CN111285926A

CN111285926A - 植物耐逆性相关蛋白GmTGA17及其编码基因与应用

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Publication number: CN111285926A
Application number: CN201811390663.3A
Authority: CN
Inventors: 马有志; 徐兆师; 李波; 周永斌; 刘�英; 高媛; 陈明; 陈隽
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2038-11-21
Also published as: CN111285926B

Abstract

本发明公开了植物耐逆性相关蛋白GmTGA17及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列1所示的蛋白质；b)在序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列1所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。通过实验证明：本发明的GmTGA17可以提高植物的耐旱和耐盐性，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

Description

植物耐逆性相关蛋白GmTGA17及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种植物耐逆性相关蛋白GmTGA17及其编码基因与应用。

背景技术

土壤干旱和盐渍是影响植物生长和发育的重要环境因子。近些年来，由于气候变化和水资源的不断匮乏，干旱已经成为我国粮食生产正面临的严峻挑战。与此同时，我国粮食生产同时面临耕地面积减少和人口不断增加的挑战，面对我国农业生产的严峻形势，需要不断地更新农作物的品种来适应高温的威胁，才能有效地提高粮食的产量，满足日益增长的粮食需求。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。

在干旱和高盐等胁迫条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。

转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影响。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物耐逆性相关的蛋白。

本发明所提供的与植物耐逆性相关的蛋白来源于大豆属大豆(Glycine max)，名称为GmTGA17，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列1所示的蛋白质；

b)在序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列1所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质GmTGA17，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质GmTGA17可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质GmTGA17的编码基因可通过将序列2自5′端第419-1885位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明又提供了与GmTGA17蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的与GmTGA17蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码GmTGA17蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列2自5′端第419-1885位所示的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GmTGA17蛋白质的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码GmTGA17蛋白质的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GmTGA17的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GmTGA17的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GmTGA17且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码GmTGA17的核酸分子的表达盒(GmTGA17基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GmTGA17的DNA，该DNA不但可包括启动GmTGA17转录的启动子，还可包括终止GmTGA17转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子及豌豆rbcS E9终止子。

可用现有的表达载体构建含有所述GmTGA17基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

在本发明的具体实施例中，所述重组表达载体具体可为YEP-GAP-GmTGA17、16318hGFP-GmTGA17、pCAMBIA1302-GmTGA17、pCAMBIA3301-GmTGA17或pCAMBIA3301-GmTGA17-RNAi。

进一步的，所述YEP-GAP-GmTGA17为将GmTGA17基因插入YEP-GAP的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5'端第419-1885位核苷酸所示的DNA片段插入YEP-GAP的BamHI和XhoI酶切识别位点之间得到的重组质粒。所述16318hGFP-GmTGA17为将GmTGA17基因插入16318hGFP的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5'端第419-1885位核苷酸所示的DNA片段插入16318hGFP的BamHI酶切识别位点之间得到的重组质粒。所述pCAMBIA1302-GmTGA17为将GmTGA17基因插入pCAMBIA1302的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5'端第419-1885位核苷酸所示的DNA片段插入pCAMBIA1302的NcoI酶切识别位点之间得到的重组质粒。所述pCAMBIA3301-GmTGA17为将GmTGA17基因插入pCAMBIA3301的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5'端第419-1885位核苷酸所示的DNA片段插入pCAMBIA3301的NcoI和BstEII酶切识别位点之间得到的重组质粒。所述pCAMBIA3301-GmTGA17-RNAi为将GmTGA17基因干扰片段插入pCAMBIA3301的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列5所示的人工合成的DNA片段插入pCAMBIA3301的EcoRI和HindIII酶切识别位点之间得到的重组质粒。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供了GmTGA17蛋白质或上述生物材料的新用途。

本发明提供了上述GmTGA17蛋白质或上述生物材料在调控植物耐逆性中的应用。

上述应用中，所述调控为提高或降低。

本发明还提供了GmTGA17蛋白质或上述生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了GmTGA17蛋白质或上述生物材料在培育耐逆性降低的转基因植物中的应用。

本发明还提供了GmTGA17蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用。

上述GmTGA17蛋白质作为转录因子中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的GmTGA17蛋白质可调控含有TGACG顺式元件(核心序列：as-1)的基因的转录表达。

上述应用中，所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。所述提高植物耐旱性和/或耐盐性具体体现在如下(1)-(4)中任一种：(1)在干旱或盐处理下，提高植物根长；(2)在干旱或盐处理下，提高植物存活率；(3)在干旱或盐处理下，提高植物鲜重；(4)在干旱或盐处理下，提高植物根表面积。所述干旱处理为PEG处理或控水处理；所述PEG处理具体可为PEG6000处理；所述PEG6000处理的浓度具体可为9％或20％。所述盐处理为NaCl处理；所述NaCl处理的浓度具体可为75mM、150mM或200mM。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育耐逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中GmTGA17蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。

上述方法中，所述提高受体植物中GmTGA17蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达GmTGA17蛋白质。

上述方法中，所述过表达的方法为将GmTGA17蛋白质的编码基因导入受体植物；

所述GmTGA17蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列2自5'端第419-1885位所示的DNA分子。

在本发明的一个实施方式中，GmTGA17蛋白质的编码基因通过重组质粒pCAMBIA1302-GmTGA17导入受体植物中。所述重组质粒pCAMBIA1302-GmTGA17为在pCAMBIA1302载体的NcoI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5'端第419-1885位核苷酸所示的DNA片段后得到的载体。

在本发明的另一个实施方式中，GmTGA17蛋白质的编码基因通过重组质粒pCAMBIA3301-GmTGA17导入受体植物中。所述重组质粒pCAMBIA3301-GmTGA17为在pCAMBIA3301载体的NcoI和BstEII酶切位点之间插入了序列表的序列2自5'端第419-1885位核苷酸所示的DNA片段后得到的载体。

携带有所述编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

上述方法中，所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(4)中任一种：(1)转基因植物的根长长于受体植物；(2)转基因植物的根表面积大于受体植物；(3)转基因植物的存活率大于受体植物；(4)转基因植物的鲜重大于受体植物。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育耐逆性降低的转基因植物的方法。

