CN103360481A - 植物耐逆性相关蛋白TaDREB4A及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了植物耐逆性相关蛋白TaDREB4A及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

Description

植物耐逆性相关蛋白TaDREB4A及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及植物耐逆性相关蛋白TaDREB4A及其编码基因和应用。

背景技术

干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响小麦生长、发育的障碍因子。因此，了解小麦对逆境条件的应答与信号传导机制，提高小麦品种的抗逆性，成为小麦遗传研究及小麦品种改良的重要任务之一。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。

在干旱、高盐和低温等逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。

转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等作用的影响。

目前已知在植物中与胁迫相关的转录因子主要有：具有AP2结构域的AP2(APETALA2)/EREBP(乙烯应答元件结合蛋白，ethylene responsive element bindingprotein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP(basic region/leucinezipper motif transcription factors)类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY转录因子家族、含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的MYB家族。

DREB(脱水应答元件结合蛋白，DRE-binding protein)类转录因子是AP2家族中EREBP-like亚家族中的一个成员。DREB和EREBP类转录因子它们在氨基酸序列上没有显著的相同性，但都含有一段非常保守的由58个左右氨基酸组成的DNA结合区域(EREBP/AP2结构域)。蛋白质三维分析表明，该区域含有3个β-折叠，对识别各类顺式作用元件起关键作用。其中位于第二个β-折叠中的第14、19位的两个氨基酸残基的差异，决定这类转录因子与不同顺式作用元件的特异结合。

由于植物的逆境耐性是由多基因调控的复杂性状，依靠导入单个功能性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提高。因此，利用一个关键性转录因子促进多个功能基因的表达，从而增强植物的抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供植物耐逆性相关蛋白TaDREB4A及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，获自小白麦，命名为TaDREB4A蛋白，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)至6)中任一所述的DNA分子：

1)序列表的序列2自5’末端第128位至1309位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表的序列2自5’末端第128位至1312位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表的序列2自5’末端第128位至1337位核苷酸所示的DNA分子；

4)序列表的序列2所示的DNA分子；

5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；

6)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体包括双元农杆菌载体和可用于微弹轰击的载体等。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接根据表型筛选。

所述重组表达载体具体可为将所述基因插入pBI121质粒的多克隆位点得到的重组质粒。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。

所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的生物中。携带有所述基因的重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化所述生物的细胞或组织。

所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥。

所述耐逆性可为耐高温和/或耐旱和/或耐盐。

所述蛋白作为转录因子的应用也属于本发明的保护范围。

TaDREB4A基因在干旱、高盐、高温、低温、脱落酸、乙烯的诱导下表达，可以特异的调控含有DRE/CRT顺式元件(核心序列：CCGAC)的基因的转录表达。将TaDREB4A基因导入植物，可以提高植物的耐盐性、耐旱性和耐高温性。本发明为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

附图说明

图1为TaDREB4A基因受胁迫诱导表达的实时荧光定量PCR图谱。

图2为酵母单杂交系统证明转录因子体内结合特异性和激活特性的原理示意图。

图3为野生型拟南芥和转基因拟南芥的耐高温性比较。

图4为野生型拟南芥和转基因拟南芥的抗旱性比较。

图5为野生型拟南芥和转基因拟南芥的耐盐性比较。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

小白麦(Triticum aestivum cv.Xiaobaimai)为普通小麦(Triticum aestivum L.)的一个品种，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，公众也可从国家种质资源库获得(编号为ZM242)；提及小白麦的文献为：孙海桃等，小麦TaDREB6转录因子互作蛋白的筛选，中国农业科学，2011，44(22)：4740-4747.；提及小白麦的文献为：Isolation and molecular characterization of the Triticum aestivum L.ethylene-responsive factor 1(TaERF1)that increases multiple stresstolerance，Plant Mol Biol(2007)65：719-732，Zhao Shi Xu，Lan Qin Xia，MingChen，Xian Guo Cheng，Rui Yue Zhang，Lian Cheng Li，Yun Xing Zhao，Yan Lu，Zhi YongNi，Li Liu，Zhi Gang Qiu，You Zhi Ma)。

