DE112010002884T5

DE112010002884T5 - Rock2 und rock3, zwei neue gain-of-function-Varianten der Cytokininrezeptoren AHK2 und AHK3

Info

Publication number: DE112010002884T5
Application number: DE112010002884T
Authority: DE
Inventors: Thomas Schmülling; Helen Braun; Tomás Werner; Isabel Bartrina Y Manns
Original assignee: Freie Universitaet Berlin
Current assignee: Freie Universitaet Berlin
Priority date: 2009-07-10
Filing date: 2010-07-09
Publication date: 2012-08-30
Also published as: EP2272862B1; MX2012000536A; US20120272409A1; US9127073B2; ATE550350T1; CA2767468A1; WO2011004005A1; AU2010270140A1; BR112012000621A2; ES2385451T3; EP2451831A1; EP2451831B1; EP2272862A1; CN102471373B; ES2462967T3; AU2010270140B2; CN102471373A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft zwei neue gain-of-function-Varianten der Cytokininrezeptor-Proteine AHK2 und AHK3, nämlich rock2 und rock3, transgene Organismen, die wenigstens eine dieser neuen gain-of-function-Cytokininrezeptor-Varianten umfassen, und ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die wenigstens eine der neuen gain-of-function-Varianten umfasst.

Description

Um eine ständig wachsende Bevölkerung mit Nahrungsmitteln und anderen pflanzlichen Produkten versorgen zu können, war der Mensch schon von jeher daran interessiert, die Produktivität in der Landwirtschaft zu verbessern.
Die Produktivität einer Pflanze kann auf verschiedene Weise beeinflusst werden, z. B. durch Verbesserung der Eigenschaften des Pflanzenwachstums oder durch Verzögerung der Blattseneszenz. Es sind einige Mechanismen und Abläufe bekannt, die am Wachstum und an der Entwicklung von Pflanzen beteiligt sind.
Cytokinin ist ein Pflanzenhormon, das positive und negative regulatorische Rollen bei vielen Aspekten des Wachstums und der Entwicklung von Pflanzen spielt. Es stimuliert die Bildung und Aktivität von Sprossmeristemen, kann Sinkgewebe hervorbringen, verlangsamt die Blattseneszenz, hemmt das Wachstum und die Verzweigung von Wurzeln und spielt eine Rolle bei Keimung und Stressreaktionen. Analysen von Pflanzen mit Cytokininmangel zeigen, dass Cytokinin gegensätzliche Rollen bei Spross- und Wurzelmeristemen spielt, und weisen darauf hin, dass das Hormon eine wesentliche Funktion bei der quantitativen Steuerung des Organwachstums ausübt (Mok, D. W. S. & Mok, M. C. (2001) Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Bio. 52, 89–118). Für die Modellpflanze Arabidopsis thaliana konnte gezeigt werden, dass das Cytokininsignal von drei Vertretern der Cytokininrezeptor-Familie wahrgenommen wird, bei denen es sich um Sensorhistidinkinasen handelt (Inoue, T. et al. (2001) Nature 409, 1060–3; Suzuki, T. et al. (2001) Plant Cell Physiol. 42, 107–13; Yamada, H. et al. (2001) Plant Cell Physiol. 42, 1017–23.). Diese drei Cytokininrezeptoren, AHK2, AHK3 und CRE1/AHK4, zeigen ein hohes Maß an Sequenzidentität, besitzen jedoch jeweils Unterscheidungsmerkmale.
Kürzlich wurde eine gain-of-function-Variante des Cytokininrezeptors AHK3 offenbart, die als ore12 bezeichnet wurde (siehe WO 2007/108931 A1 ). Es konnte gezeigt werden, dass die ore12-Expression in Arabidopsis thaliana zu Pflanzen mit verzögerter Blattseneszenz führt, während das Gesamterscheinungsbild der ganzen Pflanze keinen signifikanten Unterschied zu den Pflanzen vom Wildtyp aufwies. Zwar kann die Expression von ore12 zu Pflanzen mit verzögerter Blattseneszenz und damit zu Pflanzen mit verbesserter Produktivität führen, doch hatte die ore12-Expression keine signifikante Wirkung auf andere Merkmale des Pflanzenwachstums. Es besteht somit weiterhin ein Bedarf an einer weiteren Verbesserung der Pflanzenproduktivität.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung geeigneter Mittel und Verfahren zur Erzeugung von transgenen Pflanzen, die verbesserte Produktivität und/oder Wachstumsmerkmale aufweisen.
Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst wie nachstehend im Einzelnen dargelegt.
Die vorliegende Erfindung macht zwei neue gain-of-function-Varianten der Cytokininrezeptoren AHK2 und AHK3 verfügbar, nämlich rock2 und rock3. Das rock2-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 ist eine konstitutiv aktive Variante des Cytokininrezeptors AHK2 von Arabidopsis thaliana und kann von einer Nucleinsäure mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 codiert werden. Das rock3-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 ist eine konstitutiv aktive Variante des Cytokininrezeptors AHK3 von Arabidopsis thaliana und kann von einer Nucleinsäure mit der Sequenz SEQ ID NO: 4 codiert werden. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff konstitutiv aktive Variante” eines Cytokininrezeptors AHK2 oder AHK3 vorzugsweise ein Polypeptid, das im Wesentlichen die gleichen Zielstrukturen wie der jeweilige Wildtyp-AHK-Rezeptor AHK2 oder AHK3 phosphoryliert, bei dem jedoch die Kinase-Aktivität der konstitutiv aktiven Variante im Wesentlichen unabhängig von der Cytokinin-Bindung ist. Somit umfasst der Begriff ”konstitutiv aktive Variante” auch Polypeptide, bei denen keine spezifische Bindung an Cytokinin vorliegt, sowie Polypeptide, bei denen nicht einmal eine funktionelle oder nicht funktionelle Cytokinin-Bindungsdomäne vorliegt. Dem Fachmann sind geeignete Methoden bekannt, wie ein bestimmtes Polypeptid auf seine Kinaseaktivität hin zu prüfen ist. Vorzugsweise wird der in vitro-Kinaseassay verwendet, der von Mähönen et al. in ".Cytokinins Regulate a Bidirectional Phosphorelay Network in Arabidopsis", Current Biology (2006), 16, 1116–1122, beschrieben ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform zeigt die konstitutiv aktive Variante wenigstens 30% der Kinaseaktivität des jeweiligen Wildtyp-AHK-Rezeptors AHK2 oder AHK3 und besonders bevorzugt wenigstens 50% der Kinaseaktivität von AHK2 bzw. AHK3.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die transgene Expression eines Polypeptids, umfassend eine Aminosäuresequenz mit SEQ ID NO: 1 oder 2, zu transgenen Pflanzen führt, die verbesserte Wachstumsmerkmale und verzögerte Blattseneszenz aufweisen. Die Wirkung der transgenen Expression einer Aminosäuresequenz mit SEQ ID NO: 1 oder 2 in einer Pflanze auf die Blattseneszenz ist stärker ausgeprägt als die bei der bekannten gain-of-function-Variante von AHK3, ore12, bereits beobachtete. Noch überraschender wurde erstmals gefunden, dass die transgene Expression der AHK2- oder AHK3-gain-of-function-Variante einer Aminosäuresequenz mit SEQ ID NO: 1 oder 2 signifikante Wirkung auf das Sprosswachstum, die Anzahl der Schoten pro Haupttrieb, die Triebdicke und/oder die Blütengröße der resultierenden transgenen Pflanze im Vergleich zum Wildtyp hat, während bei den ore12 exprimierenden Pflanzen eine solche Wirkung fehlt. Somit führt die transgene Expression einer Aminosäuresequenz mit SEQ ID NO: 1 oder 2 zu Pflanzen, die verbesserte Produktivität aufweisen.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure bereitgestellt, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, codierend für:

i) eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder ein Ortholog derselben;
ii) eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 48%, vorzugsweise wenigstens 50%, besonders bevorzugt wenigstens 55% Identität über die gesamte Sequenzlänge von SEQ ID NO: 1; oder
iii) eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 53%, besonders bevorzugt wenigstens 55% Identität über einen Sequenzabschnitt der SEQ ID NO: 1 von 50 Aminosäuren mit SEQ ID NO: 5; wobei die Aminosäuresequenz die Aminosäure Phenylalanin (F) in einer Position aufweist, die der Position 552 von SEQ ID NO: 1 entspricht. Die SEQ ID NO: 5 umfasst die 50 Aminosäurereste von SEQ ID NO: 1, die sich direkt hin zum N-Terminus der Aminosäure Phenylalanin (F) an Position 552 von SEQ ID NO: 1 befinden.

Die vorliegende Erfindung macht auch eine isolierte Nucleinsäure verfügbar, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, codierend für:

i) eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 2 oder ein Ortholog derselben;
ii) eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 48%, vorzugsweise wenigstens 50%, besonders bevorzugt wenigstens 55% Identität über die gesamte Sequenzlänge von SEQ ID NO: 2; oder
iii) eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 55%, besonders bevorzugt wenigstens 60% Identität Ober einen Sequenzabschnitt der SEQ ID NO: 2 von 50 Aminosäuren mit SEQ ID NO: 6;

Vorzugsweise wird eine isolierte Nucleinsäure bereitgestellt, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, die für wenigstens eine der Aminosäuresequenzen mit SEQ ID NO: 1 oder 2 oder ein Ortholog derselben codiert. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff ”Ortholog” eine Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenz aus einer Spezies, vorzugsweise verschieden von Arabidopsis thaliana, die höchste Ähnlichkeit, vorzugsweise höchste Sequenzidentität, mit der angegebenen Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenz von Arabidopsis thaliana zeigt, da beide Gene von einem gemeinsamen Vorfahren stammen. Die vorliegende Erfindung macht auch ein isoliertes Polypeptid verfügbar, das von einer erfindungsgemäßen isolierten Nucleinsäure codiert wird, vorzugsweise ein isoliertes Polypeptid, das wenigstens eine der Aminosäuresequenzen mit SEQ ID NO: 1 oder 2 umfasst.
In einem zweiten Aspekt macht die Erfindung eine transgene Expressionskassette zur Expression von Nucleinsäuren verfügbar, wobei die erfindungsgemäße transgene Expressionskassette eine isolierte Nucleinsäure gemäß vorliegender Erfindung umfasst. Die erfindungsgemäße transgene Expressionskassette kann so ausgestaltet sein, dass sie die transgene Expression der Nucleinsäuresequenz, die für wenigstens eine der Aminosäuresequenzen mit SEQ ID NO: 1 oder 2 codiert, in einem Pflanzengewebe unter der Kontrolle wenigstens eines Promotors in einem Wirtsorganismus, vorzugsweise einer Pflanzenzelle bewirkt.
In einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der eine erfindungsgemäße isolierte Nucleinsäure oder eine erfindungsgemäße transgene Expressionskassette umfasst.
In einem vierten Aspekt hat die Erfindung einen transgenen Organismus zum Gegenstand, der eine erfindungsgemäße isolierte Nucleinsäure, eine erfindungsgemäße transgene Expressionskassette oder einen Vektor gemäß vorliegender Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung macht ein isoliertes Polypeptid verfügbar, umfassend:

