CN103451228A - 一种调控水稻籽粒大小和粒重的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种调控水稻籽粒大小和粒重的方法，包括OsABC1-2基因过量表达载体的构建步骤和OsABC1-2过表达转基因植株的获得步骤。本发明通过在粳稻中过量表达OsABC1-2基因，显著提高了种子大小和粒重，并增强了对黑暗处理诱导叶片衰老的抗性。因而，该基因是水稻粒型性状的一个新的调控因子，在提高水稻的种子大小和粒重以及增加作物产量上具有潜在的工业应用价值，产生更高的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种调控水稻籽粒大小和粒重的方法。
背景技术
水稻是最重要的粮食作物之一，养活了全世界一半以上的人口。随着人口的增长和生活水平的提高，人们对稻米无论从产量还是品质上均提出越来越高的要求。据推算，至2025年，全球人口将超过80亿，以稻米为主食的人口数量将增至35亿。按最保守的估计，由于人口增长而导致稻米需求量的增加至少达3亿吨。水稻产量的提高，依靠扩大种植面积的潜力已很有限。由于受水资源和耕地面积的限制，加上经济发展和城市化的推进，不少产稻国家的水稻种植面积实际上已有所下降。为此，今后将主要依赖于单位面积产量的提高来进一步提高水稻产量。
粒形性状包括粒长、粒宽、粒厚、粒重和长宽比等，是水稻产量的重要构成因子。控制水稻粒形遗传的数量性状基因座（QTLs）的定位、相关基因的克隆和应用已有较多研究报道。GS3是一个控制水稻粒长的主效基因，定位在第三号染色体着丝粒附近。该基因由五个外显子组成，其第二个外显子的一个无义突变导致蛋白C端的缺失，从而引起大粒品种的籽粒变大。通过RNA干涉抑制GS3的表达显著提高了小粒品种川7的粒长和粒重。GW2和qSW5/GW5均为控制水稻粒宽的QTL。其中GW2定位在水稻第2号染色体的短臂上，编码一个新的泛素蛋白连接酶。GW2功能的缺失增加了颖壳细胞的数目，导致颖壳变大、粒宽和粒重增加。通过分子标记选择将大粒品种的GW2基因导入小粒品种中，其粒重和单株产量分别增加了49.8 %和20 %。qSW5/GW5定位于水稻第5号染色体短臂。该基因编码一个由144个氨基酸残基组成的蛋白，通过泛素蛋白酶体途径负调控水稻颖壳细胞的数目，进而控制粒宽、粒重和产量。目前所分离的粒形基因多为控制粒形性状的负调控因子。近来，Li等（Li Y-B, Fan C-C, Xing Y-Z, Jiang Y-H, Luo L-J, Sun L, Shao D, Xu C-J, Li X-H, Xiao J-H, He Y-Q, Zhang Q-F. Natural variation in GS5 plays an important role in regulating grain size and yield in rice. Nature Genetics. 2011, 43: 1266-1269）克隆了一个控制水稻籽粒大小的QTL，GS5。该基因编码一个推定的丝氨酸羧肽酶，正调控粒宽、籽粒灌浆和粒重。在粳稻品种中花11中过量表达GS5显著提高了水稻籽粒的大小和产量。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种调控水稻籽粒大小和粒重的方法，通过在粳稻中过量表达OsABC1-2基因，显著提高了种子大小和粒重，并增强了对黑暗处理诱导叶片衰老的抗性，以使其满足使用要求。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种调控水稻籽粒大小和粒重的方法，包括以下步骤：
1）OsABC1-2基因过表达载体的构建
以野生型粳稻品种中花11 cDNA为模板，设计一对引物，扩增OsABC1-2基因，引物序列如下：
OsABC1-2OE-F：5’-AAAAGGATCCCGCCCTCGCGATGTCGGCC-3’，
OsABC1-2OE-R：5’-AAAAACTAGTCCGATGGCTATGCTACAACG-3’，
在引物两端分别引入了限制性内切酶BamH I和Spe I的识别位点；PCR扩增产物用胶回收试剂盒（TaKaRa, 805A）纯化，并利用BamH I和Spe I酶切后，连入用相同限制性酶切割的pCAMBIA1301-UbiNOS载体；重组质粒采用热击转化法转化大肠杆菌DH5α，转化物在含卡那霉素的LB平板上筛选，挑选阳性克隆，提取质粒后测序验证正确，获得OsABC1-2过表达载体；其中，OsABC1-2基因序列如SEQ ID NO.1所示；
2）OsABC1-2过表达转基因植株的获得
将测序正确的OsABC1-2过表达载体通过电击法转入农杆菌菌株EHA105中；将粳稻品种中花11未成熟种子带壳灭菌，在超净工作台上分离出未成熟胚，接种在诱导愈伤培养基上；暗培养6d后挑选生长旺盛，颜色浅黄的胚性愈伤组织，作为转化的受体；将带有OsABC1-2过表达重组质粒的农杆菌EHA105菌株培养至对数生长期，离心收集菌体，并用加入乙酰丁香酮的AAM培养基重悬后倒入愈伤组织进行侵染；侵染结束后的愈伤组织在共培养基上培养3d，然后在含有50 mg L-1潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织，经两代筛选以后，将抗性愈伤组织进行预分化处理和分化再生；再生小苗转入1/2MS培养基上生根壮苗；小苗经练苗处理后移入大田种植。
所述的调控水稻籽粒大小和粒重的方法，所述OsABC1-2基因表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
用于realtime PCR检测OsABC1-2基因的特异性引物OsABC1-2F和OsABC1-2R，引物序列如下：