实施例1、TaDREB4A蛋白及其编码基因的发现的克隆

一、mRNA的分离

将水培的生长10天左右的小麦(品种为小白麦)三叶期幼苗进行干旱处理2小时(处理方法：将幼苗小心的取出，注意不要伤根，用干净的吸水纸将叶片及根部的水分吸干，再将幼苗放在干净的吸水纸上，置于阴凉处2小时)，用液氮速冻，-80℃保存备用。采用Quikprep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia)进行mRNA的分离。

二、cDNA文库的构建及滴度测定

1、cDNA文库的构建

采用Timesaver^TMcDNA Synthesis Kit(Pharmacia)将步骤一中分离得到的mRNA合成cDNA双链，并加EcoRI/NotI adaptor；采用ZAP

Predigested

III Gold Cloning Kit(Stratagene)进行cDNA文库的构建，共得到500ul库液。

2、滴度的测定

(1)取1ul库液用SM Buffer稀释1000倍；

(2)分别取1ul，10ul，100ul稀释液入三个10ml离心管中，分别加100ul感受态宿主菌XL1-Blue MRF’(OD₆₀₀为1.0)，于37℃温浴20min；

(3)分别加入3ml顶胶(50℃)混匀，立即铺于固体NZY平板上，凝固后倒置，37℃培养过夜；

(4)根据平板噬菌斑数，求平均值，即为库容量。

计算公式：

噬菌斑数(pfu)×稀释因子

×1000ul/ml。

经计算，该cDNA文库的滴度为3.0×10⁶个噬菌斑。

三、cDNA文库的筛选

1、探针的准备

根据已克隆的DREB基因的AP2保守区序列设计引物WAPF和WAPR，以普通小麦的cDNA为模板进行PCR扩增，程序及体系如下：

引物序列：WAPF：5’ACC GCG GTG TGA GGC AGA GGA 3’

WAPR：5’TGA GAA GTT GAC ACG TGC TTT GGC 3’

反应体系(50μl)：

扩增条件(PTC-200)：94℃2min；94℃30sec、50℃45sec、72℃45sec，30个循环；72℃2min。

取扩增产物2ul在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，溴化乙啶染色，紫外凝胶成像仪扫描观察，在180bp的位置处是否有一条亮带。

2、探针的回收

采用Agarose Gel DNA Purifiication Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.：DV805A)回收纯化探针。

(1)在紫外灯下迅速切下含有目的DNA片段的带，大概在180bp的位置处，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量(提前记录1.5ml离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100ul)；加入3个凝胶体积的DR-I溶液，混合均匀后于75℃加热，间断混合，直至凝胶块完全熔化(约6-8min)；

(2)加0.5个DR-I体积的DR-II溶液，再加入异丙醇至终浓度为20％，混合均匀；

(3)吸取步骤(2)中的混合液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管中)，3600rpm离心1min，弃滤液；

(4)将制备管置回离心管，加0.5ml RinseA溶液，3600rpm离心30s，弃滤液；

(5)将制备管置回离心管，加0.7ml RinseB溶液，3600rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用0.7ml RinseB溶液洗涤一次；

(6)将制备管置于离心管中，最高速度离心1min；

(7)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25ul水，室温静置1min，最高速度离心1min洗脱DNA。

(8)洗脱出的即为目的DNA，保存备用。

其中，DR-I溶液：凝胶熔化剂(含DNA保护剂，防止DNA在高温下降解)。室温密闭贮存(TaKaRa公司，Code No.：DV805A)。

DR-II溶液：高离液序列溶液(促使大于100bp的DNA片段选择性结合到DNA制备膜上)。室温密闭贮存。若出现沉淀，应于70℃温育溶解并冷却至室温后再使用(TaKaRa公司，Code No.：DV805A)。