A) i) eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder ein Ortholog derselben;
ii) eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 48%, vorzugsweise wenigstens 50%, besonders bevorzugt wenigstens 55% Identität über die gesamte Sequenzlänge von SEQ ID NO: 1; oder
iii) eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 53%, besonders bevorzugt wenigstens 55% Identität über einen Sequenzabschnitt der SEQ ID NO: 1 von 50 Aminosäuren mit SEQ ID NO: 5; wobei die Aminosäuresequenz die Aminosäure Phenylalanin (F) in einer Position aufweist, die der Position 552 von SEQ ID NO: 1 entspricht; oder
B) i) eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 2 oder ein Ortholog derselben;
ii) eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 48%, vorzugsweise wenigstens 50%, besonders bevorzugt wenigstens 55% Identität über die gesamte Sequenzlänge von SEQ ID NO: 2; oder
iii) eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 55%, besonders bevorzugt wenigstens 60% Identität über einen Sequenzabschnitt der SEQ ID NO: 2 von 50 Aminosäuren mit SEQ ID NO: 6; wobei die Aminosäuresequenz die Aminosäure Isoleucin (I) in einer Position aufweist, die der Position 179 von SEQ ID NO: 2 entspricht.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße isolierte Polypeptid eine der Aminosäuresequenzen mit SEQ ID NO: 1 oder 2 und/oder besteht daraus.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine isolierte Nucleinsäure, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, die für wenigstens eine der Aminosäuresequenzen mit der SEQ ID NO: 1 oder 2 codiert.
Eine ”isolierte” Nucleinsäure ist eine solche, die im Wesentlichen von anderen Nucleinsäure-Molekülen getrennt ist, die im natürlichen Quellenmaterial der Nucleinsäure vorhanden sind (z. B. Sequenzen, die für andere Polypeptide codieren). Vorzugsweise ist eine ”isolierte” Nucleinsäure frei von einigen derjenigen Sequenzen, die natürlicherweise die Nucleinsäure in ihrem natürlich auftretenden Replikon flankieren (d. h. Sequenzen, die sich am 5'- und 3'-Ende der Nucleinsäure befinden). Zum Beispiel wird eine klonierte Nucleinsäure als isoliert erachtet. In den verschiedenen Ausführungsformen kann die erfindungsgemäße isolierte Nucleinsäure weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb der Nucleotidsequenzen enthalten, die natürlicherweise das Nucleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle flankieren, aus der die Nucleinsäure stammt. Eine Nucleinsäure wird auch dann als isoliert erachtet, wenn sie durch Eingriffe des Menschen verändert oder an einen Locus oder Ort verbracht wurde, der nicht ihre natürliche Stelle ist, oder wenn sie z. B. durch Agroinfektion in eine Zelle eingeführt wurde. Darüber hinaus kann eine ”isolierte” Nucleinsäure, etwa ein cDNA-Molekül, frei von irgendwelchem anderen zellulären Material sein, mit dem es natürlicherweise gemeinsam vorliegt, oder von Kulturmedium bei Gewinnung mittels rekombinanter Techniken oder von chemischen Vorstufen oder anderen chemischen Stoffen bei chemischer Synthese. Von der Definition der ”isolierten Nucleinsäure” ausdrücklich ausgenommen sind die folgenden: natürlich vorkommende Chromosomen (wie z. B. Chromosomenspreitungen), genomische Bibliotheken und genomische Ganzzellen-DNA oder Ganzzellen-RNA-Präparate aus natürlich vorkommenden Quellen (darunter mechanisch gescherte oder enzymatisch verdaute Ganzzellenpräparate). Die Nucleinsäuren und/oder Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in isolierter Form bereitgestellt werden, d. h. von ihrer natürlichen Umgebung befreit, vorzugsweise in im Wesentlichen reiner oder homogener Form oder frei oder weitgehend frei von Nucleinsäure oder von Genen der Ursprungsspezies, die nicht der gewünschten Sequenz entsprechen.
Die Nucleinsäure gemäß vorliegender Erfindung kann DNA, RNA, Mischungen und/oder funktionelle Substituenten derselben, insbesondere cDNA, genomische DNA und RNA umfassen und kann ganz oder teilweise synthetisch sein. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren umfassen einzelsträngige oder ganz oder teilweise doppelsträngige Polynucleotidsequenzen. Der Begriff ”isoliert” umfasst alle diese Möglichkeiten. Ist eine DNA-Sequenz angegeben, z. B. mit Verweis auf eine bestimmte SEQ ID NO, so ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, sofern der Zusammenhang nichts anderes erfordert, das RNA-Äquivalent mit eingeschlossen, wobei T mit U ersetzt ist, wenn dieses auftritt. Die erfindungsgemäße Nucleinsäure kann in irgendeiner Weise erzeugt werden, darunter genomische Präparate, cDNA-Präparate, in vitro-Synthese, PCR, RT-PCR und/oder in vitro- oder in vivo-Transkription.
Die erfindungsgemäße isolierte Nucleinsäure kann wenigstens eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die ausgewählt ist aus:

i) einer der SEQ ID NO: 3 oder 4 oder einem reversen Komplement derselben;
ii) einer funktionell äquivalenten Sequenz oder einem reversen Komplement derselben, die bzw. das wenigstens 70% Homologie, vorzugsweise wenigstens 75% Homologie, besonders bevorzugt wenigstens 80% Homologie zu einer der Sequenzen mit SEQ ID NO: 3 oder 4 über einen Abschnitt einer codierenden Sequenz mit wenigstens 300 Basenpaaren, bevorzugt über einen Abschnitt einer codierenden Sequenz mit wenigstens 500 Basenpaaren, besonders bevorzugt über die gesamte Länge der codierenden Sequenz aufweist und wenigstens für ein erfindungsgemäßes isoliertes Polypeptid, vorzugsweise für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder 2 codiert, oder
iii) funktionell äquivalenten Sequenzen oder einem reversen Komplement derselben, die unter Standardbedingungen mit einer der Nucleinsäuresequenzen mit SEQ ID NO: 3 oder 4 oder mit einer dazu komplementären Nucleinsäuresequenz hybridisieren und wenigstens für ein erfindungsgemäßes isoliertes Polypeptid, vorzugsweise für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder 2 codieren.

Die Nucleinsäuresequenz mit SEQ ID NO: 3 codiert für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1, während die Nucleinsäuresequenz mit SEQ ID NO: 4 für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 codiert.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff ”funktionell äquivalente Sequenz” eine beliebige Sequenz oder ein reverses Komplement derselben, die nicht identisch ist mit einer der SEQ ID NO: 3 oder 4 und für wenigstens eine der Aminosäuresequenzen mit SEQ ID NO: 1 oder 2 codiert. Dem Fachmann ist die Degeneration des genetischen Codes wohlbekannt, der es ermöglicht, dass mehrere verschiedene Nucleinsäuresequenzen für die gleiche Aminosäuresequenz codieren, und hat keine Schwierigkeiten bei der Bestimmung, ob eine bestimmte Nucleinsäuresequenz für wenigstens eine der Aminosäurensequenzen mit SEQ ID NO: 1 oder 2 codiert.
Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen funktionellen äquivalenten Sequenzen oder Fragmente umfassen bevorzugt die Einführung von Mutationen in eine der durch SEQ ID NO: 3 oder 4 beschriebenen Sequenzen oder ein reverses Komplement derselben. Die Mutagenese kann zufallsbestimmt sein, wobei die mutagenisierten Sequenzen anschließend mit Hilfe eines Verfahrens von Versuch und Irrtum bezüglich ihrer Eigenschaften durchmustert werden. Die Verfahren zur Mutagenese von Nucleinsäuresequenzen sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise die Verwendung von Oligonucleotiden mit einer oder mehreren Mutationen bezüglich der zu mutierenden Region (z. B. in einer ortspezifischen Mutagenese). In der Regel werden Primer mit etwa 15 bis etwa 75 Nucleotiden oder mehr eingesetzt, wobei sich bevorzugt etwa 10 bis etwa 25 oder mehr Nucleotidreste an beiden Seiten der zu verändernden Sequenz befinden. Details und Durchführung dieser Mutagenese-Verfahren sind dem Fachmann bekannt (Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol 154: 367–382; Tomic et al. (1990) Nucl Acids Res. 12: 1656; Upender et al. (1995) Biotechniques 1 (1): 29–30; US-Patent 4,237,224 ). Mutagenese kann beispielsweise auch durch Behandlung von transgenen Expressionsvektoren, die eine der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen umfassen, mit mutagenisierenden Agenzien wie etwa Hydroxylamin erreicht werden.
Der Einsatz von funktionellen äquivalenten Sequenzen kann besonders nützlich sein, um einer bestimmten Codon-Nutzung eines ausgewählten Organismus zu genügen, der zur Transkription der erfindungsgemäßen Nucleinsäure und Expression des codierten Polypeptids verwendet werden kann, das wenigstens eine der Aminosäuresequenzen mit SEQ ID NO: 1 oder 2 umfasst oder daraus besteht.
Die erfindungsgemäße isolierte Nucleinsäure kann wenigstens eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die ausgewählt ist aus funktionell äquivalenten Sequenzen oder einem reversen Komplement derselben, die wenigstens 80% Homologie, vorzugsweise wenigstens 90% Homologie, besonders bevorzugt wenigstens 95% Homologie zu einer der Sequenzen mit SEQ ID NO: 3 oder 4 über einen Abschnitt einer codierenden Sequenz mit wenigstens 300 Basenpaaren, bevorzugt über einen Abschnitt einer codierenden Sequenz mit wenigstens 500 Basenpaaren, besonders bevorzugt über die gesamte Länge der codierenden Sequenz aufweisen und wenigstens für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder 2 codieren.
Unter Homologie oder Identität zweier Nucleinsäuresequenzen versteht man die jeweilige Identität der betreffenden Sequenzen über eine bestimmte Sequenzlänge, die durch Vergleichen mit Hilfe des GAP-Programm-Algorithmus (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) berechnet wird, wobei folgende Parameter eingestellt werden:
gap-Gewicht: 12
Längengewicht: 4
Match-Durchschnitt: 2,912
Mismatch-Durchschnitt: –2,003
Zum Beispiel wird unter einer Sequenz, die wenigstens 70% Homologie oder Identität mit einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 3 oder 4 auf Nucleinsäure-Basis aufweist, eine solche Sequenz verstanden, die beim Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 oder 4 mit Hilfe des obigen Programm-Algorithmus mit dem obigen Parametersatz wenigstens 70% Homologie aufweist.
Unter Identität oder Homologie zweier Aminosäuresequenzen versteht man die jeweilige Identität der betreffenden Sequenzen über eine bestimmte Sequenzlänge, die durch Vergleichen mit Hilfe des ClusatW_Bioedit-Algorithmus (Thompson JD et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673–4680) unter Verwendung der Standardeinstellungen im Software-Paket BioEdit (zu beziehen über: http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html) berechnet wird.
Zum Beispiel wird unter einer Sequenz, die wenigstens 48% Homologie oder Identität mit einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 1 oder 2 auf Aminosäure-Basis aufweist, eine solche Sequenz verstanden, die beim Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder 2 mit Hilfe des obigen Programm-Algorithmus mit dem obigen Parametersatz wenigstens 48% Identität aufweist.
Die erfindungsgemäße isolierte Nucleinsäure kann wenigstens eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die ausgewählt ist aus funktionell äquivalenten Sequenzen oder einem reversen Komplement derselben, die unter Standardbedingungen mit einer der Nucleinsäuresequenzen mit SEQ ID NO: 3 oder 4 oder mit einer dazu komplementären Nucleinsäuresequenz hybridisieren und wenigstens für ein erfindungsgemäßes isoliertes Polypeptid, vorzugsweise für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder 2 codieren.
Der Begriff ”Standard-Hybridisierungsbedingungen” ist breit zu verstehen und impliziert sowohl stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem beschrieben von Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al. in Molecular Cloning – A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seite 9.31–9.57 oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1–6.3.6.
Zum Beispiel können die Bedingungen beim Waschschritt bzw. den Waschschritten ausgewählt werden aus dem Bereich von Bedingungen, die zwischen solchen niedriger Stringenz (mit ca. 2 × SSC bei 50°C) und hoher Stringenz (mit ca. 0,2 × SSC bei 50°C, vorzugsweise bei 65°C) liegen (20 × SSC: 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7,0). Darüber hinaus kann die Temperatur während des Waschschritts von Bedingungen niedriger Stringenz bei Raumtemperatur, etwa 22°C, auf stringentere Bedingungen bei etwa 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, und es ist auch möglich, einen der beiden Parameter konstant zu halten und nur den anderen zu variieren. Bei der Hybridisierung können auch Denaturierungsmittel wie etwa Formamid oder SDS eingesetzt werden. Die Hybridisierung in Gegenwart von 50% Formamid wird vorzugsweise bei 42°C durchgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für die Hybridisierung und die Waschschritte sind nachstehend angegeben:

