CN102234323A - 植物耐逆性相关蛋白TaDREB3A及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白TaDREB3A及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的TaDREB3A在干旱、高盐、高温、低温、病原菌、ABA、乙烯、JA、SA诱导下表达，可以特异的调控含有DRE/CRT顺式元件(核心序列：CCGAC)的基因的转录表达；提高植物的抗旱性、耐盐性、耐高温性，以及对白粉病病原菌的抗性。本发明的TaDREB3A为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物中发挥重要的作用。

Description

植物耐逆性相关蛋白TaDREB3A及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白TaDREB3A及其编码基因和应用。

背景技术

干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响小麦生长、发育的障碍因子。因此，了解小麦对逆境条件的应答与信号传导机制，提高小麦品种的抗逆性，成为小麦遗传研究及小麦品种改良的重要任务之一。在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。

在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。

转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影响。

目前已知在植物中与胁迫相关的转录因子主要有：具有AP2结构域的AP2(APETALA2)/EREBP(乙烯应答元件结合蛋白，ethylene responsive element bindingprotein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP(basic region/leucinezipper motif transcription factors)类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY转录因子家族、含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的MYB家族。这五个转录因子家族，除WRKY家族不参与植物的水胁迫反应外，其它四个家族均参与调节植物对干旱、高盐和低温等的逆境胁迫反应。其中，AP2/EREBP类转录因子在高等植物中广泛存在，它是植物所特有的一类转录因子，近年来，在拟南芥、烟草、玉米、水稻、大豆和油菜中均有报道，这表明AP2/EREBP类转录因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。

DREB(脱水应答元件结合蛋白，DRE-binding protein)类转录因子是AP2家族中EREBP-like亚家族中的一个成员。DREB和EREBP类转录因子在氨基酸序列上没有显著的相同性，但都含有一段非常保守的由58个左右氨基酸组成的DNA结合区域(EREBP/AP2结构域)。蛋白质三维分析表明，该区域含有3个β-折叠，对识别各类顺式作用元件起关键作用。其中位于第二个β-折叠中的第14、19位的两个氨基酸残基的差异，决定这类转录因子与不同顺式作用元件的特异结合。DREB类转录因子第14位氨基酸是缬氨酸(V14)，第19位氨基酸是谷氨酸(E19)，其中第19位的氨基酸并不保守，例如水稻的OsDREB1转录因子的第19位氨基酸就是缬氨酸(Dubouzet JG，Sakuma Y，Ito Y，Kasuga M，Dubouzet EG，Miura S，Seki M，Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K，2003)。在DREB相关蛋白中决定DNA结合的特异性方面，V14的作用明显要比E19重要(Sakuma Y，Liu Q，Dubouzet JG，Abe H，Shinozaki K andYamaguchi-Shinozaki K，2002)；而ERF类转录因子第14位氨基酸是甘氨酸，第19位是天冬氨酸，因而DREB特异结合DRE/CRT顺式元件，ERF特异结合GCC-盒。AP2/EREBP结构域的C-端区还包含1个由18个氨基酸残基组成的核心序列，该序列形成双亲性的α-螺旋，该α-螺旋可能参与同其它转录因子及DNA间的相互作用。

目前，在许多植物中都发现含有EREBP/AP2结构域的转录因子，并分别与抗病、抗逆等信号传递有关(刘强，赵南明，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K，2000)。刘强等认为，一个DREB基因可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达(刘强，赵南明，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K，2000)。Kasuga等的研究证实，导入到拟南芥的DREB1A基因可以同时促进与逆境胁迫耐性有关的基因rd29、rd17、kin1、cor6.6、cor15a以及erd10的表达，转基因植株的抗逆性大大增强(Kasuga M，Liu Q，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.，1999)。同样，低温耐性转录因子CBF1的转基因植株的耐低温能力有显著提高(Jaglo-OttosenKR，Gilmour SJ，Zarka DG，Schabenberger O，Thomashow MF.，1998)。由于植物的逆境耐性是由多基因调控的复杂性状，依靠导入单个功能性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提高。因此，利用一个关键性转录因子促进多个功能基因的表达，从而增强植物的抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。

根据含DNA结合区的数目，AP2/EREBP转录因子分为AP2(APETALA2)和乙烯应答元件结合蛋白EREBP(ethylene-responsive element binding protein)以及RAV三个大类型。AP2型转录因子包括拟南芥的AP2、ANT，玉米的Glossy、idsl等。这种类型的转录因子含有两个AP2/EREBP结构域，调节细胞的生长发育，在拟南芥中已发现14个AP2型转录因子基因；EREBP型转录因子仅含1个AP2/EREBP结构域，调节植物对激素(乙烯)、病原、低温、干旱及高盐等地分子应答反应。EREBP型转录因子中，已发现有烟草EREBP1-4、番茄Pti4-6、拟南芥RAV1-2、AtEBP、AtERF1-5、DREB1A-C(CBF1-3)和DREB2A-B等许多成员，分别与细胞发育、激素、抗病、低温及干旱、高盐等信号传递有关。这些EREBP型转录因子又可以再分为：EREBP(ethylene-responsive element binding protein，即ERF)亚组，包括烟草EREBP1-4、番茄Pti4-6、拟南芥AtEBP、AtERF1-5、这类转录因子与含核心序列AGCCGCC的GCC-盒特异结合，因此，它的DNA结合区又称为GCC-盒结合域(GCC-box binding domain，GBD)，其中第2个G、第5个G、第7个C对ERF蛋白的识别有重要作用(Hao D，Ohme-Takagi M，Sarai A，1998)。用核磁共振对其三维空间结构的研究表明，AtERF1的GBD通过形成3个反向的β-片层与其靶序列GCC-盒的大沟相结合；DREBP亚组，包括拟南芥DREB1A-C(CBF1-3)和DREB2A-B，这类转录因子在干旱、高盐、低温下特异结合干旱应答元件DRE/CRT，在拟南芥基因组中发现124个BREBP型转录因子基因；RAV型转录因子包括拟南芥RAV1、RAV2、含有两个不同的DNA结合区-ERF/AP2和B3，在拟南芥中已发现6个RAV型转录因子基因。还有一类特殊的转录因子AL079349，它与以上的转录因子都不同，自成一类。

最近发现EREBPs蛋白参与了干旱、高盐和低温胁迫的信号传导和基因表达调控。Mine等人从低温储藏的土豆块茎中分离到了EREBP转录因子CIP353，受低温胁迫诱导强烈表达(Mine T，Hiyoshi T，Kasaoka K，Ohyama A，2003)，说明可能有EREBP蛋白参与了受低温胁迫的基因表达调控。Park等利用西红柿为材料，得到了受高盐、乙烯或茉莉酸诱导表达的EREBP转录因子Tsi基因，EMSA(Electrophoretic mobilityshift assays)试验分析发现，Tsi蛋白与GCC-box和DRE/CRT顺式元件都能结合(ParkJM，Park CJ，Lee SB，Ham BK，Shin R，Paek KH，2001)，尽管前者结合能力大于后者，但说明，某些EREBP蛋白能激活受渗透胁迫诱导表达的基因。在正常生长条件下，Tsi基因的超量表达提高了转基因植株(35S::Tsil)的耐盐性、增强了抗病性(ParkJM，Park CJ，Lee SB，Ham BK，Shin R，Paek KH，2001)，以上说明了Tsi基因可能参与了生物胁迫和非生物胁迫两条信号传导途径。由高盐胁迫激活的一条类MAPK信号传递模式(包括SIMKK和SIMK)，将胁迫信号传递给EIN2(在乙烯信号传递途径的CTR1下游)(Guo HW and Ecker J，2004)，最后激活某些EREBPs转录因子，调控渗透胁迫相关基因的表达，提高植物的耐盐性。对于是否存在含GCC-box元件，且表达产物直接参与非生物胁迫响应的基因，还有待作进一步的证实。