OsABC1-2F：5’-AAGTCAGATGGTGCCAAGAG-3’
OsABC1-2R：5’-AACAGCATACCGACCTAACC-3’。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体（如pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA3301、pCAMBIA1301-UbiN、pCAMBIA1300 等）和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA 加工或基因表达的DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA 前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导（Ti） 质粒基因（如胭脂合成酶Nos 基因）、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子、组成型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV） 35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin）、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等） 或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因） 等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
有益效果：与现有技术相比，本发明通过在粳稻中过量表达OsABC1-2基因，显著提高了种子大小和粒重，并增强了对黑暗处理诱导叶片衰老的抗性。因而，该基因是水稻粒型性状的一个新的调控因子，在提高水稻的种子大小和粒重以及增加作物产量上具有潜在的工业应用价值，产生更高的经济效益。
附图说明
图1是OsABC1-2基因过表达载体的构建示意图；
图2是OsABC1-2基因在野生型中花11（ZH11）和过表达转基因株系（OE）中的相对表达情况；
图3是野生型中花11和过表达转基因植株种子大小比较图；
图4是野生型中花11和过表达转基因植株黑暗处理下的抗性比较图。
具体实施方法
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
以下实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规操作方法，所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1 OsABC1-2过表达转基因株系的获得及表型分析
1）OsABC1-2过表达载体的构建
采用RNAsimple总RNA提取试剂盒（Tiangen，DP419）提取粳稻品种中花11叶片总RNA，利用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，6110A）试剂盒方法反转录成cDNA。反转录步骤如下：取RNA样品3μg，分别加入50μmol L-1 OligodT primer 1μl和10mmol L-1 dNTP mixture 1μl，用RNase free dH2O补足体积10μl，65℃保温5min后，冰上迅速冷却；变性后的反应液分别加入5×PrimeScript Buffer 4μl， 40U μl-1 RNase Inhibitor 0.5μl，200U μl-1 PrimeScript RTase 1μl，用RNase free dH2O补足体积20μl，缓慢混匀；按下列条件进行反转录反应：42℃ 60min，70℃ 15min，冰上放置。以cDNA为模板，设计一对引物，利用PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer（TaKaRa，044A）扩增OsABC1-2基因编码区片段，引物序列如下：
OsABC1-2OE-F：5’-AAAAGGATCCCGCCCTCGCGATGTCGGCC-3’，
OsABC1-2OE-R：5’-AAAAACTAGTCCGATGGCTATGCTACAACG-3’，
PCR反应体系：2×PrimeSTAR GC Buffer 25μl，2.5mmol L-1 dNTP mixture 4μl，10μmol L-1 OsABC1-2OE-F、OsABC1-2OE-R引物各2μl，cDNA模板2μl，2.5 U μl-1 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μl，用灭菌蒸馏水补足体积50μl。
PCR反应条件：95℃变性5min；然后98℃变性10s，68℃延伸3min，扩增35个循环；最后在72℃下延伸10min。
在引物两端分别引入了限制性内切酶BamH I和Spe I的识别位点。PCR扩增产物用胶回收试剂盒（TaKaRa, 805A）纯化，并利用BamH I和Spe I酶切后，连入用相同限制性酶切割的pCAMBIA1301-UbiNOS载体（图1）。连接反应是利用T4 DNA Ligase（TaKaRa，2011A）进行。反应体系和条件为：10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5μl，酶切回收后的基因片段300ng，载体DNA片段100ng，350U μl-1 T4 DNA Ligase 1μl，用灭菌蒸馏水补足体积25μl，16℃过夜连接。重组质粒采用热击转化法转化大肠杆菌DH5α。具体步骤为：将DH5α感受态细胞放置于冰上融化；将连接产物10μl、感受态细胞50μl置于1.5mL灭菌管中，轻轻混匀后于冰上放置30min；将上述混合物于42℃水浴锅中热击45s，立即放回冰上，静置2min；在超净工作台上加LB液体培养基800μl，37℃振荡培养1h；吸取上述转化物涂布在含卡那霉素的LB平板上过夜筛选。挑选阳性克隆，提取质粒后测序，获得OsABC1-2过表达载体。