(1) Hybridisierungsbedingungen zum Beispiel mit:
a) 4 × SSC bei 65°C, oder
b) 6 × SSC, 0,5% SDS, 100 μg/ml denaturierte fragmentierte Lachsspermien-DNA bei 65°C, oder
c) 4 × SSC, 50% Formamid bei 42°C, oder
d) 2× oder 4 × SSC bei 50°C (Bedingungen niedriger Stringenz), oder
e) 2× oder 4 × SSC, 30 bis 40% Formamid bei 42°C (Bedingungen niedriger Stringenz), oder
f) 6 × SSC bei 45°C, oder
g) 0,05 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0, 2 mM EDTA, 1% BSA und 7% SDS.
(2) Waschschritte zum Beispiel mit:
a 0,1 × SSC bei 65°C, oder
b) 0,1 × SSC, 0,5% SDS bei 68°C, oder
c) 0,1 × SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C, oder
d) 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C, oder
e) 2 × SSC bei 65°C (Bedingungen niedriger Stringenz), oder
f) 40 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0, 1% SDS, 2 mM EDTA.

Die erfindungsgemäße isolierte Nucleinsäure kann wenigstens eine Promotorsequenz umfassen, die sich stromaufwärts in 5'-Position zu der Nucleinsäuresequenz befinden kann, die wenigstens für ein erfindungsgemäßes isoliertes Polypeptid, vorzugsweise für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder 2 codiert.
Eine Promotorsequenz ist eine Nucleinsäuresequenz, die die Transkription eines bestimmten Gens erleichtern oder verbessern kann. Die hierin vorgenommene Bezugnahme auf einen ”Promotor” soll im breitesten Sinn und Zusammenhang verstanden werden und umfasst die von einem klassischen eukaryontischen genomischen Gen abgeleiteten Transkriptionsregulationssequenzen, darunter die TATA-Box, die zur präzisen Einleitung der Transkription erforderlich ist, mit oder ohne CCAAT-Box-Sequenz und zusätzliche regulatorische oder steuernde Elemente (z. B. stromaufwärts gelegene aktivierende Sequenzen, Repressoren, Enhancer und Silencer), welche die Genexpression auf Entwicklungs- und/oder äußere Reize hin oder gewebespezifisch verändern.
Der Begriff ”Promotor” kann auch die Transkriptionsregulationssequenzen eines klassischen prokaryontischen Gens umfassen, wobei der Promotor in diesem Falle eine –35-Box-Sequenz und/oder eine –10-Box-Transkriptionsregulationssequenz umfassen kann.
Der Begriff ”Promotor” wird auch zur Beschreibung eines synthetischen oder Fusionsmoleküls oder eines Derivats verwendet, das die Expression eines Nucleinsäuremoleküls in einer Zeile, einem Gewebe oder einem Organ ermöglicht, aktiviert oder verstärkt. Promotoren können zusätzliche Kopien eines oder mehrerer spezifischer regulatorischer Elemente enthalten, um die Expression weiter zu verstärken und/oder die räumliche Expression und/oder zeitliche Expression eines Nucleinsäuremoleküls zu verändern, zu dem eine funktionelle Verknüpfung vorliegt. Solche regulatorischen Elemente können zu einer heterologen Promotorsequenz benachbart sein, um die Expression eines Nucleinsäuremoleküls als Reaktion auf z. B. Kupfer, Glucocorticoide, Dexamethason, Tetracyclin, Gibberellin, cAMP, Abscisinsäure, Auxin, Verwundung, Ethylen, Jasmonat oder Salicylsäure voran zu treiben oder die Expression eines Nucleinsäuremoleküls in bestimmten Zellen, Geweben oder Organen wie etwa Meristemen, Blättern, Wurzeln, Embryonen, Blüten, Samen oder Früchten zu ermöglichen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist der Promotor vorzugsweise eine in Pflanzen exprimierbare Promotorsequenz. Promotoren, die auch oder ausschließlich in nichtpflanzlichen Zellen wie etwa Bakterien, Hefezellen, Insektenzellen und Tierzellen wirken, sind nicht von der Erfindung ausgeschlossen. ”In Pflanzen exprimierbar” soll heißen, dass die Promotorsequenz, einschließlich aller zusätzlichen oder darin enthaltenen regulatorischen Elemente, zumindest Imstande ist, die Expression in einer pflanzlichen Zelle, einem pflanzlichen Gewebe oder Organ, vorzugsweise in einer monokotylen oder dikotylen pflanzlichen Zelle, einem pflanzlichen Gewebe oder Organ zu induzieren, zu ermöglichen, zu aktivieren oder zu steigern. Die Begriffe ”pflanzlich wirksam” und ”wirksam in einer Pflanze”, sofern hierin in Bezug auf eine Promotorsequenz verwendet, sollen als gleichwertig mit der in Pflanzen exprimierbaren Promotorsequenz verstanden werden.
Regulierbare Promotoren als Teil eines binären viralen pflanzlichen Expressionssystems sind dem Fachmann ebenfalls bekannt (Yadav 1999 – WO 99/22003 ; Yadav 2000 – WO 00117385 ). Im vorliegenden Zusammenhang ist eine ”regulierbare Promotorsequenz” ein Promotor, der in der Lage ist, die Expression eines Gens in einer bestimmten Zelle, einem Gewebe oder Organ oder in einer Gruppe von Zellen, in Geweben oder Organen einer Pflanze, gegebenenfalls unter bestimmten Bedingungen herbeizuführen, aber im allgemeinen nicht in der gesamten Pflanze unter allen Bedingungen die Expression herbeiführt. Dementsprechend kann eine regulierbare Promotorsequenz eine Promotorsequenz sein, die die Expression eines Gens, an welches sie an einer bestimmten Stelle innerhalb der Pflanze oder alternativ in der gesamten Pflanze funktionell verknüpft Ist, unter einer Reihe bestimmter Bedingungen ermöglicht, etwa nach Induktion der Genexpression durch eine chemische Verbindung oder einen anderen Auslöser. Vorzugsweise ermöglicht der bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendete regulierbare Promotor entweder konstitutiv oder nach Induktion die Expression an einer bestimmten Stelle innerhalb der Pflanze, jedoch nicht in der gesamten Pflanze unter allen Bedingungen. In den Umfang solcher Promotoren fallen zellspezifische Promotorsequenzen, gewebespezifische Promotorsequenzen, organspezifische Promotorsequenzen, zellzyklusspezifische Gen-Promotorsequenzen, induzierbare Promotorsequenzen und konstitutive Promotorsequenzen, die modifiziert werden, um Expression in einem bestimmten Teil der Pflanze zu einem beliebigen Zeitpunkt zu ermöglichen, etwa durch Integration des genannten konstitutiven Promoters innerhalb eines transponiblen genetischen Elements (Ac, Ds, SPM, En oder ein anderes Transposon). In ähnlicher Weise soll der Begriff ”gewebespezifisch” angeben, dass die Expression überwiegend in einem bestimmten Gewebe oder Gewebetyp erfolgt, vorzugsweise pflanzlichen Ursprungs, wenn auch nicht unbedingt ausschließlich in dem Gewebe oder Gewebetyp. Ebenso soll der Begriff ”organspezifisch” angeben, dass die Expression überwiegend in einem bestimmten Organ erfolgt, vorzugsweise pflanzlichen Ursprungs, wenn auch nicht unbedingt ausschließlich in dem Organ. Ebenso soll der Begriff ”zellzyklusspezifisch” angeben, dass die Expression überwiegend zyklisch erfolgt und in einer oder mehreren, nicht notwendigerweise aufeinander folgenden Phasen des Zellzyklus auftritt, wenn auch nicht unbedingt ausschließlich in zyklierenden Zellen, vorzugsweise solchen pflanzlichen Ursprungs. Dem Fachmann ist bekannt, dass ein ”induzierbarer Promotor” ein Promotor ist, dessen transkriptionelle Aktivität als Reaktion auf einen entwicklungsbedingten, chemischen, umweltbedingten oder physikalischen Reiz erhöht oder induziert wird. Dem versierten Fachmann ist auch bekannt, dass ein konstitutiver Promotor” ein Promotor ist, der in den meisten, aber nicht unbedingt allen Teilen eines Organismus, vorzugsweise einer Pflanze, während der meisten, aber nicht notwendigerweise allen Phasen von Entwicklung und Wachstum transkriptionell aktiv ist. Der Fachmann ist ohne Weiteres und ohne unnötiges Experimentieren in der Lage, geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung bei der Einregulierung einer geeigneten Expression der Cytokininrezeptorprotein-Varianten aus öffentlich zugänglichen Quellen auszuwählen.
Ein Nucleinsäuremolekül unter die regulatorische Kontrolle einer Promotorsequenz oder in funktionelle Verbindung oder Verknüpfung mit einer Promotorsequenz zu bringen, bedeutet das Positionieren des Nucleinsäuremoleküls in einer Weise, dass die Expression zumindest teilweise von der Promotorsequenz gesteuert wird. Ein Promotor befindet sich in der Regel, aber nicht notwendigerweise stromaufwärts vom oder am 5'-Ende und innerhalb 2 kb der Startstelle der Transkription des Nucleinsäuremoleküls, das von diesem reguliert wird, wenn auch Enhancer und Silencer, die ebenfalls unter den Begriff ”Promotor” fallen, werter weg von der Transkriptionsstartstelle entfernt sein können. Man nimmt an, dass diese Elemente an Proteine binden, die durch Bildung von Schleifen aus der dazwischen liegenden Sequenz heraus weitreichende Wirkung entfalten können. Beim Aufbau von Kombinationen aus heterologem Promotor/Strukturgen ist es im Allgemeinen bevorzugt, den Promotor in einem Abstand von der Startstelle der Gentranskription zu setzen, der in etwa der gleiche ist wie der Abstand zwischen dem Promotor und dem Gen, das von diesem in seiner natürlichen Umgebung gesteuert wird (z. B. das Gen, von dem der Promotor abgeleitet ist). Wie in der Fachwelt bekannt ist, kann dieser Abstand ohne Einbußen bei der Promotorfunktion zu einem gewissen Grad variiert werden. Ebenso ist die bevorzugte Positionierung eines regulatorischen Sequenzelements in Bezug auf ein heterologes Gen, das unter dessen Kontrolle gestellt werden soll, durch die Positionierung des Elements in seiner natürlichen Umgebung definiert (d. h., das Gen, von dem es abgeleitet ist). Wie in der Fachwelt bekannt ist, kann auch hier der Abstand zu einem gewissen Grad variieren.
Gemäß vorliegender Erfindung kann jede Promotorsequenz zur Herstellung einer erfindungsgemäßen isolierten Nucleinsäure verwendet werden. Vorzugsweise befindet sich die Promotorsequenz stromaufwärts von der Nucleinsäuresequenz, die wenigstens für ein erfindungsgemäßes isoliertes Polypeptid codiert, vorzugsweise für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder 2. Vorzugsweise werden Promotorsequenzen verwendet, die in wenigstens einem Gewebe- oder Zelltyp einer Pflanze aktiv sind und/oder in einem Mikroorganismus aktiv sind. Zur Erfüllung ihres Zwecks sind die wenigstens eine Promotorsequenz und die Nucleinsäuresequenz, die wenigstens für ein erfindungsgemäßes isoliertes Polypeptid codiert, vorzugsweise für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder 2, funktionell miteinander verknüpft.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine erfindungsgemäße isolierte Nucleinsäure, des Weiteren umfassend wenigstens eine Promotorsequenz, wobei die wenigstens eine Promotorsequenz und die Nucleinsäuresequenz, die wenigstens für ein erfindungsgemäßes isoliertes Polypeptid codiert, vorzugsweise für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder 2, funktionell miteinander verknüpft sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine erfindungsgemäße isolierte Nucleinsäure, des Weiteren umfassend wenigstens eine Promotorsequenz, wobei sich die Nucleinsäuresequenz, die wenigstens für ein erfindungsgemäßes isoliertes Polypeptid codiert, vorzugsweise für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder 2, in 3'-Position zu dem wenigstens einen Promotor befindet, und wobei die wenigstens eine Promotorsequenz und die Nucleinsäuresequenz funktionell miteinander verknüpft sind.
