ES2263214T3 - Gen rht del trigo para el control genetico del crecimiento y desarrollo vegetal. - Google Patents
Gen rht del trigo para el control genetico del crecimiento y desarrollo vegetal.Info
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Abstract
La invención se refiere al gen Tht del trigo y sus homólogos de otras especies, incluido el arroz y el maíz (el gen D8), útiles para modificar las características del crecimiento y/o del desarrollo de las plantas. La invención se refiere también a plantas transgénicas, procedimientos y medios de producción de éstas.
Description
Gen Rht del trigo para el control
genético del crecimiento y desarrollo vegetal.
Esta invención se refiere al control genético
del crecimiento y/o desarrollo de plantas, y a la clonación y
expresión de genes implicados en la misma. Más particularmente, la
invención se refiere a la clonación y expresión de homólogos del
gen Rht de Triticum Aestivum procedentes de otras
especies, y al uso de los genes en las plantas.
Una comprensión de los mecanismos genéticos que
influyen en el crecimiento y desarrollo de las plantas, incluyendo
la floración, proporciona un medio para alterar las características
de una planta diana. Entre especies para las cuales podría ser
ventajosa la manipulación de las características del crecimiento
y/o desarrollo se incluyen todos los cultivos, siendo ejemplos
importantes los cereales, el arroz, y el maíz, probablemente los
más agronómicamente importantes en las zonas climáticas más
cálidas, y el trigo, la cebada, la avena y el centeno en climas más
templados. Son cultivos importantes para productos de semillas, la
colza para aceite en semillas y la canola, el maíz, el girasol, la
soja y el sorgo. Por supuesto, muchos cultivos que se recolectan por
sus raíces, se cultivan anualmente a partir de semillas, y la
producción de semillas de cualquier tipo depende mucho de la
capacidad de la planta para florecer, ser polinizada y producir
semillas. En horticultura, el control del ritmo del crecimiento y
desarrollo, incluyendo la floración, es importante. Entre las
plantas de horticultura cuya floración podría controlarse se
incluyen la lechuga, la endivia y las brasicas vegetales,
incluyendo la col, el brécol, y la coliflor, y los claveles y
geranios. Las plantas enanas por un lado, y las plantas gigantes,
más altas por otro, podrían ser ventajosas y/o deseables en varios
contextos hortícolas y agrícolas, incluyendo además los árboles,
los cultivos de plantaciones y los céspedes.
En las décadas recientes se ha observado un
enorme incremento en los rendimientos de los granos de trigo
debido a la incorporación de homeoalelos de Rht de semienanismo en
los programas de producción. Estos incrementos han permitido que la
productividad del trigo se mantenga a la par con las demandas de la
creciente población mundial. Previamente, se describió la clonación
de los alelos gai de Arabidopsis (solicitud de patente
internacional PCT/GB97/00390 depositada el 12 de febrero de 1997 y
publicada como WO97/29123 el 14 de agosto de 1998, John Innes
Centre Innovations Limited, el contenido completo de la cual se
incorpora en la presente por referencia), los cuales, al igual que
los alelos mutantes de Rht en trigo (una monocotiledónea),
confieren un fenotipo enano semidominante en Arabidopsis
(una dicotiledónea) y una reducción en la capacidad de respuesta a
la hormona giberelina (GA) del crecimiento de plantas. gai
codifica una proteína mutante (gai) la cual carece de un segmento
de 17 residuos aminoácidos que se halla cerca del extremo
N-terminal de la proteína (GAI) del tipo salvaje.
La secuencia de este segmento está altamente conservada en una
secuencia de ADNc del arroz (EST). En la presente, se muestra que
este ADNc se corresponde con una sección corta de los mapas de
genoma de cereales solapados que se sabe que contienen el loci
Rht, y que se ha usado el ADNc para aislar los genes
Rht del trigo. Que genomas tan ampliamente divergidos como
los de Arabidopsis y Triticum fueran portadores de una
secuencia conservada, la cual, cuando está mutada, afecta la
capacidad de respuesta a la GA, indica un papel para esta secuencia
en la señalización de la GA que se conserva en todo el reino
vegetal. Además, la clonación del Rht permite su
transferencia a muchas especies cultivadas diferentes, con el
objetivo de potenciar el rendimiento tanto como se ha obtenido
previamente con el trigo.
La introducción de homeoalelos Rht de
semienanismo (conocidos originalmente como genes de Norin 10,
derivados de una variedad japonesa, la Norin 10) en la élite de
líneas reproductoras de trigo para pan fue una de las
contribuciones más significativas a la denominada "revolución
verde" (Gale et al., Dwarfing genes in wheat. En:
Progress in Plant Breeding, editor G. E. Russell,
Butterworths, Londres, 1985, pp 1-35). El trigo que
contenía estos homeoalelos superó permanentemente a los trigos que
carecían de ellos, y ahora comprende aproximadamente el 80% de los
cultivos de trigo del mundo. La base biológica para esta
potenciación del rendimiento parece ser doble. En primer lugar, el
fenotipo de semienanismo conferido por los alelos Rht causa
una resistencia incrementada al encamado (aplastamiento de las
plantas a causa del viento/lluvia, con la consiguiente pérdida de
rendimiento). En segundo lugar, estos alelos causan una reubicación
del fotoasimilado, habiendo más dirigido hacia el grano y menos
hacia el tallo (Gale et al., 1985). Estas propiedades tienen
efectos importantes sobre los rendimientos del trigo, tal como se
demostró por el hecho de que los rendimientos de trigo en el Reino
Unido incrementaron en más del 20% durante los años en que las
líneas que contenían el Rht fueron aceptadas por los
agricultores.
Los mutantes rht son enanos porque
contienen un alelo de rht mutante, genéticamente dominante,
que compromete sus respuestas a la giberelina (GA, un regulador
endógeno del crecimiento de la planta) (Gale et al.,
Heredity, 37:283-289 (1976)). Por tanto, los
coleóptilos de los mutantes rht, a diferencia de los de las
plantas de trigo del tipo salvaje, no responden a las aplicaciones
de GA. Además, los mutantes rht acumulan GA biológicamente
activas hasta niveles más elevados a los hallados en los controles
del tipo salvaje (Lenton et al., Gibberellin insensitivity
and depletion in wheat-consequences for development.
En: Hormone action in Plant Development-a
critical appraisal. G. V. Haod, J. R. Lenton, M. B. Jackson y R.
K. Atkin (editores), Butterworths, Londres, 1987, pp
145-150). Estas propiedades (dominancia genética,
respuestas a la GA reducidas, y niveles endógenos de GA elevados)
son comunes a los fenotipos conferidos por mutaciones en otras
especies (D8/D9 en el maíz; gaí en Arabidopsis),
indicando que estos alelos mutantes definen genes ortólogos en
estas especies diferentes, respaldado además por la observación de
que D8/D9 y Rht son loci sinténicos en los genomas del
maíz y trigo.
El término "función Rht" indica la
capacidad de influir en el fenotipo de una planta de forma similar
al gen Rht de Triticum. La "función Rht"
podría observarse fenotípicamente en una planta como la inhibición,
supresión, represión o reducción del crecimiento de la planta,
siendo antagonizada dicha inhibición, supresión, represión o
reducción por la GA. La expresión de Rht tiende a conferir un
fenotipo enano a la planta, el cual es antagonizado por la GA. La
sobreexpresión en una planta, a partir de una secuencia
nucleotídica que codifica un polipéptido con función Rht,
podría usarse para conferir un fenotipo enano a una planta, el cual
puede corregirse mediante tratamiento con GA.