综合目前的研究结果，植物在逆境胁迫条件下的信号传递途径至少有以下六条途径：(1)依赖于ABA的信号传递途径有三条：受干旱、高盐诱导，激活MYB、MYC类转录因子基因，调控具有MYBR或MYCR顺式作用元件的靶基因；受干旱、高盐诱导，激活ABF/AREB类转录因子基因，调控具有ABRE顺式作用元件的靶基因；受干旱、高盐诱导，激活CBF4，DREB1类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因。(2)不依赖于ABA的信号传递途径有三条：受干旱、高盐诱导，激活DREB2类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因；受低温诱导，激活CBF1-3/DREB1A-C类转录因子基因，调控具有DRE/CRT顺式作用元件的靶基因；受干旱、高盐或乙烯诱导，激活ERF类转录因子基因，调控具有DRE/CRT或GCC顺式作用元件的靶基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白TaDREB3A及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，为一种脱水应答元件结合蛋白，来源于小麦属小麦(Triticum aestivum L.)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列1所示蛋白质由389个氨基酸残基组成，自氨基端第75位-85位氨基酸残基和第111位-115位氨基酸残基为两个可能的核定位信号区，自氨基端第138位-195位氨基酸残基为保守的AP2/EREBP结构域。

为了使(a)中的TaDREB3A便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

             表1 标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的TaDREB3A可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的TaDREB3A的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’端第43至1212位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列2所示cDNA序列由1325个核苷酸组成，该基因的开放阅读框架为自5′端第43位-1212位核苷酸。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为YEP-GAP-TaDREB3A、pBI121-TaDREB3A、pAHC25-TaDREB3A或pCAMBIA-TaDREB3A。所述YEP-GAP-TaDREB3A为将权利要求2所述基因插入YEP-GAP的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段插入YEP-GAP的EcoRI和XhoI酶切识别位点之间得到的重组质粒。所述pBI121-TaDREB3A为将权利要求2所述基因插入pBI121的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段插入pBI121的BamHI和XhoI酶切识别位点之间得到的重组质粒。所述pAHC25-TaDREB3A为将权利要求2所述基因插入pAHC25的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段插入pAHC25的SmaI和SpeI酶切识别位点之间得到的重组质粒。所述pAHC25-TaDREB3A为将权利要求2所述基因插入pCAMBIA3301的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段插入pCAMBIA3301的SmaI和SpeI酶切识别位点之间得到的重组质粒。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物，如拟南芥(如哥伦比亚生态型拟南芥)、小麦(如济麦19)、大豆(如东农50)等。所述耐逆性可为耐非生物胁迫或抗病。所述耐非生物胁迫具体可为耐旱和/或耐盐和/或耐高温(如43℃)。所述抗病可为抗白粉病，具体可为抗由白粉病病原菌E09引起的白粉病。

本发明还保护所述蛋白作为转录因子的应用。

本发明的TaDREB3A在高盐、高温、低温、干旱、病原菌、ABA、乙烯、JA的诱导下表达，并且可以特异的调控含有DRE/CRT顺式元件(核心序列：CCGAC)的基因的转录表达，提高植物的抗旱性、耐盐性、耐高温性，以及对白粉病病原菌的抗性。本发明的TaDREB3A为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

附图说明

图1为TaDREB3A与小麦TaDREB氨基酸序列的同源性比对结果。

图2为TaDREB3A受胁迫诱导表达的实时荧光定量PCR图谱；A：脱落酸处理；B：乙烯处理；C：高温处理；D：茉莉酸甲酯处理；E：冷害处理；F：盐渍处理；G：干旱处理；H：水杨酸处理；I：白粉病病原菌处理。

图3为酵母单杂交系统证明转录因子体内结合特异性和激活特性的原理示意图。

图4为重组质粒163hGFP-TaDREB3A的结构示意图。

图5为重组质粒pBI121-TaDREB3A的结构示意图。

图6为重组质粒pAHC25-TaDREB3A的结构示意图。

图7为重组质粒pCAMBIA-TaDREB3A的结构示意图。

图8为实施例7的抗旱性结果(恢复浇水起，植株第1至15天的表型)；A：非转基因对照；B：转基因株系1；C：转基因株系2；D：转基因株系3。

图9为实施例7的耐盐性结果；A：非转基因对照；B：转基因株系1；C：转基因株系2；D：转基因株系3。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、TaDREB3A的克隆

一、mRNA的分离

将水培的生长10天左右的小白麦(国家种质资源库，编号ZM242)三叶期幼苗干旱处理2小时，用液氮速冻，-80℃保存备用。采用Quikprep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia)进行mRNA的分离。

二、cDNA文库的构建及滴度测定

1、cDNA文库的构建

采用Timesaver^TM cDNA Synthesis Kit(Pharmacia)将步骤一得到的mRNA合成cDNA双链，并加EcoRI/NotI adaptor；采用ZAP Express

Predigested Gigapack

IIIGold Cloning Kit(Stratagene)进行cDNA文库的构建，共得到500ul库液。

2、滴度的测定

(1)取1ul库液用SM Buffer稀释1000倍；

(2)分别取1ul、10ul、100ul稀释液至三个10ml离心管中，分别加100ul感受态宿主菌XL1-Blue MRF’(OD₆₀₀为1.0)，于37℃温浴20min；