So wie hierin verwendet, bedeutet ”funktionelle Verknüpfung” beispielsweise die sequentielle Anordnung wenigstens eines Promotors, der Nucleinsäuresequenz, die wenigstens für ein erfindungsgemäßes isoliertes Polypeptid codiert, vorzugsweise für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder 2, und gegebenenfalls weiterer regulatorischer Elemente, etwa eines Terminators, in einer Weise, dass jedes der regulatorischen Elemente die erwartete Funktion bei der transgenen Expression der Nucleinsäuresequenz erfüllen kann, die wenigstens für ein erfindungsgemäßes isoliertes Polypeptid codiert, vorzugsweise für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder 2. Hierfür ist nicht notwendigerweise eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen wie etwa Enhancer-Sequenzen können ihre Funktion auf die Zielsequenz auch von Positionen ausüben, die weiter entfernt gelegen sind, oder sogar von anderen DNA-Molekülen aus. In der erfindungsgemäßen isolierten Nucleinsäure ist die Nucleinsäuresequenz, die wenigstens für ein erfindungsgemäßes isoliertes Polypeptid codiert, vorzugsweise für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder 2, vorzugsweise stromabwärts von der Sequenz positioniert, die als die wenigstens eine Promotorsequenz fungiert, so dass die beiden Sequenzen covalent miteinander verbunden sind. Vorzugsweise beträgt der Abstand zwischen der wenigstens einen Promotorsequenz und der Nucleinsäuresequenz, die wenigstens für ein erfindungsgemäßes isoliertes Polypeptid codiert, vorzugsweise für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder 2, weniger als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt weniger als 100 Basenpaare und ganz besonders bevorzugt weniger als 50 Basenpaare. Der wenigstens eine Promotor und die Nucleinsäure, die wenigstens für ein erfindungsgemäßes isoliertes Polypeptid codiert, vorzugsweise für eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder 2, kann so ausgewählt und funktionell verknüpft sein, dass die transgene Expression eines erfindungsgemäßen isolierten Polypeptids, vorzugsweise wenigstens einer der Aminosäuresequenzen mit SEQ ID NO: 1 oder 2, in einem transgenen Organismus möglich ist.
”Expression” bedeutet in diesem Zusammenhang die Transkription der transgen zu exprimierenden Nucleinsäuresequenz, kann aber auch die Translation der transkribierten RNA der transgen zu exprimierenden Nucleinsäuresequenz in ein entsprechendes Polypeptid einschließen.
Im Hinblick auf eine transgene Expressionskassette, einen transgenen Expressionsvektor, einen transgenen Organismus oder ein Verfahren zur transgenen Expression von Nucleinsäuren bezeichnet ”transgen” all jene Konstrukte, die das Ergebnis transgener Verfahren sind oder aller Verfahren, bei denen diese verwendet werden, wobei eine erfindungsgemäße isolierte Nucleinsäure sich nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung befindet oder durch transgene Verfahren modifiziert wurde, wobei die Modifikation beispielsweise eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer Nucleotidreste sein kann. Vorzugsweise ist die wenigstens eine Promotorsequenz der erfindungsgemäßen isolierten Nucleinsäure heterolog in Bezug auf die weitere Nucleinsäuresequenz, die funktionell damit verknüpft ist und transgen exprimiert werden soll. In diesem Zusammenhang bedeutet ”heterolog”, dass die weitere Nucleinsäuresequenz nicht die codierende Sequenz umfasst, die natürlicherweise unter der Kontrolle dieses Promotors steht.
”Natürliche genetische Umgebung” bedeutet den natürlichen chromosomalen Locus im Ursprungsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Falle einer genomischen Bibliothek ist die natürliche genetische Umgebung der Nucleinsäuresequenz vorzugsweise wenigstens teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nucleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von wenigstens 50 bp, vorzugsweise wenigstens 500 bp, besonders bevorzugt wenigstens 1000 bp und ganz besonders bevorzugt wenigstens 5000 bp. Ein natürlich vorkommendes Expressionskonstrukt wird zu einem transgenen Expressionskonstrukt, wenn diese Kombination durch nicht natürliche, synthetische (”künstliche”) Verfahren wie beispielsweise eine in vitro-Mutagenese verändert wird. Solche Verfahren sind bereits beschrieben ( US 5,565,350 ; WO 00/15815 ; siehe auch oben).
”Transgen” in Bezug auf eine Expression (”transgene Expression”) bezeichnet vorzugsweise alle Expressionen, die mit einer transgenen Expressionskassette, einem transgenen Expressionsvektor oder einem transgenen Organismus – wie vorstehend oder nachstehend definiert – durchgeführt werden.
Eine funktionelle Verknüpfung zwischen dem wenigstens einen Promotor und der exprimierenden Nucleinsäuresequenz kann mit Hilfe gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie beispielsweise beschrieben von Maniatis T et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; und von Silhavy TJ et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; und von Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience. Ein für diesen Zweck geeignetes Verfahren ist zum Beispiel die GATEWAY^TM-Klonierungstechnik (Invitrogen Inc.), die auf Rekombination basiert.
Die erfindungsgemäße isolierte Nucleinsäure kann neben der wenigstens einen erfindungsgemäßen Promotorsequenz weitere genetische Kontrollsequenzen oder Elemente umfassen.
Das Konzept der genetischen Kontrollsequenzen oder Elemente ist breit zu verstehen und impliziert all jene Sequenzen, die Einfluss auf den Ursprung oder die Funktion der isolierten Nucleinsäure oder der transgenen Expressionskassette der Erfindung haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und/oder Translation in prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die isolierte Nucleinsäure oder die transgenen Expressionskassetten gemäß der Erfindung wenigstens eine Promotorsequenz 5' stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nucleinsäuresequenz und eine Terminationssequenz 3' stromabwärts als zusätzliche genetische Kontrollsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulatorische Elemente, die jeweils mit der transgen zu exprimierenden Nucleinsäuresequenz funktionell verknüpft sind.
Genetische Kontrollsequenzen können auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren umfassen, welche die expressionssteuernden Eigenschaften modifizieren können. Durch die genetischen Kontrollsequenzen ist es somit möglich, dass beispielsweise eine zusätzliche gewebespezifische Expression in Abhängigkeit von bestimmten Stressfaktoren stattfindet.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierte Region, Introns, die nichtkodierende 3'-Region oder auch Sequenzen von Genen. Es wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Darüber hinaus können sie die Gewebespezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15: 435–440). Umgekehrt supprimiert die 5'-untranslatierte Region des Opaque-2-Gens die Expression. Die Deletion der betreffenden Region führt zu einer Erhöhung der Genaktivität (Lohmer S et al. (1993) Plant Cell 5: 65–73).
Die isolierte Nucleinsäure kann vorteilhaft eine oder mehrere so genannte Enhancer-Sequenzen in funktioneller Verknüpfung mit dem Promotor umfassen, die erhöhte transgene Expression der Nucleinsäuresequenz ermöglichen. Es können auch weitere vorteilhafte Sequenzen am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nucleinsäuresequenzen inseriert werden, etwa weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nucleinsäuresequenzen können als eine oder mehrere Kopien in einer der erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten vorliegen.
Unter Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die homologe Rekombination oder Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Deletion aus dem Genom erlauben. Im Falle der homologen Rekombination kann zum Beispiel der natürliche Promotor eines bestimmten Gens durch einen der erfindungsgemäßen Promotoren ersetzt werden. Solche Sequenzen sind als genetische Kontrollsequenzen aufzufassen. Verfahren wie etwa die Cre/lox-Technik erlauben eine gewebespezifische und unter Umständen induzierbare Deletion der transgenen Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B (1998) Methods (Duluth) 14 (4): 381–92). Dabei werden dem Zielgen bestimmte flankierende Sequenzen angefügt (lox-Sequenzen), die später die Deletion mit Hilfe der Cre-Rekombinase ermöglichen.
Zum Selektieren von Zellen, bei denen eine erfolgreiche homologe Rekombination oder anderweitige Transformation erfolgt ist, muss in der Regel noch ein Selektionsmarker eingeführt werden (siehe unten). Die homologe Rekombination ist ein relativ seltenes Ereignis bei höheren Eukaryonten, vor allem bei Pflanzen. Vorwiegend kommt es zu Zufallsintegrationen in das Wirtsgenom. Eine Möglichkeit der Deletion zufällig integrierter Sequenzen und damit der Erhöhung der Konzentration von Zellklonen mit korrekter homologer Rekombination ist die Verwendung eines sequenzspezifischen Rekombinationssystems wie in US-Patent 6,110,736 beschrieben.
Polyadenylierungssignale, die als Kontrollsequenzen geeignet sind, umfassen pflanzliche Polyadenylierungssignale und vorzugsweise solche, die im Wesentlichen den T-DNA-Polyadenylierungssignalen von Agrobacterium tumefaciens entsprechen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die isolierte Nucleinsäure oder die transgene Expressionskassette eine Terminatorsequenz, die in Pflanzen funktionsfähig ist. In Pflanzen funktionsfähige Terminationssequenzen sind in der Regel solche Sequenzen, die bei Pflanzen den Abbruch der Transkription einer DNA-Sequenz herbeiführen können. Beispiele für geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS-Terminator (Octopinsynthase) und der NOS-Terminator (Nopalinsynthase), wobei jedoch pflanzliche Terminatorsequenzen besonders bevorzugt sind. Pflanzliche Terminatorsequenzen sind in der Regel solche Sequenzen, die Teil eines natürlichen pflanzlichen Gens sind. Besonders bevorzugt in diesem Zusammenhang ist der Terminator des Cathepsin D-Inhibitorgens der Kartoffel oder der Terminator des Speicherproteingens VfLE1B3 der Ackerbohne. Diese Terminatoren sind den im Stand der Technik beschriebenen viralen oder T-DNA-Terminatoren zumindest gleichwertig.
Die isolierte Nucleinsäure oder die transgenen Expressionskassetten der Erfindung und Vektoren, die diese umfassen, können noch weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und bezeichnet all jene Elemente, die sich auf die Erzeugung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten gemäß der Erfindung oder auf davon abgeleitete transgene Expressionsvektoren oder Organismen auswirken. Beispielhaft, aber nicht einschränkend sei auf folgendes Bezug genommen:
1. Selektionsmarker
Der Begriff ”Selektionsmarker” umfasst nicht nur positive Selektionsmarker, die Resistenz gegen ein Antibiotikum, Herbizid oder ein anderes Biozid verleihen, sondern auch negative Selektionsmarker, die zu einer Sensibilität für eben die oben genannten führen, sowie auch Marker, die dem transformierten Organismus einen Wachstumsvorteil verschaffen (z. B. durch Expression von Schlüsselgenen der Cytokinin-Biosynthese; Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 94: 2117–2121). Bei der positiven Selektion gedeihen nur diejenigen Organismen, die den fraglichen Selektionsmarker exprimieren, während im Falle einer negativen Selektion genau diese Organismen absterben. Bei der Erzeugung transgener Pflanzen ist die Verwendung eines positiven Selektionsmarkers bevorzugt. Weiterhin bevorzugt ist die Verwendung von Selektionsmarkern, die zu Wachstumsvorteilen führen. Negative Selektionsmarker können vorteilhaft verwendet werden, wenn die gestellte Aufgabe darin besteht, bestimmte Gene oder Genomabschnitte aus einem Organismus zu eliminieren (z. B. für die Zwecke eines Hybridisierungsvorgangs).

