DE69834192T2

DE69834192T2 - Weizen rht gen zur genetischen kontrolle des pflanzenwachstums und entwicklung

Info

Publication number: DE69834192T2
Application number: DE69834192T
Authority: DE
Inventors: Paul Nicholas HARBERD; Ernest Donald RICHARDS; Jinrong Peng
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1997-08-13
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2018-08-08
Also published as: EP1681349A3; ATE323163T1; DE69834192D1; EP1681349B1; US6762348B1; CA2299699A1; EP1003868A1; PT1003868E; JP4021615B2; US7268272B2; JP2001514893A; GB9717192D0; US20050060773A1; CA2299699C; CN1274386A; CN1250723C; ES2263214T3; EP1681349A2; EP1003868B1; WO1999009174A1

Description

Diese Erfindung betrifft die genetische Kontrolle des Wachstums und/oder der Entwicklung von Pflanzen und das Klonieren und die Expression von daran beteiligten Genen. Insbesondere betrifft die Erfindung das Klonieren und die Expression von Homologen des rht-Gens von Triticum aestivum von anderen Spezies und die Verwendung der Gene in Pflanzen.
Das Wissen um die genetischen Mechanismen, die das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen, einschließlich der Blüte, beeinflussen, liefert ein Mittel zur Veränderung der Eigenschaften einer Zielpflanze. Spezies, für die eine Manipulation der Wachstums- und/oder Entwicklungseigenschaften von Vorteil sein könnte, umfassen alle Feldfrüchte, wobei wichtige Beispiele die Getreidesorten Reis und Mais, die für wärmere Klimazonen wahrscheinlich die agronomisch wichtigsten Sorten sind, und Weizen, Gerste, Hafer und Roggen in gemäßigteren Zonen. Wichtige Samenprodukte sind Ölsamenraps und Canola, Mais, Sonnenblumen, Sojabohnen und Sorghum. Zahlreiche Feldfrüchte, die für ihre Wurzeln geerntet werden, werden jährlich aus Samen gezüchtet, und die Produktion von Samen jeglicher Art ist sehr stark von der Fähigkeit der Pflanze abhängig, zu blühen, bestäubt zu werden und Samen zu bilden. Im Bereich des Gartenbaus ist eine Kontrolle des Zeitpunkts des Wachstums und der Entwicklung, einschließlich der Blüte, wichtig. Gartenbaupflanzen, deren Eintritt der Blüte gesteuert werden kann, umfassen Kopfsalat, Endivie, Gemüsekohl, einschließlich Kohl, Brokkoli und Karfiol, sowie Nelken und Geranien. Zwergpflanzen einerseits und übergroße, höhere Pflanzen andererseits können in verschiedenen Gartenbau- und Landwirtschaftsbereichen von Vorteil und/oder wünschenswert sein, wozu auch Bäume, Plantagenpflanzen und Gräser zählen.
In den letzten Jahrzehnten ist die Ausbeute an Weizenkörnern aufgrund des Einbaus von Halbzwerg-Rht-Homöoallelen in die Zuchtprogramme stark angestiegen. Diese Steigerungen ermöglichten es der Weizenproduktion, mit der Nachfrage einer ständig wachsenden Weltbevölkerung Schritt zu halten. Die Erfinder haben schon früher das Klonieren der Arabidopsis-gai-Allele beschrieben (Internationale Patentanmeldung PCT/GB97/00390, eingereicht am 12. Februar 1997 und veröffentlicht als WO 97/29123 am 14. August 1998, John Innes Centre Innovations Limited, dessen gesamter Inhalt durch Verweis hierin aufgenommen ist), die, wie mutierte Rht-Allele in Weizen (einem Monokotyl), in Arabidopsis (einem Dikotyl) einen halbdominanten Zwergphänotyp bereitstellen und eine Reduktion der Reaktionsbereitschaft gegenüber dem Pflanzenwachstumshormon Gibberellin (GA) verursachen. gai kodiert für eine Proteinmutante (gai), der 17 Aminosäurerestfragmente fehlen, die im Wildtyp- (GAI-) Protein nahe dem N-Terminus vorkommen. Die Sequenz dieses Segments ist in einer Reis-cDNA-Sequenz (EST) stark konserviert. Die Erfinder zeigen hierin, dass diese cDNA mit einem kurzen Abschnitt des überlappenden Getreidegenom übereinstimmt, Übereinstimmungen, die bekannterweise die Rht-Loci enthalten, und dass sie die cDNA zur Isolation der Rht-Gene von Weizen verwendet haben. Dass so unterschiedliche Genome wie jene von Arabidopsis und Triticum eine konservierte Sequenz tragen, die sich nach einer Mutation auf die GA-Reaktionsbereitschaft auswirkt, zeigt, dass diese Sequenz bei der GA-Signalgebung eine Rolle spielt, die im gesamten Pflanzenreich konserviert ist. Außerdem ermöglicht die Klonierung von Rht seinen Transfer in viele verschiedene Feldfruchtspezies, mit dem Ziel, den Ertrag auf die schon mit Weizen erreichten Werte zu erhöhen.
Die Einführung von halbverzwergenden Rht-Homöoallelen (ursprünglich als Norin-10-Gene bekannt, abgeleitet von einer japanischen Sorte, Norin 10) in Brotweizen-Elitezuchtlinien war einer der wichtigsten Beiträge zur so genannten „grünen Revolution" (Gale et al., Dwarfing genes in wheat, in: Progress in Plant Breeding, 1–35, G.E. Russel (Hrsg.), Buttersworths, London (1985)). Diese Homöeallele enthaltender Weizen brachte durchwegs höhere Erträge als Weizen, dem diese fehlten, und heute macht er etwa 80 % der gesamten Weizenpflanzen weltweit aus. Die biologische Basis für diese Ertragssteigerung scheint zweigeteilt zu sein. Erstens führt der durch die Rht-Allele verliehene Halbzwergphänotyp zu einer Erhöhung der Standfestigkeit (Widerstand gegen Abknicken durch Wind/Regen und daraus resultierende Ertragsminderung). Und zweitens führen diese Allele zu einer Neuverteilung von Photoassimilaten, sodass mehr zum Korn und weniger zum Stamm geleitet werden (Gale et al. (1985)). Diese Eigenschaften haben starke Auswirkungen auf den Ertrag von Weizen, wie sich durch die Tatsache zeigt, dass der Weizenertrag in Großbritannien in den Jahren, seit die Bauern die Rht-hältigen Linien einsetzen, um 20 % gestiegen ist.
Die rht-Mutanten sind verzwergt, weil sie ein genetisch dominantes, mutiertes rht-Allel enthalten, das ihre Reaktionen auf Gibberellin (GA, endogener Pflanzenwachstumsregler) beeinflusst (Gale et al., Heredity 37, 283–289 (1976)). Deshalb reagieren die Koleoptilen von rht-Mutanten, anders als die von Weizenpflanzen vom Wildtyp, nicht auf GA-Wirkungen. Außerdem akkumulieren rht-Mutanten biologisch aktive GAs in größeren Mengen als Wildtyp-Kontrollen (Lenton et al., Gibberellin insensitivity and depletion in wheat – consequences for development, in: Hormone Action in Plant Development – A Critical Appraisal, S. 145–160, G.V. Haod, J.R. Lenton, M.B. Jackson und R.K. Atkin (Hrsg.), Butterworths, London (1987)). Diese Eigenschaften (genetische Dominanz, verringerte GA-Reaktionen und hohe endogene GA-Werte) sind den Phänotypen gemein, die durch Mutationen in anderen Spezies (D8/D9 bei Mais; gai bei Arabidopsis) erhalten wurden, was zeigt, dass diese mutierten Allele orthologe Gene in diesen unterschiedlichen Spezies definieren, weiter unterstützt durch die Beobachtung, dass D8/D9 und Rht syntene Loci in den Genomen von Mais und Weizen sind.
Der Begriff „Rht-Funktion" steht für die Fähigkeit, den Phänotyp einer Pflanze wie das Rht-Gen von Triticum beeinflussen zu können. Die „Rht-Funktion" kann phänotypisch in einer Pflanze als Inhibition, Suppression, Repression oder Reduktion des Pflanzenwachstums vorkommen, wobei der GA Inhibition, Suppression, Repression oder Reduktion entgegenwirkt. Die Rht-Expression verleiht einer Pflanze normalerweise einen Zwergenphänotyp, dem GA entgegenwirkt.
