DE10040379A1

DE10040379A1 - Pflanzen mit veränderten Wachstumseigenschaften

Info

Publication number: DE10040379A1
Application number: DE10040379A
Authority: DE
Inventors: Jeff Schell; Bernd Reis; Elke Kemper; Ellen Mahlow; Kerstin Koepchen; Ernesto Olmos; Sabine Steiner-Lange
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2000-08-18
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2002-02-28
Also published as: WO2002014521A3; AU2001289571A1; DE10193390D2; WO2002014521A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Pflanzen mit einer stabil in das Genom integrierten regulatorischen Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Funktion eines Promotors, und einer mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden Nukleinsäuresequenz, insbesondere der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Aktivität der Wachstumsregulierung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Pflanzen mit einer stabil in das Genom integrierten regulatorischen Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Funktion eines Promotors, und einer mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden Nukleinsäuresequenz, insbesondere der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Aktivität der Wachstumsregulierung.

Verändertes Größenwachstum beruht bei Pflanzen häufig auf Störungen des Hormonstoffwechsels. Dabei kann entweder die Hormonproduktion oder aber die Sensitivität Hormonen gegenüber beeinflußt sein. Bislang sind drei Hormonklassen bekannt, die bei Defekten verringertes Größenwachstum verursachen: Gibberelline (z. B. Peng, J. et al. (1999): Green revolution genes encode mutant gibberellin response modulators. Nature 400, 256-261), Auxine (z. B. Mirza, J. I. et al. (1984): The growth and gravitropic responses of wildtype and auxin-resistant mutants of Arabidopsis thaliana. Physiol. Plant. 60, 516-522) und Brassinosteroide (z. B. Li, J. und Chory, J. (1999): Brassinosteroid action in plants. J. Exp. Bot. 50, 275-282). Des weiteren sind bei größenreduzierten Pflanzen neben Hormondefekten auch Gendefekte, die eine eingeschränkte Nährstoffaufnahme/verwertung zur Folge haben, vorstellbar. Viele Mutanten zeigen außer dem Zwergwuchs noch weitere, oft unerwünschte Eigenschaften wie z. B. eine reduzierte Fertilität.

Die Grundversorgung der rasch anwachsenden Weltbevölkerung mit Nahrungsmitteln und pflanzlichen Rohstoffen stellt hohe Anforderungen an die moderne Agrarwirtschaft. Bemühungen zur Verbesserung des pflanzlichen Ertrages oder zur Anpassung der Pflanzen an bestimmte Umweltbedingungen stoßen mittlerweile an die Grenzen der traditionellen Züchtung und sind zudem sehr Zeit- und arbeitsintensiv. Einen Ausweg zeigt die moderne Gentechnik auf. Diese erlaubt eine gezielte Modifikation bestimmter Stoffwechselwege durch die Einführung neuer Gensequenzen oder Manipulation von bereits im Organismus vorhandenen Genen. Da bei den gentechnologischen Verfahren die Veränderungen im Erbgut in der Regel genau bekannt sind, lassen sich diese Verfahren zudem meist auf weitere Pflanzenarten übertragen. Dieser Vorteil besteht bei auf klassische Weise gezüchteten Pflanzen nicht. Für entsprechende übertragbare Verfahren besteht demnach ein erhöhter Bedarf. Eine Veränderung der Wachstumseigenschaften bei Pflanzen kann so z. B. zur Ertragssteigerung oder zur Verbesserung der Widerstandskraft gegenüber mechanischen Umwelteinflüssen wie z. B. Wind oder Regen verwendet werden, ein Ansatz, der beispielsweise bereits in WO 9729123 - über eine Manipulation der Expression von GAI-Genen - verfolgt wurde. Auch ästhetische Neuschöpfungen, beispielsweise die Entwicklung von Zwergformen verschiedenster Zier- oder Nutzpflanzen, sind damit möglich.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Pflanzen mit veränderten Wachstumseigenschaften sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung bereitzustellen.

Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.

Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren erläutert.

Fig. 1 (SEQ ID NO: 1) zeigt die genomische Nukleinsäuresequenz der Promotorregion von Sul 4.1. Der Kernbereich des Promotors ist fett gedruckt, eine TATA-Box doppelt unterstrichen dargestellt. Die Vorhersage dieser Region erfolgte unter Vorgabe eines cutoff-Wertes von 0.8 mittels "Promoter Prediction by Neural Network", verfügbar unter http: / / whitefly.lbl.gov/seq_tools/promoter.html. Bei diesem cutoff Wert liegt der Prozentsatz der falsch positiv erkannten eukaryontischen Promotoren bei unter 0,4%. Der Transkriptionsstartpunkt ist unterstrichen dargestellt und gibt den Anfang von Vollänge-EST-Klonen vor.