本发明提供的培育耐逆性降低的转基因植物的方法包括降低受体植物中GmTGA17蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性低于所述受体植物。

上述方法中，所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。所述转基因植物的耐逆性低于所述受体植物体现在转基因植物的根长短于受体植物和/或转基因植物的根表面积小于受体植物。

上述方法中，所述降低受体植物中GmTGA17蛋白质的表达量和/或活性的方法是通过对所述受体植物中GmTGA17蛋白质的编码基因进行敲除或抑制或沉默表达来实现。

进一步的，所述沉默的方法是通过将GmTGA17干扰片段导入受体植物。

更进一步的，所述GmTGA17干扰片段如序列表的序列5所示。

在本发明的一个具体实施例中，所述GmTGA17干扰片段通过重组质粒pCAMBIA3301-GmTGA17-RNAi导入受体植物中，所述重组质粒pCAMBIA3301-GmTGA17-RNAi为在pCAMBIA3301载体的EcoRI和HindIII酶切位点之间插入序列5所示的DNA片段后得到的载体。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述GmTGA17基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法或应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥或大豆；所述拟南芥具体可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)，所述大豆具体可为Willimas82。

实验证明本发明的GmTGA17在干旱和盐诱导下表达，编码的蛋白定位到细胞核上，并且可以特异的调控含有TGACG顺式元件(核心序列：as-1)的基因的转录表达。本发明的GmTGA17可以提高植物的耐旱和耐盐性，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

附图说明

图1为GmTGA17受干旱和盐胁迫诱导表达的荧光实时定量(Real-time)PCR结果。A：干旱处理；B：NaCl处理。

图2为GmTGA17在拟南芥原生质体中的定位结果。A：16318hGFP空载体对照；B：GmTGA17定位于细胞核中。

图3为酵母单杂交系统证明转录因子体内结合特异性和激活特性的原理示意图。

图4为分子检测在转基因拟南芥中的目的基因。A：DNA水平检测目的基因；B：cDNA水平检测目的基因。其中，M为Marker，C为哥伦比亚生态型拟南芥Col-0，L1为GmTGA17-1转基因拟南芥，L2为GmTGA17-2转基因拟南芥，L3为GmTGA17-3转基因拟南芥，具有预期条带的为转基因植株。

图5为PEG和NaCl处理条件下的根长实验。A：处理前野生型与转基因植株；B：75mMNaCl处理8天后的野生型与转基因植株；C：9％(m/v)PEG处理8天后的野生型与转基因植株；D：野生型和转基因植株的总根长；E：野生型和转基因植株的鲜重。

图6为野生型和转基因拟南芥的耐旱和耐盐性鉴定。A：正常生长、控水2周和复水1周的野生型与转基因植株；B：正常生长和200mM NaCl处理10天后的野生型与转基因植株；C：干旱和高盐胁迫处理后，野生型与转基因拟南芥的存活率。

图7为大豆发根验证GmTGA17的耐旱和耐盐功能。A：正常生长、150mM NaCl和20％(m/v)PEG6000处理10天后，含转RNAi毛状根，转空载体毛状根和转GmTGA17毛状根的大豆植株地上部分表型；B：不同处理后，转RNAi毛状根，转空载体毛状根和转GmTGA17毛状根的表型；C：转RNAi毛状根，转空载体毛状根和转GmTGA17毛状根中的GmTGA17表达量的检测；D和E：不同处理条件下，转RNAi毛状根系，转空载体毛状根系和转GmTGA17毛状根系的总根长和根表面积的统计分析。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所使用的试剂配方如下：

表1、纤维素酶解液配方

表2、PEG4000溶液配方

表3、W5溶液配方

表4、MMG溶液配方

表5、WI溶液配方

YPD液体培养基：细菌培养用酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract)10g/L，细菌培养用胰化蛋白胨(Bacto-Peptone)20g/L，调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃以后加入40％的Glucose，使其终浓度为20g/L。

SD/His^-/Ura^-/Trp^-选择性培养基：不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogenbase)6.7g/L，营养缺陷型混合物(drop-out media without His/Ura/Trp)100mL，琼脂粉(Bacteriological agar)20g/L，调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃后加入40％Glucose，使其终浓度为20g/L。

营养缺陷型混合物(Drop-out mix)(10×)：L-Isoleucine(异亮氨酸)300mg/L，L-Valine(缬氨酸)1500mg/L，L-Adenine(腺嘌呤)200mg/L，L-Arginine(精氨酸)200mg/L，L-Histidine Hcl monohydrate(组氨酸)200mg/L，L-Leucine(亮氨酸)1000mg/L，L-LysineHcl(赖氨酸)300mg/L，L-Methionine(甲硫氨酸)200mg/L，L-Phenylalanine(苯丙氨酸)500mg/L，L-Threonine(苏氨酸)2000mg/L，L-Tyrosine(酪氨酸)300mg/L。

1×PEG/LiAc：50％PEG3350 8mL，10×TE buffer 1mL，10×LiAc 1mL。

10×TE Buffer：100mM Tris-Hcl，10mM EDTA，pH＝7.5，121℃高压灭菌，室温保存。

1×TE/LiAc：10×TE buffer 1mL，10×LiAc 1mL，ddH₂O 8mL。

Z Buffer：Na₂HPO₄·7H₂O 16.1g/L，NaH₂PO₄·H₂O 5.5g/L，KCl 0.75g/L，MgSO₄·7H₂O 0.246g/L，调节pH至7.0，121℃/15min灭菌，4℃保存。

X-gal储存液(X-gal Stock Solution)：用N,N-dimethyl-formamide(DMF)溶解X-gal，使其终浓度为20mg/mL，-20℃贮存。

含有X-gal的Z buffer缓冲液100mL：Z buffer 98mL，β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)0.27mL，X-gal储存液(X-gal stock solution)1.67mL。

10×LiAc：100mM Tris-Hcl，100mM EDTA，pH＝7.5。121℃高压灭菌、室温保存。

YEP-GAP记载于文献“Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，Abe H，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.Two transcription factors,DREB1and DREB2,with anEREBP/AP2DNA binding domain separate two cellular signal transductionpathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression,respectively,in Arabidopsis,Plant Cell 1998Aug；10(8):1391-1406”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