(3)分别加入3ml顶胶(50℃)混匀，立即铺于固体NZY平板上，凝固后倒置，37℃培养过夜；

(4)根据平板噬菌斑数，求平均值，即为库容量。

经计算，该cDNA文库的滴度为3.0×10⁶个噬菌斑。

三、cDNA文库的筛选

1、探针的准备

根据已克隆的DREB基因的AP2保守区序列设计引物WAPF和WAPR，以普通小麦的cDNA为模板进行PCR扩增。

WAPF：5’-ACC GCG GTG TGA GGC AGA GGA-3’；

WAPR：5’-TGA GAA GTT GAC ACG TGC TTT GGC-3’。

PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳。

2、探针的回收

采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV805A)回收纯化180bp位置的条带(探针)。

3、转膜

(1)取1ul步骤二的1的库液，在培养皿中培养噬菌体，大概6.0×10³pfu；

(2)噬菌斑培养好后放在4℃冷却，临用时取出置于超净台吹干，防止转膜时顶胶被膜粘起；

(3)将Hybrond-N⁺膜剪成圆形，比直径为150mm的培养皿稍小，用铅笔在膜上表明编号及日期(与培养皿对应)；

(4)用镊子夹住膜两边，有字面朝上，中间先接触平板，慢慢松开，不要移动，不要有气泡，使膜自然摊平，完全摊平后，计时；

(5)用注射器针头在膜上扎三个不对称的孔，在培养皿背面对应的位置用记号笔做好标记；

(6)3min后，用镊子从一边开始轻轻揭起膜，不要带起顶胶；

(7)将膜迅速放入盛有变性液的培养皿中(放一层滤纸及15ml变性液)变性7min，有字面朝下，注意避免溶液到达膜的上表面；

(8)将膜转移至盛有中和液的培养皿中(放一层滤纸及15ml中和液)中和两次，每次3min；

(9)然后将膜转入漂洗液中洗30min，可轻轻摇动；

(10)取出膜，在干净的滤纸上吸干，有字面朝下；

(11)用保鲜膜将膜包好，在紫外交联仪上交联1min，4℃存放备用；

4、预杂交和杂交反应

65℃预杂交5-6h(新膜)；探针标记完后，加入NaOH溶液，混匀后于室温静置10min使探针变性，然后65℃杂交过夜。

5、洗脱

在55℃-65℃条件下洗膜。用滤纸吸干洗好的膜，保鲜膜包好，压X-光片。

6、阳性克隆的二轮筛选

(1)将X光片与膜对齐，确定位置，描下膜上的三个不对称点的位置；

(2)在读片机上放上X光片及相应的培养皿，根据不对称点使培养皿定位；

(3)用去头的1ml枪头取出确定的阳性杂交斑，放在1ml SM缓冲溶液中，加入50ul氯仿；

(4)振荡30秒，室温放置1小时，离心，取上清；

(5)取10-50ul上清再次铺板，培养噬菌体进行二次筛选；

(6)二次筛选的步骤同上：转膜、预杂交和杂交反应、洗脱、压X-光片，得到单个阳性噬菌斑。

四、得到TaDREB3A

1、集群内删除(Mass excision)

(1)制备XL1-Blue MRF’和XLOLR菌；用液体LB培养基培养XL1-Blue MRF’和XLOLR菌，30℃过夜，培养基中添加0.2％麦芽糖、10mM MgSO₄和抗生素，分别为12.5μg/ml四环素和50μg/ml卡那霉素；第二天，1000×g离心10min收集菌体，用10mM MgSO₄重悬，使OD₆₀₀达到1.0；

(2)在一个10ml的无菌离心管中加入：

1μl库液             (约含6.0×10³噬菌体颗粒)

XL1-Blue MRF’       200μl(OD₆₀₀为1.0)

ExAssist助手噬菌体   2μl(＞1×10¹⁰pfu/ml)

(3)37℃温育15min；

(4)加入20ml液体NZY培养基，37℃振荡培养2.5-3h；

(5)65-70℃加热20min；

(6)1000×g离心10min，上清移至一个新管中；

(7)在一个1.5ml的离心管中混合200μl XLOLR菌和1μl上清；

(8)37℃温育15min；

(9)取10μl、100μl菌液分别涂于LB固体培养基(含氨苄50μg/ml)上，37℃培养过夜。

2、cDNA文库插入片段的检查

(1)随机挑取步骤1中集群内删除的单菌落，提取它们的质粒DNA；

(2)用限制内切酶EcoR I(Takara)消化，反应体系10μl：

10×缓冲液H                 1μl

EcoR I(12U/μl)             0.5μl

质粒DNA                     2μl

ddH₂O                       6.5μl

(3)37℃消化2h，0.8％琼脂糖凝胶电泳，发现95％以上的载体有插入片段，说明95％以上的噬菌体含有重组子，因此文库实际含有的重组子为2.85×10⁶(cDNA文库的滴度为3.0×10⁶)。50％以上的重组子的插入片段在800bp-4Kb之间，说明构建的文库较完整。

3、单克隆内删除(Single-clone excision)

(1)将得到单个阳性噬菌斑从平板上抠下，放入到一个无菌的、已加有500μl SM缓冲液和20μl氯仿的离心管中，漩涡振荡10sec，4℃储存；

(2)用液体LB培养基培养XL1-Blue MRF’和XLOLR菌，30℃过夜，培养基中添加0.2％(w/v)麦芽糖、10mM MgSO₄和抗生素，分别为12.5μg/ml四环素和50μg/ml卡那霉素；

(3)第二天，1000×g离心10min收集菌体，用10mM MgSO₄重悬，使OD₆₀₀达到1.0；

(4)在一个10ml的无菌离心管中加入：

XL1-Blue MRF’         200μl(OD₆₀₀为1.0)

噬菌体贮存液           250μl(至少含1×10⁵噬菌体颗粒)

ExAssist助手噬菌体     1μl(＞1×10¹⁰pfu/ml)

(5)37℃温育15min；

(6)加入3ml液体NZY培养基，37℃振荡培养2.5-3h；

(7)于65-70℃水浴离心管20min，然后1000×g离心15min；

(8)将上清移至一个新的离心管中，即为噬菌粒悬浮液；

(9)在一个1.5ml的离心管中加入200μl步骤(3)制备好的XLOLR菌和步骤(8)制备好的噬菌粒悬浮液100μl，再加入300μl液体NZY培养基，37℃温育45-60min；

(10)取50μl菌液涂于LB固体培养基(含氨苄50μg/ml)上，37℃培养过夜；

(11)第二天挑取阳性克隆，用液体LB培养基培养过夜，提取质粒，用EcoRI酶切，电泳检测插入片段长度。

(12)选取插入片段大于800bp的克隆进行测序，在ABI733测序仪(GenecoreBiological Company)上，采用双脱氧核苷酸链终止法测定序列，将得到的全序列与EMBL Bank以及GENEBANK等核苷酸数据库比较，用DNASIS软件进行分析。发现16、92号克隆有一个保守的AP2/EREBP结构域。且基因结构完整。

(13)分析16、92号克隆的核苷酸序列及对应的氨基酸序列，得到序列表中序列2所示的核苷酸序列。

将序列表的序列1所示的蛋白命名为TaDREB3A蛋白，由389个氨基酸残基组成。序列1中的自氨基端第75位-85位氨基酸残基和第111位-115位氨基酸残基为两个可能的核定位信号区，自氨基端第138位-195位氨基酸残基为保守的AP2/EREBP结构域。TaDREB3A蛋白的同源序列比对结果如图1所示(黑框表示一致的氨基酸部分)，TaDREB3A与已报道的小麦TaDREB(AAL01124)只有68.72％的同源性，说明TaDREB3A是一个新发现的小麦蛋白。将TaDREB3A蛋白的编码基因命名为TaDREB3A基因，其开放阅读框架为自序列表的序列2的5′端第43位-1212位核苷酸。