Fig. 2 (SEQ ID NO: 2) zeigt die Nukleinsäuresequenz eines EST-Klons (cDNA) von Sul 4.1. Die Numerierung setzt die Numerierung aus Fig. 1 fort, wobei die letzten 6 Nukleotide von Fig. 1 mit den ersten 6 Nukleotiden von Fig. 2 überlappen. Start-ATG und Stop-Codon des längsten offenen Leserahmens dieses EST-Klons sind fett dargestellt.

Fig. 3 zeigt die aus dem offenen Leserahmen gemäß Fig. 2 abgeleitete Aminosäuresequenz von Sul 4.1. Die Numerierung beginnt mit dem Start-ATG.

Fig. 4a zeigt die Entwicklungsunterschiede von Arabidopsis thaliana Sul 4.1-Mutanten und Wildtyppflanzen zum Zeitpunkt der Blüte des Wildtyps.

Fig. 4b zeigt die Endgröße von Arabidopsis thaliana Sul 4.1-Mutanten im Vergleich zu Wildtyppflanzen.

Fig. 5a zeigt Sul 4.1-Retransformanten mit verlangsamter Entwicklung/Zwergwuchs im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen und Sul 4.1-Mutanten.

Fig. 5b zeigt Sul 4.1-Retransformanten mit beschleunigter Entwicklung/Riesenwuchs im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen und Sul 4.1-Mutanten.

Fig. 6 zeigt schematisch die Restriktionskarte des verwendeten Vektors pAC102.

Fig. 7 zeigt schematisch die Restriktionskarte des verwendeten Vektors pSEX001-VS.

Fig. 8 zeigt das Ergebnis einer Northern-Analyse Sul 4.1 überexprimierender Pflanzen im Vergleich mit Wildtyppflanzen (C24).

Der hier verwendete Ausdruck "homologe Sequenz" oder "Homolog" bezeichnet eine Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz mit signifikanter Ähnlichkeit zur Vergleichssequenz oder Teilen davon. Als homologe Sequenzen gelten somit Nukleinsäuresequenzen, die mit den Vergleichssequenzen oder Teilen dieser Sequenzen unter wenig stringenten Bedingungen, besonders bevorzugt unter stringenten Bedingungen hybridisieren (zu stringenten und wenig stringenten Bedingungen siehe Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory (1989), ISBN 0-87969-309-6). Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist: Hybridisierung in 4 × SSC bei 65°C (alternativ in 50% Formamid und 4 × SSC bei 42°C), gefolgt von mehreren Waschschritten in 0,1 × SSC bei 65°C für insgesamt etwa eine Stunde. Ein Beispiel für wenig stringente Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung in 4 × SSC bei 37°C, gefolgt von mehreren Waschritten in 1 × SSC bei Raumtemperatur. Als homologe Sequenzen sollen des weiteren Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen oder Teile davon gelten, die mit Vergleichssequenzen zu 70%, vorzugsweise zu 80%, besonders bevorzugt zu 85%, ferner besonders bevorzugt zu 90%, ferner besonders bevorzugt zu 95%, und insbesondere bevorzugt zu 99% identisch sind.

Der hier verwendete Ausdruck "Derivate" bezeichnet Nukleinsäuresequenzen, die Modifikationen in Form von einer oder mehreren Deletionen, Substitutionen, Additionen, Insertionen und/oder Inversionen aufweisen. Als Derivate sind auch Introns beinhaltende genomische Äquivalente von EST- bzw. cDNA-Sequenzen anzusehen. Derivat bedeutet ferner, daß eine Nukleinsäuresequenz zusammengesetzt ist aus einem oder mehreren Nukleinsäurefragmenten eines Gens und einem oder mehreren Nukleinsäurefragmenten eines oder mehrerer anderer Gene. Die einzelnen Domänen können dabei sowohl unmodifiziert als auch modifiziert sein.

Der hier verwendete Ausdruck "Fragment" bezeichnet Teile der ursprünglichen Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 100 Nukleotiden.

Der hier verwendete Ausdruck "funktionell verbunden" bedeutet, daß eine regulatorische Sequenz wie ein Promotor die Expression eines Gens steuert oder das eine Nukleinsäuresequenz von dem Promotor ausgehend exprimiert wird.

Der hier verwendete Ausdruck "Vektor" bezeichnet natürlich vorkommende oder künstlich erschaffene Konstrukte zur Aufnahme, Vermehrung, Expression oder Übertragung von Nukleinsäuren, z. B. Plasmide, Phagemide, Cosmide, künstliche Chromosomen, Bakteriophagen, Viren, Retroviren.

Der hier verwendete Ausdruck "Expressionssystem" bezeichnet jedwede Kombination von Vektoren, Restriktionsenzymen, Transformationsmethoden, Zellextrakten, lebenden Zellen z. B. prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder Organismen mit dem Zweck der endogenen oder exogenen Expression von Genen.

Der hier verwendete Ausdruck "transgene Pflanze" betrifft Pflanzen, die mittels rekombinanter Gentechnik und/oder mikrobiologischen Verfahren und nicht mittels herkömmlicher Züchtungsverfahren hergestellt wurden.

