ES2462967T3 - Rock2 y Rock3, dos nuevas variantes con ganancia de función de los receptores de citoquinina AHK2 y AHK3 - Google Patents

Abstract

Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante activa constitutivamente del receptor de citoquinina AHK3 con: una secuencia aminoácida con la SEC ID Nº 2 o un ortólogo de la misma; en la que la secuencia aminoácida tiene el aminoácido isoleucina (I) en una posición correspondiente a la posición 179 de la SEC ID Nº 2.

Description

Rock2 y Rock3, dos nuevas variantes con ganancia de función de los receptores de citoquinina AHK2 y AHK3

[0001] A fin de abastecer a una población en continuo crecimiento con alimentos y otros productos derivados de las plantas, las personas siempre han estado interesadas en la mejora de la productividad en la agricultura.

[0002] La productividad de una planta puede ser influenciada de diferentes maneras, por ejemplo, mejorando las características de crecimiento de las plantas o retrasando la senescencia foliar. Hay varios mecanismos y vías conocidas involucradas en el crecimiento y desarrollo de las plantas.

[0003] La citoquinina es una hormona vegetal que desempeña un papel regulador positivo y negativo en muchos aspectos del crecimiento y desarrollo de las plantas. Estimula la formación y la actividad de los meristemas de los brotes, es capaz de establecer tejidos sumideros, retrasa la senescencia foliar, inhibe el crecimiento y la ramificación de la raíz, y desempeña un papel en la germinación de las semillas y en las respuestas al estrés. El análisis de las plantas deficientes de citoquinina ha mostrado que la citoquinina desempeña papeles opuestos en los meristemas de los brotes y en los meristemas de las raíces, y sugiere que la hormona tiene una función esencial en el control cuantitativo del crecimiento orgánico (Mok, D. W. S. & Mok, M. C. (2001) Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Bio. 52, 89 -1 18). Para la planta modelo Arabidopsis thaliana, se ha mostrado que la señal de citoquinina es percibida por tres miembros de la familia de receptores de citoquinina, que son sensores de histidina quinasa (Inoue, T. et al. (2001) Nature 409, 1060 - 3; Suzuki, T.et al. (2001) Plant Cell Physiol. 42, 107 - 13; Yamada, H. et al. (2001) Plant Cell Physiol. 42, 1017 - 23.). Estos tres receptores de citoquinina, AHK2, AHK3 y CRE1/AHK4, muestran un alto grado de identidad, pero cada uno tiene características distintivas.

[0004] Recientemente, se ha revelado una variante con ganancia de función del receptor de citoquinina AHK3 y se le ha denominado ore12 (véase el documento WO 2007 / 108931 A1). Se demostró que la expresión ore12 en la Arabidopsis thaliana produce plantas con senescencia foliar retardada, mientras que la apariencia en general de la planta no mostró diferencias significativas en comparación con las plantas de tipo salvaje. Aunque la expresión de ore12 puede dirigirse a plantas con senescencia foliar retardada y, de ese modo a las plantas con productividad mejorada, la expresión ore12 no tuvo un efecto significativo en otras características de crecimiento de la planta. Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad de mejora de la productividad de la planta.

[0005] Es objeto de la presente invención proporcionar medios y métodos adecuados para producir plantas transgénicas con características de productividad y / o crecimiento mejoradas.

[0006] Esto objetivo se alcanza mediante la presente invención tal y como se describe con detalle a continuación.

[0007] La presente invención proporciona nuevas variantes con ganancia de función de los receptores de citoquinina AHK3, denominados rock3. El polipéptido rock3 con la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2 es una variante constitutivamente activa del receptor de citoquinina AHK3 de la Arabidopsis thaliana y puede ser codificada por un ácido nucleico con la secuencia de la SEC ID Nº 4.

[0008] Sorprendentemente, se descubrió que la expresión transgénica de un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 que se dirige a las plantas transgénicas que exhiben características del crecimiento mejoradas y de la senescencia foliar retardada. El efecto de la expresión transgénica de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 en una planta con senescencia foliar es más pronunciado de lo que se ha observado en la variante conocida con ganancia de función de AHK3, ore12. Aún más sorprendente, es que se descubrió por primera vez que la expresión transgénica de la variante con ganancia de función AHK3 de una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 tuvo un efecto significativo en el crecimiento de brotes, en el número de silicuas por tallo principal, en el grosor del tallo y / o en el tamaño de la flor de la planta transgénica resultante cuando se compara con la de tipo salvaje, mientras que las plantas que expresan ore12 carecen de tal efecto. Por lo tanto, la expresión transgénica de una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 se dirige a las plantas que exhiben una productividad mejorada.

[0009] En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico aislado tal y como se define en las reivindicaciones. El ácido nucleico aislado de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una variante constitutivamente activa del receptor de citoquinina AHK3 con:

i) una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 o un ortólogo de la misma;

en la que la secuencia de aminoácidos tiene el aminoácido isoleucina (I) en una posición

correspondiente a la posición 179 de la SEC ID Nº 2.