实施例2、实时荧光定量PCR分析TaDREB3A的表达特性

一、进行各种胁迫处理

苗龄为10天的小白麦幼苗，进行以下处理

(1)干旱处理：将水培的小麦幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，干旱培养30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(2)盐渍处理：将小麦幼苗置于2％的由NaCl和Na₂SO₄组成的钠盐溶液中(NaCl与Na₂SO₄的质量百分比为3∶2)中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时后分别取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(3)脱落酸处理：将小麦幼苗置于200μM的脱落酸(ABA)溶液中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(4)白粉病病原菌处理：将小麦幼苗接种白粉病菌株，光照培养3小时、6小时、12小时、2天、3天、4天、5天后，取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(5)冷害处理：将小麦幼苗置于4℃培养箱，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时后取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(6)茉莉酸甲酯处理：将小麦幼苗置于50μM的茉莉酸甲酯(JA)溶液中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(7)乙烯处理：小麦幼苗置于含有乙烯的塑料袋中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(8)水杨酸处理：将小麦幼苗置于50μM的水杨酸(SA)溶液中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(9)高温处理：将小麦幼苗置于42℃下，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(10)对照的处理：直接取未经任何处理的小麦幼苗-80℃冻存作为对照(0小时)。

二、mRNA的分离

采用Quikprep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia)进行mRNA的分离。

三.反转录为cDNA

采用R103-Quant_Reverse_Transcriptase(TIANGEN)将纯化的mRNA反转录为cDNA。

四、实时荧光定量PCR

根据TaDREB3A序列，在其可变区设计特异引物TaDREB3RTF和TaDREB3RTR。以actin为内参基因，引物为actin-2F和actin-2R。

TaDREB3RTF：5’-GATGCTGCCCGTGCTTATGAC-3’；

TaDREB3RTR：5’-CTGAGTGGTTGGTGGATGTTGT-3’。

actin-2F：5’-CTCCCTCACAACAACCGC-3’；

actin-2R：5’-TACCAGGAACTTCCATACCAAC-3’。

TaDREB3A对各个胁迫及激素表现出响应，见图2。

实施例3、TaDREB3A的激活特性

用酵母单杂交系统证明转录因子的激活特性的主要原理如图3所示，将DRE顺式作用元件和突变体DRE顺式作用元件分别构建到pHISi-1载体和pLacZi载体的基本启动子Pmin(minimal promoter)上游，Pmin启动子下游连接报道基因(His3、LacZ和URA3)。当连接有编码转录因子的目的基因的表达载体YEP-GAP(不含激活功能)分别转化到连有DRE顺式作用元件和突变体DRE顺式作用元件的酵母细胞后，如果连有突变体DRE顺式作用元件的酵母细胞中的报道基因不能表达，而连有特定的DRE顺式作用元件的酵母细胞中的报道基因能够表达，说明该转录因子能与DRE顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明目的转录因子的体内结合特异性和激活功能。

YEP-GAP：中国农业科学院作物科学研究保证向公众提供；参考文献Liu Q，KasugaM，Sakuma Y，Abe H，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.Two transcriptionfactors，DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate twocellular signal transduction pathways in drought- andlow-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis，Plant Cell 1998 Aug；10(8)：1391-1406。

YPD液体培养基：细菌培养用酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract)10g/L，细菌培养用胰化蛋白胨(Bacto-Peptone)20g/L，调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃以后加入40％的Glucose，使其终浓度为20g/L。

SD/His^-/Ura^-/Trp^-选择性培养基：不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogen base)6.7g/L，营养缺陷型混合物(drop-out media without His/Ura/Trp)100ml，琼脂粉(Bacteriological agar)20g/L，调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃后加入40％Glucose，使其终浓度为20g/L。

营养缺陷型混合物(Drop-out mix)：(10×)：L-Isoleucine(异亮氨酸)300mg/L，L-Valine(缬氨酸)1500mg/L，L-Adenine(腺嘌呤)200mg/L，L-Arginine(精氨酸)200mg/L，L-Histidine Hcl monohydrate(组氨酸)200mg/L，L-Leucine(亮氨酸)1000mg/L，L-Lysine Hcl(赖氨酸)300mg/L，L-Methionine(甲硫氨酸)200mg/L，L-Phenylalanine(苯丙氨酸)500mg/L，L-Threonine(苏氨酸)2000mg/L，L-Tyrosine(酪氨酸)300mg/L。

1×PEG/LiAc：50％PEG3350 8ml，10×TE buffer 1ml，10×LiAc 1ml。

10×TE Buffer：100mM Tris-Hcl，10mM EDTA、pH＝7.5，121℃高压灭菌，室温保存。

1×TE/LiAc：10×TE buffer 1ml，10×LiAc 1ml，ddH₂O 8ml。

Z Buffer：Na₂HPO₄·7H₂O 16.1g/L，NaH₂PO₄·H₂O 5.5g/L，KCl 0.75g/L，MgSO₄·7H₂O0.246g/L，调节pH至7.0，121℃/15min灭菌，4℃保存。

X-gal储存液(X-gal Stock Solution)：用N，N-dimethyl-formamide(DMF)溶解X-gal，使其终浓度为20mg/ml，-20℃贮存。

含有X-gal的Z buffer缓冲液100ml(Z buffer with X-gal)，现用现配：Z buffer98ml，β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)0.27ml，X-gal储存液(X-gal stocksolution)1.67ml。

10×LiAc：Clontech公司。

一、重组表达载体的构建

1、获得TaDREB3A基因的获得

根据TaDREB3A基因的序列设计引物TaDREB3-EI和TaDREB3-XI，引物末端分别引入EcoRI和XhoI酶切位点，以小白麦的cDNA为模板，PCR扩增获得TaDREB3A基因。

TaDREB3-EI：5’-GGGGAATTCATGACGGTAGATCGGAAGGACG-3’；

TaDREB3-XI：5’-GGGCTCGAGTCACAACCCTTCGAAGAACTCG-3’。

PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV807A)回收纯化1.1Kb左右的PCR产物。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切表达载体YEP-GAP，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④将步骤③的连接产物电击转化JM109菌株(Clontech公司购买)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒YEP-GAP-TaDREB3A(在YEP-GAP的EcoRI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’端第43-1212位核苷酸所示的DNA片段)。

二、TaDREB3A的体内结合特异性和激活特性的验证

1、酵母报道子的构建

(1)正常双重酵母报道子的构建

DNA片段A(含4个DRE元件)：5’-GAATTC-DRE-DRE-DRE-DRE-GTCGAC-3’(DRE的核心序列：TACCGACAT)。DNA片段A的核苷酸序列见序列表的序列3。

将DNA片段A构建到pHis-1载体(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)的Pmin_HIS3启动子上游，得到重组载体pHis-1-DRE，用Xho I和Nco I内切酶将pHis-1-DRE载体切成线状。

将DNA片段A构建到pLacZi载体(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)P_CYCI启动子上游，得到重组载体pLacZi-DRE，用Xho I和Nco I内切酶分别将pLacZi-DRE载体切成线状。

先将线状pHis-1-DRE载体转化到酵母细胞(YM4271株系，MATCHMAKER One-HybridSystem，Clontech公司)内，获得能在SD/His^-培养基上正常生长的酵母转化子(Yeasttransformant)。接着以这种酵母转化子为寄主细胞，继续转化含有4个重复DRE元件的pLacZi-DRE载体。这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的SD/His^-/Ura^-培养基上，选择获得含有pHis-1-DRE和pLacZi-DRE的正常双重酵母报道子。