RinseA溶液：洗涤液。室温密闭贮存(TaKaRa公司，Code No.：DV805A)。

RinseB溶液：洗涤液。室温密闭贮存(TaKaRa公司，Code No.：DV805A)。

3、转膜

(1)取1ul库液(见cDNA文库的构建部分)，在直径150mm的培养皿中培养噬菌体，大概6.0×10³pfu；

(2)噬菌斑培养好后需要放在4℃冷却，临用时取出置于超净台吹干，防止转膜时顶胶被膜粘起；

(3)将Hybrond-N⁺膜剪成圆形，比直径为150mm的培养皿稍小，用铅笔在膜上表明编号及日期(与培养皿对应)；

(4)用镊子夹住膜两边，有字面朝上，中间先接触平板，慢慢松开，不要移动，不要有气泡，使膜自然摊平，完全摊平后，计时；

(5)用注射器针头在膜上扎三个不对称的孔，在培养皿背面对应的位置用记号笔做好标记；

(6)3min后，用镊子从一边开始轻轻揭起膜，不要带起顶胶；

(7)将膜迅速放入盛有变性液的培养皿中(放一层滤纸及15ml变性液)变性7min，有字面朝下，注意避免溶液到达膜的上表面；

(8)将膜转移至盛有中和液的培养皿中(放一层滤纸及15ml中和液)中和两次，每次3min；

(9)然后将膜转入漂洗液中洗30min，可轻轻摇动；

(10)取出膜，在干净的滤纸上吸干，有字面朝下；

(11)用保鲜膜将膜包好，在紫外交联仪上交联1min，4℃存放备用；

其中，

变性液：  NaCl      1.5M        (87.75g/1000ml)

          NaOH      0.5M        (20g/1000ml)

中和液：  NaCl      1.5M        (87.75g/1000ml)

          Tris      0.5M        (60.57g/1000ml)

          EDTA      0.001M      (2ml 0.5M贮存液/1000ml)

加入700-800ml水溶解，用HCl调pH值至8.0，最后定容至1000ml。漂洗液：Tris-HCl(pH7.5)0.2M(200ml 1.0M贮存液/1000ml)

2×SSC(100ml 20×SSC/1000ml)

4、预杂交和杂交反应

根据要杂交的膜的数量配制预杂交液，每10ml预杂交液的成分组成如下。

*ssDNA加入之前需变性：煮沸10min后立即放冰上10min。

将预杂交液混匀，于65℃预热至澄清后放入尼龙膜，65℃预杂交5-6h(新膜)；探针标记完后，加入等体积的0.4N NaOH溶液，混匀后于室温静置10min使探针变性，然后加入到预杂交液中，65℃杂交过夜；

5、洗脱

在55℃-65℃条件下洗膜。

I洗：2×SSC/0.5％SDS，洗两次，每次15min；

II洗：0.1×SSC/0.1％SDS，洗膜过程中检测信号强度，确定洗脱时间。

用滤纸吸干洗好的膜，保鲜膜包好，压X-光片。

6、阳性克隆的二轮筛选

(1)将X光片与膜对齐，确定位置，描下膜上的三个不对称点的位置；

(2)在读片机上放上X光片及相应的培养皿，根据不对称点使培养皿定位；

(3)用去头的1ml枪头取出确定的阳性杂交斑，放在1ml SM缓冲溶液中，加入50ul氯仿；

(4)振荡30秒，室温放置1小时，离心，取上清；

(5)取10-50ul上清再次铺板，培养噬菌体进行二次筛选；

(6)二次筛选的步骤同上：转膜、预杂交和杂交反应、洗脱、压X-光片，得到单个阳性噬菌斑。

四、得到TaDREB4A

1、集群内删除(Mass excision)

(1)制备XL1-Blue MRF’和XLOLR菌。用液体LB培养基培养XL1-Blue MRF’和XLOLR菌，30℃过夜，培养基中添加0.2％(w/v)麦芽糖、10mM MgSO₄和抗生素，分别为12.5μg/ml四环素和50μg/ml卡那霉素；