[0010] Preferiblemente, se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos, la secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 o un ortólogo de la misma. El término “ortólogo” utilizado en la presente se refiere a una secuencia ácido nucleico o a una secuencia de aminoácidos de una especie, preferiblemente diferente de la Arabidopsis thaliana, que muestra una similitud más elevada, preferiblemente una identidad de secuencia más alta, con la secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos especificadas de la Arabidopsis thaliana ya que ambos genes se originaron a partir de una especie primitiva común. La presente invención proporciona también un polipéptido aislado codificado por un ácido nucleico aislado de la invención, preferiblemente un polipéptido aislado que comprende al menos, la secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2.

[0011] En un segundo aspecto, la invención proporciona un casete de expresión transgénica para la expresión de ácidos nucleicos, en el que el casete de expresión transgénica de la invención comprende un ácido nucleico aislado según la presente invención. El casete de expresión transgénica de la invención puede ser diseñado de tal manera que media la expresión transgénica de la secuencia de ácido nucleico que codifica al menos, la secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 en un tejido de la planta bajo el control de al menos un promotor en un organismo huésped, preferiblemente una célula de planta.

[0012] En un tercer aspecto de la invención, se proporciona un vector que comprende un ácido nucleico aislado según la invención o un casete de expresión transgénica de la invención.

[0013] En un cuarto aspecto, la presente invención se dirige a un organismo transgénico que comprende un ácido nucleico aislado según la invención, un casete de expresión transgénica de la invención o un vector de la presente invención, en el que el organismo es una planta o un microorganismo.

[0014] La presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende:

i) una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 o un ortólogo de la misma; en la que la secuencia de aminoácidos tiene el aminoácido isoleucina (I) en una posición correspondiente a la posición 179 de la SEC ID Nº 2.

[0015] En una realización preferente, el polipéptido aislado de la invención comprende y / o consiste en la secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2.

[0016] La presente invención se refiere también a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos, la secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2.

[0017] Un ácido nucleico “aislado” es aquel que está sustancialmente separado de otras moléculas de ácido nucleico presentes en la fuente natural del ácido nucleico (por ejemplo, secuencias que codifican otros polipéptidos). Preferiblemente, un ácido nucleico “aislado” está libre de algunas de las secuencias que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir; secuencias localizadas en los extremos 5´ y 3´ del ácido nucleico) en su replicón de origen natural. Por ejemplo, un ácido nucleico clonado se considera aislado. En diversas realizaciones, el ácido nucleico aislado de la invención puede contener menos de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, o 0,1 kb de las secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico. Un ácido nucleico se considera también aislado si ha sido alterado por la intervención humana o colocado en un locus o ubicado en una posición que no es su sitio natural, o si ha sido introducido en una célula por ejemplo por agroinfección. Por otra parte, un ácido nucleico “aislado”, como una molécula de ADNc, puede estar libre de algunos materiales celulares con los que se asocia de forma natural, o de medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Están excluidos específicamente de la definición de “ácido nucleico aislado”: los cromosomas producidos de forma natural (como las extensiones cromosómicas), las bibliotecas genómicas, y las preparaciones celulares de ADN genómico completo o ARN celular completo de fuentes de origen natural (incluyendo preparaciones celulares completas que son cortadas mecánicamente o digeridas enzimáticamente). Los ácidos nucleicos y / o polipéptidos de la presente invención pueden proporcionarse en forma aislada, es decir; purificados de su ambiente natural, preferiblemente en forma sustancialmente pura u homogénea o libre o sustancialmente libre de ácidos nucleicos o genes de las especies de origen distintas a la secuencia deseada.

[0018] El ácido nucleico según la presente invención puede incluir ADN, ARN, mezclas y / o sustituyentes funcionales de los mismos, particularmente ADNc, ADN y ARN genómico, y puede ser completo o parcialmente sintético. Los ácidos nucleicos de la invención comprenden secuencias de polinucleótidos monocatenarias o completa o parcialmente bicatenarias. El término “aislado” abarca todas estas posibilidades. Para el propósito de la presente invención, en la que se especifica una secuencia de ADN, por ejemplo con referencia a una SEC ID Nº en particular, a menos que el contexto indique lo contrario, abarca el ARN equivalente, cuando tiene lugar la sustitución de U por T. El ácido nucleico de la invención puede ser producido por cualquier medio, incluyendo preparaciones genómicas, preparaciones de ADNc, síntesis in vitro, PCR, RT -PCR, y / o transcripción in vivo o in vitro.