Die Überexpression einer Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit Rht-Funktion kodiert, in einer Pflanze kann verwendet werden, um einer Pflanze einen Zwergenphänotyp zu verleihen, der durch Behandlung mit GA korrigierbar ist.
rht-Mutantenpflanzen sind im Vergleich zum Wildtyp verzwergt, wobei die Verzwergung GA-unempfindlich ist.
Hierin bezieht sich „Rht" (groß geschrieben) auf die Wildtypfunktion, während sich „rht" (klein geschrieben) auf die Mutantenfunktion bezieht.
Viele Pflanzenwachstums- und -entwicklungsprozesse werden durch spezifische Mitglieder einer Familie von tetrazyklischen Diterpenoidwachstumsfaktoren reguliert, die als Gibberelline (GA) bekannt sind (Hooley, Plant Mol. Biol. 26, 1529–1555 (1994)). Gibberellin oder GA steht für ein Diterpenoidmolekül mit der in 5 dargestellten zugrundeliegenden Kohlenstoffringstruktur, das biologische Aktivität aufweist, d.h. für biologisch aktive Gibberelline.
Die biologische Aktivität kann durch eines oder mehrere aus Stimulierung von Zellverlängerung, Blattseneszenz oder Auslösung einer Kornaleuron-α-amylasereaktion definiert sein. Auf dem Gebiet der Erfindung sind zahlreiche Standardassays verfügbar, und ein positives Ergebnis in einem oder in mehreren davon weist ein Test-Gibberellin als biologisch aktiv aus (Hoad et al., Phytochemistry 20, 703–713 (1981); Serebryakov et al., Phytochemistry 23, 1847–1854 (1984); Smith et al., Phytochemistry 33, 17–20 (1993)).
Auf dem Gebiet der Erfindung verfügbare Assays umfassen den Salat-Hypokotyltest, den Gurken-Hypokotyltest und den Hafer-Primärblatttest, mithilfe derer die biologische Aktivität auf Basis der Fähigkeit eines angewendeten Gibberellins bestimmt werden kann, eine Verlängerung des jeweiligen Gewebes zu verursachen. Bevorzugte Assays sind solche, bei denen die Testzusammensetzung auf eine gibberellindefiziente Pflanze angewendet wird. Solche bevorzugten Assays umfassen die Behandlung einer Zwergen-GA-defizienten Arabidopsis, um das Wachstum zu bestimmen, den Zwergenerbsentest, bei dem die Internodienstreckung bestimmt wird, den Tan-Ginbozu-Zwergenreistest, bei dem die Verlängerung einer Blattscheide bestimmt wird, und den d5-Maistest, bei dem ebenfalls die Verlängerung einer Blattscheide bestimmt wird. Die Verlängerungsbioassays messen die Auswirkungen einer allgemeinen Zellverlängerung in den jeweiligen Organen, und nicht auf bestimmte Zelltypen eingeschränkt.
Weitere verfügbare Assays umfassen den Ampfer- (Rumex-) Blattsenseszenzassay und den Kornaleuron-α-amylaseassay. Aleuronzellen, die das Endosperm in Kornsekret-α-amylase bei der Keimung umgeben, welches Stärke abbaut, um Zucker zu produzieren, der dann von der wachsenden Pflanze genutzt wird. Die Enzymproduktion wird durch GA geregelt. Isolierte Aleuronzellen, denen biologisch aktive GA-Sekret-α-amylase zugegeben wird, können dann auf ihre Aktivität getestet werden, beispielsweise durch Messung des Stärkeabbaus.
Strukturmerkmale, die für eine hohe biologische Aktivität wichtig sind (wie sie GA₁, GA₃, GA₄ und GA₇ aufweisen), sind eine Carboxylgruppe auf C-6 eines B-Rings; C-19-, C-10-Lacton; und β-Hydroxylierung an C-3, während β-Hydroxylierung an C-2 zu Inaktivität führt (wie sie GA₈, GA₂₉, GA₃₄ und GA₅₁ aufweisen). rht-Mutanten reagieren nicht auf eine GA-Behandlung, z.B. eine Behandlung mit GA₁, GA₃ oder GA₄.
Eine Behandlung mit GA erfolgt vorzugsweise durch Besprühen mit einer wässrigen Lösung, beispielsweise durch Besprühen mit 10^–4 M GA₃ oder GA₄ in einer wässrigen Lösung, vielleicht wöchentlich oder häufiger, oder durch das Auftragen von Tröpfchen auf Pflanzen anstelle von Sprühen. GA kann in einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Ethanol oder Aceton, gelöst aufgetragen werden, weil es in diesen besser löslich ist als in Wasser, aber das ist nicht bevorzugt, weil diese Lösungsmittel dazu neigen, Pflanzen zu beschädigen. Wenn ein organisches Lösungsmittel verwendet wird, umfassen geeignete Formulierungen 24 μl 0,6, 4,0 oder 300 mM GA₃ oder GA₄ in 80 % Ethanol gelöst. Pflanzen, z.B. Arabidopsis, können auf einem GA enthaltenden Medium, wie z.B. einem Gewebekulturmedium (GM), das mit Agar verfestigt ist und ergänzendes GA enthält, gezüchtet werden.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in allen Aspekten verwenden eine Nucleotidsequenz, die für die in 6b oder 9b dargestellte Aminosäuresequenz kodiert. Solch eine kodierende Sequenz kann wie in 6a oder 9a dargestellt aussehen.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Nucleinsäurekonstrukt oder einen Vektor bereit, die Nucleinsäure mit einer der breitgestellten Sequenzen umfassen, vorzugsweise ein Konstrukt oder einen Vektor, aus dem ein Polypeptid, für das die Nucleinsäuresequenz kodiert, exprimiert werden kann. Das Konstrukt oder der Vektor ist vorzugsweise für eine Transformation in eine Pflanzenzelle geeignet. Die Erfindung umfasst weiters eine Wirtszelle, die mit solch einem Konstrukt oder Vektor transformiert ist, insbesondere eine Pflanzenzelle. Somit wird eine Wirtszelle, wie z.B. eine Pflanzenzelle, die Nucleinsäure gemäß der Erfindung umfasst, bereitgestellt. Innerhalb der Zelle kann die Nucleinsäure im Chromosom inkorporiert sein. Es kann mehr als eine heterologe Nucleotidsequenz pro haploidem Genom geben. Das ermöglicht beispielsweise eine gesteigerte Expression des Genprodukts im Vergleich zu endogenen Mengen, wie nachstehend erläutert wird.
Ein die Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung umfassendes Konstrukt oder ein solcher Vektor müssen keinen Promotor oder andere Regulationssequenz umfassen, insbesondere wenn der Vektor zur Einführung der Nucleinsäure in Zellen zur Rekombination in das Genom verwendet wird. In einem Aspekt stellt die Erfindung jedoch ein Nucleinsäurekonstrukt bereit, das eine für Rht kodierende Sequenz umfasst, die zur Regelung der Expression an eine Regulationssequenz gebunden ist, wobei die Regulationssequenz eine andere ist, als die von Natur aus an die kodierende Sequenz fusionierte und vorzugsweise von einem anderen Gen stammt oder abgeleitet ist.
Nucleinsäuremoleküle und -vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung können als Isolate, aus ihrer natürlichen Umgebung isoliert, vorliegen, und zwar in im Wesentlichen reiner oder homogener Form oder frei von oder im Wesentlichen frei von Nucleinsäure oder Genen der Spezies von Interesse oder anderen Ursprungs als die Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das zur Beeinflussung des Wachstums und/oder der Entwicklung, einschließlich der Blüte, in der Lage ist, wie z.B. bei Triticum aestivum eine andere Nucleinsäure als die für Rht kodierende Sequenz. Der Begriff „Nucleinsäureisolat" umfasst vollständig oder teilweise synthetische Nucleinsäure.