Die vorliegende Erfindung betrifft die regulatorische Nukleinsäuresequenz (im folgenden auch Promotor bezeichnet), die natürlicherweise in Arabidopsis thaliana die Transkription des Sul 4.1-Gens steuert. Diese erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz ist in SEQ ID NO: 1 aufgeführt. Ferner betrifft die Erfindung Fragmente oder Homologe oder Derivate der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, die die biologische Funktion eines Promotors besitzen. Ferner betrifft die Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 hybridisieren und die die biologische Funktion eines Promotors besitzen. Bevorzugt sind Nukleinsäuresequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 hybridisieren und die die biologische Funktion eines Promotors besitzen.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat eignet sich z. B. zur Identifizierung und Isolierung von zum Sul 4.1-Gen homologen Genen in anderen Organismen oder von verwandten regulatorischen Sequenzen in z. B. Arabidopsis thaliana mit Hilfe spezieller Hybridisierungs- oder Screening-Verfahren, z. B. als Sonde für das Screening in DNA-Bibliotheken mit Hilfe der Hybridisierung an einzelsträngige Nukleinsäuren.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat eignet sich ferner zur spezifischen Steuerung der Expression von Genen in Organismen oder Zellen, bevorzugt zur spezifischen Steuerung der Expression von das Wachstum beeinflussenden oder in den Hormonstoffwechsel eingreifenden Genen.

Die Erfindung betrifft somit transgene Pflanzen, die neu hergestellt wurden durch eine stabil in das Genom integrierte regulatorische Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Funktion eines Promotors, und einer mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden Nukleinsäuresequenz.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit veränderter Genexpression, umfassend das stabile Integrieren einer regulatorischen Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat mit der biologischen Funktion eines Promotors, und einer mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden Nukleinsäuresequenz in das Genom von Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben sowie Regeneration der erhaltenen Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben zu Pflanzen, vorzugsweise zu fertilen Pflanzen.

Die mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat funktionell verbundenen Nukleinsäuren können endogene, exogene genomische DNA-Abschnitte oder cDNAs oder deren Fragmente oder Derivate sein. Endogen bedeutet dabei, das die Nukleinsäuresequenz aus dem gleichen Organismus stammt, in den sie mit dem erfindungsgemäßen Verfahren integriert wird, z. B. eine Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis thaliana wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in Arabidopsis thaliana integriert. Exogen bedeutet, das die Nukleinsäuresequenz aus einem anderen Organismus stammt, z. B. eine Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis thaliana wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in z. B. Weizen integriert. Die Nukleinsäuresequenzen können gegenüber den natürlich vorkommenden Nukleinsäuresequenzen Deletionen, Substitutionen, Additionen, Insertionen und/oder Inversionen aufweisen.

Beispielsweise kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat für die Regulation der Expression des natürlicherweise mit ihr verbundenen Sul 4.1-Gens verwendet werden. Ferner eignet sich die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz auch für die Regulation der Expression anderer Gensequenzen, insbesondere zur Regulation von anderen das Pflanzenwachstum beeinflussenden Genen, wodurch ebenfalls Pflanzen mit abweichender Wachstumsgeschwindigkeit und Endgröße zu erzielen sind. In diesem Zusammenhang sind vor allem Gene des Phytohormonstoffwechsels von Auxinen, Gibberellinen, Cytokinen, Abscisinsäure sowie Ethylen zu nennen, die vom Promotor reguliert werden können. Hierfür in Frage kommen besonders Gene für Enzyme aus dem anabolen und katabolen Phytohormonstoffwechsel sowie Gene für Phytohormonrezeptoren. Prinzipiell kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat für die Regulation der Expression jedes beliebigen Gens für jedwede Anwendung, sowohl aus Arabidopsis thaliana als auch aus anderen Organismen, verwendet werden. Dabei kann der Promotor in Kombination mit beliebigen Genen vorliegen, sowohl in einem Vektor als auch in transgenen Organismen, insbesondere Pflanzen.

Anhand genetischer Veränderungen am Modellorganismus Arabidopsis thaliana wurde überraschenderweise gefunden, daß eine Veränderung der Expression einer endogenen Nukleinsäuresequenz bis dato unbekannter Funktion das pflanzliche Wachstum beeinflußt. Bei diesem Gen handelt es sich um das Sul 4.1-Gen. Pflanzen mit einer Mutation im Sul 4.1-Gen haben ein verringertes Größenwachstum gegenüber den Wildtyppflanzen. Die Nukleinsäuresequenz des Sul 4.1-Gens (im folgenden auch als Sul 4.1-cDNA oder Sul 4.1-EST bezeichnet) ist als SEQ ID NO: 2 aufgeführt. Zum Sul 4.1-Gen aus Arabidopsis thaliana ist ein EST-Klon (Genbank Accession Nummer H76408) verfügbar, jedoch war hierzu bislang keine Funktion bekannt. Ein BAC-Klon mit der entsprechenden Genregion ist unter der Genbank Accession Nummer AL162508 registriert. Ähnlichkeiten von Sul 4.1 zu anderen wachstumsregulierenden Genen bestehen nicht. Ein Gen mit entfernter Ähnlichkeit zu Sul 4.1, aber ebenfalls unbekannter Funktion befindet sich auf Chromosom 3 von Arabidopsis thaliana (Genbank Accession Nummer AL096859).