[0019] El ácido nucleico aislado de la invención puede comprender al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada de:

i) una de las SEC ID Nº 4 o un complemento inverso de la misma;

ii) una secuencia funcionalmente equivalente o un complemento inverso de la misma que tiene al menos un 70 % de homología, preferiblemente al menos un 75 % de homología, más preferiblemente al menos un 80 % de homología con la secuencia en la SEC ID Nº 4 en un segmento de secuencia codificadora de al menos 300 pares de bases, preferiblemente en un segmento de secuencia codificadora de al menos 500 pares de bases, más preferiblemente en una longitud de secuencia codificadora completa, y que codifica al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2; o

iii) secuencias funcionalmente equivalentes o un complemento inverso de la misma que se hibridizan en condiciones estándar con la secuencia del ácido nucleico con la SEC ID Nº 4 o con secuencias de ácido nucleico complementarias de las mismas y que codifican al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2.

[0020] La secuencia de ácido nucleico con la SEC ID Nº 3 codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, mientras que la secuencia de ácido nucleico con la SEC ID Nº 4 codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.

[0021] Para el propósito de la presente invención, el término “secuencia equivalente funcional” se refiere a cualquier secuencia no idéntica con una de las SEC ID Nº 4 o un complemente inverso de la misma, y que codifica al menos la secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2. Los expertos en la disciplina son conscientes de la degeneración del código genético, lo que permite a un número de diferentes secuencias de ácido nucleico codificar la misma secuencia de aminoácidos y no tiene dificultad alguna en determinar si una secuencia de ácido nucleico dada codifica al menos la secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2.

[0022] Los métodos para la preparación de secuencias equivalentes funcionales o fragmentos de la invención comprenden preferiblemente la introducción de mutaciones en la secuencia descrita por la SEC ID Nº 4 o un complemento inverso de la misma. La mutagénesis puede ser aleatoria, en cuyo caso las secuencias mutagenizadas son posteriormente cribadas de sus propiedades por un procedimiento de ensayo y error. Los métodos para la mutagénesis de secuencias de ácidos nucleicos son conocidos por los expertos e incluyen a modo de ejemplo la utilización de oligonucleótidos con una o más mutaciones en comparación con la región a ser mutada (por ejemplo, en una mutagénesis dirigida). Se emplean cebadores con 15 – 75 nucleótidos o más, con preferiblemente 15, 25 o más residuos de nucleótidos localizados a ambos lados de la secuencia que va a ser modificada. Los detalles y el procedimiento para dichos métodos de mutagénesis son familiares para los expertos en la disciplina (Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol 154: 367 - 382; Tomic et al. (1990) Nucl Acids Res 12: 1656; Upender et al. (1995) Biotechniques 18(1): 29 - 30; Pat U. S. Nº 4.237.224). Puede lograrse también una mutagénesis tratando por ejemplo, los vectores de expresión transgénica que comprenden una de las secuencias de ácido nucleico de la invención con agentes mutagénicos como la hidroxilamina.

[0023] La utilización de secuencias equivalentes funcionales puede ser particularmente beneficiosa a fin de cumplir con un uso del codón particular de un organismo seleccionado que puede utilizarse para transcribir el ácido nucleico de la invención y de expresar el polipéptido codificado que comprende o consiste en al menos la secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2.

[0024] El ácido nucleico aislado de la invención puede comprender al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las secuencias equivalentes funcionalmente o un complemento inverso de la misma que tiene al menos un 80 % de homología, preferiblemente al menos un 90 % de homología, más preferiblemente al menos un 95 % de homología con la secuencia de la SEC ID Nº 4 en un segmento de secuencia codificadora de al menos 300 pares de bases, preferiblemente en un segmento de secuencia codificadora de al menos 500 pares de bases, más preferiblemente en una longitud de secuencia codificadora completa, y que codifica al menos una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2.

[0025] La homología o identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos se entiende en el sentido de la identidad de las respectivas secuencias en una longitud de secuencia dada en cada caso, que se calcula comparándose con la ayuda del algoritmo del programa GAP (Wisconsin Package Version 10.0, Universidad de Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA), estableciendo los siguientes parámetros:

Peso de espacios: 12 Peso de longitud: 4 Media de coincidencia: 2,912 Media de malapareamiento: -2,003

[0026] Por ejemplo, una secuencia que tiene al menos un 70 % de homología o identidad con la secuencia de la SEC ID Nº 4 en la base del ácido nucleico se entiende como una secuencia que, en comparación con la SEC ID Nº 4 por el algoritmo del programa anterior con el conjunto de parámetros anteriormente establecidos, tiene al menos un 70 % de homología. La identidad u homología entre dos secuencias de aminoácidos se entiende en el sentido de la identidad de las respectivas secuencias en una longitud de secuencia dada en cada caso, que se calcula comparándose con la ayuda del algoritmo ClusatW_Bioedit (Thompson JD et al. (1994) Nucleic Acids Res 22: 4673 4680) utilizando las configuraciones predeterminadas en el paquete de software Bioedit (disponible en la página web http: //www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Por ejemplo, una secuencia que tiene al menos un 48 % de homología o identidad con la secuencia de la SEC ID Nº 2 en una base de aminoácidos se entiende como una secuencia que, en comparación con la secuencia SEC ID Nº 2 por el algoritmo del programa anterior con el conjunto de parámetros anteriormente establecidos, tiene al menos un 48% de identidad.

