CN114133437A - 蛋白质GmDREB7及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蛋白质GmDREB7在调控植物抗逆性中的应用，蛋白质GmDREB7的氨基酸序列如序列表中序列2所示。实验证明，在野生型拟南芥中过表达GmDREB7基因可以提高拟南芥的耐盐性，耐盐性提高表现为叶片持绿，其叶绿素含量升高，膜渗透性降低；在野生型二穗短柄草中过表达GmDREB7基因可以提高二穗短柄草的耐盐性，耐盐性提高表现为叶片持绿，其叶绿素含量升高，膜渗透性降低。蛋白质GmDREB7可以调控植物的抗逆性。本发明具有重要的应用价值。

Description

蛋白质GmDREB7及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质GmDREB7在调控植物抗逆性中的应用。

背景技术

干旱、高盐、低温等逆境是影响植物生长的主要非生物胁迫。在逆境条件下植物体会产生一系列应答反应，引起许多生理生化及发育上的变化。目前，已有许多与抗逆相关的基因被克隆并整合到作物中，提高作物的抗逆性。基因工程已成为作物抗逆改良的新途径。明确作物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学依据。

抗逆相关的转录因子的研究近年来日益受到重视，在这一类转录因子中，研究最多的是干旱应答元件结合蛋白(dehydration responsive element binding protein，DREB)。DREB属于AP2/EREBP转录因子家族，它能特异结合启动子中含有 DRE/CRT顺式元件，激活许多逆境诱导基因的表达，增强植物对逆境的忍耐力。

在干旱、高盐和低温等胁迫的逆境条件下，植物能够在细胞、分子和整体水平上做出相应的对抗性调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害,增强对胁迫环境的抗性。

干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响植物生长、发育的障碍因子。因此，了解植物对逆境条件的应答与信号传导机制，从而提高植物品种的抗逆性，成为植物遗传研究及品种改良的重要方向之一。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，利用生物手段提高植物的抗逆性。

为实现上述目的，本发明一方面提供了蛋白质GmDREB7在如下S1)和/或S2) 中的应用：

S1)调控植物抗逆性；

S2)培育抗逆性改变的转基因植物。

所述应用中，所述蛋白质GmDREB7为如下任一所示蛋白质：

a1)氨基酸序列为是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)将是序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆相关的蛋白质；

a3)与a1)或a2中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、90％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

a4)在是a1)或a2)或a)所限定的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc 标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述a2)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

本发明另一方面还提供了编码所述蛋白质GmDREB7的核酸分子在如下S1)和 /或S2)中的应用：

S1)调控植物抗逆性；

S2)培育抗逆性改变的转基因植物。

上述应用中，所述编码所述蛋白质GmDREB7的核酸分子为如下b1)或b2)或 b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b3)与b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权所述蛋白质GmDREB7的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质GmDREB7的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由669个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质GmDREB7的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质GmDREB7的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质GmDREB7，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质GmDREB7的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述任一所述的应用中，所述调控植物抗逆性可为增加植物抗逆性。

上述任一所述的应用中，所述“培育抗逆性改变的转基因植物”可为培育抗逆性增加的转基因植物。

上述任一所述的应用中，所述抗逆性为抗旱性和/或耐盐性/或耐低温性，所述抗旱性指对抗失水逆境的能力；所述耐盐性指对盐胁迫的耐受能力；所述耐低温性指对低温胁迫的耐受能力。

进一步的，所述抗逆性为耐盐性。

本发明再一方面提供了一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：提高出发植物中所述蛋白质GmDREB7的表达量和/或活性，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的抗逆性增加。

上述方法中，所述“提高出发植物中所述蛋白质GmDREB7的表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到提高出发植物中上述任一所述蛋白质GmDREB7的表达量和/或活性的效果。

所述方法中所述“提高出发植物中所述蛋白质GmDREB7的表达量和/或活性”通过向出发植物中导入编码所述蛋白质GmDREB7的核酸分子实现。

上述方法中，所述“向出发植物中导入编码所述蛋白质GmDREB7的核酸分子”可通过向出发植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码所述蛋白质GmDREB7的核酸分子，得到的重组质粒。

在本发明的一个具体实施方案中，所述重组质粒为pCAMBIA1300-GmDREB7。所述重组质粒pCAMBIA1300-GmDREB7具体可为向pCAMBIA1300载体的限制性内切酶Xba I的识别序列之间插入序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重组质粒。

所述转基因植物具体可为35S：：GmDREB7#5、35S：：GmDREB7#6和35S：： GmDREB7#11。此时出发植物为拟南芥，具体为野生型拟南芥Columbia-0亚型。

在本发明的另一个具体实施方案中，所述重组质粒为pTCK303-GmDREB7。所述重组质粒pTCK303-GmDREB7具体可为向pTCK303载体的限制性内切酶Spe I和 Kpn I酶切识别序列之间插入序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重组质粒。