Las plantas mutantes del rht son enanas en
comparación con el tipo salvaje, siendo el enanismo insensible a la
GA.
En la presente, "Rht" (con mayúscula) se
usa para referirse a la función del tipo salvaje, mientras que
"rht" (sin mayúsculas) se usa para referirse a la función del
mutante.
Los procesos de crecimiento y desarrollo de
muchas plantas están regulados por miembros específicos de una
familia de factores de crecimiento diterpenoides tetracíclicos
conocidos como giberelinas (GA) (Hooley, Plant Mol. Biol.,
26:1529-1555 (1994)). Por giberelina o GA se quiere
indicar una molécula diterpenoide con la estructura de anillos de
carbono básica mostrada en la Figura 5, y que posee actividad
biológica, es decir, se refiere a las giberelinas biológicamente
activas.
La actividad biológica podría definirse por una
o más de entre la estimulación de la elongación celular,
senescencia de las hojas, u obtención de la respuesta
\alpha-amilasa en células de la aleurona del
cereal. Hay muchos ensayos estándares disponibles en la técnica, un
resultado positivo en alguno, o más, de los que señaliza una
giberelina de ensayo como activa (Hoad et al.,
Phytochemistry, 20:703-713 (1981);
Serebryakov et al., Phytochemistry,
23:1847-1854 (1984); Smith et al.,
Phytochemistry, 33:17-20 (1993)).
Los ensayos disponibles en la técnica incluyen
el ensayo del hipocótilo de lechuga, el ensayo del hipocótilo del
pepino, y el ensayo de la primera hoja de la avena, todos ellos
determinan la actividad biológica en base a la capacidad de una
giberelina aplicada para causar la elongación del tejido respectivo.
Los ensayos preferidos son aquéllos en los cuales la composición de
ensayo se aplica a una planta deficitaria en giberelina. Entre tales
ensayos preferidos se incluyen el tratamiento de la
Arabidopsis enana deficitaria en GA para determinar el
crecimiento, el ensayo del guisante enano, en el que se determina la
elongación del entrenudo, el ensayo del arroz enano
Tan-ginbozu, en el que se determina la elongación de
la vaina foliar, y el ensayo del maíz-d5, en el que también
se determina la elongación de la vaina foliar. Los bioensayos de
elongación miden los efectos de la elongación celular general en
los órganos respectivos, y no están restringidos a determinados
tipos celulares.
Los ensayos adicionales disponibles incluyen el
ensayo de la senescencia de las hojas de acedera (Rumex) y
el ensayo de la \alpha-amilasa en células de
aleurona de cereal. Las células de aleurona que rodean el
endospermo en el grano secretan \alpha-amilasa
durante la germinación, la cual digiere el almidón para producir
azúcares usados a continuación por la planta en crecimiento. La
producción de enzima está controlada por la GA. Las células de la
aleurona aisladas a las que se suministra GA biológicamente activa
secretan \alpha-amilasa, cuya actividad puede
ensayarse a continuación, por ejemplo, mediante la medición de la
degradación del almidón.
Las características estructurales importantes
para una actividad biológica elevada (mostrada por la GA_{1},
GA_{3}, GA_{4} y GA_{7}) son un grupo carboxilo en el
C-6 del anillo B; una lactona C-19,
C-10; y una \beta-hidroxilación en
C-3. La \beta-hidroxilación en
C-2 causa inactividad (mostrada por GA_{8},
GA_{29}, GA_{34} y GA_{51}). Los mutantes rht no
responden al tratamiento con GA, por ejemplo, al tratamiento con
GA_{1}, GA_{3} o GA_{4}.
El tratamiento con GA se realiza preferiblemente
mediante pulverización con una solución acuosa, por ejemplo,
mediante pulverización con GA_{3} o GA_{4} 10^{-4}M en
solución acuosa, quizá semanal o más frecuentemente, y podría
hacerse colocando gotitas sobre las plantas en vez de mediante
pulverización. La GA podría aplicarse disuelta en un disolvente
orgánico tal como etanol o acetona, porque es más soluble en éstos
que en agua, pero esto no es preferido porque estos disolventes
tienen tendencia a dañar las plantas. Si va a usarse un disolvente
orgánico, entre las formulaciones apropiadas se incluyen 24\eta1
de GA_{3} o GA_{4} 0, 6, 4,0 ó 300 mM disueltos en etanol al
80%. Las plantas, por ejemplo, Arabidopsis, podrían
cultivarse en un medio que contuviera GA, tal como medio de cultivo
de tejidos (GM) solidificado con agar y conteniendo GA
suplementaria.
Las realizaciones de la presente invención, en
todos los aspectos, emplean una secuencia de nucleótidos que
codifica la secuencia de aminoácidos mostradas en la Figura 6b o en
la Figura 9b. Tal secuencia codificante podría ser tal como la
mostrada en las Figuras 6a ó 9a.
La presente invención también proporciona una
construcción o vector de ácido nucleico que comprenden ácido
nucleico con cualquiera de las secuencias proporcionadas,
preferiblemente una construcción o vector a partir del cual puede
expresarse el polipéptido codificado por la secuencia de ácidos
nucleicos. La construcción o vector es preferiblemente apropiada
para su transformación dentro de una célula vegetal. La invención
abarca además una célula huésped transformada con dicha
construcción o vector, especialmente una célula vegetal. Por tanto,
se proporciona una célula huésped, tal como una célula vegetal, que
comprende ácido nucleico según la presente invención. Dentro de la
célula, el ácido nucleico podría incorporarse en el cromosoma.
Podría haber más de una secuencia de nucleótidos heteróloga por
genoma haploide. Esto, por ejemplo, permite la expresión
incrementada del producto del gen en comparación con los niveles
endógenos, tal y como se discute posteriormente.
Una construcción o vector que comprende un ácido
nucleico según la invención no tiene porque incluir un promotor u
otra secuencia reguladora, particularmente si el vector va a usarse
para introducir el ácido nucleico en células para su recombinación
en el genoma. No obstante, en un aspecto, la presente invención
proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una
secuencia codificante de Rht unida a una secuencia
reguladora para el control de la expresión, siendo la secuencia
reguladora distinta de la que está fusionada de forma natural a la
secuencia codificante y, preferiblemente procedente o derivada de
otro gen.
Las moléculas de ácido nucleico y los vectores
según la presente invención podrían presentarse como un aislado,
aislado proporcionado a partir de su entorno natural, en forma
sustancialmente pura u homogénea, o libres o sustancialmente libres
de ácido nucleico o genes de las especies de interés u origen
distintos de la secuencia que codifica un polipéptido capaz de
influir en el crecimiento y/o desarrollo, lo que podría incluir la
floración, por ejemplo, en un ácido nucleico distinto de la
secuencia codificante de Rht en Triticum Aestivum. El
término "aislado de ácido nucleico" abarca total o
parcialmente el ácido nucleico sintético.
El ácido nucleico podría, obviamente, ser de
hebra doble o sencilla, ADNc o ADN genómico, ARN, total o
parcialmente sintético, según sea apropiado. Por supuesto, cuando
el ácido nucleico según la invención incluye ARN, la referencia a
la secuencia mostrada debería limitarse como que abarca el
equivalente de ARN, con U sustituyendo a T.