i) Positive Selektionsmarker: Der mit der transgenen Expressionskassette eingeführte selektierbare Marker verleiht erfolgreich transformierten Zellen Resistenz gegen ein Biozid, beispielsweise gegen ein Herbizid (wie etwa Phosphinothricin, Glyphosat oder Bromoxynil), einen Stoffwechselhemmer (z. B. 2-Desoxyglucose-6-phosphat; WO 98/45456 ) oder ein Antibiotikum (wie z. B. Tetracycline, Ampicillin, Kanamycin, G 418, Neomycin, Bleomycin oder Hygromycin). Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen aus untransformierten Zellen (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81–84). Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche, die Resistenz gegen Herbizide verleihen.
ii) Negative Selektionsmarker: Negative Selektionsmarker ermöglichen beispielsweise die Selektion von Organismen mit erfolgreich deletierten Sequenzen, die das Markergen umfassen (Koprek T et al. (1999) The Plant Journal 19 (6): 719–726). Bei der Durchführung einer negativen Selektion wird zum Beispiel eine Verbindung, die sonst keine nachteilige Wirkung auf die Pflanze hat, in eine Verbindung umgewandelt, die nachteilig ist, beispielsweise aufgrund des in die Pflanze eingebrachten negativen Selektionsmarkers. Ebenfalls geeignet sind Gene, die per se eine nachteilige Wirkung aufweisen.