所述转基因植物具体可为Ubi：：GmDREB7#2、Ubi：：GmDREB7#7和35S：： Ubi：：GmDREB7#7。此时出发植物为二穗短柄草野生型种子。

本发明又一方面提供了一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质GmDREB7的含量和/或活性，从而增加抗逆性。

上述任一方法中，所述抗逆性为耐盐性。

在本发明的一些具体实施方案中，所述增加耐盐性可表现为叶片持绿，其叶绿素含量升高，膜渗透性降低。

上述任一所述植物为双子叶植物或单子叶植物；

进一步的，所述植物为禾本科植物或十字花科植物；

再进一步的，所述植物为二穗短柄草或拟南芥；

更进一步的，所述植物为野生型二穗短柄草品种Bd21或野生型拟南芥 Columbia-0亚型。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

本发明通过实验证明，在野生型拟南芥中过表达GmDREB7基因可以提高拟南芥的耐盐性，转GmDREB7拟南芥在盐胁迫下表现出叶片持绿，其叶绿素含量升高，膜渗透性降低。在二穗短柄草中过表达GmDREB7基因可以提高二穗短柄草的耐盐性，转GmDREB7基因二穗短柄草的在盐胁迫下表现出叶片持绿，其叶绿素含量升高，膜渗透性降低。证明蛋白质GmDREB7可以调控植物的抗逆性，为培育抗拟植物新品种提供了新的选择，具有较好的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1中步骤2获得的GmDREB7基因PCR扩增产物；

图中：M：DL2000；1：PCR扩增GmDREB7基因；

图2为GmDREB7蛋白在洋葱表皮细胞中的定位；

图中：A：融合蛋白GmDREB7–GFP的蓝光激发下产生的荧光；B：洋葱表皮细胞在明场下的形态；C：叠加的照片；D：GFP对照；

图3为GmDREB7基因的表达模式分析；

图中：A：GmDREB7基因在盐胁迫下的表达模式；B：GmDREB7基因在低温胁迫下的表达模式；

C：GmDREB7基因在干旱胁迫下的表达模式。

图4为转GmDREB7基因拟南芥耐盐性鉴定结果；

图中：A为转GmDREB7基因的三个过表达株系及野生型拟南芥在盐处理35天后的表型；B为不同株系拟南芥中相同位置叶片中叶绿素含量测定结果，C为不同株系拟南芥中相同位置叶片中离子渗透率测定结果；

图5为转GmDREB7基因二穗短柄草的耐盐性鉴定结果。

图中：A：转GmDREB7基因的三个过表达株系及野生型二穗短柄草在盐处理50 天后的表型；B为不同株系二穗短柄草中相同位置叶片中叶绿素含量测定结果，C为不同株系二穗短柄草中相同位置叶片中离子渗透率测定结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对发明进行清楚、完整的描述。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)(野生型Columbia-0亚型)记载于如下文献中：Kim H，Hyun Y，Park J，Park M，Kim M，Kim H，Lee M，Moon J，Lee I，Kim J.A geneticlink between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsisthaliana.Nature Genetics.2004,36:167-171.在下文中，拟南芥(Arabidopsisthaliana)(野生型Columbia-0亚型)简称拟南芥。

二穗短柄草(Brachypodium distachyon L.)(野生型Bd21)记载于如下文献中：

Alves SC,Worland B,Thole V,Snape JW,Bevan MW,Vain P.A protocol forAgrobacterium-mediated transformation of Brachypodium distachyon communitystandard line Bd21.Nature Protocols.2009,4(5):638-649.在下文中，二穗短柄草(Brachypodium distachyon L.)(野生型Bd21)简称二穗短柄草。

16318hGFP(绿色荧光蛋白)载体记载于如下文献中：谷子WRKY36转录因子的分子特性及功能鉴定.中国农业科学，2015，48(5):851-860.在下文中，16318hGFP (绿色荧光蛋白)载体简称为16318hGFP载体。

pCAMBIA1300载体记载于如下文献中：Zhao,M.M.,Zhang,X.W.,Liu,Y.W.,Li, K.,Tan,Q.,Zhou,S.,et al.A WRKY transcription factor,TaWRKY42-B,facilitatesinitiation of leaf senescence by promoting jasmonic acid biosynthesis.BMCPlant Biol, 2020,20(1):444.

pTCK303载体记载于如下文献中：Du,Y.,He,W.,Deng,C.,Chen,X.,Gou,L.,Zhu,F.,et al.Flowering-Related RING Protein 1(FRRP1)Regulates Flowering Time andYield Potential by Affecting Histone H2B Monoubiquitination in Rice(OryzaSativa).PLoS One,2016,11(3):e0150458.