Die vorliegende Erfindung betrifft somit ferner transgene Pflanzen, die neu hergestellt wurden durch eine stabil in das Genom integrierte Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, oder deren Fragment oder Derivat mit der biologischen Aktivität der Wachstumsregulierung, und einer mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen regulatorischen Nukleinsäuresequenz.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen, die neu hergestellt wurden durch eine stabil in das Genom integrierte Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 hybridisiert und die biologische Aktivität der Wachstumsregulierung aufweist, und einer mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen regulatorischen Nukleinsäuresequenz. Bevorzugt sind transgene Pflanzen mit einer stabil in das Genom integrierten Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert und die biologische Aktivität der Wachstumsregulierung aufweist, und einer mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen regulatorischen Nukleinsäuresequenz.

Bei der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog kann es sich erfindungsgemäß um jede beliebige Sul 4.1-Sequenz oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog handeln, beispielsweise um eine solche aus Pflanzen, Algen oder Cyanobakterien.

Die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat eignet sich weiterhin z. B. zur Identifizierung und Isolierung von zum Sul 4.1-Gen homologen Genen in anderen Organismen oder von verwandten Sequenzen in z. B. Arabidopsis thaliana mit Hilfe spezieller Hybridisierungs- oder Screening-Verfahren, z. B. als Sonde für das Screening in DNA-Bibliotheken mit Hilfe der Hybridisierung an einzelsträngige Nukleinsäuren.

Die mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog funktionell verbundene regulatorische DNA-Sequenz, z. B. ein Promotor, kann sowohl die mit der Nukleinsäuresequenz endogen vorliegende regulatorische DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 als auch jede andere regulatorische DNA-Sequenz sein. Die regulatorische DNA- Sequenz kann sowohl ein endogener Promotor des zu transformierenden Organismus oder ein exogener Promotor sein, der sich z. B. auf dem verwendeten Vektor befindet. Als Promotor ist dabei grundsätzlich jede regulatorische Sequenz geeignet, die die Expression von Fremdgenen in Organsimen, z. B. Pflanzen, steuern kann, z. B. der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus; vgl. Franck et al., Cell 21, 285-294 (1980). Die Expression der Nukleinsäuresequenzen kann auch durch einen chemisch induzierbaren Promotor erreicht werden. Beispiele für chemisch induzierbare Promotoren sind der PRPI-Promotor (Ward et al., Plant Molecular Biology 22, 361-366 (1993)), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid induzierbarer Promotor (EP-A 388186), ein durch Tetrazyklin induzierbarer Promotor (Gatz et al., Plant Journal 2, 397-404 (1992)), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP-A 335528) oder ein durch Ethanol oder Cyclohexanon induzierbarer Promotor (WO 93/21334). Je nach gewünschtem Expressionsort können auch Promotoren verwendet werden, die z. B. in bestimmten Pflanzengeweben oder Pflanzenteilen aktiv sind. Beispiele für entsprechende Promotoren sind der Phaseolin-Promotor (US 5504200), der Isoflavon-Reduktase-Promotor (US 5750399), ein samenspezifischer Promotor, z. B. aus Tabak (US 5824863) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., (1989), EMBO J 8, 2445-2452).

Die Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 oder deren Fragmente oder Homologe oder Derivate können natürlichen Ursprungs sein oder künstlich hergestellt worden sein. Die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 liegt dabei in Sense-Orientierung vor, die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 kann sowohl in Sense- als auch in Antisense-Orientierung vorliegen.