(2)突变体双重酵母报道子的构建

DNA片段B(含4个MDRE元件)：5’-GAATTC-MDRE-MDRE-MDRE-MDRE-GTCGAC-3’(MDRE：将4个DRE元件的核心序列CCGAC突变成TTTTT)。DNA片段B的核苷酸序列见序列表的序列4。

用DNA片段B代替DNA片段A，方法同步骤(1)，得到突变体双重酵母报道子。

2、PEG/LiAc法转化酵母及结果分析

(1)接种酵母菌株(YM4271株系)到1ml YPD液体培养基中，剧烈震荡2分钟，分散团块后将悬浮液转至含有50ml YPD液体培养基的三角瓶中，30℃/250rpm摇过夜，测OD600＝1.7-1.8(计数约4×10⁷个/mL)；

(2)取30ml步骤(1)过夜培养物接到300ml新鲜的YPD培养基中，30℃/250rpm培养，约3小时(至OD600＝0.5±0.1)，室温1000g离心5min，收集菌体，弃上清，用1/2体积1×TE悬浮，1000g/5min离心；

(3)吸弃上清，用1.5ml新鲜配制的1×TE/LiAc溶液悬浮，振荡混匀备用；

(4)取出0.1ml酵母感受态进行转化，依次加下列溶液：0.1μg YEP-GAP- TaDREB3A、0.1mg ssDNA(鲑鱼精DNA，Sigma)、0.6mlPEG/LiAc高速振荡1分钟，30℃/200rpm振荡培养30分钟；

(5)加入70ul DMSO(sigma#D8779)，轻轻倒置混匀，42℃热激30分钟，其间轻轻振荡，冰浴2分钟，室温1000g离心5min；

(6)吸弃上清，加入0.5ml 1×TE buffer悬浮细胞；

(7)用接种环蘸取悬浮液，分别在含有0、15mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-选择性培养基上画线培养。

(8)平板的一半培养正常双重酵母报道子，另一半培养突变体双重酵母报道子，以便做对照分析。

(9)颠倒放置于培养箱中，30℃培养3-4天。

(10)结果发现在0mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上正常的酵母报道子和突变的酵母报道子都有生长，但突变的酵母报道子的直径明显小；而在15mmol/L3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上正常的酵母报道子能正常生长，但突变的酵母报道子被抑止没有生长。

3、半乳糖苷酶活性检测

(1)从0mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上分别挑取正常的酵母报道子和突变的酵母报道子菌落。转至YPD液体培养基中，于30℃振荡培养，待长至对数生长后期，取1.5ml菌液，3000rpm离心30s；

(2)弃上清，控干管中液体，将离心管置于液氮中速冻10min，取出使其自然融解，加50ul Z/X-gal溶液，30℃温育，结果发现正常的酵母报道子在6-8h内变蓝，而突变的酵母报道子在12h内没有变化，仍为白色。说明转录因子TaDREB3A能与DRE顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了TaDREB3A的体内结合特异性和激活功能。

实施例4、亚细胞定位分析

一、载体构建

PCR扩增TaDREB3A基因全长。用HindIII，BamHI双酶切PCR产物，将目的片段连接到同样双酶切的亚细胞定位载体163hGFP上，热激转化E.coli DH5α。对重组质粒进行PCR检测。将阳性克隆测序。测序结果表明，得到了重组质粒163hGFP-TaDREB3A(见图4)。

二、材料准备：

3μg重组质粒DNA加入直径为1.0μM的金粉悬液6μl(50mg/ml)，0.1M亚精胺(spermidine)4μl，2.5M CaCl₂ 6μl，将金粉、DNA、亚精胺和氯化钙先分别振荡混匀，然后混合振荡混匀3min后，冰上静置15min。12000rpm离心10s(指转速达到12000rpm后10s)，弃上清。加入140μl无水乙醇，粗振荡后(打散金粉)12000rpm离心10s，收集金粉沉淀。20μl无水乙醇悬浮沉淀，点膜。

三、基因枪轰击受体材料：

1.选用一定压力的可裂膜(本实验用1100psi)，与轰击膜一起，在70％的酒精中浸泡1～2h，取出晾干；

2.金属挡板用酒精浸泡，在酒精灯上灭菌，基因枪的超净工作台紫外灭菌；

3.取20μl上述制备好的金粉-质粒复合体，均匀涂布于轰击膜的中间位置上，不要涂于整个膜上，大小与载体固定圈上的孔径范围一致，晾干，然后固定在载体固定圈上；

4.将上述载体固定圈安装到发射装置上；

5.将可裂膜安装到气体加速管下端；

6.将洋葱表皮培养皿放入真空室内，取下培养皿盖；

7.抽真空指针到26In/Hg；

8.放氦气于气体加速管，直到管中压力达到可裂膜所能承受的压力时，可裂膜破开；

9.气体冲到轰击膜上，载体向下运动，被金属挡板挡住，而下面的金粉-质粒复合体却透过金属挡板的网孔射向靶细胞；

10.将轰击好的洋葱表皮细胞放入25℃培养箱中，暗培养16～24h后在激光共聚焦显微镜下观察。

四、洋葱表皮细胞镜检：

将基因枪轰击、暗培养16-24h之后的洋葱表皮压片，然后在激光扫描共聚焦显微镜(Bio-Rad MicroRadiance)(Laser scanning confocal microscopy，LSMC)观察GFP(绿色荧光蛋白)荧光，并进行扫描照像。结果表明TaDREB3A定位到细胞核中。LSCM的工作参数为：Ex＝488nm，Em＝525±15nm，Power＝10％，Zoom7，中速扫描，Frame512×512。软件为TIME-COURSE和PHOTOSHOP5.0。

实施例5、TaDREB3A提高了拟南芥的抗旱、耐盐、耐高温性

一、重组表达载体的构建

1、TaDREB3A基因的克隆

根据TaDREB3A基因的序列设计引物对(TaDREB3A-121F和TaDREB3A-121R)，引物末端分别引入BamHI和XhoI酶切识别位点，以小白麦的cDNA为模板，PCR扩增TaDREB3A。

TaDREB3A-121F：5’-GGGGGATCCATGACGGTAGATCGGAAGGACG-3’；

TaDREB3A-121R：5’-GGGCTCGAGTCACAACCCTTCGAAGAACTCG-3’。

PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV807A)回收纯化1.1Kb左右的条带。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切pBI121(Clontech公司购买)，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株(天根生化科技(北京)有限公司购买)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pBI121-TaDREB3A(在pBI121的BamHI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段)(见图5)。

二、转基因植物的获得

1、用重组质粒pBI121-TaDREB3A转化农杆菌C58(北京拜尔迪生物技术公司购买)，得到重组农杆菌。

2、将重组农杆菌接种于YEP液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时；

3、将步骤2的菌液转至YEP液体培养基(含50mg/L卡那霉素和50μg/L利福平)中，28℃、300rpm培养约14小时(菌液OD600达到1.5-3.0)；

4、收集菌体，4℃、4000g离心10min，用10％蔗糖(含0.02％silwet)稀释至OD600约为0.8-1.0；

5、将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0，SALK公司购买)整株与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T₁代种子，卡那霉素筛选(浓度为50μg/L卡那霉素)阳性植株。将阳性植株进行PCR鉴定，鉴定结果表明，得到的转基因植株(转TaDREB3A基因植株)。