大豆品种(Glycine max L.)铁丰8号记载于如下文献中：Du,YT.,Zhao,MJ.,Wang,CT.et al.Identification and characterization of GmMYB118 responses to droughtand salt stress.BMC Plant Biology,2018,18:320

Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0为TaKaRa公司的产品，Code No.为DV807A。pMD18-T载体为TaKaRa公司的产品。

下述实施例中的植物叶片叶绿素测定方法：

使用SPAD-502Plus测定仪检测离体叶片的相对叶绿素含量，仪器使用见如文献J.Naus,J.Prokopova,J.Rebicek,and M.Spundova,SPAD chlorophyll meter readingcan be pronouncedly affected by chloroplast movement.Photosynth Res, 2010,105:265-271。

下述实施例中的叶片离子渗透率的测定方法如下：

(1)取需测定的叶片置于5mL去离子水中，真空孵育1h后使用电导率仪测定离子渗透率为初始数据，去离子水作为空白对照。

(2)样品煮沸10min后，冷却至室温再次测定离子渗透率作为二次数据，去离子水作为空白对照，(初始数据-空白对照)/(二次数据-空白对照)比值为最终叶片离子渗透率。

实施例1蛋白质GmDREB7的编码基因(即GmDREB7基因)的克隆

一、采用TRNzol(TIANGEN公司)试剂提取生长至15天的铁丰8号幼苗的叶片的总RNA，然后先利用反转录酶反转录出第一链cDNA，再采用SMART法合成ds cDNA，即获得铁丰8号的ds cDNA。

二、以步骤一获得的铁丰8号的ds cDNA为模板，采用：GmDREB7-F： 5’-TTACTACTAACTACCCCTTTTGCAC-3’和GmDREB7-R： 5’-AATTAAATGGAGTAACTCCACAGAG-3’组成的引物对进行PCR扩增，扩增程序为94℃变性5min；94℃50s，55℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。得到GmDREB7基因的PCR扩增产物。1％琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

三、采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0从步骤二得到的PCR扩增产物中回收624bp的DNA片段。回收的DNA片段连接至pMD18-T载体上并测序。测序结果表明，回收的DNA片段(即GmDREB7基因)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

实施例2蛋白质GmDREB7基因在非生物胁迫下的RT-PCR表达模式分析

一、取大豆铁丰8号种子播种于花盆中，取四叶期的幼苗分别进行盐、干旱和低温处理。具体步骤如下：

1、盐处理：将大豆幼苗置于200mM NaCl溶液中，28℃恒温，分别处理0h、1 h、2h、5h、10h、24h后分别取样，迅速置于液氮速冻后，-80℃保存备用；

2、干旱处理：将大豆幼苗置于滤纸上，28℃恒温，分别处理0h、1h、2h、5h、 10h、24h后分别取样，迅速置于液氮速冻后，-80℃保存备用；

3、低温处理：将大豆幼苗置于4℃培养箱中，分别处理0h、1h、2h、5h、10 h、24h后分别取样，迅速置于液氮速冻后，-80℃保存备用。

二、利用TRNzol法(TIANGEN)提取总RNA，Olig(dT)15为锚定引物，在AMV 反转录酶作用下合成cDNA第一链。具体步骤如下：

1、取1.5ml离心管，加入纯化过的总RNA 5μl、6.5μl DEPC水和1μl Olig(dT)₁₅， 75℃5min，冰上5min；

2、依次加入下列试剂：RNase inhibitor 0.5μl、5×AMV buffer 4μl、dNTP(10mM)、 2μl和AMV 1μl；

3、室温放置10min，42℃温育90min，95℃变性5min，冰上5min。

三、半定量RT-PCR分析

以步骤二获得的铁丰8号的cDNA第一链为模板，根据GmDREB7的序列两端设计特异引物进行RT-PCR扩增，5'-TCAATCATTTCTCCGACCCA-3'和5'-GCAGCCTTCTGAATGTCCCT-3'。反应条件：94℃5min；94℃50s，56℃50 s，72℃1min，28个循环；72℃延伸10min。选用大豆Tubulin基因作对照，引物序列为：5’-AACCTCCTCCTCATCGTACT-3’和5’-GACAGCATCAGCCATGTTCA-3’。反应条件：94℃5min；94℃50s，58℃50s，72℃1min，28个循环；72℃延伸10min。

四、GmDREB7在非生物胁迫下的RT-PCR表达模式分析

实验结果见图3。结果显示GmDREB7基因强烈受盐、低温和干旱胁迫的诱导表达，在高盐胁迫下，2h后转录后表达就明显增强，10h达到最强(图3A)。在低温、干旱胁迫5h后转录表达达到最强(图3B、3C)，

上述结果表明，GmDREB7参与非生物胁迫(盐、低温、干旱胁迫)信号转导途径。

实施例3蛋白质GmDREB7的亚细胞定位分析

一、重组质粒16318hGFP-GmDREB7的构建

1、以含有GmDREB7基因的质粒为模板设计引物进行PCR反应，为构建表达载体的需要，在上游和下游序列引物中分别引入HindⅢ和BamHⅠ的酶切位点，采用 GmDREB7-GFP-F：5’-GCCAAGCTTATGTTTTCCATCAATCAT-3’和 GmDREB7-GFP-R：5’-ACAGGATCCAATGGAGTAACTCCACAG-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