Nucleinsäure kann natürlich doppel- oder einzelsträngige cDNA oder genomische DNA, RNA oder vollständig oder teilweise synthetisch sein, je nach Bedarf. Wenn Nucleinsäure gemäß der Erfindung RNA umfasst, kann natürlich ein Verweis auf die dargestellte Sequenz als das RNA-Äquivalent umfassend aufgefasst werden, wobei U anstelle von T vorkommt.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiters das Expressionsprodukt einer beliebigen der geoffenbarten Nucleinsäuresequenzen und Verfahren zur Herstellung des Expressionsprodukts durch Expression aus dafür kodierender Nucleinsäure unter geeigneten Bedingungen in geeigneten Wirtszellen. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können leicht für die Expression und Gewinnung von Produkten einer rekombinanten Genexpression Vektoren konstruieren und Protokolle ausarbeiten. Geeignete Vektoren, die geeignete Regulationssequenzen, einschließlich Promotorsequenzen, Terminatorsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Enhancer-Sequenzen, Markergenen oder anderen geeigneten Sequenzen, können ausgewählt oder konstruiert werden. Für weitere Details siehe z.B. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Die Transformationsverfahren hängen vom verwendeten Wirten ab, sind aber allgemein bekannt. Viele bekannte Verfahren und Protokolle zur Manipulation von Nucleinsäure, wie z.B. bei der Herstellung von Nucleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einführung von DNA in Zellen und Genexpression, sowie zur Analyse von Proteinen sind in Protocols in Molecular Biology, 2. Aufl., Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons (1992) im Detail beschrieben. Spezifische Verfahren und Vektoren, die bisher mit großem Erfolg bei Pflanzen eingesetzt wurden, sind in Bevan, Nucl. Acids Res. 12, 8711–8721 (1984) und Guerinaeu und Mullineaux, plant transformation and expression vectors, in: Plant Molecular Biology Labfax, S. 121–148, R.R.D. Croy (Hrsg.), Oxford, BIOS Scientific Publishers (1993) beschrieben. Die Offenbarungen von Sambrook et al. und Ausubel et a1. sowie alle anderen hierin erwähnten Dokumente sind durch Verweis hierin aufgenommen.
Eine Expression als Fusion mit einer Polyhistidin-Markierung ermöglicht die Durchführung einer Reinigung von Rht unter Verwendung von Ni-NTA-Harz von QIAGEN Inc. (USA) und DIAGEN GmbH (Deutschland). Siehe Janknecht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8972–8976 (1991) und EP-A-0.253.303 und EP-A-0.282.042, Ni-NTA-Harz weist hohe Affinität für Proteine mit aufeinanderfolgenden Histidinen nahe dem N- oder C-Terminus des Proteins auf und kann so zur Reinigung von Histidinmarkierten Rht-Proteinen von Pflanzen, Pflanzenteilen oder Extrakten oder von rekombinanten Organismen, wie beispielsweise Hefe oder Bakterien, wie z.B. E. coli, in denen das Protein exprimiert wird, verwendet werden.
Ein gereinigtes Rht-Protein, das beispielsweise rekombinant durch Expression aus dafür kodierender Nucleinsäure hergestellt wurde, kann zur Bildung von Antikörpern unter Verwendung von Verfahren verwendet werden, die auf dem Gebiet der Erfindung zu den Standardverfahren zählen. Antikörper und Polypeptide, die antigenbindende Fragmente von Antikörpern umfassen, können zur Identifikation von Homologen von anderen Spezies verwendet werden, wie weiter unten erläutert wird.
Verfahren zur Herstellung von Antikörpern umfassen die Immunisierung eines Säugetiers (z.B. Mensch, Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Ziege, Schaf oder Affe) mit dem Protein oder einem Fragment davon. Antikörper können aus immunisierten Tieren unter Verwendung verschiedenster auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren erhalten und gescreent werden, vorzugsweise unter Verwendung der Bindung eines Antikörpers an ein Antigen von Interesse. Beispielsweise können Western-Blotting-Verfahren oder Immunfällung eingesetzt werden (Armitage et al., Nature 357, 80–82 (1992)). Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein.
Als Alternative oder Ergänzung zur Immunisierung eines Säugetiers können Antikörper mit geeigneter Bindungsspezifität aus einer rekombinant produzierten Bibliothek von exprimierten variablen Immunglobulindomänen erhalten werden, z.B. unter Verwendung eines λ-Bakteriophagen oder eines filamentösen Bakteriophagen, die auf ihrer Oberfläche funktionelle Immunglobulin-Bindedomänen auf weisen; siehe z.B. WO 92/01047.
Gegen ein Rht-Polypeptid gebildete Antikörper können bei der Identifikation und/oder Isolation von homologen Polypeptiden und dann der kodierenden Gene verwendet werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifikation oder Isolierung eines Polypeptids gemäß der Erfindung bereit, welches das Screenen von vermutlichen Polypeptiden mit einem Polypeptid umfassen, das die antigenbindende Domäne eines Antikörpers (z.B. eines ganzen Antikörpers oder eines Fragments davon) umfasst, welche Bindungsspezifität für ein Polypeptid gemäß der Erfindung aufweist.
Vermutliche Polypeptide zum Screenen können beispielsweise die Produkte einer Expressionsbibliothek sein, die unter Verwendung einer von einer Pflanze von Interesse abgeleiteten Nucleinsäure geschaffen wurde, oder das Produkt eines Reinigungsprozesses aus einer natürlichen Quelle.
Ein Polypeptid, das erwiesenerweise den Antikörper bindet, kann isoliert und dann einer Aminosäuresequenzierung unterzogen werden. Jedes geeignete Verfahren kann verwendet werden, um das Polypeptid entweder vollständig oder teilweise zu sequenzieren (z.B. kann ein Fragment des Polypeptids sequenziert werden). Aminosäuresequenzinformationen können zum Erhalt von Nucleinsäure, die für das Polypeptid kodiert, verwendet werden, indem beispielsweise ein oder mehrere Oligonucleotide (z.B. ein degenerierter Pool von Oligonucleotiden) zur Verwendung als Sonden oder Primer bei der Hybridisierung an Kandidatennucleinsäure entworfen werden, wie nachstehend genauer erläutert ist.
Eine Zelle, die Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung enthält, stellt einen weiteren Aspekt der Erfindung dar, insbesondere einer Pflanzenzelle oder eine Bakterienzelle.
Die Zelle kann aufgrund der Einführung der Nucleinsäure in die Zelle oder eines Vorläufers davon die für das Protein kodierende Nucleinsäure umfassen, z.B. durch Transformation unter Verwendung eines Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahrens.
Weiters wird gemäß der Erfindung eine Pflanzenzelle bereitgestellt, in deren Genom wie geoffenbart Nucleinsäure inkorporiert ist.
Wenn eine vollständige natürlich vorkommende Sequenz eingesetzt wird, kann die Pflanzenzellen von einer anderen Pflanze stammen als dem natürlichen Wirt der Sequenz.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Pflanze bereit, die solch eine Pflanzenzelle umfasst.
Weiters wird gemäß der Erfindung eine Pflanzenzelle bereitgestellt, in deren Genom eine gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellte Sequenz von Nucleotiden inkorporiert ist, und zwar unter operativer Kontrolle einer Regulationssequenz zur Regelung der Expression. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung solch einer Pflanzenzelle bereit, umfassend das Inkorporieren der Sequenz von Nucleotiden in eine Pflanzenzelle und das Verursachen oder Ermöglichen von Rekombination zwischen dem Vektor und dem Pflanzenzellgenom, um die Sequenz von Nucleotiden in das Genom einzuführen.
Eine Pflanze gemäß vorliegender Erfindung kann eine sein, die sich in einer oder mehreren Eigenschaften nicht artgetreu fortpflanzt. Pflanzensorten können ausgeschlossen sein, insbesondere Pflanzensorten, die gemäß den britischen Plant Breeders' Rights angemeldet werden können. Es gilt anzumerken, dass eine Pflanze nicht als „Pflanzensorte" betrachtet werden muss, nur weil sie innerhalb ihres Genoms stabil ein Transgen enthält, das in eine Zelle der Pflanze oder eines Vorfahren davon eingeführt wurde.