16318hGFP记载于文献“Feng Z J，He G H，Zheng W J，Lu P P，Chen M，Gong Y M，Ma Y Z，Xu Z S.Foxtail millet NF-Y families,genome-wide survey and evolutionanalyses identified two functional genes important in abioticstresses.Frontiers in Plant Science2015；6:1142”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pCAMBIA1302记载于文献“Zhao S P，Xu Z S，Zheng W J，Zhao W，Wang Y M，Yu TF，Chen M，Zhou Y B，Min D H，Ma Y Z，Chao S C，Zhang X H.Genome-wide analysis ofthe RAV family in soybean and functional identification of GmRAV03involvementin salt and drought stresses and exogenous ABA treatment.Frontiers in PlantScience 2017；8:905”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

pCAMBIA3301和大豆品种Williams 82记载于文献“Sun X J，Hu Z，Chen R，JiangQ Y，Song G H，Zhang H，et al.Target mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9system.Scientific Reports 2015；5:10342”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

农杆菌K599菌株记载于文献“Kereszt A，Li D X，Indrasumunar A，Nguyen C DT，Nontachaiyapoom S，Kinkema M，et al.Agrobacterium rhizogenes-mediatedtransformation of soybean to study root biology.Nature Protocols 2007April；2(4):948-952”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

实施例1、GmTGA17蛋白及其编码基因的获得及GmTGA17的表达特性分析

一、GmTGA17蛋白及其编码基因的获得

将沙土中生长14天左右的Williams 82大豆幼苗，用液氮速冻，-80℃保存备用。采用Trizol法(TianGen)提取小麦叶片总RNA，第一链cDNA合成用反转录酶XL(AMV)。采用SMART法合成ds cDNA。以大豆cDNA为模板，采用GmTGA17-F：ATGGCGAGCCACAGAATAGG-3'；GmTGA17-R：5'-GAAACTTGAGAAATAATTCTG-3'进行PCR扩增。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

通过5’RACE和3’RACE的方法获得GmTGA17基因，其开放阅读框架为序列表的序列2自5′端第419-1885位所示的核苷酸，GmTGA17基因编码的GmTGA17蛋白的氨基酸序列如序列表的序列1所示。

二、实时荧光定量PCR分析GmTGA17的表达特性

1、胁迫处理

取正常生长条件下的大豆幼苗(两片真叶即可)进行以下处理：

(1)干旱处理：将长势一致的土培的大豆幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，干旱处理1小时、3小时、6小时、12小时、24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(2)盐处理：将长势一致的土培的大豆幼苗取出，将根浸没在150mM NaCl溶液中，处理1小时、3小时、6小时、12小时、24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(3)对照处理：直接取未经任何处理的大豆幼苗-80℃冻存作为对照(0小时)。

2、mRNA的分离

采用Trizol法(TianGen)提取大豆叶片总RNA。

3、反转录为cDNA

将纯化的mRNA反转录为cDNA。

4、实时荧光定量PCR

将cDNA稀释50倍后用作Q-RT-PCR的模板。用基因3′端非编码区的特异引物对对样品进行Q-RT-PCR扩增，分析基因对各种处理的应答情况，以actin做内参。Q-RT-PCR在ABI

7000实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2^-ΔΔCT计算相对表达量。

ΔΔC_T＝(C_T.Target－C_T.Actin)_Time _x－(C_T.Target－C_T.Actin)_Time ₀。Time x表示任意时间点，Time ₀表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。

结果见图1。在干旱处理条件下，GmTGA17的表达量在1h时升高，在3h时降低，3h之后，表达量显著升高，12h时达到峰值，在处理24h时，表达量又开始缓慢回落(图1A)。在盐处理条件下，起初GmTGA17的表达量缓慢升高，在12h时达到峰值，在处理24h时，表达量又开始缓慢降低(图1B)。

实施例2、GmTGA17亚细胞定位分析

一、表达载体的构建

1、GmTGA17基因的克隆

根据GmTGA17基因的序列设计引物对(GmTGA17-16318hGFP-F和GmTGA17-16318hGFP-R)，引物末端分别引入BamHI酶切识别位点，以大豆cDNA为模板PCR扩增GmTGA17。引物序列如下：GmTGA17-16318hGFP-F：5'-TATCTCTAGAGGATCCATGGCGAGCCACAGAATAGG-3'；GmTGA17-16318hGFP-R：5'-TGCTCACCATGGATCCGAAACTTGAGAAATAATTCTG-3'。

PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用Agarose Gel DNA PurificationKit Ver.2.0回收纯化1.5Kb左右的条带。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶BamHI酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶BamHI酶切16318hGFP载体，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒16318hGFP-GmTGA17；

④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株(购自北京天根公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序。

测序结果表明：重组质粒16318hGFP-GmTGA17为在16318hGFP载体的BamHI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5'端第419-1885位核苷酸所示的DNA片段后得到的载体。

二、拟南芥原生质体的转化

1、土培室种植拟南芥。

2、生长良好情况下，在未开花前取叶片制备原生质体。

3、剪取中部生长良好的叶片，用刀片切成0.5-1mm宽的叶条。

4、将切好叶条放入预先配好的酶解液中(每5-10mL酶解液大约需10-20片叶子)。用镊子使叶子完全浸入酶解液。

5、真空泵于黑暗中(锡箔纸包裹)抽真空30分钟。此时可配制PEG4000溶液，200μl和1000μl枪头去尖，使操作时吸打缓和，PEG4000溶液一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100μl PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量。

6、在室温中无须摇动，继续黑暗条件下酶解至少3h(50rpm 28℃摇)。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。此时预冷一定量W5溶液。

7、显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50μm。

8、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。

9、先用W5溶液润湿35-75μm的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。

10、用30ml的圆底离心管100g，4℃离心1-2min，沉淀原生质体，尽量去除上清。然后用10ml冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。

11、在冰上静至原生质体30分钟。

以下操作在室温23℃下进行：

12、100g离心8-10min，使原生质体沉淀。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液(1m)重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。