Die Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder deren Fragmente oder Homologe oder Derivate können in Vektoren, Expressionssystemen oder Pflanzen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen oder tierischen Zellen oder Mikroorganismen zur Veränderung der Expressionsmuster verschiedenster Genprodukte verwendet werden. Die Expression der Genprodukte kann dabei gegenüber Ihrer natürlichen Expression sowohl verstärkt als auch verringert sein.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit veränderten Wachstumseigenschaften, umfassend das stabile Integrieren einer das Pflanzenwachstum beeinflussenden Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, oder deren Fragment oder Derivat mit der biologischen Aktivität der Wachstumsregulierung, in das Genom von Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit veränderten Wachstumseigenschaften, umfassend das stabile Integrieren einer mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 hybridisierenden Nukleinsäuresequenz mit der biologischen Aktivität der Wachstumsregulierung. Bevorzugt sind Nukleinsäuresequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 hybridisieren. Bevorzugt ist ein Verfahren, wobei die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, oder deren Fragment oder Derivat mit der biologischen Aktivität der Wachstumsregulierung, funktionell mit einer regulatorischen Nukleinsäuresequenz z. B. der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Funktion eines Promotors, verbunden ist.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit veränderten Wachstumseigenschaften, umfassend das stabile Integrieren einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog in das Genom von Pflanzenzellen und Regeneration der erhaltenen Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben zu Pflanzen, vorzugsweise zu fertilen Pflanzen. Aufgrund des veränderten Wachstums kann eine erhöhte Biomasseproduktion und somit eine Steigerung des pflanzlichen Ertrages erreicht werden. Ebenfalls können kurzstielige Varietäten mit gesteigerter Widerstandskraft gegen mechanische Umwelteinflüsse wie Wind oder Regen, z. B. durch die Einführung der entsprechenden Gene in Antisense-Orientierung, erzeugt werden. Auch ästhetisch ansprechende Wuchsformen, z. B. Minipflanzen, sind herstellbar.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können endogene oder exogene Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 oder deren Fragmente oder Derivate oder Homologe verwendet werden. Endogen bedeutet, das die Nukleinsäuresequenz aus dem gleichen Organismus stammt, in den sie mit dem erfindungsgemäßen Verfahren integriert wird, z. B. ein Sul 4.1 Gen aus Arabidopsis thaliana wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in Arabidopsis thaliana integriert. Exogen bedeutet, das die Nukleinsäuresequenz aus einem anderen Organismus stammt, z. B. eine Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis thaliana wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in z. B. Weizen integriert. Nach der stabilen Integration der transformierten Nukleinsäuresequenz können dann eins, zwei oder mehr Sul 4.1-Gene oder Promotoren im Genom vorliegen, was zu einer gesteigerten Expression der entsprechenden Gene führt. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Nukleinsäuresequenzen gegenüber den natürlich vorkommenden Nukleinsäuresequenzen Deletionen, Substitutionen, Additionen, Insertionen und/oder Inversionen auf.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine transformierte Zelle, insbesondere eine transformierte Pflanzenzelle oder ein transformiertes Pflanzengewebe, in der die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 oder deren Fragmente oder Homologe oder Derivate stabil integriert sind. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 oder deren Fragmenten oder Homologen oder Derivaten transformierte Pflanzenzelle oder ein transformiertes Pflanzengewebe, die oder das zu einer Pflanze, insbesondere einer fertilen Pflanze, regenerierbar ist. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Pflanze, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Saatgut, das von Pflanzen erhalten wird, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden. Die Erfindung betrifft ferner die von den Pflanzen produzierten Früchte, z. B. Obst, Beeren, Kartoffeln und Trauben.

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Nukleinsäuresequenz verwendet, die aus Fragmenten verschiedener Sul 4.1-Gene zusammengesetzt ist. Diese zusammengesetzte Nukleinsäuresequenz kann ferner ebenfalls Modifikationen wie Deletionen, Additionen oder Substitutionen enthalten. Die Verfahren zur Herstellung solcher Nukleinsäuresequenzen sind Stand der Technik, dem Fachmann unter dem Begriff "Chimären" vertraut und von ihm leicht durchzuführen.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auf alle beliebigen Organismen anwenden. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Steigerung des Ertrags sowie zur Wachstumsregulation von mono- und dikotylen Pflanzen sowie Algen und Cyanobakterien einsetzbar. Besonders bevorzugte Pflanzen sind dabei Kulturpflanzen z. B., Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Sommerraps, Winterraps, Alfalfa (Luzerne), Salat, Erbse, Bohne, Karotte, Zwiebel, die verschiedenen Baum, Nuß- und Weinspezies, ferner Getreide z. B. Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, ferner Obstsorten z. B. Mango, Apfel, Pfirsich, Stachelbeere, Johannisbeere, Banane, Melone, Kürbis und Zitrusfrüchte z. B. Zitrone, Apfelsine, Pampelmuse oder Mandarine. Besonders bevorzugt sind ebenfalls Zierpflanzen wie z. B. Alpenveilchen, Aster, Bougainvillea, Chrysantheme, Petunie, Margerite, Narzisse, Schneeglöckchen, Rittersporn, Sonnenblume, Geranie, Gänsekresse, Gerbera, Gladiole, Iris, Hyazinthe, Lilie, Magnolie, Orchidee, Rhododendron, Rose, Tränendes Herz, Tulpe, Weihnachtsstern. Die mit der Nukleinsäuresequenz transformierten Pflanzen können Wildtyppflanzen, durch Züchtung erhaltene Pflanzen oder transgene Pflanzen sein. Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner nicht nur in Pflanzen oder Pflanzengeweben sondern auch in Pflanzenzellen z. B. in einer Zellkultur oder in Expressionssystemen zur Veränderung der Expressionsmuster von Sul 4.1-Genen oder Derivaten oder Homologen dieser Gene verwendet werden, oder zur Expression von Genen, die mit der regulatorischen Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 funktionell verbunden sind.

Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren zur temporären Wachstumsregulation geeignet, indem der Sul 4.1-spezifische Promotor gegen einen induzierbaren Promotor ausgetauscht wird. Durch eine entsprechende Induktion des Wachstums kann z. B. auf besondere Umweltbedingungen, z. B. extreme Trockenperioden oder lange Kältephasen reagiert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Vektoren, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog, und einer mit dieser Sequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden Nukleinsäuresequenz. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Vektoren, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog und eine regulatorische DNA-Sequenz.

Geeignete Vektoren zur Aufnahme und Überführung der Nukleinsäuresequenzen können die Vermehrung und/oder die Expression der aufgenommenen Nukleinsäuren in Einzellern wie z. B. Escherichia coli oder Agrobacterium tumefaciens oder in Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen gewährleisten. Entsprechende Vektoren können natürlich vorkommen oder aber künstlich hergestellt sein. Die Vektoren können Selektionsmarker, Terminatorsequenzen, Polylinker, Promotorelemente, Enhancer, Polyadenylierungsstellen und andere genetische Elemente umfassen. Zur Klonierung geeignete Vektoren sind z. B. pBluescript, Plasmide der pUC-Serie, Plasmide der pGEM-Reihe oder auf dem Bakteriophagen λ basierende Vektoren. Ein zur Verwendung in Agrobacterium benutzter Plasmidvektor ist z. B. pBin19; vgl. Bevan et al., (1984), Nucleic Acids Research 12, 8711-8721. Zur Transformation und Expression in Pflanzen stellen auf dem Ti-Plasmid von Agrobacterium-Arten oder auf Pflanzenviren aufbauende Konstrukte verwendungsfähige Vektoren dar und sind dem Fachmann bekannt. Des weiteren werden bei bestimmten Transformationsmethoden wie z. B. Mikroinjektion, Protoplasten-Transformation und Einschießen (microprojectile bombardment) anstelle von Ti-Plasmiden auch obengenannte Klonierungsvektoren oder linearisierte DNA eingesetzt. Eine zusammenfassende Beschreibung bislang häufig und standardmäßig benutzter Vektoren findet sich in Guerineau und Mullineaux, Plant Transformation and Expression Vectors, in: Plant Molecular Biology Labfax, herausgegeben von Croy, Oxford, BIOS Scientific Publishers, 121-148 (1993).

Einige der in handelsüblichen Transformations- und Expressionssystemen angewendeten Transformationsmethoden zur Übertragung von Fremdgenen in das Genom von Pflanzen werden im folgenden vorgestellt. Die Wahl der Methode zur Einbringung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz und der mit ihr funktional verbundenen für ein Genprodukt kodierenden Nukleinsäuresequenzen in pflanzliche Zellen ist jedoch nicht auf diese Liste beschränkt. Bislang eingesetzte Transformationsverfahren bei Pflanzen sind z. B. der Gentransfer mittels Agrobacterium tumefaciens (z. B. durch Baden von Samen oder Blattstückchen in einer Agrobakterienlösung), mittels pflanzlicher Viren, durch Elektroporation, durch Einschießen (microprojectile bombardment) oder Einspritzen (Mikroinjektion) sowie die Inkubation von trockenen Embryonen in DNA-haltigen Flüssigkeiten und die Transformation von Protoplasten unter Zuhilfenahme von Polyethylenglykol. Genauere Beschreibungen der angesprochenen Verfahren finden sich z. B. in Jens et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von Kung und Wu, Academic Press 128-143 (1993).

Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:

Beispiel 1 Allgemeine Klonierungsverfahren

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von Nukleinsäurefragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Filtermaterialien, Transformation und Anzucht von Bakterienzellen, Sequenzierungen, PCR etc. wurden analog den bei Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory, ISBN 0-87969-309-6 beschriebenen Verfahren durchgeführt.

Beispiel 2 Herstellung einer T-DNA Population von Arabidopsis thaliana

Arabidopsis Pflanzen des Ökotyps C24 wurden durch Vakuuminfiltration nach Bechtold et al. (1993), N. Bechtold, J. Ellis, G. Pelletier, In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants, C. R. Acad. Sci., Paris, Sciences de la vie, 1993, 316, 1184-9, mit dem Agrobacteriumstamm GV3101pMP90RK::pAC102 transformiert. Der Stamm GV3101pMP90RK ist in Koncz & Schell, (1986), Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 beschrieben. Das Plasmid pAC102 ist in Fig. 6 dargestellt. Das in den Agrobacterien enthaltene pAC102 vermittelt unter anderem Resistenz gegen das Antibiotikum Sulfadiazin und besitzt darüber hinaus die Eigenschaft, nach der Integration am rechten Grenzfragment liegende genomische Sequenzabschnitte überzuexprimieren. Durch Selektion auf Resistenz gegen Sulfadiazin wurde eine ca. 500 Individuen umfassende Population von Transformanten erhalten.