[0027] El ácido nucleico aislado de la invención puede comprender al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las secuencias equivalentes funcionalmente o un complemento inverso de la misma que se hibridizan en condiciones estándar con la secuencia de ácido nucleico en la SEC ID Nº 4 o con secuencias de ácido nucleico complementarias de las mismas, y que codifican al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2.

[0028] El término “condiciones estándar de hibridación” se debe tomar en su contexto más amplio y se refiere a ambas condiciones de hibridación severas y / o menos severas. Dichas condiciones de hibridación se describen, inter alia en Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al., in Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, páginas 9.31 - 9.57 o en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6.

[0029] Por ejemplo, las condiciones durante la(s) etapa(s) de lavado pueden seleccionarse a partir de las condiciones limitadas por aquellas de baja severidad (con 2*SSC a 50 ºC) y con una alta severidad (con 0.2*SSC a 50 ºC, preferiblemente a 65 ºC) (20*SSC: citrato sódico 0,3 M, NaCl 3 M, pH 7,0). Además, la temperatura durante la etapa de lavado puede elevarse a partir de condiciones de baja severidad a temperatura ambiente, 22 ºC, a condiciones más severas a 65 ºC. Ambos parámetros, la concentración de sal y la temperatura, pueden modificarse simultáneamente, y además es posible que uno de los dos parámetros se mantenga constante y sólo el otro se modifique. También es posible emplear agentes de desnaturalización como, por ejemplo, formamida o SDS durante la hibridación. La hibridación en presencia de un 50 % de formamida se lleva a cabo a 42 ºC. Se proporcionan a continuación algunos ejemplos de condiciones para las etapas de hibridación y lavado:

(1)

Condiciones de hibridación con, por ejemplo,

a) 4*SSC a 65 ºC, o b) 6*SSC, 0,5 % de SDS, 100 mg / ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado a 65 ºC, o c) 4*SSC, 50% de formamida, a 42 ºC, o d) 2* o 4*SSC a 50 ºC (condición baja de severidad), o e) 2* o 4*SSC, 30 – 40 % de formamida a 42 ºC (condición baja de severidad), o f) 6*SSC a 45 ºC, o, g) de tampón de fosfato sódico 0,05 M pH 7,0, 2 mM de EDTA, 1% de BSA y 7 % de SDS.

(2)

Etapas de lavado con, por ejemplo

a) 0,1*SSC a 65 ºC, o b) 0,1*SSC, 0,5 % de SDS a 68 ºC, o c) 0,1*SSC, 0,5 % de SDS, 50 % de formamida a 42 ºC, o d) 0,2*SSC, 0,1 % de SDS a 42 ºC, o e) 2*SSC a 65 ºC. (condición de baja severidad), o f) 40 mM de tampón de fosfato sódico pH 7,0, 1 % de SDS, 2 mM de EDTA.

[0030] El ácido nucleico aislado de la invención puede comprender al menos una secuencia promotora que puede localizarse aguas arriba en la posición 5´ en la secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2.

[0031] Una secuencia promotora es una secuencia de ácido nucleico capaz de facilitar o potenciar la transcripción de un gen particular La referencia aquí a un “promotor” se debe tomar en su contexto más amplio e incluye las secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariota clásico, que incluye la caja TATA requerida para la iniciación de la transcripción precisa, con o sin una secuencia de caja CCAAT y elementos reguladores o de control adicionales (por ejemplo, secuencias de activación aguas arriba, represores, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta a los estímulos y / o desarrollo externos, o en una forma específica del tejido.

[0032] El término “promotor” puede incluir además secuencias reguladoras transcripcionales de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja - 35 y / o secuencias reguladoras transcripcionales de caja

– 10.

[0033] En el presente contexto, el término “promotor” es utilizado también para describir una molécula sintética o de fusión, o derivada que confiera, active o potencie la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. Los promotores pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos, para potenciar adicionalmente la expresión y / o para alterar la expresión espacial y / o la expresión temporal de una molécula de ácido nucleico a la que está unida funcionalmente. Dichos elementos reguladores pueden ser colocados en forma adyacente a una secuencia heteróloga del promotor que dirige la expresión de una molécula de ácido nucleico en respuesta a por ejemplo, cobre, glucocorticoides, dexametasona, tetraciclina, giberelina, cAMP, ácido abscísico, auxina, heridas, etileno, jasmonato o ácido salicílico o para conferir la expresión de una molécula de ácido nucleico a células, tejido u órganos específicos como meristemas, hojas, raíces, embriones, flores, semillas o frutos.