(2)第二天，1000×g离心10min收集菌体，用10mM MgSO₄重悬，使OD₆₀₀达到1.0；

(3)在一个10ml的无菌离心管中加入：

1μl库液(见cDNA文库的构建部分)(约含6.0×10³噬菌体颗粒)

XL1-Blue MRF’            200μl  (OD₆₀₀为1.0)

ExAssist助手噬菌体        2μl(＞1×10¹⁰pfu/ml)

(4)37℃温育15min；

(5)加入20ml液体NZY培养基，37℃振荡培养2.5-3h；

(6)65-70℃加热20min；

(7)1000×g离心10min，上清移至一个新管中；

(8)在一个1.5ml的离心管中混合200μl XLOLR菌和1μl上清；

(9)37℃温育15min；

(10)取10μl、100μl菌液分别涂于LB固体培养基(含氨苄50μg/ml)上，37℃培养过夜。

2、cDNA文库插入片段的检查

(1)随机挑取步骤1中集群内删除的单菌落，提取它们的质粒DNA；

(2)用限制内切酶EcoR I(Takara)消化，反应体系10μl：

(3)37℃消化2h，0.8％琼脂糖凝胶电泳，发现95％以上的载体有插入片段，说明95％以上的噬菌体含有重组子，因此文库实际含有的重组子为2.85×10⁶(cDNA文库的滴度为3.0×10⁶)。50％以上的重组子的插入片段在800bp-4Kb之间，说明构建的文库较完整。

3、单克隆内删除(Single-clone excision)

(1)将得到单个阳性噬菌斑(见三、cDNA文库的筛选部分的步骤6二次筛选cDNA文库)从平板上抠下，放入到一个无菌的、已加有500μl SM缓冲液和20μl氯仿的离心管中，漩涡振荡10sec，4℃储存；

(2)用液体LB培养基培养XL1-Blue MRF’和XLOLR菌，30℃过夜，培养基中添加0.2％(w/v)麦芽糖、10mM MgSO₄和抗生素，分别为12.5μg/ml四环素和50μg/ml卡那霉素；

(3)第二天，1000×g离心10min收集菌体，用10mM MgSO₄重悬，使OD₆₀₀达到1.0；

(4)在一个10ml的无菌离心管中加入：

XL1-Blue MRF’        200μl(OD₆₀₀为1.0)

噬菌体贮存液          250μl(至少含1×10⁵噬菌体颗粒)

ExAssist助手噬菌体    1μl(＞1×10¹⁰pfu/ml)

(5)37℃温育15min；

(6)加入3ml液体NZY培养基，37℃振荡培养2.5-3h；

(7)于65-70℃水浴离心管20min，然后1000×g离心15min；

(8)将上清移至一个新的离心管中，即为噬菌粒悬浮液；

(9)在一个1.5ml的离心管中加入200μl步骤(3)制备好的XLOLR菌和步骤(8)制备好的噬菌粒悬浮液100μl，再加入300μl液体NZY培养基，37℃温育45-60min；

(10)取50μl菌液涂于LB固体培养基(含氨苄50μg/ml)上，37℃培养过夜；

(11)第二天挑取阳性克隆，用液体LB培养基培养过夜，提取质粒，用EcoRI酶切，电泳检测插入片段长度。

(12)选取插入片段大于800bp的克隆进行测序，在ABI733测序仪(GenecoreBiological Company)上，采用双脱氧核苷酸链终止法测定序列，将得到的全序列与EMBL Bank以及GENEBANK等核苷酸数据库比较，用DNASIS软件进行分析。发现18号克隆有一个保守的AP2/EREBP结构域。且基因结构完整。

(13)分析18号克隆的核苷酸序列及对应的氨基酸序列。

通过上述步骤，发现了新的基因序列，并得到了其相应的蛋白序列。将序列表的序列1所示蛋白质命名为TaDREB4A蛋白，由394个氨基酸残基组成，自氨基末端第75-81位氨基酸残基序列和第111-115位氨基酸残基为两个可能的核定位信号区，第137-194位氨基酸残基序列为保守的AP2/EREBP结构域。将TaDREB4A蛋白的编码基因命名为TaDREB4A基因，其开放阅读框为序列表的序列2自5’末端第128位至1312位核苷酸。