T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。

三、转空载体对照植物的获得

用质粒pBI121转化农杆菌，得到重组农杆菌，用重组农杆菌转化拟南芥Col-0，得到转空载体对照植株，方法同步骤二。

四、转基因植物的耐逆性鉴定

分别将T₃代转基因植株、T₃代转空载体对照植株和拟南芥Col-0(各60株)进行耐旱性鉴定、耐盐性鉴定和耐高温鉴定。均设置三次重复实验，结果取平均值。

1、耐旱性

将正常生长3周的幼苗，连续3周(21天)不浇水，第22天统计成活率。拟南芥Col-0全部死亡，但40％转基因植株存活且能正常生长。转空载体对照植株的表型与拟南芥Col-0一致，存活率与拟南芥Col-0没有显著差异。

2、耐盐性

将正常生长3周的幼苗，用400mM NaCl浇灌，然后转移到正常花盆中进行正常管理，2周后统计成活率。拟南芥Col-0几乎全部死亡，但35％转基因植株仍然能存活且正常生长。转空载体对照植株的表型与拟南芥Col-0一致，存活率与拟南芥Col-0没有显著差异。

3、耐高温

将正常生长2周的幼苗，进行高温处理(43℃)4小时，常温恢复生长1周，计算存活率。拟南芥Col-0的存活率为50％，100％转基因植株存活且能正常生长。转空载体对照植株的表型与拟南芥Col-0一致，存活率与拟南芥Col-0没有显著差异。

实施例6、TaDREB3A提高了小麦的抗旱性和对病原菌的耐逆性

一、重组表达载体的构建

1、TaDREB3A基因的获得

根据TaDREB3A基因的序列设计引物对(TaDREB3A-121F和TaDREB3A-121R)，引物末端分别引入SmaI和SpeI酶切位点，以小白麦的cDNA为模板，PCR扩增TaDREB3A基因。

TaDREB3A-121F：5’-TTTCCCGGGATGACGGTAGATCGGAAGGACG-3’；

TaDREB3A-121R：5’-GGGACTAGTTCACAACCCTTCGAAGAACTCG-3’。

PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV807A)回收纯化1.1Kb左右的PCR产物。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶SmaI和SpeI酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶SmaI和SpeI酶切pAHC25(北京拜尔迪生物技术公司购买)，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株(天根生化科技(北京)有限公司购买)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pAHC25-TaDREB3A(在pAHC25的SmaI和SpeI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段)(见图6)。

二、转基因植物的获得

1、基因枪法转化转化小麦愈伤组织

取大田小麦(济麦19；购自山东农业科学院)授粉后14天的未成熟胚，接种于SD2培养基上，26℃黑暗条件下诱导愈伤组织，7-10d后准备基因枪轰击。

取适量金粉(1.0μm)悬浮液(60μg/枪)，将金粉和pAHC25-TaDREB3A的混合液在4℃振荡10min，14000rpm离心5min去上清，加入无水乙醇(10μl/枪加乙醇)准备用于基因枪轰击。

采用PDS-1000/He基因枪(Bia-Rod公司生产)轰击小麦幼胚诱导的愈伤组织。选择1100Psi的可裂膜，对材料进行轰击。轰击后的愈伤组织继续在原渗透压培养基上培养16-18h，然后转入不加筛选剂的SD2培养基(MM培养基也可)中暗条件下(26℃)恢复培养2周。2周后，将愈伤组织转入第一次筛选培养基上(1/2MS+玉米素0.5mg/L+2％蔗糖+双丙氨膦钠3mg/L；或1/2MS+a-萘乙酸1mg/L+6-糠氨基嘌呤0.5mg/L+2％蔗糖+双丙氨膦钠3mg/L也可)在24℃(每天光照10h)条件下筛选分化培养4周。待到愈伤组织分化出绿芽以后，将分化的绿芽转入无激素培养基(1/2MS+双丙氨膦钠4mg/L)上直到小苗伸长(光照与温度同前)，待到小苗伸长到1-2cm时(大概需要4周)，将抗双丙氨膦钠的再生植株移入壮苗培养基(1/2MS+生长素0.5mg/L+多效唑0.5mg/L)上壮苗，再生植株生长到适宜大小(苗高6-8cm，根系较好)时移入营养钵中，在15℃左右光照培养，待苗壮后置于温室。

将得到的阳性苗进行分子鉴定，结果表明得到了转基因植株(T₀代)。T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₄代表示T₃代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₅代表示T₄代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₆代表示T₅代自交产生的种子及由它所长成的植株。

三、转空载体对照植物的获得

用pAHC25代替pAHC25-TaDREB3A，制备转空载体对照植株，方法同步骤二。

四、转基因小麦的耐病实例

2008年10月将转基因植株的T₆代植株、转空载体对照植株的T₆代植株和济麦19(各30株)种植于大田，2009年2月移栽于温室、3月底接种白粉病病原菌E09(北京地区流行的15号小种，其毒性谱：Vir1，3a，3b，3c，3e，5，6，7，8，17，19；购自中国农业科学院植物保护研究所)。两周后观察并拍照，同时进行抗病鉴定，鉴定方法见文献：谢皓，陈孝，盛宝钦，辛志勇，孔凡晶，林志珊，马有志，小麦新种质YW243白粉病抗性鉴定和遗传分析，作物学报，2001 27(6)，715-721。

抗病性鉴定结果表明，转基因植株叶片中，单位面积的发病病斑数明显小于济麦19和转空载体对照植株，即转基因植株对白粉病病原菌的耐性增强了；空载体对照植株的表型与野生型植株一致，对白粉病病原菌的耐性没有显著差异。

实施例7、TaDREB3A提高大豆的抗旱性和耐盐性

一、重组表达载体的构建

1、TaDREB3A基因的获得

根据TaDREB3A基因的序列设计引物对(TaDREB3A-121F和TaDREB3A-121R)，引物末端分别引入Sma I和Spe I酶切位点，以小白麦的cDNA为模板，PCR扩增TaDREB3A基因。

TaDREB3A-121F：5’-TTTCCCGGGATGACGGTAGATCGGAAGGACG-3’；

TaDREB3A-121R：5’-GGGACTAGTTCACAACCCTTCGAAGAACTCG-3’。

PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV807A)回收纯化1.1Kb左右的PCR产物。

2、重组表达载体的构建

①用限制性内切酶Sma I和Spe I酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶Sma I和Spe I酶切pCAMBIA3301(美国Cambia公司)，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株(天根生化科技(北京)有限公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pCAMBIA-TaDREB3A(在pCAMBIA3301的Sma I和Spe I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段)(见图7)。pCAMBIA-TaDREB3A大小为13638bp，植物抗性筛选标记为磷化乙酰转移酶基因bar。