La presente invención abarca también el producto
de la expresión de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos
descritas, y los procedimientos para preparar el producto de la
expresión mediante la expresión a partir de ácido nucleico
codificante para el mismo, en condiciones apropiadas en células
huéspedes apropiadas. Aquéllos expertos en la materia están
perfectamente capacitados para construir vectores y diseñar
protocolos para la expresión y recuperación de productos de la
expresión de genes recombinantes. Pueden escogerse o construirse
vectores apropiados, conteniendo 5 secuencias reguladoras
apropiadas, incluyendo las secuencias promotoras, los fragmentos
terminadores, las secuencias de poliadenilación, las secuencias
potenciadoras, los genes marcadores y otras secuencias según
convenga. Para detalles adicionales consultar, por ejemplo,
Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2ª edición, Sambrook
et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los
procedimientos de transformación dependen del huésped usado, pero
son bien conocidos. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la
manipulación del ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de
construcciones de ácido nucleico, en la mutagénesis, en la
secuenciación, en la introducción de ADN dentro de células y en la
expresión de genes, y en el análisis de proteínas, se describen con
detalle en Protocols in Molecular Biology, segunda edición,
editores Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992. Los
procedimientos y vectores específicos usados previamente con amplio
éxito en plantas son descritos por Bevan, Nucl. Acids Res.,
12:6711-8721 (1984)), y Guerineau y Mullineaux,
Plant transformation and expression vectors, en: Plant Molecular
Biology Labfax (editor R. R. D. Croy) Oxford, BIOS Scientific
Publishers, (1993) pp 121-148. Los descubrimientos
de Sambrook et al. y Ausubel et al., y todos los
otros documentos mencionados en la presente se incorporan en la
presente por referencia.
La expresión como una fusión con una cola de
polihistidina permite la purificación del Rht a conseguir usando una
resina Ni-NTA disponible de QIAGEN Inc. (EE.UU.) y
DIAGEN GmbH (Alemania). Consultar, Janknecht et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8972-8976
(1991) y EP-A-0253303 y
EP-A-0282042. La resina
Ni-NTA tiene una afinidad elevada por las proteínas
con histidinas consecutivas cercanas a los extremos N- o
C-terminal de la proteína, y por tanto, podría
usarse para purificar proteínas Rht marcadas con histidinas y
procedentes de plantas, partes de plantas, o extractos, o a partir
de organismos recombinantes, tales como las levaduras o bacterias,
por ejemplo, E. coli, que expresan la proteína.
La proteína Rht purificada, por ejemplo,
producida de forma recombinante mediante la expresión a partir del
ácido nucleico de la misma, podría usarse para generar anticuerpos
empleando técnicas que son estándares en la técnica. Los
anticuerpos y los polipéptidos que comprenden los fragmentos de
unión a antígeno de los anticuerpos, podrían usarse para
identificar homólogos procedentes de otras especies tal y como se
describe posteriomente.
Entre los procedimientos para producir
anticuerpos se incluyen la inmunización de un mamífero (por
ejemplo, un humano, ratón, rata, conejo, caballo, cabra, oveja o
mono) con la proteína o con un fragmento de la misma. Los
anticuerpos podrían obtenerse a partir de animales inmunizados
usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en la
técnica, y podrían cribarse, preferiblemente usando la unión del
anticuerpo al antígeno de interés. Por ejemplo, podrían usarse las
técnicas de transferencia Western o de inmunoprecipitación
(Armitage et al., Nature, 357: 80-82
(1992)). Los anticuerpos podrían ser policlonales o
monoclonales.
Como una alternativa o complemento a la
inmunización de un mamífero, los anticuerpos con la especificidad
de unión apropiada podrían obtenerse a partir de una biblioteca
producida de forma recombinante de dominios variables de
inmunoglobulinas expresada, por ejemplo, usando el bacteriófago
lambda o el bacteriófago filamentoso, los cuales exhiben dominios
de unión de inmunoglobulina funcionales sobre sus superficies; por
ejemplo, consultar
W092/01047.
W092/01047.
Los anticuerpos generados contra un polipéptido
de la Rht pueden usarse en la identificación y/o aislamiento de
polipéptidos homólogos, y a continuación de los genes codificantes.
Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para
identificar o aislar un polipéptido según la invención, que
comprende el cribado de los polipéptidos candidatos con un
polipéptido que comprende el dominio unidor de antígeno de un
anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo completo o un fragmento del
mismo) que tiene especificidad de unión por un polipéptido acorde
con la
invención.
invención.
Los polipéptidos candidatos para el cribado
podrían, por ejemplo, ser los productos de una biblioteca de
expresión creada usando un ácido nucleico derivado de una planta de
interés, o podrían ser el producto de un proceso de purificación a
partir de una fuente natural.
Un polipéptido que se halla que se une al
anticuerpo podría aislarse y, a continuación, someterse a la
secuenciación de aminoácidos. Podría usarse cualquier técnica
apropiada para secuenciar el polipéptido total o parcialmente (por
ejemplo, podría secuenciarse un fragmento del polipéptido). La
información de la secuencia de aminoácidos podría usarse en la
obtención del ácido nucleico que codifica el polipéptido, por
ejemplo, diseñando uno o más oligonucleótidos (por ejemplo, un
conjunto degenerado de oligonucleótidos) para su uso como sonda o
cebadores en la hibridación para un ácido nucleico candidato, tal y
como se discute adicionalmente más abajo.
Una célula que contiene el ácido nucleico de la
presente invención representa un aspecto adicional de la invención,
particularmente una célula vegetal, o una célula bacteriana.
La célula podría comprender el ácido nucleico
que codifica la proteína gracias a su introducción del ácido
nucleico dentro de la célula o de un antepasado de la misma, por
ejemplo, mediante su transformación usando cualquier técnica
apropiada disponible para los especialistas en el campo.
También de acuerdo con la invención, se
proporciona una célula vegetal que tiene incorporado en su genoma
el ácido nucleico tal como se ha descrito.
Cuando se emplea una secuencia completa que
ocurre de forma natural, la célula vegetal podría proceder de un
planta distinta de la que es huésped natural de la secuencia.
La presente invención también proporciona una
planta que comprende tal célula vegetal.
También de acuerdo con la invención, se
proporciona una célula vegetal que tiene incorporado en su genoma
una secuencia de nucleótidos tal como se proporciona en la presente
invención, bajo el control operativo de un secuencia reguladora
para el control de la expresión. Un aspecto adicional de la
presente invención proporciona un procedimiento para preparar tal
célula vegetal, el cual implica la introducción de un vector que
comprende la secuencia de nucleótidos dentro de una célula vegetal,
y causar o permitir la recombinación entre el vector y el genoma de
la célula vegetal para introducir la secuencia de nucleótidos en el
genoma.
Una planta acorde con la presente invención
podría ser una que no se ajusta a la variedad en una o más
propiedades. Podrían excluirse variedades de plantas, en particular
variedades de plantas registrables de acuerdo con los derechos de
obtención. Se destaca que una planta no tiene porqué considerarse
"variedad de planta" simplemente porque contenga de forma
estable un transgén en su genoma, introducido dentro de una célula
de la planta o de un antepasado de la misma.