测序获得的序列如SEQ ID NO.1所示，即为调控水稻籽粒大小和粒重的基因OsABC1-2，表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2）OsABC1-2过表达转基因植株的获得和表型分析
将测序正确的OsABC1-2过表达载体通过电击法转入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105中，利用农杆菌介导法转化粳稻品种中花11。转化的具体方法是将粳稻品种中花11未成熟种子带壳灭菌，在超净工作台上分离出未成熟胚，尖头朝下接种在诱导愈伤培养基N6D2上；暗培养6d后挑选生长旺盛，颜色浅黄的胚性愈伤组织，作为转化的受体；将带有OsABC1-2过表达重组质粒的农杆菌EHA105菌株培养至对数生长期，离心收集菌体，并用AAM培养基重悬；倒入愈伤组织浸泡15-20min，并不时摇动；侵染结束后的愈伤组织在N6D2C培养基上于28℃暗培养3d，然后分别在CCD2S1和CCD2S2选择培养基上进行两代筛选；将抗性愈伤组织转入CCA培养基上于24-26℃暗培养条件下进行预分化处理10d；经预分化处理的愈伤组织转入MSR培养基在25℃光培养下分化再生；再生小苗转入1/2MS培养基上生根壮苗；小苗在阴凉处用凉开水练苗3d后移入大田种植，按常规方法进行管理和收获。
参照Liu Q-Q， Chen X-H, Wang X-W, Peng L-T, Gu M-H. A rapid simple method of assaying hygromycin resistance in transgenic rice plants. Journal of Agricultural Biotechnology（农业生物技术学报），2001， 9（3）：264-265（in Chinese）所提供的方法对转基因再生植株进行潮霉素抗性检测，共获得了16株转基因阳性植株。
采用RNAsimple总RNA提取试剂盒（Tiangen, DP419）分别提取野生型中花11和OsABC1-2过表达转基因株系总RNA，利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa, 047A）试剂盒所述方法反转录成cDNA，以OsABC1-2基因编码区特异性引物OsABC1-2F和OsABC1-2R进行realtime PCR，以水稻Actin1基因作为内参。引物序列如下：
OsABC1-2F：5’-AAGTCAGATGGTGCCAAGAG-3’
OsABC1-2R：5’-AACAGCATACCGACCTAACC-3’
Actin1F：5’ –CCCCTCCTGAAAGGAAGTA-3’
Actin1R：5’-GGTCCGAAGAATTAGAAGCA-3’
PCR反应利用SYBR Premix Ex Taq II（TaKaRa， 820A）在7500 realtime PCR仪（Applied Biosystems）上进行。PCR体系为：2×SYBR Premix Ex Taq II 25 μl，10 μmol L-1上下游引物各2 μl，50×ROX Reference Dye II 1 μl，cDNA模板4 μl，灭菌蒸馏水16 μl，总体积50 μl。
PCR条件为：95℃ 30s预变性；95℃ 5s变性，50℃ 30s退火，72℃ 30s延伸，40个循环。
Realtime PCR结果表明，OsABC1-2基因的表达上调了3倍以上（图2）。田间种植的过表达转基因植株表型与野生型中花11无显著差异。然而过表达株系种子显著大于野生型（图3）。过表达株系种子粒长平均比野生型增加了0.69 mm，粒宽平均增加了0.36 mm，千粒重平均增加了1.05 g（表1），表中，粒长和粒宽为随机选择的30粒种子的平均值，千粒重为10个单株种子的平均值。
表1野生型中花11和OsABC1-2过表达转基因株系种子对比。
| 材料 | 粒长（mm） | 粒宽（mm） | 千粒重（g） |
| 中花11 | 7.12±0.24 | 3.16±0.15 | 24.36±0.30 |
| OsABC1-2过表达 | 7.81±0.29 ** | 3.52±0.07 ** | 25.41±0.37 ** |
**：P<0.01。
实施例2 OsABC1-2过表达转基因株系黑暗处理下的抗性分析
野生型中花11和过表达转基因株系种子均在MS培养基上萌发，过表达株系培养基中加入50 mg L-1潮霉素进行筛选。在培养基中生长2周后，幼苗转移到盛土的小盆中继续生长。4周大的植株用于黑暗处理。在26℃的培养箱中黑暗处理72小时以后，中花11和过表达植株叶片均出现一定程度的黄化表型。然而，与对照相比过表达植株叶片仍保持绿色并具有较强的生活力（图4）。利用PAM2100叶绿素荧光仪进一步对叶片叶绿素荧光参数进行测定表明，过表达植株PS Ⅱ最大光化学量子产量（Fv/Fm）和PS Ⅱ实际光合量子产量（Yield）均显著高于野生型对照。这些结果说明OsABC1-2基因过表达显著增强了对黑暗处理诱导叶片衰老的抗性。
以上实施例是使用的培养基配方，具体如下：
N6D2培养基的组成及浓度如下：
大量元素：（NH4）2SO4 463 mg L-1，KNO3 2830 mg L-1，CaCl2·2H2O 166 mg L-1，MgSO4·7H2O 185 mg L-1，KH2PO4 400 mg L-1；