实施例2、实时荧光定量PCR分析TaDREB4A基因的表达特性

一、苗龄为10天的小白麦幼苗，进行以下处理：

(1)干旱处理：将水培的小麦幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，干旱培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(2)NaCl处理：将小麦幼苗置于2％的由NaCl和Na₂SO₄组成的钠盐溶液中(NaCl与Na₂SO₄的质量百分比为3∶2)中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后分别取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(3)脱落酸处理：将小麦幼苗置于200μM的脱落酸(ABA)溶液中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(4)低温处理：将小麦幼苗置于4℃培养箱，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(5)高温处理：将小麦幼苗置于42℃下，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(6)乙烯处理：小麦幼苗置于含有乙烯的塑料袋中，光照培养30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时后分别取出并用液氮速冻，-80℃保存备用。

(7)对照处理：直接取未经任何处理的小麦幼苗-80℃冻存作为对照。

二、实时荧光定量PCR分析TaDREB4A基因的表达特性

1、将步骤一的各个样本采用Quikprep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia)进行mRNA的分离。

2、采用R103-Quant_Reverse_Transcriptase(TIANGEN)将mRNA反转录为cDNA。

3、实时荧光定量PCR

用于检测TaDREB4A基因的引物对如下：

TaDREB4ARTF：5’-GATGTGTTCGAGCCATTGGAG-3’；

TaDREB4ARTR：5’-TGGTCCAAGCCATCCAGGTAG-3’。

用于检测内参基因(actin基因)的引物对如下：

actin-2F：5’-CTCCCTCACAACAACCGC-3’；

actin-2R：5’-TACCAGGAACTTCCATACCAAC-3’。

将对照样本中TaDREB4A基因的表达量作为1，与对照样本相比各个样本中TaDREB4A基因的相对表达量见图1(横坐标的单位为小时，纵坐标为相对表达量)。

实施例3、TaDREB4A的激活特性

用酵母单杂交系统证明转录因子的激活特性的主要原理如图2所示，将DRE顺式作用元件和突变体DRE顺式作用元件分别构建到pHISi-1载体和pLacZi载体的基本启动子Pmin(minimal promoter)上游，Pmin启动子下游连接报道基因(his3、LacZ和URA3)。当连接有编码转录因子的目的基因的表达载体YEP-GAP(不含激活功能)分别转化到连有DRE顺式作用元件和突变体DRE顺式作用元件的酵母细胞后，如果连有突变体DRE顺式作用元件的酵母细胞中的报道基因不能表达，而连有特定的DRE顺式作用元件的酵母细胞中的报道基因能够表达，说明该转录因子能与DRE顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了Pmin启动子，促使报道基因表达。从而证明了目的转录因子的体内结合特异性和激活功能。

一、将TaDREB4A基因构建到表达载体YEP-GAP上

1、提取小白麦的总RNA并反转录为cDNA。

2、以步骤1的cDNA为模板，用TaDREB4A-EI和TaDREB4A-XI组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

TaDREB4A-EI(上游引物)：5’-GGGGAATTCATGACGGTAGATCGGAAGGAC-3’；

TaDREB4A-XI(下游引物)：5’-GGGCTCGAGATGGTTTGGCCGCCGCAAAG-3’。

PCR反应体系(50μl)：模板(60ng/ul)0.5μl、dNTP(10mM)1μl、上游引物(25μM)0.5μl、下游引物(25μM)0.5μl、10×buffer 5μl、Taq(5U/μ1)0.4μ1、ddH₂O 42.1μl。

PCR扩增条件(PTC-200)：94℃2min；94℃30sec、58℃45sec、72℃70sec，30个循环。

3、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切步骤2的PCR扩增产物，得到酶切产物。

4、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切YEP-GAP质粒(Liu Q，Kasuga M，SakumaY，Abe H，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.，1998)，回收载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒YEP-GAP-TaDREB4A。