Además de una planta, la presente invención
proporciona cualquier parte suelta de tal planta, semilla, progenie
propia o híbrida, y descendientes, y cualquier parte de estas, tales
como esquejes, semillas. La invención proporciona cualquier
propágulo de planta, es decir, cualquier parte que podría usarse en
la reproducción o propagación, sexual o asexual, incluyendo los
esquejes, las semillas, etcétera. También está abarcada por la
invención una planta que es un vástago propagado sexual o
asexualmente, un clon o descendiente de tal planta, o cualquier
parte o propágulo de dicha planta, vástago, clon o
descendiente.
La invención proporciona además un procedimiento
para influenciar en las características de una planta, el cual
comprende la expresión de un polinucleótido heterólogo de la
invención dentro de las células de la planta. El término
"heterólogo" indica que el gen/secuencia de nucleótidos en
cuestión ha sido introducido en dichas células de la planta, o un
ancestro de la misma, usando ingeniería genética, es decir,
mediante intervención humana, la cual podría comprender la
transformación. El gen podría estar en un vector extragenómico o
incorporado, preferiblemente de forma estable, en el genoma. El gen
heterólogo podría remplazar un gen equivalente endógeno, es decir,
uno que normalmente realiza la misma función o una similar en el
control del crecimiento y/o del desarrollo, o la secuencia
insertada podría ser adicional a un gen endógeno. Una ventaja de la
introducción de un gen heterólogo es la capacidad de colocar la
expresión del gen bajo el control de un promotor escogido, con
objeto de ser capaz de influir la expresión del gen y, por tanto,
el crecimiento y/o el desarrollo de la planta de acuerdo con
ciertas preferencias. Además, los mutantes y derivados del gen del
tipo salvaje podrían usarse en lugar del gen endógeno. El gen
insertado podría ser ajeno o exógeno a la célula huésped, por
ejemplo, de otra especie de planta.
La característica principal que podría alterarse
usando la presente invención es el crecimiento.
De acuerdo con el modelo en el que el gen
Rht actúa como un represor del crecimiento, la menor
expresión del gen podría usarse para promover el crecimiento, al
menos en plantas que sólo tienen un gen endógeno que confiere la
función Rht (no, por ejemplo, en Arabidopsis, que
tiene homólogos endógenos que la compensarían). Esto podría
implicar el uso de la regulación antisentido o con sentido. Podrían
conseguirse plantas más altas eliminando el Rht o el gen
homólogo relevante en la planta de interés. Podrían obtenerse
plantas que fueran resistentes a compuestos que inhiben la
biosíntesis de la GA, tales como el paclobutrazol, por ejemplo,
para permitir el uso de un inhibidor de la biosíntesis de la GA
para mantener las malas hierbas enanas, pero dejar que las plantas
cultivadas crecieran altas.
La sobreexpresión de un gen Rht podría
conducir a una planta enana, lo que puede corregirse con GA, tal
como predice el modelo de represión de la Rht.
Una segunda característica que podría alterarse
es el desarrollo de la planta, por ejemplo, la floración. En
algunas plantas, y en ciertas condiciones medioambientales, se
requiere una señal de GA para la inducción de la floración. Por
ejemplo, las plantas de Arabidopsis mutantes y deficientes
en GA hechas crecer en condiciones de días cortos, no florecen a
menos que se traten con GA: estas plantas sí que florecen
normalmente cuando se hacen crecer en condiciones de días más
largos. Las plantas mutantes gai de Arabidopsis muestran un
floración retrasada en condiciones de días cortos: los mutantes
severos no florecen en absoluto. Así pues, por ejemplo, mediante la
expresión o sobreexpresión del gen rht, podrían producirse
plantas que permanecen vegetativas hasta que se les administra el
tratamiento con GA para inducir la floración. Esto podría ser útil
en contexto hortícolas, o para las espinacas, lechugas y otros
cultivos en los que es deseable la supresión de la floración
prematura.
El ácido nucleico acorde con la invención podría
colocarse bajo el control de un promotor de gen inducible
externamente, para colocar la Rht o la secuencia codificante
rht bajo el control del usuario.
El término "inducible" tal como se aplica a
un promotor es bien entendido entre aquéllos especialistas en el
campo. En esencia, la expresión bajo el control de un promotor
inducible está "activada" o incrementada en respuesta a un
estímulo aplicado. La naturaleza del estímulo varía entre
promotores. Algunos promotores inducibles causan niveles de
expresión bajos o indetectables (o ninguna expresión) en ausencia
del estímulo apropiado. Otros promotores inducibles causan la
expresión constitutiva detectable en ausencia de estímulo.
Cualquiera que sea el nivel de expresión en ausencia del estímulo,
la expresión a partir de cualquier promotor inducible está
incrementada en presencia del estímulo correcto. La situación
preferible es cuando el nivel de expresión incrementa a partir de
la aplicación del estímulo relevante en una cantidad efectiva para
alterar una característica fenotípica. Por tanto, podría usarse un
promotor inducible (o "activable"), el cual causa un nivel de
expresión en ausencia del estímulo que es demasiado bajo para
proporcionar un fenotipo deseado (y podría ser de hecho cero). A
partir de la aplicación del estímulo, la expresión está
incrementada (o activada) hasta un nivel que proporciona el
fenotipo
deseado.
deseado.
Los promotores apropiados incluyen el promotor
del gen 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV 35S), que
se expresa a un nivel elevado en virtualmente todos los tejidos
vegetales (Benfey et al., 1990a y 1990b); el promotor del
gen de la isoforma II de la
glutatión-S-transferasa del maíz
(GST-II-27), el cual se activa en
respuesta a la aplicación de un herbicida Safener (W093/01294, ICI
Ltd); el promotor meri 5 de la coliflor, que se expresa en el
meristemo apical vegetativo así como en varias posiciones bien
localizadas en el cuerpo de la planta, por ejemplo, en el floema
interno, el primordio floral, los puntos de ramificación de las
raíces y brotes (Medford, 1992; Medford et al., 1991); y el
promotor LEAFY de Arabidopsis thaliana, que se expresa muy
pronto en el desarrollo de la flor (Weigel et al.,
1992).
Se ha mostrado que el promotor del gen
GST-II-27 es inducido por ciertos
compuestos químicos, los cuales pueden aplicarse a plantas en
crecimiento. El promotor es funcional en ambas, las
monocotiledóneas y las dicotiledóneas. Por tanto, puede usarse para
controlar la expresión del gen en una variedad de plantas
modificadas genéticamente, incluyendo los cultivos tales como la
canola, el girasol, el tabaco, la remolacha azucarera, el algodón;
los cereales tales como el trigo, la cebada, el arroz, el maíz, el
sorgo; frutos tales como los tomates, los mangos, los albaricoques,
las manzanas, las peras, las fresas, las bananas, y los melones; y
vegetales tales como la zanahoria, la lechuga, la calabaza y la
cebolla. El promotor de GST-II-27
es también apropiado para su uso en una variedad de tejidos,
incluyendo las raíces, las hojas, los tallos y los tejidos
reproductores.
En consecuencia, la presente invención
proporciona en un aspecto adicional una construcción de gen que
comprende un promotor inducible unido operativamente a una
secuencia nucleotídica proporcionada por la presente invención.
Esto permite el control de la expresión del gen. La invención
también proporciona plantas transformadas con dicha construcción del
gen, y procedimientos que comprenden la introducción de tal
construcción en una célula vegetal y/o la inducción de la expresión
de una construcción dentro de una célula vegetal, mediante la
aplicación de un estímulo apropiado, un inductor exógeno efectivo.
El promotor podría ser el promotor del gen
GST-II-27 o cualquier otro promotor
vegetal inducible.