微量元素：KI 0.8 mg L-1，H3BO3 1.6 mg L-1，MnSO4·4H2O 4.4 mg L-1，ZnSO4·7H2O 1.5 mg L-1；
铁盐：FeSO4·7H2O 27.8 mg L-1，Na2-EDTA·2H2O 37.3 mg L-1；
有机成分：肌醇100 mg L-1，甘氨酸2 mg L-1，烟酸0.5 mg L-1，盐酸硫胺素B1 1mg L-1，盐酸吡哆醇B6 0.5 mg L-1；
水解酪蛋白0.5 g L-1，蔗糖30 g L-1，2,4-D 2 mg L-1，植物凝胶2.5 g L-1，其余为水，pH5.8。
AAM培养基的组成及浓度如下：
大量元素：CaCl2·2H2O 440 mg L-1，MgSO4·7H2O 370 mg L-1，KH2PO4 170 mg L-1，KCl 2940 mg L-1；
微量元素：KI 0.83 mg L-1，H3BO3 6.2 mg L-1，MnSO4·4H2O 22.3 mg L-1，ZnSO4·7H2O 8.6 mg L-1，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg L-1，CuSO4·5H2O 0.025 mg L-1，CoCl2·6H2O 0.025 mg L-1；
铁盐：FeSO4·7H2O 27.8 mg L-1，Na2-EDTA·2H2O 37.3 mg L-1；
有机成分：肌醇100 mg L-1，烟酸0.5 mg L-1，盐酸硫胺素B1 0.1 mg L-1，盐酸吡哆醇B6 0.5 mg L-1，天冬氨酸266 mg L-1，精氨酸228 mg L-1，谷氨酰胺877 mg L-1，甘氨酸75 mg L-1；
水解酪蛋白0.5 g L-1，葡萄糖36 g L-1，蔗糖68.5 g L-1，乙酰丁香酮100 μmol L-1，其余为水，pH5.2。
N6D2C培养基的组成及浓度如下：
大量元素：（NH4）2SO4 463 mg L-1，KNO3 2830 mg L-1，CaCl2·2H2O 166 mg L-1，MgSO4·7H2O 185 mg L-1，KH2PO4 400 mg L-1；
微量元素：KI 0.8 mg L-1，H3BO3 1.6 mg L-1，MnSO4·4H2O 4.4 mg L-1，ZnSO4·7H2O 1.5 mg L-1；
铁盐：FeSO4·7H2O 27.8 mg L-1，Na2-EDTA·2H2O 37.3 mg L-1；
有机成分：肌醇100 mg L-1，甘氨酸2 mg L-1，烟酸0.5 mg L-1，盐酸硫胺素B1 1mg L-1，盐酸吡哆醇B6 0.5 mg L-1；
水解酪蛋白0.5 g L-1，葡萄糖10 g L-1，蔗糖30 g L-1，2,4-D 2 mg L-1，植物凝胶2.5 g L-1，乙酰丁香酮100μmol L-1，其余为水，pH5.2。
CCD2S1培养基的组成及浓度如下：
大量元素：NH4NO3 640 mg L-1，KNO3 1212 mg L-1，CaCl2·2H2O 588 mg L-1，MgSO4·7H2O 247 mg L-1，KH2PO4 136 mg L-1；
微量元素：KI 0.83 mg L-1，H3BO3 3.1 mg L-1，MnSO4·4H2O 11.15 mg L-1，ZnSO4·7H2O 5.76 mg L-1，Na2MoO4·2H2O 0.24 mg L-1，CuSO4·5H2O 0.025 mg L-1，CoCl2·6H2O 0.028 mg L-1；
铁盐：FeSO4·7H2O 27.8 mg L-1，Na2-EDTA·2H2O 37.3 mg L-1；
有机成分：肌醇90 mg L-1，甘氨酸2 mg L-1，烟酸6 mg L-1，盐酸硫胺素B1 8.5 mg L-1，盐酸吡哆醇B6 1 mg L-1；
水解酪蛋白0.5 g L-1，蔗糖20 g L-1，甘露醇36.43 g L-1，2,4-D 2 mg L-1，植物凝胶2.5 g L-1，头孢霉素600 mg L-1，潮霉素25 mg L-1，其余为水，pH5.8。
CCD2S2培养基的组成及浓度如下：
大量元素：NH4NO3 640 mg L-1，KNO3 1212 mg L-1，CaCl2·2H2O 588 mg L-1，MgSO4·7H2O 247 mg L-1，KH2PO4 136 mg L-1；
微量元素：KI 0.83 mg L-1，H3BO3 3.1 mg L-1，MnSO4·4H2O 11.15 mg L-1，ZnSO4·7H2O 5.76 mg L-1，Na2MoO4·2H2O 0.24 mg L-1，CuSO4·5H2O 0.025 mg L-1，CoCl2·6H2O 0.028 mg L-1；
铁盐：FeSO4·7H2O 27.8 mg L-1，Na2-EDTA·2H2O 37.3 mg L-1；
有机成分：肌醇90 mg L-1，甘氨酸2 mg L-1，烟酸6 mg L-1，盐酸硫胺素B1 8.5 mg L-1，盐酸吡哆醇B6 1 mg L-1；
水解酪蛋白0.5 g L-1，蔗糖20 g L-1，甘露醇36.43 g L-1，2,4-D 2 mg L-1，植物凝胶2.5 g L-1，头孢霉素300 mg L-1，潮霉素50 mg L-1，其余为水，pH5.8。
CCA培养基的组成及浓度如下：
大量元素：NH4NO3 640 mg L-1，KNO3 1212 mg L-1，CaCl2·2H2O 588 mg L-1，MgSO4·7H2O 247 mg L-1，KH2PO4 136 mg L-1；
微量元素：KI 0.83 mg L-1，H3BO3 3.1 mg L-1，MnSO4·4H2O 11.15 mg L-1，ZnSO4·7H2O 5.76 mg L-1，Na2MoO4·2H2O 0.24 mg L-1，CuSO4·5H2O 0.025 mg L-1，CoCl2·6H2O 0.028 mg L-1；
