct ggcagcttgt attcgttgac 2400

cgtgagaatg atgttctcct ccttggtgat gacccctggc atgagtttgt gaacagtgtt 2460

tggtacatca agatactctc tccacttgaa gtgcagcaga tgggcaaaca gggcctcgac 2520

ctaccaagtg ctggcaaaac gcagaggatc actagcaatg gcaatggctg cgatgatttc 2580

atgaaccgga accattcgtg taatattatg aatgggatcc ctctgggatc acttgagtac 2640

taa 2643

<210> 4

<211> 880

<212> PRT

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 4

MKVSTSGFNS QPEEAGEKKS LNSELWHACA GPLVSLPHVG TRVVYFPQGH SEQVAASTNK 60

ELNGHIPSYP GLPPQLICQL HNVTMDADVE TDEVYAQMTL QPLTPQEQKD VCLLPAELGT 120

PSKQPSNYFC KTLTASDTST HGGFSVPRRA AEKVFPPLDY SQQPPVQELI GKDLHGNEWK 180

FRHIFRGQPK RHLLTTGWSV FVSAKRLVAG DSVIFIWNEN NQLLLGIRRA NRPQTVLPSS 240

VLSSDSMHIG LLAAAAHAAA TNSRFTIFFN PRACPSEFVI PLAKYAKAVY HTRVSVGMRF 300

RMLFETEESS IRRYMGTITG IGDLDPVRWP NSHWQSVKVG WDESTAGERQ PRVSLWEIEP 360

LTTFPMYPSP FSLRLKRPWP PGLPSFPGLS NGDMTMNSQL PWLHGGMGDQ GIQSLNFQGF 420

GVTPFMQPRF DASMLGLQPD ILQAMAALDS SKLANQPLMQ FQHIPSTSAS SIQSQLLHPS 480

NLQHTFLQGL PENQLISQAQ MLQQQLQCHQ SYNTQQQQLQ RQQLYHDQQL QEPHQVQRQD 540

QQQTKAQLCS ATQSQLSHLQ VLGSTGSQQT FSDLVGHHIN TSNNSSTMQS LLSSFSHNGA 600

STSLNMSETN SLVSPSSSSK RIALESQIPS QAPYMVTQAE VITVPNTKVS DFSTLFSPNP 660

GRQVLDYQAV AVSQNNALFG VNGMSNLKGN SPENGSLPVP YATSTFTSTV GSEYPVNSDM 720

TTSSCVDESG VLQSSENVDQ ANSLTETFVK VYKSESFGRS LDISKFSSYN ELRSELARMF 780

GLEGLLEDPE RSGWQLVFVD RENDVLLLGD DPWHEFVNSV WYIKILSPLE VQQMGKQGLD 840

LPSAGKTQRI TSNGNGCDDF MNRNHSCNIM NGIPLGSLEY 880

<210> 5

<211> 1847

<212> DNA

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 5

tttaccatgt ccctaccctc tatatataca aaatttttct taaattataa tacattattt 60

aagattaagt ttccatttta ataatctaaa tttaattttc acgcgtaaag tctttatcta 120

taattctaac tttttgaata ataaacttaa gtcgttatca tgtgttatgt gacagaaaaa 180

tgcatgtatc tccaacacat tctattgaat aattataaaa atctataaat gaatattaaa 240

ttgttcaagt ccagcacatt tacataataa tcttaaaaac gtgaataata aaataatata 300

caattataca agaataaata aaattaggaa taataatatt cacaaaaaaa tcaaataaca 360

cattaaaata tagcatgcta taggccaaat acataaacaa attcttaaac ttgttgggtt 420

ttttccctca ggtatctcaa ctacgtcatt ttcttattga atcattaaat tacccataat 480

ttgtttcgtt taaacaaaca ccattttccg atgtggaacc agatttgtga agggtattga 540

tagagaatat atatgttgtt ccagaactca ttagtccaat tgattataaa aatgttcgag 600

aataattgta ttttacttaa ttcatttgaa cacattagaa aacaaatgag actaacacga 660

tttgtcttta ttccttcaat caaaatcatt acaattcgaa cacaattaaa gatatttaca 720

atagaaaaac ggatcaaaat caaccaacaa tgttttaaag aaacaaataa tgattgatta 780

aatgattcaa tagaaaaatg acataattga agtacgtgag aaaaaaaccc tacaaattta 840

gagatctatt tatatatttg gcctatgcta taatatcata caagatgggg ttaggtttgt 900

catgtcataa atcgacaatg aatgcataaa atgatgataa gtcaatttaa cactaggaaa 960