13、加入10μl或者20μl DNA(10-20微克约5-10kb的步骤一制备的质粒DNA)至2mlEP管中。

14、加入100μl原生质体(2×10⁴个)，轻柔混合。

15、加入110μl PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合(每次大约可以转化6-10个样品)。

16、诱导转化混合物20-30min(转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更长转化时间)。

17、室温下用400-440μl W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好，以终止转化反应。

18、室温下100g离心2min，然后除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心2min去上清。

19、用1ml WI溶液轻柔重悬原生质体于多孔组织培养皿中。

20、室温下(20-25℃)诱导原生质体18小时以上。之后在激光共聚焦显微镜下观察GFP标签表达。

三、拟南芥原生质体镜检

将暗培养18h之后的原生质体压片，然后在激光扫描共聚焦显微镜(Bio-RadMicroRadiance)(Laser scanning confocal microscopy，LSMC)观察GFP(绿色荧光蛋白)荧光，并进行扫描照像。LSCM的工作参数为：Ex＝488nm，Em＝525±15nm，Power＝10％，Zoom7，中速扫描，Frame512×512。软件为TIME-COURSE和PHOTOSHOP5.0。结果见图2。结果表明：GmTGA17定位于细胞核中。

实施例3、GmTGA17的激活特性分析

用酵母单杂交系统证明转录因子的激活特性的主要原理如图3所示，将as-1和突变体as-1分别构建到pHISi-1载体和pLacZi载体的基本启动子Pmin(minimal promoter)上游，Pmin启动子下游连接报道基因(His3、LacZ和URA3)。当连接有编码转录因子的目的基因的表达载体YEP-GAP(不含激活功能)分别转化到连有as-1和突变体as-1的酵母细胞后，如果连有突变体as-1的酵母细胞中的报道基因不能表达，而连有特定的as-1的酵母细胞中的报道基因能够表达，说明该转录因子能与as-1结合，且具有激活功能，激活了Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了目的转录因子的体内结合特异性和激活功能。

一、重组表达载体的构建

1、GmTGA17基因的获得

根据GmTGA17基因的序列设计引物GmTGA17-BI和GmTGA17-XI，引物末端分别引入BamHI和XhoI酶切位点，以大豆cDNA为模板，PCR扩增获得GmTGA17基因。引物序列如下：GmTGA17-BI：5'-ATGGCGAGCCACAGAATAGGAG-3'；GmTGA17-XI：5'-TCAGAAACTTGAGAAATAATT-3'。

PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。采用Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.DV807A)回收纯化约1.5Kb左右的PCR产物。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物。

②用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切表达载体YEP-GAP，回收载体骨架。

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒YEP-GAP-GmTGA17。

④将步骤③的连接产物电击转化JM109菌株(购自Clontech公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序。

测序结果表明，重组质粒YEP-GAP-GmTGA17为在YEP-GAP的BamHI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5'端第419-1885位核苷酸所示的DNA片段后得到的载体。

二、GmTGA17的体内结合特异性和激活特性的验证

1、酵母报道子的构建

(1)正常双重酵母报道子的构建

DNA片段A(含3个as-1顺式元件)的核苷酸序列如下：5’-GAATTCCTGACGTAATGACGGGGTGACGATGACGCACTAGTCGAC-3'(序列3)。

将DNA片段A构建到pHis-1载体(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)的Pmin_HIS3启动子上游，得到重组载体pHis-1-as-1，用XhoⅠ和NcoⅠ将pHis-1-as-1载体切成线状。

将DNA片段A构建到pLacZi载体(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)P_CYCI启动子上游，得到重组载体pLacZi-as-1，用XhoⅠ和NcoⅠ将pLacZi-as-1载体切成线状。

先将线状pHis-1-as-1载体转化到酵母细胞(YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)内，获得能在SD/His^-培养基上正常生长的酵母转化子(Yeast transformant)。接着以这种酵母转化子为寄主细胞，继续转化含有3个重复as-1元件的pLacZi-as-1载体。这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的SD/His^-/Ura^-培养基上，选择获得含有pHis-1-as-1和pLacZi-as-1的正常双重酵母报道子。

(2)突变体双重酵母报道子的构建

DNA片段B(含3个mas-1元件)的核苷酸序列如下：5’-GAATTCCCTCCGTAATGGTGAGGTGATGCCGCGGGACTAGTCGAC-3'(序列4)。

用DNA片段B代替DNA片段A，方法同步骤(1)，得到突变体双重酵母报道子。

2、PEG/LiAc法转化酵母及结果分析

(1)接种酵母菌株(YM4271株系)到1ml YPD液体培养基中，剧烈震荡2分钟，分散团块后将悬浮液转至含有50mL YPD液体培养基的三角瓶中，30℃/250rpm摇过夜，测OD600＝1.7-1.8(计数约4×10⁷个/mL)。

(2)取30mL步骤(1)过夜培养物接到300mL新鲜的YPD培养基中，30℃/250rpm培养，约3小时(至OD600＝0.5±0.1)，室温1000g离心5min，收集菌体，弃上清，用1/2体积1×TE悬浮，1000g/5min离心。

(3)吸弃上清，用1.5mL新鲜配制的1×TE/LiAc溶液悬浮，振荡混匀备用。

(4)取出0.1mL酵母感受态进行转化，依次加入下列溶液：0.1μg YEP-GAP-GmTGA17、0.1mg ssDNA(鲑鱼精DNA，Sigma)、0.6mL PEG/LiAc高速振荡1分钟，30℃/200rpm振荡培养30分钟。

(5)加入70uL DMSO(sigma#D8779)，轻轻倒置混匀，42℃热激30分钟，其间轻轻振荡，冰浴2分钟，室温1000g离心5min。

(6)吸弃上清，加入0.5mL 1×TE buffer悬浮细胞。

(7)用接种环蘸取悬浮液，分别在含有0、10mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-选择性培养基上画线培养。