铁盐：FeSO4·7H2O 27.8 mg L-1，Na2-EDTA·2H2O 37.3 mg L-1；
有机成分：肌醇90 mg L-1，甘氨酸2 mg L-1，烟酸6 mg L-1，盐酸硫胺素B1 8.5 mg L-1，盐酸吡哆醇B6 1 mg L-1；
水解酪蛋白0.3 g L-1，麦芽糖20 g L-1，脯氨酸0.5 g L-1，6-BA 2 mg L-1，NAA 1 mg L-1，ABA 5 mg L-1，植物凝胶2.5 g L-1，头孢霉素300 mg L-1，潮霉素50 mg L-1，其余为水，pH5.8。
MSR培养基的组成及浓度如下：
大量元素：NH4NO3 1650 mg L-1，KNO3 1900 mg L-1，CaCl2·2H2O 440 mg L-1，MgSO4·7H2O 370 mg L-1，KH2PO4 170 mg L-1；
微量元素：KI 0.83 mg L-1，H3BO3 6.2 mg L-1，MnSO4·4H2O 22.3 mg L-1，ZnSO4·7H2O 8.6 mg L-1，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg L-1，CuSO4·5H2O 0.025 mg L-1，CoCl2·6H2O 0.025 mg L-1；
铁盐：FeSO4·7H2O 27.8 mg L-1，Na2-EDTA·2H2O 37.3 mg L-1；
有机成分：肌醇100 mg L-1，甘氨酸2 mg L-1，烟酸0.5 mg L-1，盐酸硫胺素B1 0.1 mg L-1，盐酸吡哆醇B6 0.5 mg L-1；
水解酪蛋白0.3 g L-1，蔗糖30 g L-1，山梨醇20 g L-1，6-BA 2 mg L-1，NAA 0.2 mg L-1，玉米素0.2 mg L-1，KT 0.5 mg L-1，植物凝胶2.5 g L-1，头孢霉素300 mg L-1，潮霉素50 mg L-1，其余为水，pH5.8。
1/2MS培养基的组成及浓度如下：
大量元素：NH4NO3 825 mg L-1，KNO3 950 mg L-1，CaCl2·2H2O 220 mg L-1，MgSO4·7H2O 185 mg L-1，KH2PO4 85 mg L-1；
微量元素：KI 0.83 mg L-1，H3BO3 6.2 mg L-1，MnSO4·4H2O 22.3 mg L-1，ZnSO4·7H2O 8.6 mg L-1，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg L-1，CuSO4·5H2O 0.025 mg L-1，CoCl2·6H2O 0.025 mg L-1；
铁盐：FeSO4·7H2O 27.8 mg L-1，Na2-EDTA·2H2O 37.3 mg L-1；
有机成分：肌醇100 mg L-1，甘氨酸2 mg L-1，烟酸0.5 mg L-1，盐酸硫胺素B1 0.1 mg L-1，盐酸吡哆醇B6 0.5 mg L-1；
水解酪蛋白0.3 g L-1，蔗糖30 g L-1，NAA 1 mg L-1，多效唑6 mg L-1，植物凝胶2.5 g L-1，其余为水，pH5.8。
SEQUENCE LISTING
<110> 淮阴师范学院
<120> 一种调控水稻籽粒大小和粒重的方法
<130> 100
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2292
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
atgtcggccg cggccggggc ggccaccctc gtcgcctcct ccgcctcgct ctccgtgccc 60
gaccacctcc gcctccgccg cttccgcctc cacctccacc cgcgcccgcc gccgccgcat 120
ccccagctcc ggtcccgctc cctccggcag cgccgccgct tcgtgctcgc cgtgctgcag 180
gaggaccggt ccccctccgc gccggatgag gaggcgagga ggtacgggct caacgggagc 240
gccccgagca gcggggtcgg gtacgacgat gccgccgtgg aggcctacct cgggaccaac 300
ggcaacggga gggggaacgg tgcggcggcg gtggtgaagc ccgccgcgga gtcacggagc 360
agcgccgcct tggtgtccgc ggggcctggg ccgggggatg atgagaggag gaggaaggag 420
cgggtggagg agatcggcag ggaggacgcc tggttcaagc agagcggcgg ggattccaag 480
cccgaggtgt ctgtcgctcc tggaggtcgc tggaatcggt ttaaaaccta ttcgacgatt 540
caaaggacgt tggaaatatg gggctttgtt tttaaattta tattcagatc ttggctcaat 600
aatcagaagt tcacttatcg aggagggatg acggaggaga aaagggtaat gaggaggaaa 660
gttcttgcca agtggcttaa ggagagtatt ttgagactag gtcccacatt tatcaaaatt 720
gggcagcagt tctccaccag agtggacatt cttccacagg aatatgtcga ccagttatct 780