aaaataaatc agtttgcatt cttttttgat cgatttatga aattatacta aatatataaa 1020

aattattagt aatatatata aaaataattt cgaataaaat gtattaccgt ttcactattt 1080

ttttcaactc tttctttcca tgtcgtgagt tcggaactta aataaataag ttaccgaaag 1140

ataaaagtaa atagtaactt attttgataa cttttatttt ttctaactta tttaggcttg 1200

gaactccttc ttcactcacc actaaagaat ataatgctga atgagattgt ttctctttta 1260

attattgata gagatttgag ttttgaatat gaaatattat tggcatagaa agtatgaata 1320

tgaatatcga atttcgaaaa aaaataatct ttcttccttg tttgtgtttg ttgatcatgt 1380

gcaaatattg tattggatgg tccgtactct gacaatgact attcaagaat ggtggcacat 1440

gccacttctg tcaaatccaa taccccacct caattcaatg gcgaagatca ttcatgtaca 1500

agtttcatca aacggctgtt gattgaagct tttctcccca aaaccccttt ctctgattga 1560

gtatactcct tatctttctc tctctgtttc ttgattttct ctctctactg tgattcaggt 1620

cgaacttggt cgggtgtgct ataaaaacag aaaaaagaac ctttctttat cactcactct 1680

ttcatagata gtgattgctc tcaactcaac ttctttttct tcatattcaa ctaaaaatca 1740

agaaaagggt agtgtttaga atttctgaaa cacttcaaaa acttgatctt ttttctttaa 1800

agctggtttt ggtgttttgg ggttgttaat ggaggtcttg gagaaag 1847

<210> 6

<211> 1900

<212> DNA

<213> 番茄（Micro Tom）

<400> 6

cgagatcatt aagatgtatt tttgtgtgaa taatcttcac catcacgttg tccacacaac 60

caccggccat caccaataac cacttcttag tggcagagtc agaaatttta ttaagggtat 120

ccaagaataa tggtgtttag ctgtcaatat tttttaaaaa attgtgatat ttcgggttca 180

aacctgaagc tccttcattc aataaacact cattaccatt gtgccaaaga cataactttt 240

gtcaagggtg tccaactatt aagtgtatat tctttaaata tagaatttaa catatatata 300

caacataatt ttcctatgac tcgagcaccc tcgaactgcc acctctgctt atcacaataa 360

caattgatgt ggccaatata aatcaccact atcagctata tttgtcatca caatcacttt 420

aacagccctt taccatatcc aattattacc gtcactctgt tagtcactaa atatttatca 480

ccttcatcgt tataattata ttcatggcca ccactatgag tgtcactaca tttatcaaac 540

acactcactg ttgcaaccaa tccctactaa gtactactaa ctatcacctt actcacaatt 600

aacaccacac caactaccac caacatcact gttatctgtc acacattctt cgtacatcat 660

ttattctaac actatatcaa tttctaacac caatccattt caccatcaca atcacaacac 720

tatatcaact tctaacaccg acccatttca ccatcacaat caccgtcatt actatcatat 780

cagtcactac aacactaaac atctccactg tcataattaa cacgcactaa ctatcatcaa 840

tcactacaca tatttcaaac accaccacca aatactagca atagccaact ccaccttcca 900

accaccatca atactattaa ctgttaccat cacacgtcag tcactataac atcaatcagc 960

tccgtcaaca tgatttttac tatccaccaa taaatttttt tattaaatta taatcttatt 1020

ctaaaattat atatatttaa tgattcgata tttgatactt agacatataa gataaatagt 1080

atcaaatggg aaatggagaa agcaatagta tgaaagggag actcactgac atagtcttct 1140

ttccacactt tgatacctca aaaacttcca agggaacttt ttttctgtca cattgtgaca 1200

catacctaaa agcttatagc tacaaacagc ctacaaaggc tatagtgttg tgtagtgcca 1260

taaatacggg ggaagaatta tataatatag tattatatat taatactaca atagagtagg 1320

aacaataaat tatacaagta gtactattac tagtaaagac taaaccagta gtttccctag 1380