Cuando se introduce una construcción de gen
escogida, deben tenerse en cuenta ciertas consideraciones, bien
conocidas por los especialistas en la técnica. El ácido nucleico a
insertarse debe ensamblarse dentro de una construcción que contiene
elementos reguladores efectivos, los cuales dirigirán la
transcripción. Debe haber disponible un procedimiento para
transportar la construcción dentro de la célula. Una vez la
construcción se encuentra dentro de la membrana celular, tendrá
lugar, o no, la integración en el material cromosómico endógeno.
Finalmente, en lo que se refiere a las plantas, el tipo celular
debe ser tal que las células puedan regenerarse en plantas
comple-
tas.
tas.
Podrían usarse marcadores genéticos
seleccionables, consistentes en genes quiméricos que confieren
fenotipos tales como la resistencia a antibióticos como la
kanamicina, la higromicina, fosfinotricina, clorsulfurona,
metotrexato, gentamicina, spectinomicina, imidazolinonas y
glifosato.
\newpage
Un aspecto de la presente invención es el uso de
ácido nucleico acorde con la invención en la producción de una
planta transgénica.
Un aspecto adicional proporciona un
procedimiento que incluye introducir el ácido nucleico en una
planta vegetal y causar o permitir la incorporación del ácido
nucleico en el genoma de la célula.
Cualquier procedimiento apropiado de
transformación de la planta podría usarse para generar células
vegetales que comprenden ácido nucleico según la presente
invención. A continuación de la transformación, las plantas podrían
regenerarse a partir de células vegetales y tejidos
transformados.
Las células y/o plantas transformadas
exitosamente, es decir, con la construcción incorporada en su
genoma, podría seleccionarse a continuación de la introducción del
ácido nucleico dentro de las células vegetales, seguida
opcionalmente por su regeneración en una planta, por ejemplo,
usando uno o más genes marcadores tales como los de la resistencia
a antibiótico (ver más arriba).
Las plantas transformadas con el segmento de ADN
que contiene la secuencia podrían producirse mediante técnicas
estándares, las cuales ya son conocidas para la manipulación
genética de plantas. El ADN puede transformarse dentro de células
vegetales usando cualquier tecnología apropiada, tales como el
vector de plásmido Ti desarmado portado por Agrobacterium,
explotando su capacidad natural para la transferencia del gen
(EP-A-270355,
EP-A-0116718, NAR,
12(22):8711-87215 (1984)), el bombardeo con
partículas o microproyectiles (patente estadounidense n° 5.100.792,
EP-A-44882,
EP-A-434616), la microinyección (WO
92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green et al.,
Plant Tissue and Cell Culture, 1987, Academic Press), la
electroporación (EP 290395, WO 8706614 Gelvin Debeyser- -ver
adjunta), otras formas de captación directa del ADN (DE 4005152, WO
9012096, patente estadounidense n° 4.684.611), la captación de ADN
mediada por liposomas (por ejemplo, Freeman et al., Plant
Cell Physiol., 29:1353 (1984)), o el procedimiento de agitación
con vórtice (por ejemplo, Kindle, PNAS U.S.A., 87:1228
(1990d). Los procedimientos físicos para la transformación de
células vegetales están revisados en Oard, Biotech. Adv.,
9:1-11 (1991)
La transformación de Agrobacterium es
ampliamente usada por los especialistas en la técnica para
transformar especies dicotiledóneas. Recientemente, ha habido un
progreso sustancial hacia la producción rutinaria de plantas
transgénicas fértiles y estables en casi todos los cultivos de
plantas monocotiledóneas económicamente relevantes (Toriyama et
al., Bio/Technology, 6:1072-1074 (1988);
Zhang et al., Plant Cell Rep.,
7:379-384 (1988)); Zhang et al., Theor.
Appl. Genet., 76:835-840 (1988); Shimamoto et
al., Nature, 338:274-276 (1989); Datta
et al., Bio/Technology, 8:736-740
(1990); Christou et al., Bio/Technology,
9:957-962 (1991); Peng et al.,
International Rice Research Institute, Manila, Philippines,
563-574 (1991); Cao et al., Plant Cell
Rep., 11, 585-591 (1992); Li et al.,
Plant Cell Rep., 12:250-255 (1993); Rathore
et al., Plant Molecular Biology,
21:871-884 (1993); Fromm et al.,
Bio/Technology, 8:833-839 (1990);
Gordon-Kamm et al., Plant Cell,
2:603-618 (1990); 15 D'Halluin et al.,
Plant Cell, 4:1495-1505 (1992); Walters
et al., Plant Molecular Biology,
18:189-200 (1992); Koziel et al.,
Biotechnology, 11:194-200 (1993); Vasil, I.
K. Plant Molecular Biology, 25:925-937
(1994); Weeks et al., Plant Physiology,
102:1077-1084 (1993); Somers et al.,
Bio/Technology, 10:1589-1594 (1992);
W092/14828). En particular, la transformación mediada por
Agrobacterium está emergiendo ahora también como un
procedimiento de transformación altamente eficiente en
monocotiledóneas (Hiei et al., The Plant Journal,
6:271-282 (1994)).
La generación de plantas transgénica fertiles se
ha conseguido en los cereales arroz, maíz, trigo, avena y cebada
(revisada en Shimamoto, K., Current Opinion in
Biotechnology, 5:158-162 (1994); Vasil et
al., Bio/Technology, 10:667-674 (1992);
Vain et al., Biotechnology Advances,
13(4):653-671 (1995); Vasil, Nature
Biotechnology, 14:702 (1996)).
El bombardeo con microproyectiles, la
electroporación, y la captación directa de ADN se prefieren
cuando
Agrobacterium es ineficiente o inefectivo. Alternativamente, podría emplearse una combinación de diferentes técnicas para potenciar la eficiencia del proceso de transformación, por ejemplo, bombardeo con micropartículas recubiertas con Agrobacterium (EP-A-486234) o bombardeo con microproyectiles para inducir lesiones seguido por co-cultivo con Agrobacterium (EP-A-486233).
Agrobacterium es ineficiente o inefectivo. Alternativamente, podría emplearse una combinación de diferentes técnicas para potenciar la eficiencia del proceso de transformación, por ejemplo, bombardeo con micropartículas recubiertas con Agrobacterium (EP-A-486234) o bombardeo con microproyectiles para inducir lesiones seguido por co-cultivo con Agrobacterium (EP-A-486233).
La transformación de Brassica napus se describe
en Moloney et al., Plant Cell Reports,
8:238-242 (1989).
A continuación de la transformación, una planta
podrían regenerarse, por ejemplo, a partir de células sueltas,
tejido de callo, o discos de hojas, tal como es estándar en la
técnica. Casi cualquier planta puede regenerarse en su totalidad a
partir de células, tejidos y órganos de la planta. Las técnicas
disponibles se revisan en Vasil et al., Cell Culture and
Somatic Cel Genetics of Plants, volúmenes I, II y III, Laboratory
Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, y en
Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology,
Academic Press,
1989.
1989.
La elección particular de una tecnología de
transformación estará determinada por su eficiencia para
transformar ciertas especie vegetal, así como por la experiencia y
preferencia de la persona que está practicando la invención con un
determinada metodología escogida. Será evidente para la persona
capacitada que la elección particular de un sistema de
transformación para introducir el ácido nucleico en células
vegetales no es esencial para, o una limitación de la invención, ni
lo es la elección de la técnica para la regeneración de la
planta.