(8)平板的一半培养正常双重酵母报道子，另一半培养突变体双重酵母报道子，以便做对照分析。

(9)颠倒放置于培养箱中，30℃培养3-4天。

结果发现在0mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上正常的酵母报道子和突变的酵母报道子都有生长，但突变的酵母报道子的直径明显小；而在10mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上正常的酵母报道子能正常生长，但突变的酵母报道子被抑止没有生长。

3、半乳糖苷酶活性检测

(1)从0mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上分别挑取正常的酵母报道子和突变的酵母报道子菌落。转至YPD液体培养基中，于30℃振荡培养，待长至对数生长后期，取1.5mL菌液，3000rpm离心30s。

(2)弃上清，控干管中液体，将离心管置于液氮中速冻10min，取出使其自然融解，加50uL Z/X-gal溶液，30℃温育，结果发现正常的酵母报道子在6-8h内变蓝，而突变的酵母报道子在12h内没有变化，仍为白色。说明转录因子GmTGA17能与as-1结合，且具有激活功能，激活了Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了GmTGA17的体内结合特异性和激活功能。

实施例4、GmTGA17蛋白对拟南芥生长及耐逆性影响

一、重组表达载体的构建

1、GmTGA17基因的克隆

根据GmTGA17基因的序列设计引物对(GmTGA17-1302-F和GmTGA17-1302-R)，引物末端分别引入NcoI酶切识别位点，以大豆cDNA为模板PCR扩增GmTGA17。引物序列如下：GmTGA17-1302-F：5'-GGGACTCTTGACCATGATGGCGAGCCACAGAATAGGA-3'；GmTGA17-1302-R：5'-TCAGATCTACCATGGGAAACTTGAGAAATAATTCTG-3'。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶NcoI酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶NcoI酶切pCAMBIA1302载体，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒pCAMBIA1302-GmTGA17；

测序结果表明：重组质粒pCAMBIA1302-GmTGA17为在pCAMBIA1302载体的NcoI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5'端第419-1885位核苷酸所示的DNA片段后得到的载体。

二、转基因拟南芥的获得

1、用重组质粒pCAMBIA1302-GmTGA17转化农杆菌GV3101(北京博迈德生物技术有限公司)，得到重组农杆菌。

2、将步骤1获得的重组农杆菌接种于LB液体培养基(含50mg/mL利福平，100mg/mL卡那霉素，50mg/mL庆大霉素)中，28℃、300rpm培养约30小时。

3、将步骤2的菌液转至LB液体培养基(含50mg/mL利福平，100mg/mL卡那霉素，50mg/mL庆大霉素)中，28℃、300rpm培养约14小时(菌液OD600达到1.5-3.0)。

4、收集菌体，4℃、4000g离心10min，用含10％蔗糖MS液体培养基(含0.02％silwet)稀释至OD600约为0.8-1.0。

5、将野生型拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0，SALK公司)整株与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24h后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T₁代种子，卡那霉素筛选(浓度为50μg/L卡那霉素)阳性植株。T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。

6、对T₃代转基因植株在DNA水平和cDNA上进行鉴定。鉴定的引物序列如下：DNA水平鉴定的引物对：F：5'-ATTCACAGCCAGACCTGCAGC；R：5'-AGTCCACATGCCATTGATAAG-3'；预期条带为751bp；内参Actin基因引物对：F：5'-GAAATCACAGCACTTGCACC-3'；R：5'-AAGCCTTTGATCTTGAGAGC-3'；cDNA水平鉴定的引物对：F：5'-CCAAGAGCAGCCTCTTCACA-3'；R：5'-ATCCACGAACAAGCCCTGAG-3'；预期条带为265bp。

部分样本的鉴定结果见图4。DNA水平的鉴定结果表明，阴性对照水和受体材料中均没有检测到751bp的目的条带，在3个过表达转基因株系L1、L2和L3中均检测到751bp的目的条带。cDNA水平的鉴定结果表明，内参Actin基因在受体材料和过表达株系中均能检测到，而GmTGA17目的基因只有在3个过表达株系中才能检测到。上述在DNA和cDNA水平的检测结果均能证明外源GmTGA17已经整合到3个转基因拟南芥株系中，并选取T₃代阳性转GmTGA17拟南芥株系L1、L2和L3用于下述实验分析。

三、转空载体对照植物的获得

用质粒pCAMBIA1302转化农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，用重组农杆菌转化拟南芥，得到转空载体对照植株，方法同步骤二。

四、转GmTGA17拟南芥在干旱和盐胁迫条件下的根长试验

分别将T₃代阳性转GmTGA17拟南芥植株、T₃代转空载体对照植株和野生型拟南芥Col-0(WT)(各60株)进行根长试验。设置三次重复实验，结果取平均值。具体方法如下：在通过4℃一致处理3d的拟南芥对照植株、转空载体植株和转GmTGA17拟南芥植株萌发4d后，挑取生长状态一致的幼苗转移到含有75mM NaCl和9％(m/v)PEG6000的1/2MS培养基上竖直培养8d，观察表型、拍照并统计根长。同时以正常条件下生长的植株作为对照。

结果见图5。在NaCl处理条件下，野生型拟南芥Col-0的总根长为7.3cm，鲜重为22.9mg；转GmTGA17植株的总根长为10.2-10.6cm，鲜重为25.1-25.7mg。转空载体对照植株的表型与野生型拟南芥Col-0一致，根长和鲜重与野生型拟南芥Col-0没有显著差异。在PEG处理条件下，野生型拟南芥Col-0的总根长为2.2cm，鲜重为9.4mg；转GmTGA17植株的总根长为2.5-2.6cm，鲜重为10.4-10.6mg。转空载体对照植株的表型与野生型拟南芥Col-0一致，根长和鲜重与拟南芥Col-0没有显著差异。

五、转GmTGA17拟南芥的耐旱和耐盐性鉴定

为评价过表达GmTGA17拟南芥植株苗期耐旱和耐盐效果。将T₃代阳性转GmTGA17拟南芥植株、T₃代转空载体对照植株和野生型拟南芥Col-0(WT)(各60株)进行耐旱和耐盐性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。具体方法如下：在通过4℃一致处理3d的野生型拟南芥对照植株、转空载体植株和转GmTGA17拟南芥植株萌发7d后，移栽至营养土中，在正常生长条件下生长10d后，分别进行干旱和高盐处理。处理方法分别如下：