2、采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0从步骤1得到的PCR扩增产物中回收约700bp的DNA片段。

3、以HindⅢ与BamHⅠ酶切步骤2回收的DNA片段，与同样双酶切的线性化的16318hGFP载体相连接，转入E.coli DH5α，PCR、酶切筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行测序验证。得到重组质粒16318hGFP-GmDREB7。

二、基因枪法转化洋葱表皮细胞

1、取3μg 16318hGFP-GmDREB7重组质粒DNA与6μl 50mg ml^-1的金粉悬液 (直径为1.0μm)、4μl 0.1M亚精胺(抽滤灭菌)、6μl 2.5M CaCl₂涡旋震荡混匀，冰上静置15min，12000rpm离心10s，收集金粉沉淀，20μl无水乙醇重悬金粉 -DNA混合物。

2、将幼嫩的洋葱表皮摆放在MS培养基(参照Murashige T&Skoog F(1962) 文献报道，用于组织基本培养)上，22℃预培养4h。

3、基因枪轰击洋葱表皮细胞方法：

(1)将BIO-RAD基因枪(PDS-1000/He)放置在较大型号的超净工作台上，紫外灯杀菌30min以上，70％乙醇擦净基因枪真空室及各部件；

(2)阻挡网和装膜器在无水酒精中浸泡15min，用酒精灯烤干；

(3)载体膜、可裂膜(1100psi)于无水乙醇中消毒15min，然后置于无菌滤纸上，在超净台上吹干；

(4)装弹，取10μl子弹液均匀涂在载体膜中央，待干；

(5)取出盛载体膜的器件，拧开盖子，先将阻挡网放入凹槽中，然后把装有载体膜的器件倒扣于凹槽上，拧紧盖子；

(6)可裂膜装在固定盖中，并旋紧；

(7)将组装好的盛载体膜的器件放在真空室上数第二个格子里，载有要轰击的愈伤组织的培养皿放在数第四个格子里，轰击距离为5cm；

(8)抽真空：按VAC键，当真空度达到25～28inches Hg时，将VAC键直接锁定在HOLD位置；

(9)轰击：按住FIRE键，直至可裂膜爆裂，再按VENT键，使真空表指针回零，打开真空室小门，取出样品。

轰击后的洋葱表皮细胞22℃暗培养24h后在共聚焦显微镜(Bio-RadMicroRadiance)下观察。

三、蛋白质GmDREB7的亚细胞定位分析

在共聚焦显微镜(Bio-Rad MicroRadiance)(Laser scanning confocalmicroscopy， LSMC)下观察GFP的荧光，并扫描照像。激光扫描共聚焦显微镜的工作参数为：Ex＝488nm，Em＝525±15nm，Power＝10％，Zoom7，中速扫描，Frame512×512。软件为TIME-COURSE和PHOTOSHOP5.0。

结果见图2，绿色荧光蛋白在475nm蓝光激发下可产生509nm的绿色荧光。对照GFP蛋白无核定位功能，可经过核孔复合物扩散进入细胞核，从而在细胞核内和细胞质中都可以观察到GFP的绿色荧光信号，将GmDREB7基因插入到 CaMV35S启动子和绿色荧光蛋白基因之间形成GmDREB7-GFP融合蛋白，仅在核内产生绿色荧光，表明GmDREB7是定位于细胞核中的核蛋白。

实施例4转GmDREB7基因拟南芥的获得及鉴定

一、重组质粒pCAMBIA1300-GmDREB7和GV3101/pCAMBIA1300-GmDREB7 的获得

1、以实施例1中步骤三回收的DNA片段为模板，为构建表达载体的需要，在上游和下游序列引物中分别引入Xba I的酶切位点，采用GmDREB7-1300-F：5’- GCTCTAGAACTACTAACTACCCCTTTTGCACA-3’和GmDREB7-1300-R：5’- CTCTAGATTAAATTAAATGGAGTAACTCCACAG-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。采用Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0回收约700bp的 DNA片段。

2、用限制性内切酶Xba I酶切pCAMBIA1300载体(HE G H,XU J Y,WANG Y X,LIU JM,LI P S,CHEN M,MA Y Z,XU Z S.Drought-responsive WRKY transcription factorgenes TaWRKY1 and TaWRKY33 from wheat confer drought and/or heat resistancein Arabidopsis.BMC Plant Biology,2016,16(1):116.)，采用Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0回收载体骨架1。