gaattacagg accaagttcc tccatttcct tcagagacag cggtgtcaat tattgaggaa 840
gagctagggg catctgtgaa taagattttt gatcgatttg actttgaacc aatagctgct 900
gctagcctcg gccaggttca tcgggcatgc ttgaatggca aagaagttgt catcaaagtg 960
caaaggcctg gtctgaagga gctatttgat attgatctga aaaacttaag ggtaatagca 1020
gaataccttc agaaagtgga ccctaagtca gatggtgcca agagagactg ggttgctatc 1080
tatgatgagt gcgcatctgt tttgtatcag gaaatagact atacaaagga agcatttaat 1140
gctgaaaaat tttctgaaaa cttcaaaaat atggattatg tgaaggttcc agagattttg 1200
tgggagtata ctacacctca ggtcttaaca atggaatacg tcccaggaat caagataaat 1260
aggataaagc agctagataa gttaggagtt gatcggaaaa ggttaggtcg gtatgctgtt 1320
gagtcgtacc tggagcagat cttatctcat ggatttttcc atgcagatcc gcatccagga 1380
aatattgctg ttgatgatgt caacggtggg aggcttatct tctacgactt tggaatgatg 1440
ggaagcatta gtccaaatat ccgggaaggg ttgctcgaag cattctatgg agtttatgaa 1500
aaagatcctg ataaagtgct tcaatcaatg attcaaatgg gtgtccttgt tcctactgga 1560
gatatgacgg ctgtcagaag aacagctcaa tttttccttg atagcttcga agagcgttta 1620
gcagcacaaa ggaaagaaag agagatggcg actgaggaac ttggatttaa gaagcaatta 1680
actaaggagg agaagtttga aaagaagaag caaaggcttg ctgctatcgg agaggatctt 1740
ttgtcaattg ctgctgatca accatttcga tttcctgcca cctttacttt tgtggtcaga 1800
gcattctcag tactagatgg tatcgggaag ggccttgatc ctagatttga tatcacagag 1860
attgctaaac catatgctat ggagttgctt agatttaatg aagctggagt tgaagttatt 1920
gtaaaggatg cgaggaagag atgggaaagg cagtcccgtg cattctacaa tttatttcgc 1980
cagcccgaca gagttgaaaa gcttgcgcaa atcattgagc gtttggagca aggtgatctc 2040
aagcttcgtg tcagaacatt ggagtcagaa agagcattcc aaagagttgc agctgtacag 2100
aaaacaattg gatatggagt tgccgcaggt agtttggtaa acctcgccac cgttctctac 2160
ctcaattcaa tccggttgcc agcgaccata gcatactctc tctgcgcgtt cttcggccta 2220
caagtccttg tcggcctttt gaaggtcaag aagttggatc aacaggagag actgataacc 2280
ggcactgctt ga 2292
<210> 2
<211> 763
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 2
Met Ser Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Leu Val Ala Ser Ser Ala Ser
1 5 10 15
Leu Ser Val Pro Asp His Leu Arg Leu Arg Arg Phe Arg Leu His Leu
20 25 30
His Pro Arg Pro Pro Pro Pro His Pro Gln Leu Arg Ser Arg Ser Leu
35 40 45
Arg Gln Arg Arg Arg Phe Val Leu Ala Val Leu Gln Glu Asp Arg Ser
50 55 60
Pro Ser Ala Pro Asp Glu Glu Ala Arg Arg Tyr Gly Leu Asn Gly Ser
65 70 75 80
Ala Pro Ser Ser Gly Val Gly Tyr Asp Asp Ala Ala Val Glu Ala Tyr
85 90 95
Leu Gly Thr Asn Gly Asn Gly Arg Gly Asn Gly Ala Ala Ala Val Val
100 105 110
Lys Pro Ala Ala Glu Ser Arg Ser Ser Ala Ala Leu Val Ser Ala Gly
115 120 125