En la presente invención, podría conseguirse la
sobreexpresión mediante la introducción de la secuencia de
nucleótidos en una orientación con sentido. Por tanto, la presente
invención proporciona un procedimiento para influir en una
característica de una planta, comprendiendo el procedimiento el
causar o permitir la expresión del ácido nucleico acorde con la
invención a partir de ese ácido nucleico dentro de las células de
la planta.
La menor expresión del polipéptido que es
producto del gen podría conseguirse usando la tecnología
anti-sentido o la "regulación del sentido". El
uso de genes anti-sentido o de secuencias del gen
parciales para regular a la baja la expresión del gen está
actualmente bien establecida. El ADN se coloca bajo el control de
un promotor, de tal forma que la transcripción de la hebra
"anti-sentido" del ADN proporciona ARN que es
complementario del ARNm normal transcrito a partir de la hebra
"con sentido" del gen diana. Para el ADN de doble hebra, esto
se consigue colocando una secuencia codificante o un fragmento de
la misma en una "orientación invertida" bajo el control de un
promotor. Se cree que la secuencia de ARN
anti-sentido complementaria se une entonces con el
ARNm para formar un dúplex, inhibiendo la traducción del ARNm
endógeno, del gen diana en la proteína. Es todavía incierto si éste
es el modo de acción real. Sin embargo, es un hecho establecido que
la técnica funciona. Consultar, por ejemplo, Rothstein et
al., 1987; Smith et al., Nature,
334:724-726 (1988); Zhang et al., The
Plant Cell, 4:1575-1588 (1992), English et
al., The Plant Cell, 8:179-188 (1996).
La tecnología antisentido está revisada también en Bourque,
Plant Science, 105:125-149 (1995), y
Flavell, PNAS USA, 91:3490-3496 (1994).
No tiene porqué usarse la secuencia completa
correspondiente a la secuencia codificante en orientación inversa.
Por ejemplo, podrían usarse fragmentos con la longitud suficiente.
Para la persona capacitada en la técnica es un asunto rutinario
cribar fragmentos de varios tamaños y procedentes de varias partes
de la secuencia codificante para optimizar el nivel de inhibición
antisentido. Podría ser ventajoso incluir el codón de inicio ATG de
metionina, y tal vez uno o más nucleótidos cadena arriba respecto
del codón de inicio. Un posibilidad adicional es apuntar a una
secuencia reguladora de un gen, por ejemplo, una secuencia que es
característica de uno o más genes en uno o más patógenos contra los
cuales se desea tener resistencia. Un fragmento apropiado podría
tener al menos aproximadamente 14-23 nucleótidos,
por ejemplo, aproximadamente 15, 16 ó 17, ó más, al menos
aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos
aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, o más. Otros
fragmentos podrían tener al menos aproximadamente 300 nucleótidos,
al menos aproximadamente 400 nucleótidos, al menos aproximadamente
500 nucleótidos, al menos aproximadamente 600 nucleótidos, al menos
aproximadamente 700 nucleótidos o más. Tales fragmentos en la
orientación con sentido podrían usarse en la
co-supresión (ver más abajo).
No es esencial la total complementariedad de la
secuencia, aunque podría preferirse. Uno o más nucleótidos podrían
diferir en la construcción antisentido respecto el gen diana.
Podría ser preferible para ellos tener homología suficiente por las
respectivas moléculas de ARN con sentido y
anti-sentido para hibridarse, particularmente en
las condiciones existentes en una célula vegetal.
Por tanto, la presente invención proporciona
también un procedimiento para influir en una característica de una
planta, comprendiendo el procedimiento el causar o permitir la
transcripción a partir del ácido nucleico acorde con la invención
dentro de células de la planta.
Cuando se insertan copias adicionales del gen
diana con sentido, es decir, con la misma orientación que el gen
diana, se producen una serie de fenotipos que incluye individuos en
los que ocurre la sobreexpresión, y algunos en los que ocurre la
menor expresión de la proteína a partir del gen diana. Cuando el
gen insertado es sólo parte del gen endógeno, el número de
individuos con infraexpresión en la población transgénica aumenta.
El mecanismo mediante el cual ocurre la regulación por sentido,
particularmente la regulación a la baja, no se comprende del todo.
Sin embargo, esta técnica también está bien descrita en la
literatura científica y de patentes, y se usa rutinariamente para
el control de los genes. Consultar, por ejemplo, van der Krol et
al., The Plant Cell, 2:291-299 (1990);
Napoli et al., The Plant Cell,
2:279-289 (1990); Zhang et al., The Plant
Cell, 4:1575-1588 (1992), y
US-A-5.231.020.
Por tanto, la presente invención proporciona
también un procedimiento para influir en una característica de una
planta, comprendiendo el procedimiento el causar o permitir la
expresión a partir del ácido nucleico acorde con la invención
dentro de células de la planta. Esto podría usarse para influir en
el crecimiento.
Los aspectos y realizaciones de la presente
invención se ilustrarán ahora, a modo de ejemplo, con referencia a
los figuras que la acompañan.
Las figuras muestran secuencias del maíz y del
arroz de la invención y también, por referencia, secuencias
procedentes de otras especies.
Figura 1: Alineamiento del extremo
N-terminal predicho de la secuencia de aminoácidos
de GAI (Gai) con EST D39460 (0830) del arroz, con una región de
homología remarcada en negro.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 2: Secuencias de ADN de
C15-1, 14a1 y 5a1.
- La Figura 2a muestra una secuencia de ADN consenso G4 de ADNc de C15-1 (obtenida a través de la secuenciación de paso único).
- La Figura 2b muestra datos procedentes de las análisis de secuenciación del ADN original procedente de 14a1 (un único paso).
- La Figura 2c muestra datos procedentes de las análisis de secuenciación del ADN original procedente de 5a1 (un único paso).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 3: Secuencias del Rht.
- La Figura 3a muestra una secuencia de ADN compuesta del gen Rht de trigo derivada de los datos en la Figura 2, incluyendo la secuencia codificante.
- La Figura 3b muestra un alineamiento de la secuencia entera de proteína Rht predicha, codificada por la secuencia codificante de la Figura 2 (rht), con la secuencia entera predicha de la proteína GAI de Arabidopsis (Gai). Las regiones con identidad de secuencia se destacan en negro.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 4: Secuencia D39460.
- La Figura 4a muestra la secuencia de ADN (un único paso) del ADNc D39460 del arroz. Este ADNc es un clon parcial, incompleto, que carece del extremo 3' del ARNm del que se deriva.
- La Figura 4b muestra un alineamiento de la secuencia entera de proteína Rht predicha (trigo, codificada por la secuencia codificante de la Figura 2) con la de GAI (Gai) y la secuencia de la proteína del arroz predicha a partir de la secuencia de ADN de la Figura 4a (Rice). Las regiones con identidad de aminoácidos se destacan en negro; algunas sustituciones conservadores están sombreadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 5: Estructura básica de anillos de
carbono de las giberelinas.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 6: Secuencia EST del arroz.
- La Figura 6a muestra la secuencia de nucleótidos de la EST D39460 del arroz, según la han determinado los presentes inventores.
- La Figura 6b muestra la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la secuencia EST del arroz de la Figura 6a.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 7: ADNc del C15-1 de
trigo.
- La Figura 7a muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del C15-1 de trigo.