3、将步骤1回收的DNA片段和载体骨架1连接，得到重组质粒 pCAMBIA1300-GmDREB7。重组连接产物通过转化到XL-Blue菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序。测序结果表明，重组质粒pCAMBIA1300-GmDREB7为向 pCAMBIA1300载体的限制性内切酶XbaI的识别序列之间插入序列表中序列1所示的DNA分子。重组质粒pCAMBIA1302-GmDREB7表达序列表中序列2所示的蛋白质GmDREB7。

4、将重组质粒pCAMBIA1300-GmDREB7导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/pCAMBIA1300-GmDREB7。

二、转GmDREB7基因拟南芥的获得

1、采用拟南芥花序浸花转化法(记载于如下文献中Clough，S.J.，and Bent，A.F..Floraldip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana.Plant J.(1998)16，735-743.)，将GV3101/pCambia1300-GmDREB7 转至野生型拟南芥中，获得T₁代转GmDREB7基因拟南芥种子。

2、将T₁代转GmDREB7基因拟南芥种子播种于含有潮霉素(Hyg)的MS固体培养基上黑暗培养，下胚轴能够伸长的拟南芥(抗性苗)即为T₁代转GmDREB7基因阳性苗，T₁代转GmDREB7基因阳性苗收到的种子即为T₂代转GmDREB7基因拟南芥种子。

3、将筛选出的不同株系的T₂代转GmDREB7基因拟南芥种子播种于含有潮霉素(Hyg)的MS固体培养基上进行筛选，如果某株系中下胚轴伸长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为GmDREB7基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T₃代转GmDREB7基因拟南芥种子。

4、将筛选出的T₃代转GmDREB7基因拟南芥种子再次播种于含有潮霉素(Hyg) 的MS固体培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T₃代纯合转GmDREB7基因拟南芥。将其中3个T₃代纯合转GmDREB7基因拟南芥株系分别命名为35S：：GmDREB7#5(或35S：：GmDREB7 OE#5)、35S：：GmDREB7#6(或35S：：GmDREB7 OE#6)和35S：：GmDREB7#11(或35S：：GmDREB7 OE#11)，并进行后续实验。

三、分子鉴定

待测拟南芥种子为35S：：GmDREB7#5的T₃代种子、35S：：GmDREB7#6的T₃代种子、35S：：GmDREB7#11的T₃代种子、野生型拟南芥种子进行如下处理：

1、取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于MS固体培养基上，4℃吸涨2天。

2、完成步骤1后，取所述待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h 暗培养)7天，得到待测拟南芥幼苗。

3、提取待测拟南芥幼苗的基因组DNA并以其作为模板，采用5’-TTACTACTAACTACCCCTTTTGCAC-3’和5’- AATTAAATGGAGTAACTCCACAGAG-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：如果某PCR扩增产物中含有约700bp的DNA片段，则该 PCR扩增产物对应的待测拟南芥幼苗为阳性苗。

结果表明，35S：：GmDREB7#5的T₃代种子、35S：：GmDREB7#6的T₃代种子、 35S：：GmDREB7#11的T₃代种子获得的幼苗均为阳性苗。

四、转GmDREB7基因拟南芥的耐盐性鉴定

MS0固体培养基：(Du,Y.T.；Zhao,M.J.；Wang,C.T.；Gao,Y.；Wang,Y.X.；Liu,Y.W.；Chen,M.；Chen,J.；Zhou,Y.B.；Xu,Z.S.；Ma,Y.Z.,Identification andcharacterization of GmMYB118 responses to drought and salt stress.BMC PlantBiol. 2018,18,(1),320.)

待测拟南芥种子为35S：：GmDREB7#5的T₃代种子、35S：：GmDREB7#6的T₃代种子、35S：：GmDREB7#11的T₃代种子、野生型拟南芥种子。

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于MS固体培养基上，4℃吸涨3天。

2、完成步骤1后，取所述待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养 /8h暗培养)4天，得到待测拟南芥幼苗。

3、完成步骤2后，将不同的株系移栽至培养土中，选取生长状态基本一致的待测拟南芥幼苗，随机选取转GmDREB7基因的三个过表达株系以及野生型(Col-0) 拟南芥各10株；将不同株系GmDREB7过表达拟南芥和野生型移栽至相同的生长环境中，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)；施加200mM NaCl的盐水，相同环境培养35天；

4、完成步骤3后，观察待测拟南芥生长情况，统计叶绿素含量和离子渗透率并按组求平均值。

实验结果见图4(数据进行t-test分析，“*”代表“P﹤0.05”，“**”代表“P﹤ 0.01”，“***”代表“P﹤0.001”)，结果表明，3个T₃代纯合转GmDREB7基因拟南芥株系(35S：：GmDREB7#5、35S：：GmDREB7#6和35S：：GmDREB7#11)的叶绿素含量明显高于野生型拟南芥，离子渗透率明显低于野生型。