[0034] En el contexto de la presente invención, el promotor es preferiblemente una secuencia promotora expresable en plantas. Los promotores que también funcionan o funcionan únicamente en células no vegetales como las bacterias, células de levadura, células de insecto y células de animales, no se excluyen de la invención. Por “expresable en plantas” se refiere a la secuencia promotora, que incluye cualquier elemento regulador adicional añadido a la misma o contenido en la misma, es al menos capaz de inducir, conferir, activar o potenciar la expresión en una célula, tejido u órgano vegetal, preferiblemente en una célula tejido u órgano de planta monocotiledónea o dicotiledónea. Los términos “operativo en plantas” y “operativo en una planta” cuando se utilizan en la presente, respecto a una secuencia promotora, deberán tomarse como equivalentes a una secuencia promotora expresable en plantas.

[0035] Los promotores regulables como parte de un sistema de expresión vegetal viral binario también son conocidos por los expertos en la disciplina (Yadav 1999 - WO 99/22003; Yadav 2000 - WO 00/17365). En el presente contexto, una “secuencia promotora regulable” es un promotor capaz de conferir expresión de un gen en una célula particular, tejido, órgano o grupo de células, tejido u órganos de una planta, opcionalmente en condiciones específicas, sin embargo generalmente no confiere expresión en la planta en todas las condiciones. Por consiguiente, una secuencia promotora regulable puede ser una secuencia promotora que confiere expresión de un gen al que está ligado funcionalmente en una posición particular en la planta o alternativamente a través de la planta en un conjunto específico de condiciones, como la inducción de una expresión génica por un compuesto químico u otro inductor. Preferiblemente, el promotor regulador utilizado en la realización de la presente invención confiere expresión en una posición específica en la planta, ya sea constitutivamente o tras la inducción, sin embargo, no en toda la planta en cualquier circunstancia. Incluidos en el alcance de dichos promotores están las secuencias promotoras específicas de células, secuencias promotoras específicas de tejidos, secuencias promotoras específicas de órganos, secuencias promotoras génicas específicas del ciclo celular, secuencias promotoras inducibles y secuencias promotoras constitutivas que han sido modificadas para conferir expresión en una parte particular de la planta en un momento determinado, como la integración de dicho promotor constitutivo en un elemento genético transponible (Ac, Ds, Spm, En, u otro transposón). Del mismo modo, el término “específico de tejido” se tendrá en cuenta para indicar que la expresión está predominantemente en un tejido particular o tipo de tejido, preferiblemente de origen vegetal, aunque no necesariamente exclusivamente en dicho tejido o tipo de tejido. Del mismo modo, el término “específico de órgano” se tendrá en cuenta para indicar que la expresión está predominantemente en un órgano particular, preferiblemente de origen vegetal, aunque no necesariamente exclusivamente en dicho órgano. Del mismo modo, el término “específico del ciclo celular” se tendrá en cuenta para indicar que la expresión es predominantemente cíclica y tiene lugar en una o más, no necesariamente en fases consecutivas del ciclo celular aunque no necesariamente exclusivamente en células cíclicas, preferiblemente de origen vegetal. Los expertos en la disciplina serán conscientes de que un “promotor inducible” es un promotor de la actividad transcripcional que se incrementa o induce en respuesta a un estímulo de desarrollo, químico, ambiental o físico. Del mismo modo, los expertos comprenderán que un “promotor constitutivo” es un promotor transcripcionalmente activo durante la mayor parte, aunque no necesariamente en todas las partes de un organismo, preferiblemente una planta, durante la mayor parte, aunque no necesariamente en todas las fases de su crecimiento y desarrollo. Los expertos en la disciplina serán capaces de seleccionar secuencias promotoras apropiadas para su utilización en la regulación de la expresión apropiada de las variantes de proteína del receptor de citoquinina a partir de fuentes disponibles públicamente sin experimentación indebida.

[0036] La colocación de una molécula de ácido nucleico en el control regulador de una secuencia promotora, o en una conexión o ligamiento funcional con una secuencia promotora, se refiere a colocar dicha molécula de ácido nucleico de manera que la expresión está en parte controlada por la secuencia promotora. Un promotor está generalmente, aunque no necesariamente, situado aguas arriba, o en el extremo 5´ y en 2 Kb del sitio de iniciación de la transcripción de una molécula de ácido nucleico que se regula, aunque los potenciadores y silenciadores que están comprendidos también por el término “promotor” pueden situarse más lejos del sitio de iniciación de la transcripción. Se cree que estos elementos se unen a proteínas capaces de una acción de largo alcance debido a un lazo de la secuencia de intervención. En la construcción de combinaciones promotoras / génicas estructurales heterólogas, se prefiere generalmente situar el promotor a una distancia del sitio de iniciación de la transcripción génica que es aproximadamente la misma que la distancia entre ese promotor y el gen que lo controla en su ajuste natural (es decir; el gen del que se deriva el promotor). Como se conoce ya en la disciplina, pueden ajustarse algunas modificaciones en esta distancia sin pérdida de la función del promotor. Del mismo modo, la posición preferida de un elemento de la secuencia reguladora con respecto al gen heterólogo que se sitúa bajo su control es definido por la posición del elemento en su ajuste natural (es decir; el gen del que se deriva el promotor). De nuevo, como se conoce en la disciplina, pueden también producirse algunas modificaciones en esta distancia.