- La Figura 7b muestra la secuencia de aminoácidos predicha del ADNc del C15-1 de trigo de la Figura 7a.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 8: Clon genómico 5al del trigo.
- La Figura 8a muestra la secuencia de nucleótidos del clon genómico 5a1 del trigo.
- La Figura 8b muestra la secuencia de aminoácidos predicha del clon genómico 5a1 del trigo de la Figura 8a.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 9: Clon genómico 1a1 del maíz.
- La Figura 9a muestra la secuencia de nucleótidos del clon genómico 1a1 del maíz, es decir, D8.
- La Figura 9b muestra la secuencia de aminoácidos del clon genómico 1a1 del maíz de la Figura 9a.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 10 muestra un alineamiento PRETTYBOX
de las secuencias de aminoácidos del polipéptido D8 del maíz con,
el polipéptido Rht del trigo, la secuencia EST del arroz
determinada por los presentes inventores, y el polipéptido Gai de
Arabidopsis thaliana.
\newpage
Figura 11: Secuencias de los alelos de D8 del
maíz.
- La Figura 11a muestra una secuencia parcial de nucleótidos del alelo D8-1 del maíz.
- La Figura 11b muestra una secuencia parcial de aminoácidos del alelo D8-1 del maíz.
- La Figura 11c muestra una secuencia parcial de nucleótidos del alelo D8-2023 del maíz.
- La Figura 11d muestra una secuencia parcial de aminoácidos del alelo D8-2023 del maíz.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 12: Alelo rht-10
del trigo.
- La Figura 12a muestra una secuencia parcial de nucleótidos del alelo rht-10 del trigo.
- La Figura 12b muestra una secuencia parcial de aminoácidos del alelo rht-10 del trigo.
\vskip1.000000\baselineskip
Previamente, clonamos el gen GAI de
Arabidopsis (PCT/GB97/00390-WO97/29123
publicada el 14 de agosto de 10 1997). La comparación de las
secuencias de ADN del tipo salvaje (GAI) y de los alelos mutantes
(gai) mostró que gai codifica un producto de proteína
predicha mutante (gai) que carece de un segmento de 17 aminoácidos
de cerca del extremo N-terminal de la proteína. El
cribado de las bases de datos de secuencias de ADN con la secuencia
GAI reveló la existencia de una EST (D39460) del arroz, la
cual contiene una región de una secuencia estrechamente relacionada
con la del segmento que está suprimido del GAI en la proteína gai.
Una comparación de las secuencias de aminoácidos predichas de la
región DELLA a EQLE muestra que son idénticas en ambas secuencias.
Las dos diferencias (V/A; E/D) son sustituciones conservadoras, en
las que un residuo aminoácidos es remplazado por otro que tiene
propiedades químicas muy similares. Además, la región de identidad
se extiende más allá de los límites de la región de supresión en la
proteína gai. La secuencia DVAQKLEQLE no se ve afectada por la
supresión en gai, y todavía está perfectamente conservada entre las
secuencias GAI i D39460 (Figura 1).
Se usó un subfragmento
SalI-NotI de aproximadamente 700 p.b. de
D39460, en experimentos de hibridación con baja rigurosidad, para
aislar los clones que se hibridaban a partir de ADNc de trigo y de
bibliotecas genómicas (preparadas a partir de ADN de la variedad
Chinese Spring), y a partir de una biblioteca genómica del maíz
(preparada a partir de la línea B73N). Se aislaron varios clones,
incluyendo los C15-1 y C15-10
(ADNc), y los 5a1 y 14a1 (clones genómicos). El clon
C15-1 se ha usado en experimentos de mapado del
gen. El análisis nulisómico-tetrasómico mostró que
el clon C15-1 se híbrida con fragmentos de ADN
genómico derivados de los cromosomas 4A, 4B y 4D del trigo. Esto es
consistente con que el clon C15-1 contenga la
secuencia Rht, puesto que el loci Rht se cartografía
en los cromosomas del grupo 4. Adicionalmente, el análisis
recombinante usando una población de segregación para el alelo
Rht-D1b (anteriormente Rht2)
identificó un fragmento que se hibridaba, que mostraba un
co-segregación perfecta con el alelo mutante. Esto
situó la ubicación genómica del gen que codifica la secuencia de
ARNm en el ADNc C15-1 dentro de un segmento de 2 cM
(que ya se sabía que contenía el Rht) del grupo 4 de
cromosomas, y proporciona una evidencia clara de que el ADNc y los
clones genómicos contienen efectivamente el gen Rht. La
secuencia de ADN del DB de maíz descubierta en la presente
procede de fragmentos SalI de 1,8 kb y 3,0 kb contiguos
subclonados (clonados en Bluescript^{TM} SK^{+}) procedentes de
1a1. La secuencia de Rht de trigo descubierta en la presente
procede de un subfragmento DraI de 5,7 kb (clonado en
Bluescript^{TM} SK^{+}) del
clon 5a1.
clon 5a1.
La Figura 2a proporciona la secuencia de ADN (un
único paso) completa del ADNc de C15-1. Se ha
obtenido también la secuencia de ADN para el
C15-10; es idéntica a la del C15-1
y, por tanto, no se muestra. Las Figuras 2b y 2c muestran datos
originales procedentes de los análisis de secuenciación de los
clones 14a1 y 5a1. Las secuencias mostradas en la Figura 2 pueden
solaparse para preparar una secuencia de ADN compuesta, mostrada en
la Figura 3a. Esta secuencia exhibe una homología intensa con la
del GAI de Arabidopsis, tal como se reveló mediante
una comparación de la secuencia de aminoácidos de un producto de
traducción predicho de la secuencia del trigo (Rht) con la del
GAI (GAI), mostrada en la Figura 3b. En particular, la
secuencia de aminoácidos predicha de la presunta Rht revela una
región prácticamente idéntica con GAI a lo largo de la región que
está ausente en gai (Figura 4). La Figura 4 revela que la homología
que se extiende más allá de la región de supresión de gai en la EST
del arroz, también está conservada en la Rht (DVAQKLEQLE),
indicando, por tanto, que esta región, además de la hallada en la
supresión de gai, está implicada en la transducción de señal de
GAI. Esta región no se halla en SCR, otra proteína que está
relacionada en su secuencia con la GAI, pero que no está implicada
en la señalización de GAI. Los cebadores usados en los experimentos
de secuenciación de más arriba se muestran en la Tabla 1.
Se ha obtenido confirmación adicional de que
estas secuencias son realmente los loci Rht del trigo y
D8 del maíz mediante el análisis de las secuencias del gen
procedentes de varios alelos mutantes, tal como sigue.
Los presentes inventores obtuvieron y
secuenciaron el clon identificado en la base de datos como la EST
D39460 del arroz, y las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos
predicha a partir de ese trabajo de muestran respectivamente en la
Figura 6a y en la Figura 6b.
El trabajo previo sobre el gen GAI de
Arabidopsis mostró que la proteína GAI consiste en dos
secciones, un mitad N-terminal que no presenta
homología con ninguna otra proteína de función conocida, y un mitad
C-terminal que presenta una homología extensa con
el factor de transcripción candidato SCR de Arabidopsis
(Peng et al., Genes and Development,
11:3194-3205 (1997); PCT/GB97/00390). Tal como se
ha descrito más arriba, la supresión de una porción de la mitad
N-terminal de la proteína causa las respuestas
reducidas a la GA características del alelo mutante gai (Peng et
al., 1997; PCT/GB97/00390). Por tanto, los inventores predijeron
que si D8 y Rht son homólogos funcionales
(ortólogos), respectivamente del maíz y del trigo, de la GAI
de Arabidopsís, entonces los alelos mutantes dominante de
D8 y Rht deberían contener también mutaciones que
afectaran las secciones N-terminales de las
proteínas que codifican.