2) Reportergene
Reportergene codieren für leicht quantifizierbare Proteine, die über ihre Farbe oder Enzymaktivität eine Abschätzung der Transformationseffizienz, des Orts oder des Zeitpunkts der Expression ermöglichen (siehe auch Schenbron E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (1): 29–44). Als Beispiele seien die folgenden genannt: "grün fluoreszierendes Protein" (GFP) (Chui WL et al. (1996), Curr Biol 6: 325–330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques 23 (5): 912–8; Sheen et al. (1995) Plant J 8 (5): 777–784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94 (6): 2122–2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93 (12): 5888–5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267–271; WO 97/41228 ). Chloramphenicoltransferase (Fromm et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82: 5824–5828), Luciferase (Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10: 324–414; Ow et al. (1986) Science 234: 856–859); ermöglicht den Nachweis über Biolumineszenz. β-Galactosidase, codiert für ein Enzym, für das verschiedene chromogene Substrate befestigbar sind. β-Glucuronidase (GUS) (Jefferson et al. (1987) EMBO J. 6: 3901–3907) oder das uidA-Gen, das für ein Enzym für eine ganze Reihe von chromogenen Substraten codiert. R-Locus-Genprodukt: Protein, das die Produktion von Anthocyanin-Pigmenten (rote Färbung) in pflanzlichem Gewebe reguliert und somit die direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zusatz weiterer Hilfsstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht (Dellaporta et al. (1988) in: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18. Stadler Genetics Symposium, 11: 263–282). Tyrosinase (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129: 2703–2714), ein Enzym, das Tyrosin zu DOPA und Dopachinon oxidiert, die anschließend Melanin bilden, das leicht nachweisbar ist. Aequorin (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3): 1259–1268), kann beim calciumsensitiven Biolumineszenz-Nachweis verwendet werden.
3) Replikationsursprünge
Replikationsursprünge gewährleisten die Vermehrung der transgenen Expressionskassetten oder transgenen Expressionsvektoren der Erfindung beispielsweise in E. coli oder Agrobakterien. Als Beispiele seien die folgenden genannt: OR1 (Ursprung der DNA-Replikation), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Beispiele für in Agrobakterium funktionsfähige Replikationsursprünge sind pRK2, PRI, PVS1 oder PSA.
4) Randsequenzen
”Border-Sequenzen” (wie beispielsweise der rechte oder linke Rand der T-DNA) ermöglichen Agrobakterien-vermittelten Transfer in Pflanzenzellen für den Transfer und die Integration in das pflanzliche Genom.
5) Multiple Klonierungsstellen (Multiple Cloning Sites, MCS) ermöglichen und erleichtern die Insertion einer oder mehrerer Nucleinsäuresequenzen.
Die Erfindung betrifft auch Vektoren, die die oben beschriebene erfindungsgemäße isolierte Nucleinsäure oder die erfindungsgemäße Expressionskassette umfassen. Vektoren bezeichnen in der Regel Strukturen, die zur Replikation befähigt und vorzugsweise wirtsspezifisch sind und die Aufnahme von Nucleinsäuresequenzen und deren Transfer in andere Zellen ermöglichen. Mögliche Beispiele für Vektoren sind Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobakterien. Vektoren, die sich besonders für die Zwecke der Pflanzenbiotechnologie eignen, sind nachstehend exemplarisch beschrieben. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung umfassen transgene Expressionsvektoren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene, mit wenigstens einer erfindungsgemäßen isolierten Nucleinsäure oder wenigstens einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transient oder stabil transformierte oder transfizierte Organismen oder die Nachkommen solcher transgenen Organismen. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile, wie zum Beispiel im Falle von pflanzlichen Organismen die Blätter, Wurzeln und dergleichen, oder das von solchen Organismen stammende Vermehrungsgut, z. B. die Samen von erfindungsgemäßen transgenen Organismen. Es versteht sich, dass für die Zwecke der vorliegenden Erfindung der Begriff des transgenen Organismus nicht nur solche Organismen umfasst, bei denen die erfindungsgemäße Nucleinsäure transient oder stabil eingeführt wurde, sondern auch – unabhängig vom Abstand der Generationen – die Nachkommen solcher Organismen, z. B. Nachkommen der ersten Generation sowie Nachkommen der x-ten Generation, vorausgesetzt, dass diese Organismen noch immer die erfindungsgemäße Nucleinsäure umfassen.
Vorzugsweise ist der transgene Organismus eine Pflanze oder ein Mikroorganismus, in besonders bevorzugter Weise ist der transgene Organismus eine Pflanze, die ausgewählt ist aus der Familie der Brassicaceae, ganz besonders bevorzugt aus den Gattungen Brassica oder Arabidopsis.
Unter Organismen, Ausgangsorganismen oder Wirtsorganismen sind prokaryontische oder eukaryontische Organismen zu verstehen, wie beispielsweise Mikroorganismen oder pflanzliche Organismen. Bevorzugte Mikroorganismen sind Bakterien, Hefen, Algen oder Pilze.
Bevorzugte Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobactrium, Alcaligenes oder Cyanobakterien, beispielsweise der Gattung Synechocystis.
Besonders bevorzugt sind Mikroorganismen, die Pflanzen infizieren und damit die Nucleinsäure, die Expressionskassette und/oder den Vektor der Erfindung übertragen können. Bevorzugte Mikroorganismus sind solche aus der Gattung Agrobacterium und insbesondere die Art Agrobacterium tumefaciens.
Bei den Wirts- oder Ausgangsorganismen, die als transgene Organismen bevorzugt sind, handelt es sich vor allem um pflanzliche Organismen. Pflanzliche Organismen bezeichnet im Allgemeinen all diejenigen Organismen, die zur Photosynthese fähig sind. Pflanzliche Organismen, die in den Umfang der Erfindung fallen, sind alle Gattungen und Arten der höheren und niederen Pflanzen des Pflanzenreiches. Ebenfalls eingeschlossen sind die reifen Pflanzen, die Samen, Knollen, Rüben/speichernde Pfahlwurzeln, Früchte, Sprossen und Keimlinge sowie Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, beispielsweise davon abgeleitete Zellkulturen. Reife Pflanzen sind Pflanzen eines beliebigen Entwicklungsstadiums nach dem des Keimlings. Ein Keimling ist eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium. Bevorzugte Wirtsorganismen zur Herstellung transgener Pflanzen sind einjährige, mehrjährige, monokotyle und dikotyle Pflanzen. Bevorzugt sind Pflanzen der Pflanzenfamilie Brassicaceae, insbesondere Pflanzen der Gattungen Brassica und Arabidopsis.
Die Herstellung eines transformierten Organismus oder einer transformierten Zelle erfordert das Einbringen der entsprechenden DNA in die entsprechende Wirtszelle. Für diesen als Transformation bezeichneten Vorgang ist eine Vielzahl von Verfahren verfügbar (siehe auch Keown et al. 1990, Methods in Enzymology 185: 527–537). So kann die DNA beispielsweise direkt durch Mikroinjektion oder durch Beschuss mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Die Zelle kann auch chemisch permeabilisiert werden, zum Beispiel unter Verwendung von Polyethylenglycol, so dass die DNA in die Zelle eindiffundieren kann. Die DNA kann auch mittels Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie etwa Minizellen, Zellen, Lysosomen oder Liposomen realisiert werden. Eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA ist die Elektroporation, wobei die Zellen durch einen elektrischen Impuls reversibel permeabilisiert werden.
Im Falle von Pflanzen werden die zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Verfahren zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Verfahren sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglycol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Gen-Kanone, die ”Partikelbeschuss”-Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltige Losung und Mikroinjektion.
Abgesehen von diesen ”direkten” Transformationstechniken kann die Transformation auch durch bakterielle Infektion mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Diese Stämme enthalten ein Plasmid (Ti- oder Ri-Plasmid), von dem ein Teil (als T-DNA geläufig) nach der Infektion mit Agrobacterium auf die Pflanze übertragen und in das Genom der Pflanzenzelle integriert wird. Die durch Agrobacterium vermittelte Transformation ist am besten für Zellen dikotyler Pflanzen geeignet, während sich die direkten Transformationstechniken für jeden Zelltyp eignen.
Eine erfindungsgemäße transgene Expressionskassette kann vorteilhaft in Zellen eingebracht werden, vorzugsweise in Pflanzenzellen, wobei Vektoren und vorzugsweise erfindungsgemäße Vektoren verwendet werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Expressionskassette mit Hilfe von Plasmidvektoren eingeführt. Bevorzugt sind solche transgenen Expressionsvektoren, die stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen. In diesem Zusammenhang bezeichnet Wirtsgenom die gesamte Erbinformation des Wirts und umfasst zum Beispiel nicht nur die chromosomale DNA des Zellkerns, sondern auch die DNA der Plastiden und Mitochondrien. Bevorzugt ist jedoch die Insertion in die chromosomale DNA des Zellkerns.
Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Es können einfache Plasmide wie etwa die der pUC-Reihe verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, muss ein zusätzliches Selektionsmarkergen auf dem Plasmid vorhanden sein.
Es sind Transformationstechniken für verschiedene monokotyle und dikotyle pflanzliche Organismen beschrieben. Darüber hinaus sind verschiedene mögliche Plasmidvektoren, die in der Regel einen Replikationsursprung zur Vermehrung in E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterien enthalten, für die Einführung fremder Gene in Pflanzen verfügbar. Beispiele sind pBR322, die pUC-Reihe, M13 mp-Reihe, pACYC184 etc..
Die Expressionskassette kann über eine geeignete Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das resultierende Plasmid wird zunächst in E. coli eingeführt. Fehlerfrei transformierte E. coli-Zellen werden selektiert, kultiviert, und das rekombinante Plasmid wird mit Hilfe von Methoden erhalten, die dem Fachmann vertraut sind. Zur Überprüfung des Klonierungsschritts kann Restriktionsanalyse und Sequenzierung herangezogen werden.
Transformierte Zellen, d. h., solche, die die eingeführte DNA in die DNA der Wirtszelle integriert enthalten, können aus untransformierten Zellen selektiert werden, sofern ein Selektionsmarker Teil der eingebrachten DNA ist. Ein Marker kann beispielsweise ein beliebiges Gen sein, das in der Lage ist, Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide zu verleihen. Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, können in Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizids überleben, bei denen ein untransformierter Wildtyp abgetötet wird. Beispiele sind das bar-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Phosphinothricin verleiht (Rathore KS et al., Plant Mol Biol. 1993 März, 21(5): 871-884), das nptII-Gen, das Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt-Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, und das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht.
Je nach Verfahren der DNA-Einführung können weitere Gene auf dem Vektorplasmid erforderlich sein. Bei Verwendung von Agrobakterien ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen intermediären Vektor (Shuttle-Vektor) oder einen binären Vektor. Soll zum Beispiel ein Ti- oder Ri-Plasmid zur Transformation verwendet werden, so ist zumindest der rechte Rand, in den meisten Fällen jedoch der rechte und der linke Rand der Ti- oder Ri-Plasmid-T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden transgenen Expressionskassette verbunden. Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, der von der rechten und linken T-DNA-Bordersequenz flankiert wird. Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181–187). Das Selektionsmarkergen erlaubt die Selektion transformierter Agrobakterien, und ein Beispiel ist das nptII-Gen, das Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das Agrobacterium, das in diesem Falle als Wirtsorganismus fungiert, sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese Region ist für die Übertragung der T-DNA auf die Pflanzenzelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden.
Die Verwendung von T-DNA zur Transformation von Pflanzenzellen wurde eingehend untersucht und beschrieben (B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von Kung SD und Wu R, Academic Press (1993), S. 128–143; sowie in Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205–225; EP 120516 ; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters BV, Alblasserdam, Kapitel V; Fraley et al., Crit. Reu. Plant. Sci. 4: 1–46; und An et al. (1985) EMBO J. 4: 277–287). Es sind verschiedene binäre Vektoren bekannt und zum Teil im Handel erhältlich wie zum Beispiel pBIN19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res. 12: 8711f; Clontech Laboratories, Inc. USA) oder PSUN-Derivate (SunGene GmbH & Co. KGaA; WO 02100900 ). Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann wie vorstehend und/oder nachstehend beschrieben in diese binären Vektoren inseriert und in das pflanzliche Genom integriert werden.
Die DNA wird durch Cokultivieren von Pflanzen-Explantaten mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes in die Pflanzenzelle übertragen. Ausgehend von infiziertem Pflanzenmaterial (z. B. Blatt-, Wurzel- oder Stielteile, aber auch Protoplasten oder Pflanzenzellensuspensionen) können ganze Pflanzen unter Verwendung eines geeigneten Mediums regeneriert werden, das zum Beispiel Antibiotika oder Biozide zur Selektion der transformierten Zellen enthalten kann. Die erhaltenen Pflanzen können dann auf das Vorhandensein der eingeführten DNA durchmustert werden, in diesem Fall auf die erfindungsgemäße transgene Expressionskassette. Sobald die DNA in das Genom des Wirts integriert ist, ist der entsprechende Genotyp in der Regel stabil, und die entsprechende Insertion wird auch in den nachfolgenden Generationen wieder angetroffen. Normalerweise enthält die integrierte Expressionskassette einen Selektionsmarker, der der transformierten Pflanze Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie etwa 2-DOG oder ein Antibiotikum wie z. B. Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinothricin etc. verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen aus untransformierten Zellen (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81–84). Die erhaltenen Pflanzen können in der üblichen Weise kultiviert und gekreuzt werden. Es sollten zwei oder mehr Generationen kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt ist, kann eine vollständige Pflanze unter Anwendung von Methoden erhalten werden, die dem Fachmann bekannt sind. Zu diesem Zweck werden beispielsweise Kalluskulturen als Ausgangspunkt verwendet. Aus diesen noch undifferenzierten Zellhaufen ist es möglich, die Bildung von Sprossen und Wurzeln in bekannter Weise zu induzieren. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und kultiviert werden.
Die Integration der T-DNA kann z. B. auf der Grundlage der Wirksamkeit der Expression der transgen zu exprimierenden Nucleinsäuren oder des Selektionsmarkers beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermehrung unter Anwendung eines der oben beschriebenen Selektionsverfahren bestimmt werden.
Die Erfindung betrifft ferner Zellen, Zellkulturen, Teile wie beispielsweise Wurzeln, Blätter, etc. im Falle von transgenen pflanzlichen Organismen und transgenes Vermehrungsgut wie etwa Samen, Knollen, Rüben/speichernde Pfahlwurzeln oder Früchte, die von den oben beschriebenen transgenen Organismen abgeleitet sind und/oder eine erfindungsgemäße isolierte Nucleinsäure, eine erfindungsgemäße transgene Expressionskassette oder einen erfindungsgemäßen Vektor umfassen.
Es können auch für den Verzehr durch Mensch und Tier geeignete genetisch veränderte Pflanzen der Erfindung verwendet werden, beispielsweise direkt oder nach der Herstellung als an sich bekannte Nahrungs- oder Futtermittel.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der oben beschriebenen erfindungsgemäßen transgenen Organismen und der Zellen, Zellkulturen, Teile wie z. B. Wurzeln, Blätter, etc. im Falle von transgenen pflanzlichen Organismen und davon abgeleitetes transgenes Vermehrungsgut wie etwa Samen, Knollen, Rüben/speichernde Pfahlwurzeln oder Früchte zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen isolierten Nucleinsäure, einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder eines erfindungsgemäßen Vektors zur Herstellung einer transgenen Pflanze.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, umfassend die Schritte:

a) Einführung einer erfindungsgemäßen isolierten Nucleinsäure, einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder eines erfindungsgemäßen Vektors in eine oder mehrere pflanzliche Zellen;
b) Selektion von transgenen Zellen, die die isolierte Nucleinsäure, die Expressionskassette oder den Vektor der Erfindung stabil in das Genom integriert umfassen; und
c) Regeneration ganzer Pflanzen aus den transgenen Zellen.

Informationen darüber, wie diese Schritte durchgeführt werden können, sind vorstehend im Einzelnen angegeben.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung des Pflanzensprosswachstums, umfassend:

i) Einführung einer erfindungsgemäßen isolierten Nucleinsäure in eine Pflanze; und
ii) Expression der eingeführten erfindungsgemäßen Nucleinsäure.

Im Folgenden soll die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen eingehender beschrieben werden.
Figuren:
1 zeigt das vegetative Wachstum von rock2-, rock3- und ore12-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp: (A.) Photographie von Sämlingen 19 DAG (Tage nach der Keimung). Die Pflanzen wurden unter Bedingungen langer Tage gezogen. (B.) Vergleich von Blättern der in (A.) gezeigten Pflanzen ohne ore12. (C.) Vergleich des Frischgewichts 18 DAG. n = 10; *, • = p < 0,01; **, •• = p < 0,005; ***, ••• = p < 0,0001. * = im Vergleich zu WT; • = im Vergleich zu ore12.
2 zeigt die natürliche Seneszenz von Blatt 6 der Pflanzen mit der rock- und ore12-Mutation unter Bedingungen langer Tage: (A.) Verringerung der Photosyntheseleistung des Photosystems II von 16 bis 37 DAE (Tage nach dem Auflaufen). (B.) Verringerung des Chlorophyll-Gehalts von 16 bis 35 DAE. (C.) Vergleich von Blättern der in (A.) und (B). gezeigten Pflanzen. n = 10; • = p < 0,01; •• = p < 0,005 im Vergleich zu ore12.
3 zeigt die Sprossparameter von Pflanzen mit den rock2-, rock3- und ore12-Mutationen und transgenen Linien, die pAHK2:rock2 oder pAHK3:rock3 exprimieren. (A.) Die Wuchshöhe bei rock2-Mutanten und den transgenen Pflanzen mit der rock2- und rock3-Mutation nimmt zu. (B.) Die rock2-Mutanten und die transgenen rock2- und rock3-Linien bilden mehr Schoten am Haupttrieb. n = 10; *, • = p < 0,01; ***, ••• = p < 0,0001; * = im Vergleich zum WT; • = im Vergleich zu ore12.
4 zeigt die Sprossparameter von Pflanzen mit den rock2-, rock3- und ore12-Mutationen und transgenen Linien, die pAHK2:rock2 oder pAHK3:rock3 exprimieren. (A., B.) Die rock2- und rock3-Mutanten und die transgenen rock2- und rock3-Linien bilden (A.) dickere Stiele und (B.) größere Blüten. n = 10; ***, ••• = p < 0,0001; * im Vergleich zum WT; • = im Vergleich zu ore12.
5 zeigt den Samenertrag von zwei unabhängigen transgenen pAHK3:rock3-Linien im Vergleich zum Wildtyp. Die transgenen Linien haben einen bis zu 47% höheren Samenertrag als die Wildtyp-Pflanzen. n = 10. ** = p < 0,005; *** = p < 0,0001 im Vergleich zum WT.
Beispiele:
Material und Methoden
Die rock2- und rock3-Allele wurden anhand ihrer Fähigkeit zur Suppression der phänotypischen Auswirkungen des durch Überexpression eines für Cytokininoxidase/Cytokinindehydrogenase codierenden CKX-Gens hervorgerufenen Cytokinin-Mangels identifiziert und isoliert.
Pflanzenmaterial und Wachstumsbedingungen
Als Wildtyp wurde der Columbia(Col-0)-Ökotyp von Arabidopsis thaliana verwendet. Die Pflanzen wurden im Gewächshaus auf Erde oder unter sterilen Bedingungen in ATS-Medium enthaltenden Petrischalen gezogen (Estelle, M. A. und Somerville, C. (1986), Auxin-resistant mutants of Arabidopsis thaliana with an altered morphology. Mol. Gen. Genet. 206, 200–206). Alle Pflanzen wurden bei 22°C unter Bedingungen langer Tage gezogen (16 h Licht/8 h Dunkelheit).
Mutagenese
Etwa 25.000 35S:CKX1-Samen (Werner, T., Motyka, V., Laucou, V., Smets, R., Van Onckelen, H. und Schmülling, T. (2003), Cytokinin-deficient transgenic Arabidopsis plants show multiple developmental alterations indicating opposite functions of cytokinins in the regulation of shoot and root meristem activity. Plant Cell 15, 2532–2550) wurden bei Raumtemperatur 16 h lang mit 100 ml 0,2% (v/v) Methansulfonsäureethylester getränkt. Die M1-Generation wurde in Form einzelner Pflanzen gezogen, und die M2-Generation wurde auf Pflanzen mit Wildtypähnlichem Phänotyp durchgesehen.
Genetische Analyse
Kartierungspopulationen für rock2 und rock3 wurden erzeugt durch Kreuzen der rock2-35S:CKX1- und rock3-35S:-CKX1-Pflanzen mit dem Wildtyp-Ökotypus Landsberg erecta. Zur Kartierung von rock2 und rock3 wurden die F2-Pflanzennachkommen verwendet.
Um die Auswirkungen der rock2- und rock3-Mutationen im Wildtyp zu analysieren, wurden die rock- und rock3-Suppressormutanten im 35S:CKX1-Hintergrund auf Wildtyp-Columbia gekreuzt. Die F1-Pflanzennachkommen aus dieser Kreuzung zeigten noch immer den Revertanten-Phänotyp, was darauf hindeutet, dass die rock2- und rock3-Allele dominant sind. Die F2-Generation wurde auf rock2- und rock3-Pflanren im Wildtyp-Hintergrund durchsucht (dann rock2- und rock3-Mutanten genannt).
Erstellung der transgenen Linien
Für den Aufbau des pAHK2:rock2-Transgens wurde eine 2124 bp-Promotorregion von AHK2 mittels PCR aus genomischer DNA von A. thaliana Col-0 amplifiziert und mit der Gateway^TM-Technologie in den pDONR^TM-P4-P1R-Eingangsvektor (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) kloniert. Nach Klonierung der AHK2-Codierungssequenz in den pDONR^TM221-Eingangsvektor (Invitrogen) mittels Gateway^TM-Technologie wurde die rock2-Punktmutation durch PCR-basierte Mutagenese mit dem ”QuickChange Site-Mutagenese”-Kit (Stratagene, La Jolla, USA) eingeführt, um das rock2-Alle) zu erhalten. Beide Fragmente wurden durch rekombinante Multisite-Gateway^TM-Klonierung in den pK7m24GW,3-Vektor (Karimi et al., 2005) kombiniert. Zur Gewinnung des pAHK3:rock3-Konstrukts wurde eine 2062 bp-Promotorregion von AHK3 mittels PCR aus genomischer DNA von A. thaliana Col-0 amplifiziert und das Fragment in den pDONR^TMP4-P1R-Eingangsvektor (Invitrogen) inseriert. Die den offenen Leserahmen des Gens enthaltende AHK3-cDNA wurde mittels PCR aus A. thaliana Col-0 amplifiziert und in den pDONR^TM222-Eingangsvektor (Invitrogen) kloniert. Zur Einführung der rock3-Punktmutation wurde das ”QuickChange Site-Mutagenese”-Kit (Stratagene, La Jolla, USA) verwendet, um das rock3-Alle) zu erhalten. Der AHK3-Promotor und die rock3-cDNA wurden durch rekombinante Multisite-Gateway^TM-Klonierung in den pK7m24GW,3-Vektor kombiniert (Karimi, M., De Meyer, B. und Hilson, P. (2005), Modular cloning in plant cells. Trends Plant Sci. 10, 103–105). Beide Konstrukte wurden in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101 eingeführt und die A. thaliana Col-0-Pflanzen mit der Blütentauchmethode (floral dip) transformiert (Clough, S. J. und Bent, A. F. (1998), Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, 735–743). Die transgenen Linien wurden mit Kanamycin selektiert und zur T3- oder T4-Generation vermehrt.
Morphometrische Messungen
18 Tage nach der Keimung wurden Digitalbilder von den Rosetten aufgenommen, und der Rosettendurchmesser wurde mit dem Scion Image-Programm (Scion Corporation, Frederick, Maryland, USA) gemessen. Die Blüten der Stufe 14 wurden photographiert und ihre Größe wurde ebenfalls mit dem Scion Image-Programm gemessen.
Bestimmung von Frischgewicht, Pflanzenendhöhe und Ertragsparametern
Die Frischgewichte wurden gemessen durch Wiegen der Rosetten, der Sprossen ohne Rosetten oder der gesamten oberirdischen Teile der Pflanzen. Die Endhöhe der Pflanze und die Anzahl der Schoten wurden nach Beendigung der Blüte bestimmt. Zur Analyse des Samenertrags wurden die Pflanzen nach Beendigung der Blüte in Papiertüten verbracht. Das Gesamtsamengewicht wurde bestimmt nach weiteren drei Wochen Trockenhalten der Pflanzen.
Photosyntheseparameter
Die maximale Leistungsfähigkeit der PSII-Photochemie (Fv/Fm-Verhältnis) von dunkel angepassten Pflanzen wurde mit FluorCam (Photon-Systems Instruments, Brno, Tschechische Republik) gemessen. Die Chlorophyllgehalte der einzelnen Blätter wurden mit dem Chlorophyll Meter SPAD-502 (Konika Minolta, Bremen, Deutschland) gemessen, wobei der Mittelwert von zwei Messungen am gleichen Blatt genommen wurde.