Pro Gly Pro Gly Asp Asp Glu Arg Arg Arg Lys Glu Arg Val Glu Glu
130 135 140
Ile Gly Arg Glu Asp Ala Trp Phe Lys Gln Ser Gly Gly Asp Ser Lys
145 150 155 160
Pro Glu Val Ser Val Ala Pro Gly Gly Arg Trp Asn Arg Phe Lys Thr
165 170 175
Tyr Ser Thr Ile Gln Arg Thr Leu Glu Ile Trp Gly Phe Val Phe Lys
180 185 190
Phe Ile Phe Arg Ser Trp Leu Asn Asn Gln Lys Phe Thr Tyr Arg Gly
195 200 205
Gly Met Thr Glu Glu Lys Arg Val Met Arg Arg Lys Val Leu Ala Lys
210 215 220
Trp Leu Lys Glu Ser Ile Leu Arg Leu Gly Pro Thr Phe Ile Lys Ile
225 230 235 240
Gly Gln Gln Phe Ser Thr Arg Val Asp Ile Leu Pro Gln Glu Tyr Val
245 250 255
Asp Gln Leu Ser Glu Leu Gln Asp Gln Val Pro Pro Phe Pro Ser Glu
260 265 270
Thr Ala Val Ser Ile Ile Glu Glu Glu Leu Gly Ala Ser Val Asn Lys
275 280 285
Ile Phe Asp Arg Phe Asp Phe Glu Pro Ile Ala Ala Ala Ser Leu Gly
290 295 300
Gln Val His Arg Ala Cys Leu Asn Gly Lys Glu Val Val Ile Lys Val
305 310 315 320
Gln Arg Pro Gly Leu Lys Glu Leu Phe Asp Ile Asp Leu Lys Asn Leu
325 330 335
Arg Val Ile Ala Glu Tyr Leu Gln Lys Val Asp Pro Lys Ser Asp Gly
340 345 350
Ala Lys Arg Asp Trp Val Ala Ile Tyr Asp Glu Cys Ala Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Gln Glu Ile Asp Tyr Thr Lys Glu Ala Phe Asn Ala Glu Lys Phe
370 375 380
Ser Glu Asn Phe Lys Asn Met Asp Tyr Val Lys Val Pro Glu Ile Leu
385 390 395 400
Trp Glu Tyr Thr Thr Pro Gln Val Leu Thr Met Glu Tyr Val Pro Gly
405 410 415
Ile Lys Ile Asn Arg Ile Lys Gln Leu Asp Lys Leu Gly Val Asp Arg
420 425 430
Lys Arg Leu Gly Arg Tyr Ala Val Glu Ser Tyr Leu Glu Gln Ile Leu
435 440 445
Ser His Gly Phe Phe His Ala Asp Pro His Pro Gly Asn Ile Ala Val
450 455 460
Asp Asp Val Asn Gly Gly Arg Leu Ile Phe Tyr Asp Phe Gly Met Met
465 470 475 480
Gly Ser Ile Ser Pro Asn Ile Arg Glu Gly Leu Leu Glu Ala Phe Tyr
485 490 495
Gly Val Tyr Glu Lys Asp Pro Asp Lys Val Leu Gln Ser Met Ile Gln
500 505 510
Met Gly Val Leu Val Pro Thr Gly Asp Met Thr Ala Val Arg Arg Thr
515 520 525
Ala Gln Phe Phe Leu Asp Ser Phe Glu Glu Arg Leu Ala Ala Gln Arg
530 535 540
Lys Glu Arg Glu Met Ala Thr Glu Glu Leu Gly Phe Lys Lys Gln Leu
545 550 555 560
Thr Lys Glu Glu Lys Phe Glu Lys Lys Lys Gln Arg Leu Ala Ala Ile
565 570 575
Gly Glu Asp Leu Leu Ser Ile Ala Ala Asp Gln Pro Phe Arg Phe Pro
580 585 590
Ala Thr Phe Thr Phe Val Val Arg Ala Phe Ser Val Leu Asp Gly Ile
595 600 605
Gly Lys Gly Leu Asp Pro Arg Phe Asp Ile Thr Glu Ile Ala Lys Pro
610 615 620
Tyr Ala Met Glu Leu Leu Arg Phe Asn Glu Ala Gly Val Glu Val Ile
625 630 635 640