二、转基因植物的获得

根癌农杆菌LBA4404：中国农业科学院作物科学研究保证向公众提供；参考文献：徐淑平，卫志明，黄健秋，钟仲贤，徐悌惟；根癌农杆菌介导B.t.基因和CpTI基因对花椰菜的转化；植物生理与分子生物学学报，2002，28(3)：193-199。

用重组质粒pCAMBIA-TaDREB3A转化根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌。

以东农50(购自东北农业大学农学院)为试验材料，以大豆子叶节为外植体，采用根癌农杆菌LBA4404(Rif^R，Str^R，Km^R，)介导进行遗传转化，具体步骤如下：

1、外植体的获得

选取当年收获的表面光滑无病的健康饱满的东农50种子，利用氯气消毒法灭菌：将选取好的豆种子放在培养皿中，称量96ml的次氯酸钠放于广口瓶中，将其与放好种子的培养皿平稳的放在通风橱内密闭的容器内，称取4ml的浓盐酸混于盛有次氯酸钠广口瓶中，迅速密封容器，进行灭菌。

将灭菌后的种子接种于萌发培养基上，培养条件：温度24±1℃；光周期16/8h。种子萌发5～7d后，去掉种皮，在子叶节下3～4mm处切去下胚轴，纵向切开子叶，去掉顶芽和腋芽。每粒种子获得两个子叶节外植体。萌发培养基的基本成分：B5大量盐和微量盐，MS铁盐，B5维生素，2％蔗糖，0.7mg·L^-16-BA，0.8％琼脂，PH＝5.8。

2、侵染与共培养

在子叶节生长点附近轻划伤口，与重组农杆菌菌液(OD₆₀₀＝0.6-0.8)混合在一起。将其置于摇床上，120rpm侵染30min。将外植体取出，吸干菌液，倒扣在铺有一层滤纸的共培养培养基上，暗培养3d。共培养培养基为：1/10浓度的B5大量盐和微量盐，1/10浓度的MS铁盐，B5维生素，3％蔗糖，3.9g·L^-1Mes，40mg·L^-1AS，0.25ug·L^-1GA₃，1mM·L^-1DTT，8.8mM·L^-1L-cysteine，1.70mg·L^-16-BA，0.5％琼脂，PH＝5.4。

3、丛生芽的诱导及筛选

将共培养后的子叶节用无菌水清洗两次，然后再用加有除菌剂的芽诱导培养基清洗两次，用无菌滤纸吸干子叶节，接种在添加了除菌剂的芽诱导培养基上，进行恢复培养。芽诱导培养基为：B5大量盐和微量盐，MS铁盐，B5维生素，3％蔗糖，0.59g·L^-1Mes，1.7mg·L^-16-BA，100mg·L^-1cefotaxime，0.8％琼脂，PH＝5.6。

在芽诱导培养基上培养7d后，将其转入筛选培养基中进行筛选7d。培养条件为：温度24±1℃；光周期16/8h。筛选培养基为：B5大量盐和微量盐，MS铁盐，B5维生素，3％蔗糖，0.59g·L^-1 Mes，1.7mg·L^-1 6-AP，100mg·L^-1 cefotaxime，5mg·L^-1PPT，0.8％琼脂，PH＝5.6。

4、抗性芽的伸长和生根

将通过筛选的外植体转入芽伸长培养基中，转入时切掉子叶以及下胚轴基部的老化组织，每7d继代一次。芽伸长培养基为：MS大量盐和微量盐，MS铁盐，B5维生素，3％蔗糖，0.59g·L^-1 Mes，0.5mg·L^-1 GA₃，0.1mg·L^-1 IAA，1mg·L^-1 ZR，50mg·L^-1L-asparagine，100mg·L^-1L-pyroglutamic，100mg·L^-1cefotaxime，0.8％琼脂，PH＝5.6。

当芽伸长至3～4cm时，将其贴根剪下，转入生根培养基中进行生根培养。培养条件为：温度24±1℃；光周期16/8h。生根培养基为：1/2浓度的B5大量盐和微量盐，MS铁盐，2％蔗糖，0.59g·L^-1Mes，1mg·L^-1IAB，0.8％琼脂，PH＝5.6。

5、抗性植株的驯化

待根足够发达后，洗净根部的培养基，将小苗移入液体培养液中炼苗3～5d，同时打开瓶口，使无菌苗逐渐适应有菌的外界环境。然后将植株取出转至蛭石中避光培养驯化，同时套袋以保湿，然后逐渐降低湿度、增强光照。待小植株成活后转入正常的土壤中栽培，保持温、湿度和正常光照至结荚成熟。

共获得28株植株，提取叶片DNA进行PCR检测。鉴定结果表明，得到了T₀代转基因植株(转TaDREB3A基因植株)。

T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株。将T₂代植株进行Southern杂交，结果表明，TaDREB3A基因在大豆基因组中以低拷贝的形式存在。

三、转空载体对照植物的获得

用质粒pCAMBIA3301转化根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌，用重组农杆菌转化大豆，得到转空载体对照植株，方法同步骤二。

四、转基因植物的耐逆性鉴定

分别将三个株系的T₂代转基因植株、T₂代转空载体对照植株和野生型植株(各60株)进行耐旱性鉴定和耐盐性鉴定。均设置三次重复实验，结果取平均值。

1、耐旱性

将正常生长3周的幼苗，连续15d不浇水，然后恢复浇水，每天观察表型(见图8)。经过15d的干旱胁迫后，转基因植株仍然生长良好，偶有轻微萎蔫的叶片，但在恢复浇水1天后能迅速恢复正常。野生型植株出现了比较严重的萎蔫现象，恢复浇水后需要5天后才恢复正常。转空载体对照植株的表型与野生型植株一致。

经过15d的干旱胁迫后，分别检测转基因植株和野生型植株的脯氨酸含量、丙二醛含量和SOD活性。结果表明：转TaDREB3A基因可以提高大豆的脯氨酸含量，降低丙二醛含量，提高SOD活性。这些变化对大豆抗逆是有益的。

2、耐盐性

将正常生长4周的幼苗，用300mM NaCl浇灌4天，野生型植株叶片明显变黄，继续浇灌3周，野生型植株全部枯死。野生型植株全部枯死时，平行处理的转基因植株仅是叶片枯黄，100％存活，且能正常结荚。说明转基因植株具有很强抗盐特性(见图9)。转空载体对照植株的表型与野生型植株一致，存活率与野生型植株没有显著差异。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>植物耐逆性相关蛋白TaDREB3A及其编码基因和应用

<130>CGGNARYl02246

<160>4

<210>1

<211>389

<212>PRT

<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)

<400>1

Met Thr Val Asp Arg Lys Asp Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

1                   5                   10                  15

Pro Phe Glu Ile Pro Ala Leu Gln Pro Gly Arg Thr Cys Gly Ala Glu

            20                  25                  30

Glu Ser Thr Arg Ser His Val Leu Val Lys Pro Ile Ala Gly Ser Ser

        35                  40                  45

Asn Leu Pro Cys Asn Glu Tyr Ala Leu Leu Ala Arg Gln Asn Pro Lys

    50                  55                  60

Gly Asp Ala Gln Pro Val Ala Ser Ile Leu Arg Lys Lys Arg Pro Arg

65                  70                  75                  80

Arg Ser Arg Asp Gly Pro Asn Ser Val Ser Glu Thr Ile Arg Arg Trp

                85                  90                  95

Lys Glu Val Asn Gln Gln Leu Glu His Asp Pro Gln Gly Ala Lys Arg

            100                 105                 110

Ala Arg Lys Pro Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys Gly Cys Met Gln Gly