Los informes previos describen un cierto número
de alelos mutantes dominantes de D8 y de Rht, en particular,
D8-1, D8-2023 y
Rht-D1c (anteriormente Rht10) (Börner et
al., Euphytica, 89:69-75 (1996); Harberd
y Freeling, Genetics, 121:827-838 (1989);
Winkler y Freeling, Planta, 193:341-348
(1994)). Por tanto, los presentes inventores clonaron los genes
D8/Rht candidatos procedentes de estos mutantes, y
examinaron mediante secuenciación del ADN la porción del gen que
codifica la mitad N-terminal de la proteína.
Un fragmento de los genes D8 o Rht
que codifica una porción de la mitad N-terminal de
la proteína D8/Rht se amplificó mediante la PCR a partir de ADN
genómico de plantas que contenían D8-1, D8-2023 y
Rht-D1c, usando los siguientes cebadores para
la amplificación: para D8-1, los cebadores
ZM-15 y ZM-24; para D8-2023,
los cebadores ZM-9 y ZM-11; para
Rht-D1c se realizó la PCR anidad usando
Rht-15 y Rht-26 seguidos por
Rht-16 y Rha-2. Las reacciones de
la PCR se realizaron usando un equipo de la PCR geneAmp XL de Perkin
Elmer, usando las siguientes condiciones: las reacciones se
incubaron a 94°C durante 1 minuto, a continuación se sometieron a 13
ciclos de 94°C, 15 segundos - x°C durante 15 segundos - 69°C 5
minutos (en donde x se reduce en 1°C por ciclo, empezando a 64°C y
finalizando a 52°C), a continuación 25 ciclos de 94°C, 15 segundos -
53°C, 15 segundos - 65°C, 5 minutos, a continuación 10 minutos a
70°C. Estos fragmentos se clonaron a continuación en el vector
pGEM^{R}-T Easy (Promega, consultar el Manual
Técnico), y se determinaron sus secuencias de ADN.
Se hallaron mutaciones en los genes D8 y
Rht candidatos en cada uno de los mutantes anteriores. La
mutación D8-1 es una supresión en pauta que suprime los
aminoácidos VAQK (55-59) y añade una G (ver la
secuencia en la Figura 11a y en la Figura 11b). Esta supresión se
solapa con el bloque de homología DVAQKLEQLE conservado descrito
más arriba. D8-2023 es otra mutación de supresión en pauta
que suprime los aminoácidos LATDTVHYNPSD (87-98) del
extremo N-terminal de la proteína D8 (ver la Figura
11c y la Figura 11d). Esta supresión no se solapa con la supresión
en gai o en D8-1, pero cubre otra región que está
altamente conservada entre GAI, D8 y Rht (ver la Figura 10).
Finalmente, Rht-D1c contiene otra pequeña
supresión en pauta que suprime los aminoácidos LNAPPPPLPPAPQ
(109-121) en la región N-terminal de
la proteína Rht mutante que codifica (ver la Figura 12a y la
Figura 12b) (LN-P está conservada entre GAI, D8 y
Rht, ver la Figura 10).
Por tanto, todos los alelos mutantes descritos
más arriba son dominantes, y confieren enanismo asociado con una
respuesta reducida a la GA. Todos estos tres alelos contienen
mutaciones de supresión que suprimen una porción de la mitad
N-terminal de la proteína que codifican. Estas
observaciones demuestran que se han clonado los genes D8 y
Rht del maíz y del trigo.
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Claims (27)
1. Polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la
secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 9b para el
polipéptido D8 del maíz.
2. Polinucleótido aislado según la
reivindicación 1, en el cual el polinucleótido tiene la secuencia
de nucleótidos codificante mostrada en la Figura 9a.
3. Polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la
secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 6b.
4. Polinucleótido aislado según la
reivindicación 3, en el cual el polinucleótido tiene la secuencia
de nucleótidos codificante mostrada en la Figura 6a.
5. Polinucleótido aislado en el cual un
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 está
unido operativamente a una secuencia reguladora para su
expresión.
6. Polinucleótido aislado cuya secuencia de
nucleótidos es complementaria de una secuencia de al menos 50
nucleótidos contiguos de la secuencia codificante o secuencia
complementaria de la secuencia codificante de un ácido nucleico
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, apropiado para su
uso en una regulación antisentido o con sentido
("co-supresión") de la expresión de dicha
secuencia codificante y bajo el control de una secuencia reguladora
para la transcripción.
7. Polinucleótido según la reivindicación 5 ó la
reivindicación 6, en el cual la secuencia reguladora incluye un
promotor inducible.
8. Vector de ácido nucleico apropiado para la
transformación de una célula vegetal, y que incluye un
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores.
9. Célula huésped que contiene un
polinucleótido heterólogo o vector de ácido nucleico según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
10. Célula huésped según la reivindicación 9,
la cual es microbiana.
11. Célula huésped según la reivindicación 9,
la cual es una célula vegetal.
12. Célula vegetal según la reivindicación 11
que tiene dicho polinucleótido heterólogo en su cromosoma.
13. Célula vegetal según la reivindicación 12
que tiene más de uno de dicho polinucleótido por genoma
haploide.
14. Célula vegetal según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, la cual está comprendida en una planta,
en una parte de planta, o en un propágulo de planta, o en un
extracto o derivado de una planta.
15. Procedimiento para producir una célula
según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, incluyendo el
procedimiento la incorporación de dicho polinucleótido o vector de
ácido nucleico en la célula por medio de la transformación.
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
el cual incluye recombinar el polinucleótido con el ácido nucleico
del genoma de la célula, de tal forma que se incorpore establemente
en el mismo.
17. Procedimiento según la reivindicación 15 o
reivindicación 16, el cual incluye regenerar una planta a partir de
una o más células transformadas.
18. Planta que comprende una célula vegetal
según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.
19. Parte o propágulo de una planta que
comprende una célula vegetal según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13.
20. Procedimiento para producir una planta,
incluyendo el procedimiento la incorporación de un polinucleótido o
vector de ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 8, en una célula vegetal y la regeneración de una planta a
partir de dicha célula vegetal.
21. Procedimiento según la reivindicación 20,
que incluye el propagar sexual o asexualmente, o hacer crecer, un
vástago o un descendiente de la planta regenerada a partir de dicha
célula vegetal.
22. Procedimiento para influir en una
característica de una planta, incluyendo el procedimiento causar o
permitir la expresión a partir de un polinucleótido heterólogo,
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, dentro de las
células de la planta.
23. Utilización de un polinucleótido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la producción de una
planta transgénica.
24. Polipéptido aislado codificado por un
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
25. Anticuerpo que incluye un sitio de unión a
antígeno con afinidad de unión específica para el polipéptido
según la reivindicación 24.
26. Polipéptido que incluye el sitio de unión a
antígeno de un anticuerpo según la reivindicación 25.
27. Procedimiento para identificar u obtener un
polipéptido según la reivindicación 24, incluyendo el
procedimiento cribar polipéptidos candidatos con un anticuerpo o
polipéptido según la reivindicación 25 o reivindicación 26.
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