二、TaDREB4A的体内结合特异性和激活特性的验证

1、酵母报道子的构建

将含有4个DRE元件的片段5’-GAATTC-DRE-DRE-DRE-DRE-GTCGAC-3’(DRE的核心序列：TACCGACAT)分别构建到pHis-1载体(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)的Pmin_HIS3启动子和pLacZi载体(MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)P_CYCI启动子上游，分别得到重组载体pHis-1-DRE和pLacZi-DRE，用Xho I和Nco I内切酶分别将pHis-1-DRE和pLacZi-DRE载体切成线状。先将线状pHis-1-DRE载体转化到酵母细胞(YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)内，获得能在SD/His^-培养基上正常生长的酵母转化子(Yeast transformant)。接着以这种酵母转化子为寄主细胞，继续转化含有4个重复DRE元件的pLacZi-DRE载体。这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶的SD/His^-/Ura^-培养基上，选择获得含有pHis-1-DRE和pLacZi-DRE的正常双重酵母报道子；将4个DRE元件的核心序列CCGAC突变成TTTTT(MDRE)，即5’-GAATTC-MDRE-MDRE-MDRE-MDRE-GTCGAC-3’，按正常的双重酵母报道子构建方法，再构建一个含4个MDRE盒的突变体双重酵母报道子。

2、PEG/LiAc法转化酵母及结果分析

(1)接种酵母菌株(YM4271株系，MATCHMAKER One-Hybrid System，Clontech公司)到1ml YPD液体培养基中，剧烈震荡2分钟，分散团块后将悬浮液转至含有50ml YPD液体培养基的三角瓶中，30℃/250rpm摇过夜，测OD600＝1.7-1.8(计数约4×10⁷个/mL)；

(2)取30ml步骤(1)过夜培养物接到300ml新鲜的YPD培养基中，30℃/250rpm培养，约3小时至OD600＝0.5±0.1，室温1000g离心5min，收集菌体，弃上清，用1/2体积1×TE悬浮，1000g/5min离心；

(3)吸弃上清，用1.5ml新鲜配制的1×TE/LiAc溶液悬浮，振荡混匀备用；

(4)取出0.1ml酵母感受态进行转化，依次加下列溶液：0.1μg表达载体YEP-GAP-TaDREB4A、0.1mg ssDNA(鲑鱼精DNA，Sigma)、0.6mlPEG/LiAc高速振荡1分钟，30℃/200rpm振荡培养30分钟；

(5)加入70ul DMSO(sigma#D8779)，轻轻倒置混匀，42℃热激30分钟，其间轻轻振荡，冰浴2分钟，室温1000g离心5min；

(6)吸弃上清，加入0.5ml 1×TE buffer悬浮细胞；

(7)用接种环蘸取悬浮液，分别在含有0，15mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-选择性培养基上画线培养；

(8)平板的一半培养步骤1构建的正常双重酵母报道子，另一半培养步骤1构建的突变体双重酵母报道子，以便做对照分析；

(9)颠倒放置于培养箱中，30℃培养3-4天；

(10)结果发现在0mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上正常的酵母报道子和突变的酵母报道子都有生长，但突变的酵母报道子的直径明显小；而在15mmol/L3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上正常的酵母报道子能正常生长，但突变的酵母报道子被抑止没有生长。

3、半乳糖苷酶活性检测

(1)从0mmol/L 3-AT的SD/His^-/Ura^-/Trp^-的培养基平板上分别挑取正常的酵母报道子和突变的酵母报道子菌落。转至YPD液体培养基中，于30℃振荡培养，待长至对数生长后期，取1.5ml菌液，3000rpm离心30s；