Neben einer Pflanze stellt die vorliegende Erfindung auch beliebige Klone solch einer Pflanze, Samen, geselbstete oder hybridisierte Früchte oder Nachkommen sowie beliebige Teile davon, wie z.B. Stecklinge, Samen, bereit. Die Erfindung stellt beliebige Fortpflanzungseinheiten bereit, d.h. jegliche Teile, die zur Reproduktion oder Vermehrung, geschlechtlich oder ungeschlechtlich, verwendet werden können, ein schließlich Stecklingen, Samen usw. Weiters umfasst die Erfindung eine Pflanze, bei der es sich um einen geschlechtlichen oder ungeschlechtlichen Nachkommen, ein Klon oder einen Abkömmling der Pflanze, eines Nachkommen, Klons oder Abkömmlings handelt.
Außerdem stellt die Erfindung ein Verfahren zur Beeinflussung der Eigenschaften einer Pflanze beriet, umfassend die Expression eines heterologen Polynucleotids der Erfindung innerhalb von Zellen der Pflanze. Der Begriff „heterolog" gibt an, dass das Gen/die Sequenz von Nucleotiden von Interesse in die Zellen der Pflanze oder eines Vorfahren davon eingeführt wurde, und zwar unter Verwendung von Gentechnik, d.h. durch menschliche Intervention, die eine Transformation umfassen kann. Das Gen kann auf einem extragenomischen Vektor vorliegen oder in das Genom inkorporiert sein, vorzugsweise auf stabile Weise. Das heterologe Gen kann ein endogenes äquivalentes Gen ersetzen, d.h. eines, das normalerweise die gleiche oder eine ähnliche Funktion in Bezug auf die Kontrolle des Wachstums und/oder der Entwicklung ausübt, oder die insertierte Sequenz kann zusätzlich zu einem endogenen Gen vorliegen. Ein Vorteil der Einführung eines heterologen Gens besteht in der Möglichkeit, die Expression des Gens unter Kontrolle eines gewählten Promotors zu stellen, um die Genexpression und somit das Wachstum und/oder die Entwicklung der Pflanze nach Wunsch beeinflussen zu können. Weiters können Mutanten und Derivate des Wildtypgens anstelle des endogenen Gens verwendet werden. Das insertierte Gen kann fremd oder exogen in Bezug auf die Wirtszelle sein, d.h. von einer anderen Pflanzenspezies stammen.
Das Hauptmerkmal, das unter Verwendung der vorliegenden Erfindung verändert werden kann, ist das Wachstum.
Gemäß dem Modell des Rht-Gens als Wachstumsrepressor kann die Unterexpression des Gens verwendet werden, um das Wachstum zu fördern, zumindest bei Pflanzen, die nur ein endogenes Gen besitzen, das eine Rht-Funktion bereitstellt (nicht z.B. Arabidopsis, das endogene Homologe aufweist, die kompensieren würden). Dies kann die Verwendung von Antisense- oder Sense-Regulation umfassen.
Größere Pflanzen können durch gezielte Inaktivierung von Rht oder des relevanten homologen Gens in der Pflanze von Interesse hergestellt werden. Es können auch pflanzen gebildet werden, die resistent gegenüber Verbindungen sind, die die GA-Biosynthese hemmen, wie z.B. Paclobutrazol, beispielsweise um die Verwendung eines GA-Biosyntheseinhibitors zu ermöglichen, um Unkraut klein zu halten, Nutzpflanzen aber hoch wachsen zu lassen.
Die Überexpression eines Rht-Gens kann zu einer Zwergpflanze führen, die durch Behandlung mit GA korrigierbar ist, wie durch das Rht-Repressionsmodell vorhergesagt wurde.
Ein zweites Merkmal, das verändert werden kann, ist die Pflanzenentwicklung, beispielsweise die Blüte. Bei manchen Pflanzen und unter bestimmten Umweltbedingungen ist ein GA-Signal zur Blühinduktion erforderlich. GA-defiziente mutierte Arabidopsis-Pflanzen, die unter Kurztagbedingungen gezüchtet wurden, werden ohne Behandlung mit GA beispielsweise nicht blühen: diese Pflanzen blühen normalerweise, wenn sie unter Langtagbedingungen gezüchtet werden. Mutierte Arabidopsis-gai-Pflanzen weisen unter Kurztagbedingungen eine verzögerte Blüte auf: starke Mutanten blühen eventuell gar nicht. So können beispielsweise durch Rht-Genexpression oder -überexpression Pflanzen produziert werden, die bis zur GA-Behandlung zur Induktion der Blüte vegetativ bleiben. Dies kann im Zusammenhang mit dem Gartenbau nützlich sein, beispielsweise für Spinat, Kopfsalat und andere Nutzpflanzen, wo eine Suppression der Schosserbildung erwünscht ist.
Die Nucleinsäure gemäß der Erfindung kann unter Kontrolle eines extern induzierbaren Genpromotors gesetzt werden, um die für Rht kodierende Sequenz unter Kontrolle des Benutzers zu setzen.
Der Begriff „induzierbar" in Bezug auf einen Promotor ist Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Im Wesentlichen wird die Expression unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors als Reaktion auf einen angewendeten Stimulus „eingeschaltet" oder gesteigert. Die Art des Stimulus variiert zwischen den Promoto ren. Einige induzierbare Promotoren führen in Abwesenheit des geeigneten Stimulus zu einer geringen oder undetektierbaren Expressionsstärke (oder zu keiner Expression). Andere induzierbare Promotoren lösen in Abwesenheit des Stimulus eine detektierbare konstitutive Expression aus. Egal wie die Expressionsstärke in Abwesenheit des Stimulus aussieht, in Gegenwart des korrekten Stimulus wird die Expression aus jedem beliebigen induzierbaren Promotor gesteigert. Die bevorzugte Situation sieht so aus, dass die Expressionsstärke bei Anwendung des relevanten Stimulus in einem Ausmaß, das zur Änderung einer phänotypischen Eigenschaften effektiv ist, erhöht wird. Somit kann ein induzierbarer (oder „einschaltbarer") Promotor verwendet werden, der in Abwesenheit des Stimulus zu einer Grundexpressionsstärke führt, die zu schwach ist, um einen gewünschten Phänotyp hervorzubringen (und diese kann sogar null betragen). Bei Anwendung des Stimulus wird die Expression auf einen Wert gesteigert (oder eingeschaltet), der den gewünschten Phänotyp hervorbringt.
Geeignete Promotoren umfassen den Blumenkohl-Mosaikvirus-35S- (CaMV-35S-) Genpromotor, der auf einem hohen Niveau in praktisch allen Pflanzengeweben exprimiert wird (Benfey et al., 1990a und 1990b); den Maisglutathion-S-Transferase-Isoform-II- (GST-II-27-) Genpromotor, der als Reaktion auf die Anwendung eines exogenen Safeners aktiviert wird (WO93/01294, ICI Ltd.); den Blumenkohl-meri-5-Promotor, der im vegetativen Apikalmeristem sowie in mehreren gut lokalisierten Abschnitten in Pflanzenkörpern, z.B. im inneren Phloem, in der Blütenanlage, in Verzweigungspunkten in Wurzeln und Sprossen, exprimiert wird (Medford (1992), Medford et al. (1991)), und den Arabidopsis-thaliana-LEAFY-Promotor, der sehr früh in der Blütenentwicklung exprimiert wird (Weigel et al. (1992)).