[0037] Según la presente invención, cualquier secuencia promotora puede utilizarse para producir un ácido nucleico aislado de la invención. Preferiblemente, la secuencia promotora se sitúa aguas arriba de la secuencia de ácido nucleico codificada al menos por un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 1. Preferiblemente se utilizan secuencias promotoras que están activas en al menos un tejido o un tipo celular de una planta y / o que están activas en un microorganismo. Para tal finalidad, al menos una secuencia promotora y una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2; están funcionalmente unidas entre sí.

[0038] La presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado de la invención, además comprende al menos una secuencia promotora, en la que al menos una secuencia promotora y una secuencia de ácido nucleico codifica al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2, están funcionalmente unidas entre sí.

[0039] La presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado de la invención, además comprende al menos una secuencia promotora, en la que al menos una secuencia promotora codifica al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2, está localizada en la posición 3´ en al menos un promotor y en la que al menos una secuencia promotora y una secuencia de ácido nucleico están funcionalmente unidas entre sí.

[0040] Tal y como se utiliza en la presente, “ligamiento funcional” se refiere, por ejemplo, a la disposición secuencial de al menos un promotor de la secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2, y, si es conveniente, de los elementos reguladores como por ejemplo, un terminador, de manera que cada uno de los elementos reguladores son capaces de cumplir con su función esperada en la expresión transgénica de una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2. Esto no requiere necesariamente un ligamiento directo en un sentido químico. Las secuencias de control genético, como por ejemplo, las secuencias potenciadoras, pueden asimismo ejercer su función en la secuencia diana en posiciones que están más alejadas, o de hecho a partir de otras moléculas de ADN. Preferiblemente en un ácido nucleico aislado de la invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 está posicionada aguas abajo de la secuencia que actúa al menos como una secuencia promotora de manera que ambas secuencias se acoplan covalentemente entre sí. Preferiblemente, la distancia entre al menos una secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 es menor a 200 pares de bases, especialmente preferiblemente menor a 100 pares de bases, muy especialmente preferiblemente menor a 50 pares de bases. Al menos una secuencia promotora y el ácido nucleico que codifica al menos un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2, puede seleccionarse y unirse funcionalmente de manera que permita la expresión transgénica de un polipéptido aislado de la invención, preferiblemente al menos una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 2 en un organismo transgénico.

[0041] “Expresión” se refiere en este contexto a la transcripción de una secuencia de ácido nucleico que se expresa transgénicamente, aunque también puede incluir la traducción del ARN transcrito de la secuencia de ácido nucleico que se expresa transgénicamente en su correspondiente polipéptido.

[0042] “Transgénico” significa - por ejemplo en referencia a un casete de expresión transgénica, un vector de expresión transgénica, un organismo transgénico o un método para la expresión transgénica de ácidos nucleicos - todos aquellos constructos que son el resultado de métodos transgénicos, o todos los métodos que se utilizan, en los que un ácido nucleico aislado de la invención no se encuentran en su ambiente genético natural o se han modificado por métodos transgénicos, en el que la modificación, a modo de ejemplo, puede ser una sustitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótidos. Preferiblemente, al menos una secuencia promotora del ácido nucleico aislado según la invención es heteróloga con respecto a la secuencia de ácido nucleico a la que está funcionalmente ligada y que se expresa transgénicamente. En este contexto, “heteróloga” se refiere a la secuencia de ácido nucleico que no comprende la secuencia codificadora que está de forma natural bajo el control de dicho promotor.

[0043] “Ambiente genético natural” se refiere al locus cromosómico natural en el organismo de origen o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácido nucleico se retiene preferiblemente al menos en parte. El ambiente limita la secuencia de ácido nucleico al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, preferiblemente al menos 500 pb, de forma particularmente preferida al menos 1000 pb, muy de la forma más particularmente preferida al menos 5000 pb. Un constructo de expresión producido de forma natural se convierte en un constructo de expresión transgénica cuando esta combinación se modifica por métodos no naturales, sintéticos (“artificiales”) como por ejemplo, una

mutagénesis in vitro. Dichos métodos se han descrito en (Pat U. S. Nº 5.565.350; en el documento WO 00 / 15815; véase anteriormente en la presente). [0044] “Transgénico” con respecto a una expresión (“expresión transgénica”) se refiere preferiblemente a todas aquellas expresiones que han sido realizadas utilizando un casete de expresión transgénica, un vector de expresión transgénica o un organismo transgénico, tal y como se ha definido anteriormente o como se define a continuación.

[0045] Un ligamiento funcional entre al menos una secuencia promotora y una secuencia de ácido nucleico que va a ser expresada puede producirse por medios de recombinación convencional y técnicas de clonación descritas por ejemplo, en Maniatis T et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., en Silhavy T J et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. y en Ausubel F M et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience. Un método adecuado para tal propósito es, por ejemplo, la tecnología de clonación GATEWAY (TM) (Invitrogen Inc.), basada en la recombinación.