干旱处理：控水两周，然后复水恢复生长1周并统计存活率；

高盐处理：将生长有野生型拟南芥、转空载体植株和转GmTGA17拟南芥植株的花盆浸没在浓度为200mM NaCl溶液中处理10d，然后统计存活率。

同时以正常条件下生长的植株作为对照。

结果见图6。在干旱处理条件下，野生型拟南芥Col-0的存活率为51％，转GmTGA17拟南芥植株的存活率为77-85％。转空载体对照植株的表型与野生型拟南芥Col-0一致，存活率与野生型拟南芥Col-0没有显著差异。在高盐胁迫处理条件下，拟南芥Col-0的存活率为47％，转GmTGA17拟南芥植株的存活率为71-87％。转空载体对照植株的表型与野生型拟南芥Col-0一致，存活率与野生型拟南芥Col-0没有显著差异。

上述结果表明：GmTGA17可提高植物的耐旱性及耐盐性。

实施例5、GmTGA17蛋白对大豆耐逆性的影响

一、重组表达载体的构建

1、GmTGA17基因的克隆

根据GmTGA17基因的序列设计引物对(GmTGA17-3301-F和GmTGA17-3301-R)，引物末端分别引入NcoI和BstEII酶切识别位点，以大豆cDNA为模板PCR扩增GmTGA17。引物序列如下：GmTGA17-3301-F：5'-GACTCTTGACCATGATGGCGAGCCACAGAATAGG-3'；GmTGA17-3301-R：5'-TTCGAGCTGGTCACCTCAGAAACTTGAGAAATAAT-3'。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶NcoI和BstEII酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶NcoI和BstEII酶切pCAMBIA3301载体，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒pCAMBIA3301-GmTGA17；

测序结果表明：重组质粒pCAMBIA3301-GmTGA17为在pCAMBIA3301载体的NcoI和BstEII酶切位点之间插入了序列表的序列2自5'端第419-1885位核苷酸所示的DNA片段后得到的载体。

二、RNAi干扰载体的构建

1、RNAi干扰片段的获得

根据RNAi干扰的原理，人工合成了一段包含序列表的序列2自5'端第968-1167位核苷酸所示的DNA片段、序列5自5'端第210-333位核苷酸所示的DNA片段和序列2自5'端第968-1167位核苷酸所示的DNA片段的反向互补片段(委托北京博迈德生物技术有限公司合成)。合成序列末端分别引入EcoRI和HindIII酶切识别位点。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切pCAMBIA3301载体，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒pCAMBIA3301-GmTGA17-RNAi；

测序结果表明，重组质粒pCAMBIA3301-GmTGA17-RNAi为在pCAMBIA3301载体的EcoRI和HindIII酶切位点之间插入序列5所示的DNA片段后得到的载体。

三、转基因毛状根的获得

1、农杆菌转化

①将-80℃保存的农杆菌K599菌株重新活化，28℃，200rpm培养菌液OD₆₀₀至0.6-1.0；

②吸取1ml活化的菌液于40ml含链霉素(50mg/l)的LB培养基中，28℃，200rpm培养菌液OD₆₀₀至0.6左右。

③将菌液转移到灭菌的50ml离心管中，插入冰内，冰浴30min后，5000rpm离心5min，弃上清。

④用2ml经灭菌的20mM的CaCl₂重悬菌体，混匀后按每管200μl分装。液氮速冻后，置于-80℃保存。

⑤分别向新制备的200μl农杆菌感受态中加入4μl(约2μg)的步骤一中的重组表达载体和步骤二制备的RNAi干扰载体，冰浴5min后，液氮冷冻8min，在迅速置于37℃水浴5min。

⑥之后向每管中加入600μl不含抗生素的LB培养基，28℃，200rpm摇床上培养4-6h。

⑦5000rpm离心2min，去除部分上清，使每管内留有100-200μl液体，用移液枪悬浮液体，然后均匀地涂有Kan(50mg/l)和Str(50mg/l)的LB固体培养基上，28℃条件下，倒置培养至单菌落长出。

⑧挑取单菌落，扩大培养，筛选得到阳性菌落。

⑨将Willimas82大豆种子均匀播种于高温高压灭菌的蛭石内，添加适量营养液，高湿条件下培养至大豆子叶形成(约5d左右)。在播种大豆的同时将转化含有目标基因表达载体的农杆菌K599活化后，在含有Kan(50mg/l)与Str(50mg/l)抗性的固体培养基上，28℃培养至菌落长出。

⑩用1ml注射器针头挑取农杆菌菌落，在大豆子叶节处注射。高温、高湿条件下培养，直至大豆毛状根长出，此过程需半月左右，得到转GmTGA17毛状根和转RNAi毛状根。

三、转空载体对照毛状根的获得

将质粒pCAMBIA3301转化农杆菌K599菌株，得到重组农杆菌，用重组农杆菌注射Willimas82大豆子叶节，得到转空载体毛状根，方法同步骤二。

四、转基因毛状根的鉴定

在cDNA水平上检测转GmTGA17毛状根、转RNAi毛状根及转空载体毛状根中目的基因的表达量。引物序列如下：内参CYP2基因引物对：F：5'-ACCAGAATTGCATTACCAGTTGA-3'；R：5'-GGTGCCGAGACTCATGAAGATAT-3'；目的基因引物对：F：5'-CCAAGAGCAGCCTCTTCACA-3'；R：5'-ATCCACGAACAAGCCCTGAG-3'。

结果见图7C。与转空载体毛状根系中GmTGA17的表达量相比，转GmTGA17毛状根系中的GmTGA17的表达量升高了3.43倍，而转RNAi毛状根系中，GmTGA17表达量降低了大约0.5倍。选取阳性转GmTGA17毛状根、转RNAi毛状根用于下述实验分析。