Für den GST-II-27-Genpromotor wurde gezeigt, dass er durch bestimmte chemische Verbindungen induziert wird, die an wachsenden Pflanzen angewandt werden können. Der Promotor ist sowohl in Monokotylen als auch in Dikotylen funktionell. Er kann daher verwendet werden, um Genexpression in zahlreichen gentechnisch veränderten Pflanzen zu steuern, einschließlich Feldfrüchten wie Canola, Sonnenblume, Tabak, Zuckerrübe, Baumwolle; Getreidesorten wie Weizen, Gerste, Reis, Mais, Sorghum; Früchten wie Tomate, Mango, Pfirsich, Apfel, Birne, Erdbeere, Banane und Melone; und Gemüsesorten wie Karotte, Kopfsalat, Kohl und Zwiebel. Der GST-II-27-Promotor ist auch zur Verwendung in zahlreichen verschiedenen Geweben, einschließlich Wurzeln, Blättern, Stämmen und reproduktiver Gewebe, geeignet.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Genkonstrukt bereit, das einen induzierbaren Promotor umfasst, der operativ an eine gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellte Nucleotidsequenz gebunden ist. Dies ermöglicht die Steuerung der Expression des Gens. Die Erfindung stellt auch Pflanzen bereit, die mit dem Genkonstrukt transformiert sind, sowie Verfahren, die das Einführen eines solchen Konstrukts in eine Pflanzenzelle und/oder die Induktion der Expression eines Konstrukts innerhalb einer Pflanzenzelle durch Anwendung eines geeigneten Stimulus, eines wirksamen exogenen Induktors, umfassen. Der Promotor kann der GST-II-27-Genpromotor oder ein beliebiger anderer induzierbarer Pflanzenpromotor sein.
Wird ein ausgewähltes Genkonstrukt in eine Zelle eingeführt, so müssen bestimmte Überlegungen in Betracht gezogen werden, die Fachleuten durchwegs bekannt sind. Die zu insertierende Nucleinsäure sollte innerhalb eines Konstrukts assembliert werden, das wirksame Regulationselemente enthält, welche die Transkription steuern. Es muss ein Verfahren zum Transport des Konstrukts in die Zelle verfügbar sein. Befindet sich das Konstrukt einmal innerhalb der Zellmembran, so tritt eine Integration in das endogene chromosomale Material entweder ein oder auch nicht. Schließlich muss, soweit Pflanzen betroffen sind, der Target-Zelltyp so beschaffen sein, dass Zellen zu ganzen Pflanzen neu entwickelt werden können.
Selektierbare Marker können verwendet werden, die aus chimären Genen bestehen, die selektierbare Phänotypen, wie z.B. Resistenz gegenüber Antibiotika wie Kanamycin, Hygromycin, Phosphinotricin, Chlorsulfuron, Methotrexat, Gentamycin, Spectinomycin, Imidazolinon und Glyphosat, verleihen.
Ein Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von Nucleinsäure gemäß der Erfindung bei der Herstellung einer transgenen Pflanze.
Ein weiterer Aspekt stellt ein Verfahren bereit, welches das Einführen der Nucleinsäure in eine Pflanzenzelle und das Verursachen oder Ermöglichen der Inkorporation der Nucleinsäure in das Genom der Zelle.
Jedes geeignete Verfahren zur Transformation von Pflanzen kann verwendet werden, um Pflanzenzellen zu erzeugen, die Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen. Nach der Transformation können Pflanzen aus transformierten Pflanzenzellen und Gewebe neu gebildet werden.
Erfolgreich transformierte Zellen und/oder Pflanzen, d.h. in deren Genom das Konstrukt inkorporiert ist, können nach der Einführung der Nucleinsäure in Pflanzenzellen ausgewählt werden, gegebenenfalls gefolgt von einer Neubildung einer Pflanze, beispielsweise unter Verwendung von einem oder mehreren Markergenen, wie z.B. Antibiotikaresistenz (siehe oben).
Pflanzen, die mit dem DNA-Segment transformiert sind, das die Sequenz enthält, können mittels Standardverfahren hergestellt werden, die bereits für die genetische Manipulation von Pflanzen bekannt sind. DNA kann unter Verwendung jeglicher geeigneten Technik in Pflanzenzellen transformiert werden, wie beispielsweise unter Verwendung von einem deaktivierten Ti-Plasmidvektor, der von Agrobacterium getragen wird, unter Ausnutzung seiner natürlichen Gentransferfähigkeit (EP-A-270.355, EP-A-0.116.718, NAR 12(22), 8711–87215 (1984)), Partikel- oder Mikroprojektilbeschuss ( US 5100792 , EP-A-444.882, EP-A-434.616), Mikroinjektion (WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331.083 , EP 175.966 , Green et al., Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press (1987)), Elektroporation ( EP 290.395 , WO 87/06614, Gelvin Debeyser - siehe Anhang) oder anderen Formen von direkter DNA-Aufnahme ( DE 4.005.152 , WO 90/12096, US 4.684.611 ), Liposomen-vermittelter DNA-Aufnahme (z.B. Freeman et al., Plant Cell Physiol. 29, 1353 (1984)) oder dem Zentrifugenverfahren (z.B. Kindle, PNAS U.S.A. 87, 1228 (1990d)). Physikalische Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen werden in Oard, Biotech. Adv. 9, 1–11 (1991), zusammenfassend erläutert.
Agrobacterium-Transformation wird von Fachleuten umfassend verwendet, um zweikeimblättrige Spezies zu transformieren. Erst jüngst wurden wesentliche Fortschritte in Richtung routinemäßiger Herstellung stabiler, fruchtbarer transgener Pflanzen in beinahe allen wirtschaftlich relevanten einkeimblättrigen Pflanzen erzielt (Toriyama et al., Bio/Technology 6, 1072–1074 (1988); Zhang et al., Plant Cell Rep. 7, 379–384 (1988); Zhang et al., Theor. Appl. Genet. 76, 835–840 (1988); Shimamoto et al., Nature 338, 274–276 (1989); Datta et al., Bio/Technology 8, 736–740 (1990); Christou et al., Bio/Technology 9, 957–962 (1991); Peng et al., International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563–574 (1991); Cao et al., Plant Cell Rep. 11, 585–591 (1992); Li et al., Plant Cell Rep. 12, 250–255 (1993); Rathore et al., Plant Molecular Biology 21, 871–884 (1993); Fromm et al., Bio/Technology 8, 833–839 (1990); Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2, 603–618 (1990); D'Halluin et al., Plant Cell 4, 1495–1505 (1992); Walters et al., Plant Molecular Biology 18, 189–200 (1992); Koziel et al., Biotechnology 11, 194–200 (1993); I.K. Vasil, Plant Molecular Biology 25, 925–937 (1994); Weeks et al., Plant Physiology 102, 1077–1084 (1993); Somers et al., Bio/Technology 10, 1589–1594 (1992); WO 92/14828). Insbesondere entwickelt sich Agrobacterium-vermittelte Transformation nun auch zu einem hocheffizienten alternativen Transformationsverfahren für Monokotyle (Hiei et al., The Plant Journal 6, 271–282 (1994)).
Die Herstellung von fruchtbaren transgenen Pflanzen wurde bei den Getreidesorten Reis, Mais, Weizen, Hafer und Gerste bereits erreicht (hierüber berichten K. Shimamoto, Current Opinion in Biotechnology 5, 158–162 (1994); Vasil et al., Bio/Technology 10, 667–674 (1992); Vain et al., Biotechnology Advances 13 (4), 653–671 (1995); Vasil, Nature Biotechnology 14, 702 (1996)).
Mikroprojektilbeschuss, Elektroporation und direkte DNA-Aufnahme werden bevorzugt, wenn Agrobacterium ineffizient oder wirkungslos ist. Alternativ dazu kann eine Kombination von verschiedenen Verfahren verwendet werden, um die Effizienz des Transformationsprozesses zu erhöhen, z.B. Beschuss mit Agrobacterium-beschichteten Mikropartikeln (EP-A-486.234), oder Mikroprojektilbeschuss zur Herbeiführung von Wunden, gefolgt von Co-Kultivierung mit Agrobacterium (EP-A-486.233).
Eine Brassica-napus-Transformation ist in Moloney et al., Plant Cell Reports 8, 238–242 (1989) beschrieben.
Nach der Transformation kann eine neue Pflanze gebildet werden, beispielsweise aus einer einzelnen Zelle, Kallusgewebe oder Blattscheiben, wie es auf dem Gebiet der Erfindung Standard ist. Beinahe jede Pflanze kann vollständig aus Zellen, Geweben und Organen der Pflanze neu gebildet werden. Verfügbare Verfahren sind in Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Bd. I, II und III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press (1984), und Weissbach und Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press (1989), dargestellt.