(2)弃上清，控干管中液体，将离心管置于液氮中速冻10min，取出使其自然融解，加50ul Z/X-gal溶液，30℃温育，结果发现正常的酵母报道子在6-8h内变蓝，而突变的酵母报道子在12h内没有变化，仍为白色。说明转录因子TaDREB4A能与DRE顺式作用元件结合，且具有激活功能，激活了Pmin启动子(还是Pmin_HIS3启动子或P_CYCI启动子？)，促使报道基因表达。从而证明了TaDREB4A的体内结合特异性和激活功能。

三、药剂配制：

(1)YPD液体培养基

细菌培养用酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract)    10g/L

细菌培养用胰化蛋白胨(Bacto-Peptone)          20g/L

调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃以后加入40％的Glucose，使其终浓度为20g/L。

(2)SD/His^-/Ura^-/Trp^-选择性培养基

不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogen base)    6.7g/L

营养缺陷型混合物(drop-out media without His/Ura/Trp)100ml

琼脂粉(Bacteriological agar)            20g/L

调节pH至5.8，121℃/15min灭菌，降至60℃后加入40％Glucose，使其终浓度为20g/L。

(3)营养缺陷型混合物(Drop-out mix)：(10X)

(4)1×PEG/LiAc：

50％(w/v)PE63350        8ml

10×TE buffer           1ml

10×LiAc                1ml

(5)10×TE Buffer：

100mM Tris-Hcl

10mM EDTA，pH＝7.5

121℃高压灭菌，室温保存。

(6)1×TE/LiAc：

10×TE buffer        1ml

10×LiAc             1ml

ddH₂O                8ml

(7)Z Buffer：

调节pH至7.0，121℃/15min灭菌，4℃保存。

(8)X-gal储存液(X-gal Stock Solution)：

用N，N-dimethyl-formamide(DMF)溶解X-gal，使其终浓度为20mg/ml，-20℃贮存。

(9)含有X-gal的Z buffer缓冲液100ml(Z buffer with X-gal)，注意现用现配：

Z buffer                            98ml

β-疏基乙醇(β-mercaptoethanol)     0.27ml

X-gal储存液(X-gal stock solution)   1.67ml。

实施例4、转基因植物的获得及其耐逆性鉴定

一、重组表达载体的构建

1、提取小白麦的总RNA并反转录为cDNA。

2、以步骤1的cDNA为模板，用TaDREB4A-12lF和TaDREB4A-12lR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

TaDREB4A-121F(上游引物)：5’-GGGGGATCCATGACGGTAGATCGGAAGGAC-3’；

TaDREB4A-121R(下游引物)：5’-GGGCTCGAGATGGTTTGGCCGCCGCAAAG-3’。

PCR反应体系(50μ1)：模板(60ng/ul)0.5μl、dNTP(10mM)1μl、上游引物(25μM)0.5μl、下游引物(25μM)0.5μl、2×GC buffer 5μl、Taq(5U/μl)0.4μl、ddH₂O 42.1μl。

PCR扩增条件(PTC-200)：94℃2min；94℃40sec、62℃40sec、72℃90sec，35个循环。

3、用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切步骤2的PCR扩增产物，得到酶切产物。

4、用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切pBI121质粒(Clonteeh公司)，回收载体骨架(约12654bp)。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pBI121-TaDREB4A。根据测序结果，对重组质粒pBI121-TaDREB4A进行结构描述如下：在pBI121质粒的BamHI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第128位至1337位核苷酸所示的TaDREB4A基因(其中第128至1312位核苷酸为开放阅读框)。

二、转基因植物的获得

1、用重组质粒pBI121-TaDREB4A转化农杆菌C58(北京拜尔迪生物技术公司)，得到重组农杆菌。

2、将重组农杆菌接种于YEP液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时。

3、将步骤2的菌液转至YEP液体培养基(含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平)中，28℃、300rpm培养约14小时(菌液OD600达到1.5-3.0)。

4、将步骤3的菌液4℃、4000g离心10min，收集菌体并用10％蔗糖水溶液(含0.02％体积比的silwet-L77)稀释至OD600约为0.8-1.0。

5、将整株哥伦比亚生态型拟南芥(又称Col-0或野生型拟南芥，SALK公司)与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布；24小时后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T₁代种子。