五、转GmTGA17毛状根和转RNAi毛状根的耐旱和耐盐性鉴定

为评价转GmTGA17毛状根、转RNAi毛状根的耐旱和耐盐效果。将转GmTGA17毛状根、转RNAi毛状根及转空载体毛状根(各100株)进行耐旱和耐盐性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。具体步骤如下：将只含有转GmTGA17毛状根的植株(过表达)、只含有转RNAi毛状根的植株(干扰)及只含有转空载体毛状根的植株(空载)移栽至营养土中，正常生长10天后，分别用质量分数为20％的PEG6000水溶液和浓度为150mM NaCl水溶液进行单次浇灌处理，处理10天后观察表型、拍照并对部分根系参数统计分析。

结果见图7。结果表明：只含有转RNAi毛状根的植株对PEG和NaCl胁迫表现最敏感，叶片最早出现萎蔫、干枯；其次是只含有转空载体毛状根的植株；只含有转GmTGA17毛状根的植株对PEG和NaCl胁迫处理最不敏感(图7A和图7B)。总根长和根表面积参数的分析结果也表明，只含有转RNAi毛状根的植株对PEG和NaCl胁迫处理最敏感，其次是只含有转空载体毛状根的植株和只含有转GmTGA17毛状根的植株。其中，在PEG处理条件下，只含有转GmTGA17毛状根的植株、只含有转空载体毛状根的植株和只含有转RNAi毛状根的植株的总根长分别是144.87cm、116.82cm和91.40cm，相对应的根表面积分别是14.23、12.34和10.02cm²。在NaCl处理条件下，只含有转GmTGA17毛状根的植株、只含有转空载体毛状根的植株和只含有转RNAi毛状根的植株的总根长分别是133.91cm、107.05cm和92.13cm，相对应的根表面积分别是13.66cm²、12.55cm²和11.10cm²。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>植物耐逆性相关蛋白GmTGA17及其编码基因与应用