上述结果表明，在野生型拟南芥中过表达GmDREB7基因可以提高拟南芥的耐盐性；耐盐性提高表现为：叶片持绿，其叶绿素含量升高，膜渗透性降低。

实施例5、转GmDREB7基因二穗短柄草的获得及鉴定

一、重组质粒pTCK303-GmDREB7的构建和重组农杆菌的获得

1、以实施例4步骤一中的中间载体为模板，为构建表达载体的需要，在上游和下游序列引物中分别引入Spe I和Kpn I的酶切位点，采用GmDREB7-303-F： 5’-TTACACTAGTACTACTAACTACCCCTTTTGCACA-3’和GmDREB7-303-R： 5’-CGGAGGTACCTTAAATTAAATGGAGTAACTCCACAG-3’组成的引物对进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物。

2、用限制性内切酶Spe I和Kpn I酶切步骤1得到的PCR扩增产物，然后采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收约710bp的DNA片段。

3、用限制性内切酶Spe I和Kpn I酶切pTCK303载体，回收载体骨架。

4、将DNA片段和载体骨架连接，得到重组质粒pTCK303-GmDREB7。

将重组质粒pTCK303-GmDREB7进行测序。测序结果表明，重组质粒pTCK303-GmDREB73为将pTCK303载体的限制性内切酶Spe I和Kpn I之间的DNA 小片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子，得到的重组质粒。重组质粒pTCK303-GmDREB7表达序列表中序列2所示的蛋白质GmDREB7。

5、将重组质粒pTCK303-GmDREB7导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pTCK303-GmDREB7。

二、转GmDREB7基因二穗短柄草的获得

1、将EHA105/pTCK303-GmDREB7转化至二穗短柄草。(具体方法参考Alves, S.C.,Worland,B.,Thole,V.,Snape,J.W.,Bevan,M.W.,and Vain,P.A protocol forAgrobacterium-mediated transformation of Brachypodium distachyon communitystandard line Bd21.Nat Protoc,2009,4(5),638-649.)

2、光暗交替培养即光培养和暗培养交替，条件为：16小时光照培养/8小时黑暗培养；光照培养时的光照强度为90μE/m²/s。

愈伤组织诱导及继代培养基：MS基本培养基+2.5mg/L 2,4-D+0.6mg/L CuSO4 +0.5mg/L酸水解酪蛋白+30mg/L蔗糖+7g/L琼脂；

共培养培养基：MS基本培养基+2.5mg/L 2,4-D+0.2mmoL/L乙酰丁香酮+10g/L 葡萄糖(固体培养基另加7g/L琼脂)；

愈伤组织分化培养基：基本培养基+500mg/L酸水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7g/L 琼脂，添加不同浓度的KT、6-BA；

生根培养基：1/2MS基本培养基+0.6mg/L IAA+15g/L蔗糖+7g/L琼脂。

以上培养基pH均为5.8，并在121℃下高压灭菌20min后备用。

(1)种植野生型二穗短柄草(Bd21)，生长大约7-9周，植株生长在恒温苗室，温度为25℃，光照16h/黑暗8h。

(2)在超净工作台中选取未成熟的种子去除外壳，首先使用70％的酒精进行消毒2min，然后使用灭菌的超纯水进行冲洗三次，每次30s，随后使用50mL，10％的次氯酸钠溶液(加入约1mL吐温-20)消毒7-10min，而后使用灭菌的超纯水冲洗 5次，最后放入超纯水中待用。

(3)在超净工作台中，使用两把灭菌的杂交镊轻轻的剥离1.5-3.0毫米的幼胚，将其放置在愈伤诱导基础培养基(MSB)平板上，使用3M透气胶带封口。

(4)将含有幼胚的平板放置于25℃培养箱，黑暗诱导，形成淡黄色的致密胚性愈伤组织，经常观察幼胚的生长情况，避免其被污染而生长杂菌，大约每两周更换新的培养基，提供充足的营养物质，生长大约6周左右时可以进行农杆菌的愈伤组织转化。

(5)配置预处理培养基，在超净工作台中将淡黄色的致密胚性愈伤放于预处理培养基中43℃热激3分钟，不添加ace。

(6)农杆菌的制备：将含有目的基因的农杆菌在YEP固体培养基上活化，挑取活化的农杆菌至3ml YEP液体培养基中，在30℃摇床过夜培养，培养至浓度为 OD₆₀₀＝0.8-1.2，记为C1。

(7)转移农杆菌至2.0Eppendorf管(体积记为V1)，在5000r/min,离心5分钟，去掉上清，将收集的菌加入至液体共培养培养基中(大约50ml记为V2)，调节其浓度为OD600＝0.05，稀释计算公式为C1*V1＝C2*V2。

(8)愈伤转化：去除预处理培养基，将热激处理完的胚性愈伤转移至含有农杆菌的共培养培养基，在28℃、90r/min的摇床上，黑暗处理5min。

(9)将感染农杆菌的愈伤组织放置于灭菌的滤纸上，吸取多余的农杆菌液，在超净工作台中吹干。

(10)将感染的愈伤组织转移至固体共培养培养基上，培养基表面铺一层灭菌的滤纸，在22℃培养箱黑暗共培养4-5天。共培养期间培养基不能太湿或太干，防止农杆菌过度生长。