[0046] El ácido nucleico aislado según la invención puede comprender secuencias o elementos de control genético adicionales, además de al menos una secuencia promotora según la invención.

[0047] El concepto de las secuencias o elementos de control genético se debe tomar en su contexto más amplio y se refiere a todas aquellas secuencias que tienen un efecto en el origen o en la función del ácido nucleico aislado o en el casete de la expresión transgénica según la invención. Las secuencias de control genético modifican por ejemplo, la transcripción y / o la traducción en organismos procariotas o eucariotas. Preferiblemente, el ácido nucleico aislado o los casetes de expresión transgénica según la invención comprenden al menos una secuencia promotora 5´aguas arriba de una secuencia de ácido nucleico particular que va a ser expresada transgénicamente y una secuencia de terminación 3´aguas abajo como una secuencia de control genético, y, si es conveniente, elementos reguladores usuales, en cada caso ligados funcionalmente con la secuencia de ácido nucleico que va a expresarse transgénicamente.

[0048] Las secuencias de control genético pueden comprender también promotores, elementos promotores o promotores mínimos capaces de modificar las propiedades de control de la expresión. Esto es posible gracias a los medios de las secuencias de control genético, que por ejemplo se realizan en la expresión específica del tejido que tendrá lugar además en dependencia de determinados factores de estrés.

[0049] Las secuencias de control genético comprenden además la región 5´ no traducida, intrones, la región 3´ no codificada u otras secuencias de genes. Se ha demostrado que las secuencias no traducidas en 5´ son capaces de potenciar la expresión transitoria de los genes heterólogos. Por otra parte, pueden promover la especificidad tisular (Rouster J et al. (1998) Plant J 15: 435 - 440). Por el contrario, la región no traducida en 5´ del gen opaco – 2 suprime la expresión. La deleción de la región en cuestión da lugar a un aumento en la actividad génica. (Lohmer S et al. (1993) Plant Cell 5: 65 - 73).

[0050] El ácido nucleico aislado puede ventajosamente comprender uno o más de lo que se conoce como secuencias potenciadoras en un ligamiento funcional con el promotor, hace que incremente la expresión transgénica de la posible secuencia de ácido nucleico. Secuencias ventajosas adicionales pueden asimismo insertarse en el extremo 3´ de las secuencias de ácido nucleico para expresarse transgénicamente, tales como los elementos o terminadores reguladores. Las secuencias de ácido nucleico pueden expresarse transgénicamente como una o más copias en uno de los casetes de expresión transgénica según la invención.

[0051] Las secuencias de control deben entenderse además en el sentido de aquellas que hacen posible la recombinación homóloga o la inserción en el genoma de un organismo huésped, o que permiten la deleción del genoma. En el caso de la recombinación homóloga, uno de los promotores según la invención puede sustituirse por ejemplo, por el promotor natural o un gen particular. Dichas secuencias se han de entender como secuencias de control genético. Los métodos como la tecnología cre / lox permiten la deleción especificidad del tejido, y en algunas circunstancias inducibles, del casete de expresión transgénica del genoma del organismo huésped (Sauer B (1998) Methods (Duluth) 14(4): 381 - 92). En la presente, algunas secuencias flanqueadoras pueden añadirse al gen diana (secuencias lox), que más tarde hacen posible la deleción por medio de la recombinasa cre.

[0052] Para seleccionar células que han superado con éxito la recombinación homóloga, u otra transformación, es, necesario por regla, introducir además un marcador de selección (véase a continuación). La recombinación homóloga es un hecho relativamente raro en eucariotas superiores, en particular en plantas. Predominan las integraciones aleatorias en el genoma huésped. Es la utilización de un sistema de recombinación específico en la secuencia descrito en la Patente U. S. Nº 6.110.736 una posibilidad de deleción de las secuencias integradas al alzar, y por lo tanto para incrementar la concentración de clones celulares con una recombinación homóloga correcta.

[0053] Las señales de poliadenilación adecuadas como secuencias de control comprenden señales de poliadenilación en las plantas y preferiblemente aquellas que corresponden esencialmente a las señales de poliadenilación de ADN - T de Agrobacterium tumefaciens. En una realización particularmente preferente, el ácido nucleico aislado o el casete de expresión transgénica corresponde a una secuencia de terminación que es funcional en plantas. Las secuencias de terminación que son funcionales en plantas se refieren generalmente a aquellas secuencias capaces de producir, en plantas, la terminación de la transcripción de una secuencia de ADN. Ejemplos de secuencias de terminación adecuadas son el terminador OCS (octopina sintasa) y el terminador NOS (nopalina sintasa). Sin embargo, son especialmente preferentes las secuencias de terminación de las plantas. Las secuencias de terminación de las plantas se refieren generalmente a aquellas secuencias que son parte de un gen de una planta natural. Especialmente preferido en este contexto es el terminador del gen inhibidor catepsina D de patata o el terminador del gen VfLE1B3 de la proteína de almacenamiento de la haba. Estos terminadores son al menos equivalentes a los terminadores de ADN – T descritos en el trabajo anterior.