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>488

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

Met Ala Ser His Arg Ile Gly Glu Leu Gly Leu Ser Glu Ser Gly Pro

1 5 10 15

Ser Ser His His Ile Pro Tyr Gly Val Leu His Gly Ile Asn Thr Pro

20 25 30

Ala Ser Ser Leu Ile Asn Gln Gly Ser Ala Phe Asp Phe Gly Glu Leu

35 40 45

Glu Glu Ala Ile Val Leu His Gly Val Lys Gly Arg Asn Asp Glu Gly

50 55 60

Lys Ala Ser Leu Phe Thr Ala Arg Pro Ala Ala Thr Leu Glu Met Phe

65 70 75 80

Pro Ser Trp Pro Met Arg Phe Gln Gln Thr Pro Arg Val Gly Ser Lys

85 90 95

Ser Gly Gly Glu Ser Thr Asp Ser Gly Leu Ser Ser Lys Thr Glu Pro

100 105 110

Pro Phe Glu Ala Glu Ser Pro Ile Ser Lys Lys Ala Ser Ser Ser Asp

115 120 125

His His Gln Ala Phe Asp Gln Gln His Leu Gln His Arg Gln Gln Leu

130 135 140

Gln Gln Glu Met Ala Ser Asp Ala Pro Arg Ala Ala Ser Ser Gln Asn

145 150 155 160

Gln Ser Ala Ala Lys Ser Pro Gln Glu Lys Arg Lys Gly Ala Gly Ser

165 170 175

Thr Ser Asp Lys Pro Leu Asp Ala Lys Thr Leu Arg Arg Leu Ala Gln

180 185 190

Asn Arg Glu Ala Ala Arg Lys Ser Arg Leu Arg Lys Lys Ala Tyr Val

195 200 205

Gln Gln Leu Glu Ser Ser Arg Leu Lys Leu Asn Gln Ile Glu Gln Glu

210 215 220

Leu Gln Arg Ala Arg Pro Gln Gly Leu Phe Val Asp Cys Gly Gly Val

225 230 235 240

Gly Ser Thr Val Ser Ser Ala Gly Ala Ala Met Phe Asp Met Glu Tyr

245 250 255

Ala Arg Trp Leu Glu Glu Asp His Arg Leu Met Gly Glu Leu Arg Asn

260 265 270

Gly Leu Gln Ala Pro Leu Ser Asp Ser Asp Met Arg Val Met Val Asp

275 280 285

Gly Tyr Leu Ser His Tyr Asp Glu Ile Phe Arg Leu Lys Gly Val Ala

290 295 300

Ala Lys Ser Asp Val Phe His Leu Ile Asn Gly Met Trp Thr Ser Gln

305 310 315 320

Ala Glu Arg Cys Phe Leu Trp Ile Gly Gly Phe Arg Pro Ser Asp Leu

325 330 335

Ile Met Met Leu Ile Gln Gln Leu Glu Pro Leu Ala Glu Gln Gln Ile

340 345 350

Met Gly Met Tyr Gly Leu Lys His Ser Ser Gln Gln Ala Glu Glu Ala

355 360 365

Leu Ser Gln Gly Leu Glu Gln Leu Gln Gln Ser Leu Val Asp Thr Ile

370 375 380

Ala Gly Gly Pro Val Val Asp Gly Val Gln Gln Met Val Val Ala Met

385 390 395 400

Ser Lys Leu Ala Asn Leu Glu Gly Phe Val Arg Gln Ala Asp Asn Leu

405 410 415

Arg Gln Gln Thr Leu His Gln Leu Cys Arg Leu Leu Thr Val Arg Gln

420 425 430

Ala Ala Arg Cys Phe Ile Val Ile Gly Glu Tyr Tyr Gly Arg Leu Arg

435 440 445

Ala Leu Ser Ser Leu Trp Ala Ser Arg Pro Arg Glu Thr Leu Ile Asn

450 455 460

Asp Asp Asn Ser Cys Gln Thr Thr Thr Glu Met Gln Ile Val Gln His

465 470 475 480

Ser Gln Asn Tyr Phe Ser Ser Phe

485

<210>2

<211>2201

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

taagaagccc cacaagtcca aactccaaag agagcatgag acaagttttg ctgggacaac 60

atcttgggta ccacagaatg agtttctcaa tctgaaatat tttttcaact agggacagcc 120

ataaagcaag ccaaacagac taatcactca ggtttcttca ttgagaagga gaaaagaaag 180

agaaagagac accccatgaa agataaaata aaaagttgca aagaggatca tatctgagaa 240

aaagactgga ccctctcttg tgccaactta caacatagat tagatattac tttgacaaga 300

aagccttgat ctttctcccc tctatgacct tctcaatata gacttgtatt tatccctaaa 360

acacacatag aggtaagctt cagggaagat gataatggtc taaaaataaa agctttgcat 420

ggcgagccac agaataggag aacttggttt gtctgagtca ggaccttcaa gtcaccacat 480

cccttatgga gtgcttcacg gaattaacac tcctgcatca agcttaatca atcaaggatc 540

tgcttttgat tttggggagc tggaggaagc aattgttctg catggagtta agggtagaaa 600

tgatgagggc aaagcatctt tattcacagc cagacctgca gctacactgg aaatgttccc 660

ttcatggcca atgagattcc agcaaacccc aagagttggt tcaaagtcag gaggagaaag 720

cactgattca ggtctctcta gcaaaactga gccccccttt gaggcagaat ctcccataag 780

taaaaaggca tcttcttcag atcatcatca ggcttttgat cagcagcatc tgcagcatag 840

acagcaactt caacaggaga tggcaagtga tgccccaaga gcagcctctt cacagaatca 900

atcagcagcc aaatcacctc aagaaaagag aaagggagct ggttctacat cagacaaacc 960

acttgatgca aagacattga gacgtttggc tcaaaacaga gaggctgcaa ggaaaagccg 1020

tctgaggaaa aaggcttatg tgcagcaact agagtcaagt agattaaagc ttaaccagat 1080

agaacaagaa cttcaaagag cacgccctca gggcttgttc gtggattgtg gtggtgttgg 1140

aagtactgta agctcggcag gagccgcaat gtttgacatg gaatatgcaa gatggttaga 1200

agaagatcac agactaatgg gggagctgag gaacgggttg caagcaccgt tatcagacag 1260

tgatatgaga gtgatggtgg atggatatct ttctcactat gatgagattt tcaggctcaa 1320

gggtgtggct gctaaatctg atgtcttcca ccttatcaat ggcatgtgga cttcccaagc 1380

tgaacgttgt ttcctctgga ttggtggttt tagaccctct gatctcatca tgatgctgat 1440

tcagcagttg gagccactag ctgagcaaca gataatgggg atgtatggcc tgaagcattc 1500

ctcacagcaa gcagaagaag cactctctca gggacttgag cagttgcagc agtcacttgt 1560

ggacaccata gctggaggcc cagtggttga tggtgttcaa caaatggtcg ttgccatgag 1620

caagcttgcc aatcttgaag gttttgttcg ccaggctgat aatttgaggc agcaaactct 1680

tcatcagcta tgtcgattac tcacagttcg tcaagcagca cgatgcttta ttgttattgg 1740

agagtactat ggacgtcttc gtgcccttag ttctctttgg gcatcaagac cacgagagac 1800

cttgatcaac gacgataact catgccaaac aactacggaa atgcaaatag tccaacattc 1860

tcagaattat ttctcaagtt tctgagagat gtaattaaaa cccattagcc tgaaagaagt 1920

ttgctcgcca taattaaggg gatttcgttg ggctgcttta caaatgaatg tcagcgtctt 1980

cctaaaagaa aaatatttat ttattttttc ttttcaatct tctatgctcc cttgtgtctt 2040

tatgttttat tgtaaatgta aatctagttt ttatgtgcat gatgaggaag ctcctacttt 2100

agctgaagag aaatagaaaa aaaaaaaaac agtttatgag aaggtgcttg tggcatggat 2160

gtagataaag tatccataca attgactcta tcttctagtt a 2201

<210>3

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

gaattcctga cgtaatgacg gggtgacgat gacgcactag tcgac 45

<210>4

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

gaattccctc cgtaatggtg aggtgatgcc gcgggactag tcgac 45

<210>5

<211>542

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

ccggaattct gcaaagacat tgagacgttt ggctcaaaac agagaggctg caaggaaaag 60

ccgtctgagg aaaaaggctt atgtgcagca actagagtca agtagattaa agcttaacca 120

gatagaacaa gaacttcaaa gagcacgccc tcagggcttg ttcgtggatt gtggtggtgt 180

tggaagtact gtaagctcgg caggagccgg taattattct tcaataatag tatcatctcc 240

taatcctatt aacttttcag gctcttaaga aggaactaat atgcttggtt tgtgttgatt 300

ttaatttaaa ctgttttttg ttttgtttct tagcggctcc tgccgagctt acagtacttc 360

caacaccacc acaatccacg aacaagccct gagggcgtgc tctttgaagt tcttgttcta 420

tctggttaag ctttaatcta cttgactcta gttgctgcac ataagccttt ttcctcagac 480

ggcttttcct tgcagcctct ctgttttgag ccaaacgtct caatgtcttt gcaaagcttg 540

gg 542

Claims

1.蛋白质，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列1所示的蛋白质；

2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)所示的基因：

1)其编码序列是序列2自5’端第419-1885位所示的DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的DNA分子。

4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在培育耐逆性降低的转基因植物中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白质作为转录因子中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在植物育种中的应用。

5.一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性；

或，所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(4)中任一种：

(1)转基因植物的根长长于受体植物；

(2)转基因植物的根表面积大于受体植物；

(3)转基因植物的存活率大于受体植物；

(4)转基因植物的鲜重高于受体植物。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达权利要求1所述的蛋白质；

或，所述过表达的方法为将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体植物；

或，所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列2自5’端第419-1885位所示的DNA分子。

8.一种培育耐逆性降低的转基因植物的方法，包括降低受体植物中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性低于所述受体植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性；

或，所述转基因植物的耐逆性低于所述受体植物体现在转基因植物的根长短于受体植物和/或转基因植物的根表面积小于受体植物。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述降低受体植物中权利要求1所述的蛋白质的表达量和/或活性的方法是通过对所述受体植物中权利要求1所述的蛋白质的编码基因进行敲除或抑制或沉默表达来实现。