(11)配置恢复培养基，将接种的愈伤组织转移至恢复培养基，28℃培养箱恢复培养3-4天。

(12)筛选有抗性的愈伤组织：在含有潮霉素的筛选培养基上28℃黑暗筛选大约4周，直至长出新的白色愈伤

(13)转基因植物的再生：转化大约6周后，转移至含有激动素的再生培养基 I，16h光照/8h黑暗条件下培养10-14d，长出1-2cm绿色小芽。

(14)转移至生根培养基，培养至根系健壮，将其转移至4℃培养箱中进行春化(一个月)，期间保持正常的光照。

(15)壮苗移栽：春化后放于25℃培养箱适应一天，然后打开盖子，加灭菌超纯水，大约2天左右，移栽至营养土中，在培养箱中培养1周左右，观察转基因植株健壮后转移至苗室培养。得到T₀代转GmDREB7基因二穗短柄草植株。

三、分子鉴定

1、分别将各个世代转GmDREB7基因二穗短柄草生长至10天的幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。

2、提取待测二穗短柄草幼苗的基因组DNA并以其作为模板，采用5’-TTACTACTAACTACCCCTTTTGCAC-3’和5’- AATTAAATGGAGTAACTCCACAGAG-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物；然后进行如下判断：如果某PCR扩增产物中含有约700bp的DNA片段，则该PCR扩增产物对应的待测二穗短柄草幼苗为阳性苗。

(1)取T₀代拟转GmDREB7基因二穗短柄草植株，分子鉴定筛选阳性苗，即获得T₀代转GmDREB7基因二穗短柄草阳性植株。

(2)将T₀代转GmDREB7基因二穗短柄草植株自交，收获T₁代转GmDREB7 基因二穗短柄草种子。

(3)将T₁代转GmDREB7基因二穗短柄草种子播种于含有50mg/L潮霉素的 MS固体培养基上，将能够正常生长的二穗短柄草幼苗进行分子鉴定筛选阳性苗，即获得T₁代转GmDREB7基因二穗短柄草植株。

(4)将T₁代转GmDREB7基因二穗短柄草植株自交，收获T₂代转GmDREB7 基因二穗短柄草种子。

(5)将不同株系的T₂代转GmDREB7基因二穗短柄草种子播种于含有50mg/L 潮霉素的MS固体培养基上，如果某株系中能够正常生长的二穗短柄草苗的数目与不能够正常生长的二穗短柄草苗的数目比例为3：1，则该株系为GmDREB7基因插入一个拷贝的株系；将该株系进行分子鉴定筛选阳性苗，获得T₂代转GmDREB7基因二穗短柄草植株。

(6)将T₂代转GmDREB7基因二穗短柄草植株自交，收获T₃代转GmDREB7 基因二穗短柄草种子。

(7)将T₃代转GmDREB7基因二穗短柄草种子播种于含有50mg/L潮霉素的 MS固体培养基上，分子鉴定筛选阳性苗，均为阳性苗的即为T₃代纯合转GmDREB7 基因二穗短柄草。

结果表明，Ubi：：GmDREB7#2的T₃代种子、Ubi：：GmDREB7#7的T₃代种子、 Ubi：：GmDREB7#11的T₃代种子获得的幼苗均为阳性苗。

四、转GmDREB7基因二穗短柄草的耐盐性鉴定

待测二穗短柄草种子为Ubi：：GmDREB7#2的T₃代种子、Ubi：：GmDREB7#7的 T₃代种子、Ubi：：GmDREB7#11的T₃代种子以及二穗短柄草野生型种子。

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、取待测二穗短柄草种子，用0.7％(v/v)过氧化氢水溶液浸泡过夜，清水洗涤3次；然后37℃光暗交替培养至露白芽(约2天)。

2、完成步骤1后，将待测二穗短柄草种子移至剪去下部的96孔板上，每个孔放置一粒待测二穗短柄草种子，然后将所述96孔板置于清水中，37℃光暗交替培养 1周；得到二穗短柄草幼苗。

3、完成步骤2后，将不同的株系移栽至培养土中，选取生长状态基本一致的待测二穗短柄草幼苗，随机选取转GmDREB7基因的三个过表达株系以及野生型二穗短柄草各20株；施加200mM NaCl的盐水，相同环境培养50天；

4、完成步骤3后，观察待测二穗短柄草生长情况，统计叶绿素含量和离子渗透率并按组求平均值。

实验结果见图5(数据进行t-test分析，“*”代表“P﹤0.05”，“**”代表“P﹤ 0.01”，“***”代表“P﹤0.001”)，结果表明，3个T₃代纯合转GmDREB7基因二穗短柄草株系(Ubi：：GmDREB7#2、Ubi：：GmDREB7#7和Ubi：：GmDREB7#11)的叶绿素含量明显高于野生型拟南芥，离子渗透率明显低于野生型。