Beispiel 3 Screening nach Mutanten mit verändertem Wachstum

Die Sul 4.1-Mutante wurde durch Screening der mit Ti-Plasmid pAC102 transformierten Population von Arabidopsis thaliana Pflanzen nach visueller Auswahl von Individuen mit veränderten Wachstumseigenschaften detektiert. Die Samen der durch Vakuum-Infiltration behandelten Arabidopsis Pflanzen wurden dazu zur Selektion von Transformanten auf ein Perlit/Sand Gemisch, das Sulfadiazin enthielt, aufgebracht. Nach Inkubation bei 2-5°C im Dunkeln für 3 Tage zur Überwindung der Samenruhe wurden die Keimlinge im Kurztag (8 Stunden Licht, 16 Stunden Dunkel, 22°C) in der Klimakammer angezogen. Transformanten, d. h. in diesem Fall Keimlinge, die unter Selektion das Vier-Blatt-Stadium erreichten, wurden pikiert dann in Plastikbehältern auf "Minitray"-Erde (Gebr. Patzer GmbH & Co KG, D-36391 Sinntal-Jossa, Deutschland) weiter im Kurztag wachsen gelassen. Nach Ausbildung der Blattrosette wurden die Pflanzen im Langtag (16 Stunden Licht, 8 Stunden Dunkel) im nicht klimatisierten Gewächshaus zur Samenreife gebracht. Zur Identifizierung von phänotypisch auffälligen Mutanten der entstandenen T-DNA Population wurden ca. 500 Pflanzen per Auge nach Auffälligkeiten durchmustert. Dabei konnte eine Linie (Sul 4.1) identifiziert werden, die sich dadurch von den Normalpflanzen abhob, daß sie auf Erde unter normalen Gewächshausbedingungen ein stark verzögertes Wachstum zeigte und nur in Sterilkultur am Leben erhalten werden konnte.

Beispiel 4 Vermehrung der Pflanzen

Sterilkulturpflanzen wurden in Reagenzglasröhrchen mit Watteverschluß zur Samenreife gebracht. Samen dieser Pflanzen wurden in Sterilkultur auf Sulfadiazin-haltigem Medium ausgekeimt und resistente Keimlinge im Gewächshaus auf mini-tray Erde vermehrt. Die Fertilisation mit "Osmocote Plus" (15% N, 11% P₂O₅, 13% K₂O, 2% MgO; Scotts Deutschland GmbH, D-48527 Nordhorn, Deutschland) erfolgte gemäß den Angaben des Herstellers.

Beispiel 5 Identifizierung von T-DNA-flankierenden Sequenzen

Die die Sul 4.1 T-DNA flankierenden genomischen Sequenzen wurden durch die sogenannte Plasmid-rescue-Technik isoliert. Dazu wurde DNA von Sul 4.1 Pflanzen mit der CTAB Methode präpariert, mit EcoRI geschnitten, die so entstandenen Enden mit T4 Ligase ligiert, und der Ligaseansatz in DH10B Zellen nach Hersteller Angaben (Gibco/Brl) transformiert. Die auf die auf diesem Wege erhaltenen genomischen Sequenzen wurden durch DNA- Sequenzierung nach der Didesoxy-Methode von Sanger analysiert. Dazu wurden die Oligonukleotide 1046 und pucli3 verwendet.

Beispiel 6 Spezifische Oligonukleotide und Adaptersequenzen (5'-3' Orientierung)

pucli3: CCGGGTACCGAGCTCGAATTC (SEQ ID NO: 5)
1046: GATCAGATTG TCGTTTCCCG CCTTCAGTTT (SEQ ID NO: 6).

Beispiel 7 Sequenzierung

Die DNA Sequenzierung wurde von der ADIS Servicegruppe des MPIZ mit PE Biosystems Abi Prism 377 and 3700 Geräten und der BigDye-terminator Chemie durchgeführt. Die DNA Sequenzen wurden mit Hilfe des "University of Wisconsin Genetic Computer Group" Sequenzanalysepaketes oder mit Hilfe von FASTA verglichen. Diese Homologiesuche ergab, daß die aus Sul 4.1 erhaltene genomische Sequenz signifikante Homologie zu EST 194D3T7 (Genbank Acc. Nummer H76408) aufweist.

Beispiel 8 Wachstumsmessungen

Homozygote Sul 4.1 Pflanzen und Wildtyp C24 Pflanzen wurden in parallelen Reihen in einer Pflanzschale unter verschiedenen Aufzuchtbedingungen im Gewächshaus kultiviert und nach mehreren Zeitpunkten die Schlüsselparameter Stengellänge und Blattrosettengröße durch Ausmessen mit einem Lineal bestimmt. Das Wachstum von Sul 4.1 Pflanzen ist gegenüber dem Wildtyp ab dem Zeitpunkt des Blütenansatzes deutlich verlangsamt. Zur Samenreife beträgt die Größe von Sul 4.1 Pflanzen im Durchschnitt nur die Hälfte der Größe von Wildtyp Pflanzen.