Die jweilige Auswahl eines Transformationsverfahrens wird durch seine Effizienz bei der Transformation bestimmter Pflanzenspezies sowie durch die Erfahrung und Präferenz der die Erfindung durchführenden Person bezüglich eines bestimmten ausgewählten Verfahrens festgelegt. Fachleuten wird verständlich sein, dass die bestimmte Auswahl eines Transformationssystems zur Einführung von Nucleinsäure in Pflanzenzellen für die Erfindung nicht wesentlich ist und auch keine Einschränkung darstellt, was ebenfalls für die Auswahl des Verfahrens zur Pflanzenneubildung gilt.
In der vorliegenden Erfindung kann Überexpression durch Einführen der Nucleotidsequenz in einer Sense-Ausrichtung erreicht werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Beeinflussung einer Eigenschaft einer Pflanze bereit, worin das Verfahren das Verursachen oder Ermöglichen der Expression von Nucleinsäure gemäß der Erfindung aus dieser Nucleinsäure innerhalb von Zellen der Pflanze umfasst.
Unterexpression des Genproduktpolypeptids kann unter Verwendung von Antisense-Technologie oder "Sense-Regulierung" erreicht werden. Die Verwendung von Antisense-Genen oder partiellen Gensequenzen zur Herabregulierung von Genexpression ist mittlerweile ein Routineverfahren. DNA wird unter Kontrolle eines Promotors gestellt, sodass die Transkription des "Antisense"-Strangs der DNA RNA ergibt, die zu normaler mRNA komplementär ist, die aus dem "Sense"-Strang des Targetgens transkribiert ist. Bei doppelsträngiger DNA wird dies erreicht, indem eine kodierende Sequenz oder ein Fragment davon in „Umkehrausrichtung" unter Kontrolle eines Promotors gesetzt wird. Von der komplementären Antisense-RNA-Sequenz wird angenommen, dass sie sich dann mit mRNA bindet, um einen Duplex zu bilden und dadurch die Translation der endogenen mRNA aus dem Targetgen in ein Protein zu inhibieren. Ob dies der tatsächliche Wirkungsmodus ist, ist noch ungeklärt. Es ist jedoch anerkannt, dass das Verfahren funktioniert. Siehe beispielsweise Rothstein et al. (1987); Smith et al., Nature 334, 724–726 (1988); Zhang et al., The Plant Cell 4, 1575–1588 (1992), English et al., The Plant Cell 8, 179–188 (1996). Die Antisense-Technologie ist auch in Bourque, Plant Science 105, 125–149 (1995) und Flavell, PNAS USA 91, 3490–3496 (1994) beschrieben.
Die vollständige Sequenz, die der kodierenden Sequenz in umgekehrter Ausrichtung entspricht, muss nicht verwendet werden. Fragmente von ausreichender Länge können beispielsweise verwendet werden. Für Fachleute ist es ein Routineverfahren, Fragmente verschiedener Größen und aus verschiedenen Teilen der Kodiersequenz zu screenen, um den Grad von Antisense-Inhibierung zu optimieren. Es kann von Vorteil sein, das Initiations-Methionin-ATG-Codon und eventuell ein oder mehrere Nucleotide stromauf des Initiationscodons einzubinden. Eine weitere Möglichkeit ist, eine Regulationssequenz eines Gens, z.B. eine Sequenz, die in Bezug auf ein oder mehrere Pathogene, gegen welche Resistenz gewünscht wird, für ein oder mehrere Gene charakteristisch ist, als Target heranzunehmen. Ein geeignetes Fragment kann zumindest etwa 14–23, z.B. etwa 15, 16 oder 17 oder mehr, zumindest etwa 25, zumindest etwa 30, zumindest etwa 40, zumindest etwa 50 oder mehr, Nucleotide aufweisen. Andere Fragmente können zumindest etwa 300 Nucleotide, zumindest etwa 400 Nucleotide, zumindest etwa 500 Nucleotide, zumindest etwa 600 Nucleotide, zumindest etwa 700 Nucleotide oder mehr lang sein. Solche Fragmente in Sense-Ausrichtung können bei der Co-Suppression verwendet werden (siehe unten).
Vollständige Sequenzkomplementarität ist nicht wesentlich, kann jedoch bevorzugt sein. Ein oder mehr Nucleotide können sich im Antisense-Konstrukt vom Targetgen unterscheiden. Es mag zu bevorzugen sein, dass ausreichende Homologie für die jeweiligen Antisense- und Sense-RNA-Molekül vorhanden sind, um zu hybridisieren, insbesondere unter den in einer Pflanzenzelle vorherrschenden Bedingungen.
Somit stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Beeinflussung einer Eigenschaft einer Pflanze bereit, worin das Verfahren das Verursachen oder Ermöglichen von Antisense-Transkription aus Nucleinsäure gemäß der Erfindung innerhalb von Zellen der Pflanze umfasst.
Werden zusätzliche Kopien des Targetgens in Sense-, d.h. derselben, Ausrichtung wie das Targetgen insertiert, so wird eine Reihe von Phänotypen gebildet, die einzelne Phänotypen umfasst, in denen Überexpression auftritt, und andere, in denen Unterexpression eines Proteins aus dem Targetgen auftritt. Ist das insertierte Gen nur ein Teil des endogenen Gens, so steigt die Anzahl von unterexprimierenden Einheiten in der transgenen Population. Der Mechanismus, durch den Sense-Regulierung, insbesondere Herabregulation, stattfindet, ist nicht umfassend bekannt. Dieses Verfahren ist jedoch in der wissenschaftlichen und der Patentliteratur ausführlich beschrieben und wird routinemäßig zur Gensteuerung verwendet. Siehe beispielsweise van der Krol et al., The Plant Cell 2, 291–299 (1990); Napoli et al., The Plant Cell 2, 279–289 (1990); Zhang et al., The Plant Cell 4, 1575–1588 (1992) und US-A-5.231.020.
Somit stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Beeinflussung einer Eigenschaft einer Pflanze bereit, worin das Verfahren die Verursachung oder Ermöglichung der Expression aus Nucleinsäure gemäß der Erfindung innerhalb von Zellen der Pflanze umfasst. Dieses kann zur Beeinflussung des Wachstums eingesetzt werden.
Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun anhand von Beispielen unter Verweis auf die beiliegenden Zeichnungen veranschaulicht.
Die Figuren zeigen Mais- und Reissequenzen der Erfindung und zum Vergleich Sequenzen von anderen Spezies. Die folgenden Figuren sind hierin enthalten:
1: Anordnung einer N-terminalen vorhergesagten GAI-Aminosäuresequenz (Gai) mit Reis-EST-D39460 (0830), wobei homologe Regionen schwarz unterlegt sind.
2: DNA-Sequenzen von C15-1, 14a1 und 5a1.
2a zeigt eine Consensus-DNA-Sequenz cDNA C15-1 (erhalten durch einen einzigen Sequenzierungsdurchgang).
2b zeigt Daten von ursprünglichen DNA-Sequenzierungsdurchgängen mit 14a1 (ein Durchgang).
2c zeigt Daten von ursprünglichen DNA-Sequenzierungsdurchgängen mit 5a1 (ein Durchgang).
3: Rht-Sequenzen.
3a zeigt eine zusammengesetzte DNA-Sequenz eines Weizen-Rht-Gens, abgeleitet aus den Daten in 2, einschließlich einer kodierenden Sequenz.
3b zeigt eine Anordnung der gesamten vorhergesagten Rht-Proteinsequenz, für welche die kodierende Sequenz aus 2 (rht) kodiert, mit der gesamten vorhergesagten GAI-Proteinsequenz von Arabidopsis (Gai). Regionen mit Sequenzidentität sind schwarz unterlegt.
4: D39460-Sequenz.
4a zeigt eine DNA-Sequenz (ein Durchgang) der Reis-cDNA D39460. Diese cDNA ist ein unvollständiger, partieller Klon, dem das 3'-Ende der mRNA fehlt, von dem er abgeleitet ist.
4b zeigt eine Anordnung der gesamten vorhergesagten Rht-Proteinsequenz (Weizen - kodierende Sequenz aus 2) mit der von GAI (Gai) und einer Reisproteinsequenz, die anhand der DNA-Sequenz in 4a (Reis) vorhergesagt wurde. Regionen mit Aminosäureidentität sind schwarz unterlegt; einige konservative Substitutionen sind grau unterlegt.