上述结果表明，在野生型二穗短柄草中过表达GmDREB7基因可以提高二穗短柄草的耐盐性；耐盐性提高表现为：叶片持绿，其叶绿素含量升高，膜渗透性降低。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所

<120> 蛋白质GmDREB7及其编码基因在调控植物抗逆性中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Phe Ser Ile Asn His Phe Ser Asp Pro Asp Ala Thr Ser Pro Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Ser Ser Arg Pro Ala Leu Ser Asp Glu Asp Phe Phe Leu

20 25 30

Ala Ala Ser Asn Pro Lys Lys Arg Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu

35 40 45

Thr Arg His Pro Val Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Asp Ser Gly Lys

50 55 60

Trp Val Cys Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu

65 70 75 80

Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala

85 90 95

Ala Ile Ala Leu Arg Gly Arg Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser

100 105 110

Ala Ser Arg Leu Pro Val Pro Ala Thr Ala Glu Ala Arg Asp Ile Gln

115 120 125

Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Glu Ala Phe Arg Pro Gly Lys Asp Asp

130 135 140

Asp Ala Val Ala Glu Arg Val Ala Ala Thr Ala Thr Glu Arg Glu Glu

145 150 155 160

Glu Gln Glu Glu Gly Met Val Pro Glu Tyr Leu Arg Asn Met Val Leu

165 170 175

Met Ser Pro Thr His Cys Phe Gly Ser Asp Glu Tyr Gly Ser Ala Asp

180 185 190

Val Glu Phe Asp Asp Ala Glu Val Ser Leu Trp Ser Tyr Ser Ile

195 200 205

<210> 2

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgttttcca tcaatcattt ctccgaccca gatgccacct cgccggggtc gggaggaagc 60

tcccgaccgg cgctgtcgga cgaggatttt tttctggcgg caagcaatcc caagaaacgc 120

gccgggagga agaagttccg ggagacgcgc cacccggtgt accgcggcgt gagaaggcgg 180

gactccggca agtgggtgtg cgaggtgcgc gagcccaaca agaagtccag gatttggctc 240

gggacctttt ccacggcgga gatggcggcg cgtgcgcatg acgtggcggc gatcgcgctg 300

aggggaaggt cagcctgcct caacttcgcc gactccgcgt ctcggctccc ggttccggcg 360

acggcggagg ccagggacat tcagaaggct gcggcggagg ccgcagaggc gtttcgccct 420

gggaaggatg atgatgcggt ggcggagagg gtggcagcga cggcgacgga gcgtgaagaa 480

gaacaagaag aagggatggt gccggagtat ctgaggaaca tggtgctcat gtcgccgacg 540

cattgcttcg ggagtgatga gtatggaagt gctgacgtgg aatttgacga tgctgaagtt 600

tctctgtgga gatactccat ttaa 624

Claims (10)

1.蛋白质GmDREB7的应用，为S1)或S2)：

S1)调控植物抗逆性；

S2)培育抗逆性改变的转基因植物。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质GmDREB7为a1)或a2)或a3)或a)：

a1)氨基酸序列为是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)将是序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗逆相关的蛋白质；

a3)与a1)或a2中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、90％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

a4)在是a1)或a2)或a)所限定的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

3.编码权利要求1或2所述蛋白质GmDREB7的核酸分子的应用，为S1)或S2)：

S1)调控植物抗逆性；

S2)培育抗逆性改变的转基因植物。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述编码蛋白质GmDREB7的核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b3)与b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或2中所述蛋白质GmDREB7的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2中所述蛋白质GmDREB7的DNA分子。

5.如权利要求1至4任一所述的应用，其特征在于：所述调控植物抗逆性为增加植物抗逆性；所述培育抗逆性改变的转基因植物为培育抗逆性增加的转基因植物。

6.一种培育转基因植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：提高出发植物中权利要求1或2中所述蛋白质GmDREB7的表达量和/或活性，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的抗逆性增加。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述“提高出发植物中所述蛋白质GmDREB7的表达量和/或活性”通过向出发植物中导入编码所述蛋白质GmDREB7的核酸分子实现。

8.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中权利要求1或2所述蛋白质GmDREB7的含量和/或活性，从而增加抗逆性。

9.如权利要求1至5任一所述的应用或权利要求6至8任一所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为耐盐性、耐低温性和抗旱性；

进一步的，所述抗逆性为耐盐性。

10.如权利要求1、2、3、4、5或9所述的应用或权利要求6至9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物；

进一步的，所述植物为禾本科植物或十字花科植物；

再进一步的，所述植物为二穗短柄草或拟南芥；

更进一步的，所述植物为野生型二穗短柄草品种Bd21或野生型拟南芥Columbia-0亚型。

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