Val Lys Asp Ala Arg Lys Arg Trp Glu Arg Gln Ser Arg Ala Phe Tyr
645 650 655
Asn Leu Phe Arg Gln Pro Asp Arg Val Glu Lys Leu Ala Gln Ile Ile
660 665 670
Glu Arg Leu Glu Gln Gly Asp Leu Lys Leu Arg Val Arg Thr Leu Glu
675 680 685
Ser Glu Arg Ala Phe Gln Arg Val Ala Ala Val Gln Lys Thr Ile Gly
690 695 700
Tyr Gly Val Ala Ala Gly Ser Leu Val Asn Leu Ala Thr Val Leu Tyr
705 710 715 720
Leu Asn Ser Ile Arg Leu Pro Ala Thr Ile Ala Tyr Ser Leu Cys Ala
725 730 735
Phe Phe Gly Leu Gln Val Leu Val Gly Leu Leu Lys Val Lys Lys Leu
740 745 750
Asp Gln Gln Glu Arg Leu Ile Thr Gly Thr Ala
755 760
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> OsABC1-2OE-F
<400> 3
aaaaggatcc cgccctcgcg atgtcggcc 29
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> OsABC1-2OE-R
<400> 4
aaaaactagt ccgatggcta tgctacaacg 30
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> OsABC1-2F
<400> 5
aagtcagatg gtgccaagag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> OsABC1-2R
<400> 6
aacagcatac cgacctaacc 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Actin1F
<400> 7
cccctcctga aaggaagta 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Actin1R
<400> 8
ggtccgaaga attagaagca 20
Claims (3)
1.一种调控水稻籽粒大小和粒重的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）OsABC1-2基因过表达载体的构建
以野生型粳稻品种中花11 cDNA为模板，设计一对引物，扩增OsABC1-2基因，引物序列如下：
OsABC1-2OE-F：5’-AAAAGGATCCCGCCCTCGCGATGTCGGCC-3’，
OsABC1-2OE-R：5’-AAAAACTAGTCCGATGGCTATGCTACAACG-3’，
在引物两端分别引入了限制性内切酶BamH I和Spe I的识别位点；PCR扩增产物用胶回收试剂盒（TaKaRa, 805A）纯化，并利用BamH I和Spe I酶切后，连入用相同限制性酶切割的pCAMBIA1301-UbiNOS载体；重组质粒采用热击转化法转化大肠杆菌DH5α，转化物在含卡那霉素的LB平板上筛选，挑选阳性克隆，提取质粒后测序验证正确，获得OsABC1-2过表达载体；其中，OsABC1-2基因序列如SEQ ID NO.1所示；
2）OsABC1-2过表达转基因植株的获得
将测序正确的OsABC1-2过表达载体通过电击法转入农杆菌菌株EHA105中；将粳稻品种中花11未成熟种子带壳灭菌，在超净工作台上分离出未成熟胚，接种在诱导愈伤培养基上；暗培养6d后挑选生长旺盛，颜色浅黄的胚性愈伤组织，作为转化的受体；将带有OsABC1-2过表达重组质粒的农杆菌EHA105菌株培养至对数生长期，离心收集菌体，并用加入乙酰丁香酮的AAM培养基重悬后，倒入愈伤组织进行侵染；侵染结束后的愈伤组织在共培养基上培养3d，然后在含有50 mg L-1潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织，经两代筛选以后，将抗性愈伤组织进行预分化处理和分化再生；再生小苗转入1/2MS培养基上生根壮苗；小苗经练苗处理后移入大田种植。
2.根据权利要求1所述的调控水稻籽粒大小和粒重的方法，其特征在于：所述OsABC1-2基因表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的调控水稻籽粒大小和粒重的方法，其特征在于：用于realtime PCR检测OsABC1-2基因的特异性引物OsABC1-2F和OsABC1-2R，引物序列如下：
OsABC1-2F：5’-AAGTCAGATGGTGCCAAGAG-3’
OsABC1-2R：5’-AACAGCATACCGACCTAACC-3’。
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-
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- 2013-09-17 CN CN201310421680.XA patent/CN103451228B/zh active Active
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