5: Die grundlegende Kohlenstoffringstruktur von Gibberellinen.
6: Reis-EST-Sequenz.
6a zeigt die Nucleotidsequenz der Reis-EST D39460, bestimmt durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung.
6b zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz, für die die Reis-EST-Sequenz aus 6a kodiert.
7: Weizen-C15-1-cDNA.
7a zeigt die Nucleotidsequenz der Weizen-C15-1-cDNA.
7b zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz der Weizen-C15-1-cDNA aus 7a.
8: genomischer Weizen-5a1-Klon.
8a zeigt die Nucleotidsequenz des genomischen 5a1-Weizen-Klons.
8b zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz des genomischen 5a1-Weizen-Klons aus 8a.
9: genomischer Mais-1a1-Klon.
9a zeigt die Nucleotidsequenz des genomischen 1a1-Mais-Klons, d.h. D8.
9b zeigt die Aminosäuresequenz des genomischen 1a1-Mais-Klons aus 9a.
10 zeigt eine PRETTYBOX-Anordnung von Aminosäuresequenzen des Mais-D8-Polypeptids mit dem Weizen-Rht-Polypeptid, dem durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung bestimmten Reis-EST-Sequenz und dem Arabidopsis-thaliana-Gai-Polypeptid.
11: Sequenzen von Mais-D8-Allelen.
11a zeigt eine partielle Nucleotidsequenz des Mais-D8-1-Allels.
11b zeigt eine partielle Aminosäuresequenz des Mais-D8-1-Allels.
11c zeigt eine partielle Nucleotidsequenz des Mais-D8-2023-Allels.
11d zeigt eine partielle Aminosäuresequenz des Mais-D8-2023-Allels.
12: Weizeh-rht-10-Allel.
12a zeigt eine partielle Nucleotidsequenz des Weizen-rht-10-Allels.
12b zeigt eine partielle Aminosäuresequenz des Weizen-rht-10-Allels.
Bisher klonierten die Erfinder das GAI-Gen von Arabidopsis (PCT/GB97/00390 – WO 97/29123, veröffentlicht am 14. August 1997). Ein Vergleich der DNA-Sequenzen der Wildtyp- (GAI) und der mutierten (gai) Allele zeigte, dass gai für ein mutiertes vorhergesagtes Produkt (gai) kodiert, dem ein Segment aus 17 Aminosäuren nahe dem N-Terminus des Proteins fehlt. Screenen der DNA-Sequenz-Datenbasen mit der GAI-Sequenz zeigte die Existenz einer Reis-EST (D39460) auf, die eine Sequenzregion enthält, die eng mit der Sequenz des Segments verwandt ist, das aus dem GAI im gai-Protein deletiert ist. Ein Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenzen der Region DELLA und EQLE zeigte, dass beide Sequenzen ident sind. Die beiden Unterschiede (V/A; E/D) sind konservative Substitutionen, worin ein Aminosäurerest durch einen anderen mit sehr ähnlichen chemischen Eigenschaften ersetzt ist. außerdem erstreckt sich die identische Region über die Grenzen der deletierten Region hinaus in das gai-Protein hinein. Die Sequenz DVAQKLEQLE ist von der Deletion in gai nicht betroffen und zwischen der GAI- und D39460-Sequenz trotzdem perfekt konserviert (1).
Ein etwa 700 bp großes Sall-Notl-Subfragment von D39460 wurde in Hybridisierungsexperimenten unter schonenden Bedingungen verwendet, um Hybridisierungsklone aus Weizen-cNDA und genomischen Bibliotheken (hergestellt aus DNA von der Spezies Chinese Spring) sowie einer genomischen Mais-Bibliothek (hergestellt aus der Linie B73N) zu isolieren. Mehrere Weizenklone wurden isoliert, einschließlich C15-1 und C15-10 (cDNAs) sowie 5a1 und 14a1 (genomische Klone). Der Klon C15-1 wurde in Genkartierungsexperimenten eingesetzt. Nullisomie-Tetrasomie-Analysen zeigten, dass der Klon C15-1 an genomische DNA-Fragmente hybridisiert, die von den Weizenchromosomen 4A, 4B und 4D stammen. Das stimmt mit dem Klon C15-1 mit der Rht-Sequenz überein, da die Rht-Loci mit den Gruppe-4-Chromosomen übereinstimmen. Außerdem wurde in einer Rekombinationsanalyse unter Verwendung einer Population, die sich bezüglich des Rht-D1b- (frührer Rht2-) Allels unterschied, ein Hybridisierungsfragment identifiziert, das eine perfekte Co-Segregation mit dem mutierten Allel aufwies. Das platzierte die genomische Position des für die mRNA-Sequenz in der cDNA C15-1 kodierenden Gens innerhalb eines 2-cM-Segments (von dem schon bekannt war, dass es Rht enthält) der Gruppe-4-Chromosome und brachte starke Beweise dafür, dass die cDNA und genomische Klone tatsächlich das Rht-Gen enthalten. Die hierin geoffenbarte Mais-D8-DNA-Sequenz stammt von subklonierten zusammenhängenden 1,8 kb und 3,0 kb großen Sall-Fragmenten (kloniert in Bluescript^TM SK⁺) von 1a1. Die hierin geoffenbarten Weizen-Rht-Sequenz stammt von einem 5,7 kb großen Dral-Subfragment (kloniert in Bluescript^TM SK⁺) vom Klon 5a1.
2a zeigt die komplette (ein Durchgang) DNA-Sequenz der cDNA C15-1. Die Erfinder erhielten auch eine DNA-Sequenz für C15-10; diese ist identisch mit der von C15-1 und deshalb nicht dargestellt. 2b und 2c zeigen die ursprünglichen Daten von einzelnen Sequenzierungsdurchgängen mit den Klonen 14a1 und 5a1. Die in 2 dargestellten Sequenzen können überlappt werden, um eine zusammengesetzte DNA-Sequenz zu erhalten, die in 3a dargestellt ist. Diese Sequenz weist starke Homologie mit der von Arabidopsis-GAI auf, wie ein Vergleich der Aminosäuresequenz eines vorhergesagten Translationsprodukts der Weizensequenz (Rht) mit der von GAI (GAI), dargestellt in 3b, zeigte. Insbesondere weist die vorhergesagte Aminosäuresequenz des vermutlichen Rht eine Region auf, die in der Region, die in gai fehlt, fast identisch mit GAI ist (4). 4 zeigt, dass die Homologie, die sich über die gai-Deletionsregion im Reis-EST erstreckt, auch in Rht konserviert ist (DVAQKLEQLE), was zeigt, dass diese Region, neben der in der gai-Deletion gefunden, an der GA-Signaltransduktion beteiligt ist. Diese Region ist in SCR, einem anderen Protein, deren Sequenz mit der von GAI verwandt ist, das aber nicht an der GA-Signalgebung beteiligt ist, nicht vorhanden. Die in den oben genannten Sequenzierungsexperimenten verwendeten Primer sind in Tabelle 1 angeführt.
Eine weitere Bestätigung, dass es sich bei diesen Sequenzen tatsächlich um Weizen-Rht- und Mais-D8-Loci handelt, wurde durch die Analyse der Gensequenzen von verschiedenen mutierten Allelen erhalten, wie nachstehend erläutert wird.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung erhielten und sequenzierten den Klon, der in der Datenbasis als Reis-EST D39460 identifiziert ist, und das Nucleotid und die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die aus dieser Arbeit resultierten, sind in 6a bzw. 6b dargestellt.
Frühere Arbeiten am GAI-Gen von Arabidopsis zeigten, dass das GAI-Protein aus zwei Abschnitten besteht, einer N-terminalen Hälfte, die keine Homologie mit anderen Proteinen mit bekannter Funktion aufweist, und einer C-terminalen Hälfte, die umfassende Homologie mit dem Arabidopsis-SCR-Kandidatentranskriptionsfaktor aufweist (Peng et al., Genes and Development 11, 3194–3205 (1997); PCT/GB97/ 00390). Wie oben beschrieben führt die Deletion eines Abschnitts der N-terminalen Hälfte des Proteins zu einer Reduktion der GA-Reaktionen, die charakteristisch für die gai-Allelmutante sind (Pent et al. (1997); PCT/GB97/00390). Die Erfinder sagten deshalb voraus, dass, wenn D8 und Rht funktionelle Mais- bzw. Weizenhomologe (Orthologe) von Arabidospsis-GAI sind, dann sollten auch die dominanten mutierten Allele von D8 und Rht Mutationen enthalten, die sich auf die N-terminalen Abschnitte der Proteine, für die sie kodieren, auswirken.