T₁代种子收获后在MS培养基(含有50μg/L的卡那霉素)中筛选抗性植株，将抗性植株移栽到土中，收获T₂代种子并将其培育为植株(T₂代植株)。

分别提取T₁代植株和T₂代植株的叶片的总RNA并反转录为cDNA，用TaDREB4A-121F和TaDREB4A-121R组成的引物对对来自各个样本的cDNA进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的植株即转基因植株。对于某一T₁代植株，如果其T₂代植株均PCR鉴定为阳性，则该植株为纯合的转基因植株，该植株及其后代即为1个转基因株系。

T₂代转基因植株自交产生T₃代种子。

三、转空载体植物的获得

用pBI121质粒代替重组质粒pBI121-TaDREB4A，其它同步骤二，得到转空载体植株的T₃代种子，作为转基因植株T₃代种子的对照。

四、转基因植物的耐高温鉴定

将一个转基因株系的T₃代植株、一个转空载体株系的T₃代植株和哥伦比亚生态型拟南芥(每个株系60株)分别进行耐高温鉴定(各株系采用平行处理，设置三次重复实验，结果取平均值)，具体步骤如下：

种子萌发一周后在43℃高温中放置2小时、4小时或8小时，然后恢复25℃正常培养。

恢复正常培养1周后拍照并统计存活率。照片见图3，其中A为高温处理2小时再恢复培养一周后植物的照片，B为高温处理4小时再恢复培养一周后植物的照片，C为高温处理8小时再恢复培养一周后植物的照片。高温处理2小时再恢复培养一周后，野生型拟南芥和转基因株系拟南芥的存活率均为100％。高温处理4小时再恢复培养一周后，野生型拟南芥的存活率为70％，而转基因株系拟南芥的存活率为100％。高温处理8小时再恢复培养一周后，野生型拟南芥全部死亡(存活率为0％)，转基因株系植拟南芥的存活率高达55％。转空载体植株的表型以及存活率均与哥伦比亚生态型拟南芥一致。

五、转基因植物的耐旱鉴定

将一个转基因株系的T₃代植株、一个转空载体株系的T₃代植株和哥伦比亚生态型拟南芥(每个株系60株)分别进行耐旱鉴定(各株系采用平行处理，设置三次重复实验，结果取平均值)，具体步骤如下：

将萌发3周后的幼苗进行干旱处理(即连续三周不浇水)。

干旱处理结束后拍照并统计存活率。照片见图4。转空载体植株的表型与哥伦比亚生态型拟南芥一致。哥伦比亚生态型拟南芥全部死亡。转空载体植株全部死亡。转基因株系植株的存活率为92％。

六、转基因植物的耐盐鉴定

将一个转基因株系的T₃代植株、一个转空载体株系的T₃代植株和哥伦比亚生态型拟南芥(每个株系60株)分别进行耐盐鉴定(各株系采用平行处理，设置三次重复实验，结果取平均值)，具体步骤如下：

将萌发3周后的幼苗用400mM NaCl水溶液浇灌一次，然后正常管理，2周后拍照并统计存活率。照片见图5。转空载体植株的表型与哥伦比亚生态型拟南芥一致。哥伦比亚生态型拟南芥存活率为5％，转空载体植株全部死亡，转基因株系植株的存活率为62％。

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1)至6)中任一所述的DNA分子：

1)序列表的序列2自5’末端第128位至1309位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表的序列2自5’末端第128位至1312位核苷酸所示的DNA分子；

3)序列表的序列2自5’末端第128位至1337位核苷酸所示的DNA分子；

4)序列表的序列2所示的DNA分子；

5)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列杂交且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子；

6)与1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物耐逆性相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体为将权利要求2或3所述基因插入pBI121质粒的多克隆位点得到的重组质粒。

6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组载体导入所述目的植物中。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

9.如权利要求6至8中任一所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐高温和/或耐旱和/或耐盐。

10.权利要求1所述蛋白作为转录因子的应用。

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