Ergebnisse
1. Analyse mutierter Allele im 35S:CKX1-Hintergrund
Um die Auswirkungen der rock3-Mutation mit denen der ore12-Mutation zu vergleichen, wurde die letztere in den 35S:CKX1-Hintergrund (rock3 wurde in diesem Hintergrund identifiziert) introgrediert. Es konnte gezeigt werden, dass die ore12-Mutation die phänotypischen Auswirkungen der CKX1-Überexpression teilweise revertiert. Allerdings ist zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der Entwicklung der Grad der Reversion weniger ausgeprägt als die mit dem rock3-Allel erzielte Reversion. Dieser Unterschied zeigt sich am deutlichsten bei der Größe der Sämlinge und beim Rosettendurchmesser. Diese beiden Parameter sind gute Indikatoren für einen veränderten Cytokininstatus der CKX1ox-Pflanzen.
2. Analyse mutierter Allele im Wildtyp-Hintergrund
Als nächstes wurden die Auswirkungen aller drei mutierten Allele (rock2, rock3 und ore12) im Wildtyp-Hintergrund (Col-0) verglichen. In 1 ist gezeigt, dass nur die rock2- und rock3-Allele das vegetative Wachstum von Wildtyp-Pflanzen merklich verbessern, während das ore12-Allel keine signifikante Verbesserung des Wachstums ergibt. Dieser Effekt wird bereits früh nach der Keimung der Samen sichtbar (1A) und ist auch aus dem Vergleich der Blattgrößen in einem späteren Entwicklungsstadium erkennbar (1 B). Die Effekte der rock2- und rock3-Allele waren nicht nur deutlich stärker im Vergleich zu den Wildtyp-Pflanzen, sondern auch im Vergleich zum ore12-Allel. Sowohl rock2 als auch rock3 bewirkten eine > 75% Zunahme des Frischgewichts 18 Tage nach der Keimung (DAG) im Vergleich zum Wildtyp. Eine Analyse der Zunahme des Frischgewichts von Rosetten und der gesamten Pflanze über den gesamten Lebenszyklus der Pflanzen zeigte, dass die Zunahme der Frischgewichtdifferenz 32–40 DAG besonders deutlich ist und dass der Effekt beim rock2-Allel am stärksten ist.
Es ist bekannt, dass der durch das ore12-Allel bewirkte erhöhte Cytokininstatus die Blattseneszenz verzögert. Es wurde die Blattseneszenz bei Wildtyp-Pflanzen, ore12- mutierten Pflanzen und rock-Mutanten verglichen. 2 zeigt deutlich das verzögerte Einsetzen der Blattseneszenz bei allen mutierten Pflanzen im Vergleich zum Wildtyp. Die Photosyntheseleistung des PS 11 (Fv/Fm) begann in Rosettenblatt 6 bei den Wildtyp-Pflanzen um 17 DAE und bei den mutierten Pflanzen (2A) um 21 bis 23 DAE nachzulassen. Dabei zeigten die rock2-Pflanzen das früheste Einsetzen von Blattseneszenz, gefolgt von ore12 und rock3. Dieser zeitliche Unterschied bei der Seneszenz wurde beibehalten und führte zu einer etwa 10 Tage längeren Lebensdauer der rock3-Blätter im Vergleich zu den Wildtyp-Blättern (2A). Dieses Ergebnis wurde bestätigt durch Messung weiterer Seneszenzparameter, der Abnahme des Chlorophylls (2B) sowie durch Sichtprüfung der Blätter (2C).
3. Analyse der transgenen Expression von rock-Allelen
Im nächsten Schritt wurden die Auswirkungen der transgenen Expression der dominanten rock-Allele analysiert. Zu diesem Zweck transformierten wir Arabidopsis Cal-0-Pflanzen mit Genen, umfassend ca. 2 kb der 5' stromaufwärts gelegenen regulatorischen Regionen von AHK2 bzw. AHK3 und der rock2 bzw. rock3 codierenden Sequenzen. Diese Gene wurden pAHK2:rock2 bzw. pAHK3:rock3 benannt und sind in 3 bis 5 mit pAHK2:rock2 und pAHK3:rock3 bezeichnet. Im Allgemeinen zeigte sich eine weitere Verstärkung der phänotypischen Merkmale, die in den Pflanzen mit der rock-Mutation verändert waren. Die 3 und 4 zeigen, dass die transgenen pAHK2:rock2- und pAHK3:-rock3-Pflanzen im Vergleich zu den Wildtyp- oder ore12-Pflanzen eine signifikante Steigerung der Sprosshöhe (3A), eine signifikant erhöhte Anzahl von Schoten am Haupttrieb (3B), dickere Stiele aufgrund einer erhöhten Anzahl von größeren Zellen in der radialen Ausdehnung (4A) und eine signifikant erhöhte Blütengröße (4B) aufweisen. Wie in 5 verdeutlicht, konnte gezeigt werden, dass die transgenen pAHK3:rock3-Pflanzen deutlich höheren Samenertrag im Vergleich zum Wildtyp aufweisen.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Isolierte Nucleinsäure, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, codierend für: i) eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder ein Ortholog derselben; ii) eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 48%, vorzugsweise wenigstens 50%, besonders bevorzugt wenigstens 55% Identität über die gesamte Sequenzlänge von SEQ ID NO: 1; oder iii) eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 53%, besonders bevorzugt wenigstens 55% Identität über einen Sequenzabschnitt der SEQ ID NO: 1 von 50 Aminosäuren mit SEQ ID NO: 5; wobei die Aminosäuresequenz die Aminosäure Phenylalanin (F) in einer Position aufweist, die der Position 552 von SEQ ID NO: 1 entspricht.
isolierte Nucleinsäure, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, codierend für: i) eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 2 oder ein Ortholog derselben; ii) eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 48%, vorzugsweise wenigstens 50%, besonders bevorzugt wenigstens 55% Identität über die gesamte Sequenzlänge von SEQ ID NO: 2; oder iii) eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 50%, vorzugsweise wenigstens 55%, besonders bevorzugt wenigstens 60% Identität über einen Sequenzabschnitt der SEQ ID NO: 2 von 50 Aminosäuren mit SEQ ID NO: 6; wobei die Aminosäuresequenz die Aminosäure Isoleucin (I) in einer Position aufweist, die der Position 179 von SEQ ID NO: 2 entspricht.
Isolierte Nucleinsäure nach den vorstehenden Ansprüchen, des Weiteren umfassend wenigstens eine Promotorsequenz, wobei die wenigstens eine Promotorsequenz und die codierende Nucleinsäuresequenz funktionell miteinander verknüpft sind.
Transgene Expressionskassette zur Expression von Nucleinsäuren, die eine isolierte Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfassen.
Vektor, enthaltend eine isolierte Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eine transgene Expressionskassette nach Anspruch 4.
Transgener Organismus, der mit einer isolierten Nucleinsäure nach den Ansprüchen 1 bis 3, einer Expressionskassette nach Anspruch 4 oder einem Vektor nach Anspruch 5 transient oder stabil transformiert oder transfiziert ist, oder Nachkommen dieses transgenen Organismus.
Transgener Organismus nach Anspruch 6, wobei der Organismus eine Pflanze oder ein Mikroorganismus ist.
Transgener Organismus nach Anspruch 7, wobei der Organismus eine Pflanze ist, ausgewählt aus der Familie der Brassicaceae, vorzugsweise aus den Gattungen Brassica oder Arabidopsis.
Zelle, Zellkultur, Teil, Organ, Gewebe oder transgenes Vermehrungsgut, umfassend eine isolierte Nucleinsäure nach den Ansprüchen 1 bis 3, eine transgene Expressionskassette nach Anspruch 4 oder einen Vektor nach Anspruch 5.
Verwendung einer isolierten Nucleinsäure nach den Ansprüchen 1 bis 3, einer transgenen Expressionskassette nach Anspruch 4 oder eines Vektors nach Anspruch 5 zur Herstellung einer transgenen Pflanze.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, umfassend die folgenden Schritte: a) Einführung einer isolierten Nucleinsäure nach den Ansprüchen 1 bis 3, einer transgenen Expressionskassette nach Anspruch 4 oder eines Vektors nach Anspruch 5 in eine oder mehrere Pflanzenzellen, um transgene Zellen herzustellen; b) Selektion von transgenen Zellen, die die isolierte Nucleinsäure, die Expressionskassette oder den Vektor stabil in das Genom integriert umfassen; und c) Regeneration ganzer Pflanzen aus den transgenen Zellen oder davon abgeleiteten Zellen.
Isoliertes Polypeptid, das durch eine isolierte Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert wird.
Isoliertes Polypeptid, umfassend wenigstens eine der Aminosäuresequenzen mit der SEQ ID NO: 1 oder 2.
Verfahren zur Verbesserung des Pflanzensprosswachstums, umfassend: i) Einführung einer isolierten Nucleinsäure nach den Ansprüchen 1 bis 3 in eine Pflanze; und ii) Expression der eingeführten Nucleinsäure nach den Ansprüchen 1 bis 3.