In früheren Berichten wurde eine Reihe von dominanten mutierten Allelen bei D8 und bei Rht, insbesondere D8-1, D8-2023 und Rht-D1c (früher Rht10) beschrieben (Börner et al., Euphytica 89, 69–75 (1996); Harberd und Freeling, Genetics 121, 827–838 (1989); Winkler und Freeling, Plante 193, 341–348 (1994)). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung klonierten deshalb die vermutlichen D7/Rht-Gene aus diesen Mutanten und untersuchten den Abschnitt des Gens, das für die N-terminale Hälfte des Proteins kodiert, durch DNA-Sequenzierung.
Ein Fragment der vermutlichen D8- oder Rht-Gene, das für einen Abschnitt der Nterminalen Hälfte des D8/Rht-Proteins kodiert, wurde mittels PCR aus genomischer DNA von Pflanzen mit D8-1, D8-2023 und Rht-D1c amplifiziert, und zwar unter Verwendung der folgenden Amplifikationsprimer: für D8-1 die Primer ZM-15 und ZM-24; für D8-2023 die Primer ZM-9 und ZM-11; für Rht-D1c wurde ineinandergeschachtelte PCR unter Verwendung von Rht-15 und Rht-26, gefolgt von Rht-16 und Rha-2 durchgeführt. Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung eines Sets geneAMP XL PCR von Perkin Elmer durchgeführt, und zwar unter folgenden Bedingungen: die Reaktionen wurden 1 min lang bei 94 °C inkubiert, dann 13 Zyklen 94 °C, 15 s – x °C, 15 s – 69 °C, 5 min unterzogen (wobei x beginnend bei 64 °C pro Zyklus um 1 °C reduziert wird und bei 52 °C endet), dann 25 Zyklen 94 °C, 15 s – 53 °C, 15 s – 65 °C, 5 m in, dann 10 min bei 70 °C. Diese Fragmente wurden dann in den pGEM^R-T-Easy-Vektor (Promega, siehe Technisches Handbuch) kloniert, und ihre DNA-Sequenzen wurden bestimmt.
Mutationen wurden in allen oben genannten Mutanten der vermutlichen D8- und Rht-Gene gefunden. Die D8-1-Mutation ist eine In-Frame-Deletion, mit der die Aminosäuren VAQK (55–59) entfernt und ein G hinzugeführt wurde (siehe Sequenz in 11a und 11b). Diese Deletion überlappt mit dem oben beschriebenen konservierten DVAQKLEQLE-Homologieblock. D8-2023 ist eine weitere In-Frame-Deletionsmutation, mit der die Aminosäuren LATDTVHYNPSD (87–98) vom N-Terminus des D8-Proteins entfernt wurden (siehe 11c und 11d). Diese Deletion überlappt nicht mit der Deletion in gai oder D8-1, deckt aber eine andere Region ab, die zwischen GAI, D8 und Rht stark konserviert ist (siehe 10). Schließlich enthält Rht-D1 c eine weitere kleine In-Frame-Deletion, mit der die Aminosäuren LNAPPPPLP-PAPQ (109–121) in der N-terminalen Region der Rht-Proteinmutante, für das sie kodiert, entfernt wurden (siehe 12a und 12b) (LN-P ist zwischen GAI, D8 und Rht konserviert, siehe 10).
Somit sind alle oben beschriebenen mutierten Allele dominant und verleihen im Zusammenhang mit einer reduzierten GA-Reaktion Zergwuchs. Alle drei dieser Alle enthalten Deletionsmutationen, die einen Abschnitt der N-terminalen Hälfte des Proteins, für das sie kodieren, entfernen. Diese Beobachtungen zeigen, dass die D8- und Rht-Gene von Mais und Weißen kloniert wurden.
TABELLE 1 - Bei der Seguenzierung von Rht verwendete Primer
TABELLE 2 - Bei der Sequenzierung von D-8-Klonen verwendete Primer

Claims

Isoliertes Polynucleotid, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, das die in 9b gezeigte Aminosäuresequenz für das Mais-D8-Polypeptid umfasst.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 1, worin das Polynucleotid die in 9a gezeigte kodierende Nucleotidsequenz aufweist.
Isoliertes Polynucleotid, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, das die in 6b gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Isoliertes Polynucleotid nach Anspruch 3, worin das Polynucleotid die in 6a gezeigte kodierende Nucleotidsequenz aufweist.
Isoliertes Polynucleotid, worin ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 operabel an eine Regulationssequenz zur Expression gebunden ist.
Isoliertes Polynucleotid, dessen Nucleotidsequenz zu einer Sequenz von zumindest 50 zusammenhängenden Nucleotiden der Kodiersequenz oder Sequenz, die komplementär zur Kodiersequenz der Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 ist, komplementär ist, die zur Verwendung bei Antisense- oder Sense-Regulation ("Co-Suppression") von Expression der Kodiersequenz und unter Kontrolle einer Regulationssequenz zur Transkription geeignet ist.
Polynucleotid nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, worin die Regulationssequenz einen induzierbaren Promotor umfasst.
Nucleinsäurevektor, der zur Transformation einer Pflanzenzelle geeignet ist und ein Polynucleotid nach einem der vorangehenden Ansprüche umfasst.
Wirtszelle, die ein heterologes Polynucleotid oder einen Nucleinsäurevektor nach einem der vorangehenden Ansprüche enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 9, die eine Mikrobe ist.
Wirtszelle nach Anspruch 9, die eine Pflanzenzelle ist.
Pflanzenzelle nach Anspruch 11, die das heterologe Polynucleotid innerhalb ihres Chromosoms aufweist.
Pflanzenzelle nach Anspruch 12 mit mehr als einem genannten Polynucleotid pro haploidem Genom.
Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 11 bis 13, die in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Fortpflanzungseinheit einer Pflanze oder einem Extrakt oder Derivat einer Pflanze vorhanden ist.
Verfahren zur Herstellung einer Zelle nach einem der Ansprüche 9 bis 13, worin das Verfahren die Inkorporation des Polynucleotids oder des Nucleinsäurevektors in die Zelle mittels Transformation umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, umfassend das Rekombinieren des Polynucleotids mit der Zellgenomnucleinsäure, sodass es darin stabil inkorporiert wird.
Verfahren nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, umfassend die Neubildung einer Pflanze aus einer oder mehreren transformierten Zellen.
Pflanze, die eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 11 bis 13 umfasst.
Teil oder Fortpflanzungseinheit einer Pflanze, der bzw. die eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 11 bis 13 umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, umfassend das Inkorporieren eines Polynucleotids oder eines Nucleinsäurevektors nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in eine Pflanzenzelle und die Neubildung einer Pflanze aus dieser Pflanzenzelle.
Verfahren nach Anspruch 20 einschließlich geschlechtlicher oder ungeschlechtlicher Fortpflanzung oder Züchtung von Nachkommenschaft oder eines Abkömmlings der Pflanze, die aus der Pflanzenzelle gebildet wurde.
Verfahren zur Beeinflussung einer Eigenschaft einer Pflanze, umfassend das Verursachen oder Ermöglichen von Expression aus einem heterologen Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 innerhalb von Zellen der Pflanze.
Verwendung eines Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bei der Herstellung einer transgenen Pflanze.
Isoliertes Polypeptid, für das ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert.
Antikörper, der eine Antigen-Bindungsstelle mit spezifischer Bindungsaffinität zum Polypeptid nach Anspruch 24 umfasst.
Polypeptid, das die Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers nach Anspruch 25 umfasst.
Verfahren zur Identifikation oder Gewinnung eines Polypeptids nach Anspruch 24, umfassend das Screenen von vermutlichen Polypeptiden mit einem Antikörper oder einem Polypeptid nach Anspruch 25 oder Anspruch 26.