attgagctaa cagttcagca atctatcact ttctataatc ttccttcaaa tcttttgagg 1440

gaccctcttt ctttctttac tgctttgaat acttgaacag agtctcactg aaaaaaaaag 1500

agaaagaaag atctgtacct aaaaagctgc ttgatttact gtgctttttt cctttagggt 1560

ttcaagattt tacttgggaa tttgaagatc tgttttagtt ttgatgtaat tagttggttc 1620

tgtagtttct ttggagaaaa gggtgttttc ttgatttttt ttcagtgatc taggacaagt 1680

atgaaggagc tgacattggt ggtgtttagt tgtggaagtg gggttggata agaaatatgt 1740

ttgcctgctt cttggttttt gtttagggtg gggggtgggg tgggggtggg gggtggcaga 1800

ctagtgctaa agttttcatc tttagctttc ttttagctct tttatatata gttggggctt 1860

ttccttttca acttttttgt gagtttgttg atttgaggga 1900

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tttaccatgt ccctaccctc t 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctttctccaa gacctccatt 20

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgagatcatt aagatgtatt tttgtg 26

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tccctcaaat caacaaactc 20

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggactctaga ggatccatga agctttcaac atcagg 36

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gatcggggaa attcgagctc gtaatcaagt gatcctatag 40

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggactctaga ggatccatga aggtatctac ttctggcttc 40

<210> 14

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gatcggggaa attcgagctc ttagtactca agtgatccca gagg 44

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctaacgggga agacgatcac cc 22

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tcccaagggt tgtcacatac atc 23

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atgaagcttt caacatcagg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gtaatcaagt gatcctatag 20

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atgaaggtat ctacttctgg cttc 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ttagtactca agtgatccca gagg 24

Claims

1.与番茄叶片衰老相关的基因，其特征在于，所述基因为ARF8或ARF6，所述ARF8和ARF6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示，或为在SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且同样与番茄叶片衰老相关的核苷酸序列。

2.与番茄叶片衰老相关的蛋白，其特征在于，由权利要求1所述基因ARF8编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或由权利要求1所述基因ARF6编码，其氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

3.含有权利要求1所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

4.根据权利要求3所述表达盒，其特征在于，自5’端到3’端依次包含启动子、由所述启动子启动表达的ARF8或ARF6基因，以及终止子；所述启动子为组成型表达的启动子或叶片组织特异性启动子，其控制基因在植株叶片组织中过表达。

5.如权利要求1所述基因在调控植物叶片衰老中的应用。

6.如权利要求1所述基因在提高植物叶片叶绿素含量中的应用。

7.如权利要求1所述基因在提高植物对抗乙烯诱导衰老中的应用。

8.根据权利要求5~7任一项所述应用，其特征在于，是将权利要求1所述基因导入目的植物中，在目的植物中过表达所述基因，提高目的植物中权利要求2所述蛋白的表达量和/或活性。

9.根据权利要求5~7任一项所述应用，其特征在于，所述植物为观叶草本植物。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述观叶草本植物为玉簪、红掌、细茎针茅、蓝羊茅、豆瓣绿或普通针毛蕨。