        115                 120                 125

Lys Gly Gly Pro Glu Asn Thr Gln Cys Gly Phe Arg Gly Val Arg Gln

    130                 135                 140

Arg Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg Val

145                 150                 155                 160

Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala Glu Asp Ala Ala Arg

                165                 170                 175

Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Arg Ala Met Tyr Gly Ala Leu Ala Arg Thr

            180                 185                 190

Asn Phe Pro Val His Pro Ala Gln Ala Pro Ala Val Ala Val Ala Ala

        195                 200                 205

Ala Ile Glu Gly Val Val Arg Gly Ala Ser Ala Ser Cys Glu Ser Thr

    210                 215                 220

Thr Thr Ser Thr Asn His Ser Asp Val Ala Ser Ser Leu Pro Arg Gln

225                 230                 235                 240

Ala Gln Ala Leu Glu Ile Tyr Ser Gln Pro Asp Val Leu Glu Ser Thr

                245                 250                 255

Glu Ser Val Val Leu Thr Pro Val Glu His Tyr Ser His Gln Asp Ser

            260                 265                 270

Val Pro Asp Ala Gly Ser Ser Ile Ala Arg Ser Thr Ser Glu Glu Asp

        275                 280                 285

Val Phe Glu Pro Leu Glu Pro Ile Ser Ser Leu Pro Asp Gly Glu Ser

    290                 295                 300

Asp Gly Phe Asp Ile Glu Glu Leu Leu Arg Leu Met Glu Ala Asp Pro

305                 310                 315                 320

Ile Glu Val Glu Pro Val Asn Gly Gly Ser Trp Asn Gly Val Glu Ile

                325                 330                 335

Gly Gln Gln Glu Pro Leu Tyr Leu Asp Gly Leu Asp Gln Gly Met Leu

            340                 345                 350

Glu Gly Met Leu Gln Ser Asp Tyr Pro Tyr Pro Met Trp Ile Ser Glu

        355                 360                 365

Asp Arg Ala Met His Asn Pro Ala Phe His Asp Ala Glu Met Ser Glu

    370                 375                 380

Phe Phe Glu Gly Leu

385

<210>2

<211>1325

<212>DNA

<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)

<400>2

gcgaacgcta gatatctgga cccgatccgg atcgggccgg ccatgacggt agatcggaag     60

gacgctgagg cggcggcggc ggcggccgca cccttcgaga tcccggcgct ccagcctgga    120

agaacttgtg gagcagagga aagtacccgg agtcatgttc tcgtcaaacc aatagcagga    180

agcagtaatc ttccctgtaa tgaatatgca ctcttggcgc ggcaaaaccc caagggagat    240

gcgcagccag tggcatctat tctgcggaaa aagcgacctc ggagatcacg tgatgggcct    300

aattcagtct ctgaaacgat caggcgatgg aaagaagtga accaacaact ggagcatgat    360

ccacagggtg caaagagggc gaggaagcca cctgcaaagg gttcaaagaa gggctgtatg    420

caggggaaag gaggacctga gaatacacaa tgtggattcc gtggtgtaag gcaacgtact    480

tgggggaagt gggttgctga aattcgggag ccaaatcggg tgagcaggct ctggttggga    540

acgttcccca ctgctgagga tgctgcccgt gcttatgacg aggcagccag agcaatgtat    600

ggcgcactgg ctcgtaccaa cttccctgtg catcctgcac aagctcctgc tgtggctgta    660

gcagcggcaa ttgaaggtgt tgtacgtggt gcttcagcat catgtgagtc tactacaaca    720

tccaccaacc actcagatgt tgcttcttcc ttgccgcgac aagctcaagc tcttgagatt    780

tactcccagc cagatgtgct tgagtccacc gaatcagttg tgcttactcc tgttgagcat    840

tacagccatc aagacagtgt tcctgacgct ggctcaagca ttgcaaggag cacatccgaa    900

gaggatgtgt ttgagccatt ggagcctatt tccagtttgc cggatgggga atctgacggt    960

tttgatatag aagaattatt aagattgatg gaagccgacc caattgaagt tgagccggtc   1020

aacgggggct cctggaatgg ggtggagatt ggccagcagg aacctctcta cctggatggc   1080

ttggaccaag gcatgctgga gggcatgctg cagtctgatt atccttaccc aatgtggata   1140

tcagaggatc gggccatgca caaccctgcc ttccatgatg ctgagatgag cgagttcttc   1200

gaagggttgt gatgaattac cggcggccaa accatgtcta tggtgtttgg tcggcttgcc   1260

cttcggtgtc cgctgctgcg ctccagtgaa gatcaaatgg tggaccagaa gattggattc   1320

ctctg                                                               1325

<210>3

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gaattctacc gacattaccg acattaccga cattaccgac atgtcgac                  48

<210>4

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

gaattctatt tttattattt ttattatttt tattattttt atgtcgac                  48

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因，优选为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’端第43至1212位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。

3.含有权利要求2所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为YEP-GAP-TaDREB3A、pBI121-TaDREB3A、pAHC25-TaDREB3A或pCAMBIA-TaDREB3A；

所述YEP-GAP-TaDREB3A为将权利要求2所述基因插入YEP-GAP的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段插入YEP-GAP的EcoRI和XhoI酶切识别位点之间得到的重组质粒；

所述pBI121-TaDREB3A为将权利要求2所述基因插入pBI121的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段插入pBI121的BamHI和XhoI酶切识别位点之间得到的重组质粒；

所述pAHC25-TaDREB3A为将权利要求2所述基因插入pAHC25的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段插入pAHC25的SmaI和SpeI酶切识别位点之间得到的重组质粒；

所述pAHC25-TaDREB3A为将权利要求2所述基因插入pCAMBIA3301的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5’端第43位-1212位核苷酸所示的DNA片段插入pCAMBIA3301的Sma I和Spe I酶切识别位点之间得到的重组质粒。

5.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：权利要求2所述基因通过权利要求3或4所述重组表达载体导入所述目的植物中；所述耐逆性为耐非生物胁迫或抗病。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述耐非生物胁迫为耐旱和/或耐盐和/或耐高温；所述目的植物为拟南芥，优选为哥伦比亚生态型拟南芥；所述方法为将权利要求2所述基因通过所述pBI121-TaDREB3A导入所述目的植物中。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述目的植物为小麦，优选为济麦19；

所述抗病为抗白粉病；所述白粉病是由白粉病病原菌E09引起的；

所述方法为将权利要求2所述基因通过所述pAHC25-TaDREB3A导入所述目的植物中。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述耐非生物胁迫为耐旱和/或耐盐；

所述目的植物为大豆，优选为东农50；

所述方法为将权利要求2所述基因通过所述pCAMBIA-TaDREB3A导入所述目的植物中。

10.权利要求1所述蛋白作为转录因子的应用。

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