Beispiel 9 Genetische Charakterisierung

Durch Southern Blotting und Co-Segregationsanalyse wurde die Kopplung der Sul 4.1 T-DNA Insertion mit dem Phänotyp des verkürzten Wachstums nachgewiesen. Durch Northern Blotting und Vergleich mit Wildtyp konnte gezeigt werden, daß das Sul 4.1 (194D3T7) Gen in Sul 4.1 Pflanzen stark überexprimiert wird. Ein entsprechendes Transkript konnte mit Northern Blotting in Wildtyp nicht nachgewiesen werden. Elementare molekularbiologische Methoden wie z. B. Southern und Northern Blotting wurden wie bei Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory, ISBN 0-87969-309-6 beschrieben, durchgeführt.

Beispiel 10 Retransformation

Der EST Klon 194D3T7 wurde zwischen dem CaMV 35S Promotor und Terminator des Plasmides pSEX001-VS (vgl. Fig. 7 und SEQ ID NO: 4) inseriert und das entstandene Plasmid pSEX146 in Agrobacterium Stamm GV3101pMP90RK durch Elekroporation transformiert. Dieser Agrobacterium Stamm wurde für eine Transformation durch Vakuuminfiltration von Arabidopsis Wildtyp C24 benutzt. Transformanten wurden auf Resistenz gegen Sulfadiazin selektiert (Primärtransformanten). Die Nachkommen dieser Primärtransformanten wurden wie für Beispiel 8 durch Wachstumstests im direkten Vergleich mit Wildtyp C24 und Sul 4.1 charakterisiert. Diese Tests ergaben, daß 194D3T7 RNA überexpimierende Retransformanten den Phänotyp von Sul 4.1 zeigten. Es wurden jedoch auch Retransformanten erhalten, die den gegenteiligen Phänotyp, erhöhtes Wachstum im Vergleich zu Wildtyp, zeigten. Dieser Effekt ist vermutlich auf Co-Suppressions-Phänomene zurückzuführen.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Transgene Pflanze mit einer stabil in das Genom integrierten regulatorischen Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Funktion eines Promotors, und einer mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden Nukleinsäuresequenz.

2. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 1, wobei für die für ein Genprodukt codierende Nukleinsäuresequenz eine endogene oder exogene Nukleinsäuresequenz verwendet wird.

3. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei für die für ein Genprodukt codierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus Genen des Phytohormonstoffwechsels von Auxinen, Gibberellinen, Cytokinen, Abscisinsäure oder Ethylen.

4. Transgene Pflanze mit einer stabil in das Genom integrierten Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Aktivität der Wachstumsregulierung, und einer mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen regulatorischen Nukleinsäuresequenz.

5. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 4, wobei die regulatorische Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe der Promotoren CaMV 35S-Promotor, PRPI-Promotor, Phaseolin-Promotor, Isoflavon-Reduktase Promotor, ST-LSI Promotor, durch Salizylsäure induzierbarer Promotor, durch Benzenesulfonamid induzierbarer Promotor, durch Tetrazyklin induzierbarer Promotor, durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor, durch Ethanol oder Cyclohexanon induzierbarer Promotor, Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Funktion eines Promotors, oder ein samenspezifischer Promotor.

6. Transgene Pflanze nach Anspruch 4 oder 5, wobei die für ein Genprodukt codierende Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 in Sense- oder Antisense-Orientierung vorliegt.

7. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Expression der stabil ins Genom integrierten für ein Genprodukt codierenden Nukleinsäuresequenz gegenüber ihrer natürlichen Expression erhöht oder verringert ist.

8. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aus Fragmenten verschiedener Sul 4.1-Gene zusammengesetzt ist und gegebenenfalls Deletionen, Additionen oder Substitutionen aufweist.

9. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend das stabile Integrieren einer regulatorischen Nukleinsäuresequenz, insbesondere einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Funktion eines Promotors, und einer mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden Nukleinsäuresequenz, insbesondere der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Aktivität der Wachstumsregulierung, in das Genom von Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben und Regeneration der erhaltenen Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben zu fertilen Pflanzen.

10. Transformierte Pflanzenzelle oder transformiertes Pflanzengewebe, dadurch gekennzeichnet, daß eine regulatorische Nukleinsäuresequenz, insbesondere einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Funktion eines Promotors, und eine mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden Nukleinsäuresequenz, insbesondere der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Aktivität der Wachstumsregulierung, stabil in das Genom der Pflanzenzelle oder des Pflanzengewebes integriert ist.

11. Pflanzenzelle oder Pflanzengewebe nach Anspruch 10, regenerierbar zu einer fertilen Pflanze.

12. Saatgut, erhalten von Pflanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 8.

13. Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Funktion eines Promotors, oder eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 hybridisiert und die biologische Funktion eines Promotors aufweist.

14. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 13, wobei die hybridisierende Nukleinsäuresequenz unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 hybridisiert.

15. Vektor, umfassend eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 13 oder 14.