[0054] El ácido nucleico aislado o los casetes de expresión transgénica según la invención y los vectores que los comprenden, pueden comprender además elementos funcionales. El término elemento funcional debe entenderse en su contexto más amplio y se refiere a todos aquellos elementos que tienen un efecto en la generación, multiplicación

o función de los casetes de expresión transgénica según la invención o en los vectores de expresión transgénica u en los organismos derivados de ellos. Lo siguiente puede mencionarse a modo de ejemplo, aunque de manera no limitante:

1. Marcadores de selección

[0055] El término “marcador de selección” comprende no solamente los marcadores de selección positiva, que confieren resistencia a un antibiótico, herbicida u otro biocida, sino también marcadores de selección negativa, que confieren sensitividad a los anteriormente mencionados, y también marcadores que confieren una ventaja de crecimiento para el organismo transformado (por ejemplo mediante expresión de genes clave de biosíntesis de citoquinina; Ebinuma H et al., (2000) Proc Natl Acad Sci USA 94: 2117 – 2121). En el caso de la selección positiva, solo se desarrollan los organismos que expresan el marcador de selección en cuestión, mientras, precisamente estos organismos, mueren en caso de selección negativa. Es preferible el uso de un marcador de selección positiva en la generación de plantas transgénicas. Además, es preferible el uso de marcadores de selección que confieren ventajas de crecimiento. Pueden emplearse ventajosamente marcadores de selección negativa cuando el trabajo actual consiste en eliminar ciertos genes o segmentos del genoma de un organismo (por ejemplo con el objetivo de un proceso de hibridación).

i) Marcadores de selección positiva: el marcador seleccionable introducido con el casete de expresión transgénica confiere resistencia a un biocida, por ejemplo a un herbicida (como fosfinotricina, glifosfato o bromoxinil), un inhibidor metabólico (como 2 – desoxiglucosa – 6 – fosfato; WO 98 / 45456) o un antibiótico (como, por ejemplo, tetraciclinas, ampicilina, kanamicina, G 418, neomicina, bleomicina o higromicina) a las células transformadas satisfactoriamente. El marcador de selección permite seleccionar las células transformadas a partir de células no transformadas (McCornick et al., (1986) Plant Cell Reports 5:81 – 84). Son especialmente preferibles los marcadores de selección que confieren resistencia a herbicidas. ii) Marcadores de selección negativa: los marcadores de selección negativa hacen posible, por ejemplo, la selección exitosa de organismos con secuencias eliminadas que comprenden el gen marcador (Koprek T et al., (1999) The Plant Journal 19 (6): 719 – 726. Cuando se está llevando a cabo una selección negativa, por ejemplo un compuesto que de otra manera no tiene efecto adverso en la planta se convierte en un compuesto desventajoso, por ejemplo debido al marcador de selección negativa introducido en la planta. Los genes que tienen un efecto adverso per se también están disponibles.

2) Genes indicadores

[0056] Los genes indicadores codifican fácilmente proteínas cuantificables que, mediante su color o la actividad enzimática, permiten una evaluación de la eficacia de transformación, del sitio o el tiempo de la expresión (véase también Schenbron E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (1) : 22 – 44). Los ejemplos que pueden citarse son: “proteína verde fluorescente” (GFP) (Chui W L et al. (1996), Curr Biol 6 : 325 - 330; Leffel S M et al. (1997) Biotechniques 23(5) : 912 - 8; Sheen et al. (1995) Plant J 8(5): 777 - 784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6): 2122 - 2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12): 5888 – 5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228). Cloranfenicol transferasa (Fromm et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:5824-5828), Luciferasa (Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414; Ow et al. (1986) Science 234:856859); permite la detección mediante bioluminiscencia. La ß – Galactosidasa codifica una enzima para que están disponibles numerosos sustratos cromogénicos. La ß – Glucuronidasa (GUS) (Jefferson et al., (1987) EMBO J. 6: 3901 – 3907) o el gen uidA, que codifica una enzima para numerosos sustratos cromogénicos. El producto génico del locus R: proteína que regula la producción de pigmentos de antocianina (coloración roja) en tejido de plantas y, por tanto, hace posible el análisis directo de la actividad promotora sin añadir otras sustancias auxiliares o sustratos cromogénicos (Dellaporta et al. (1988) en: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18º Stadler Genetics Symposium, 11: 263 - 282). Tirosinasa (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129:2703-2714), una enzima que oxidiza la tirosina en DOPA y dopaquinona, que forman, consecuentemente, melanina, que puede detectarse fácilmente. Aequorina (Prasher et al., (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3) : 1259 – 1268), puede emplearse en la detección bioluminiscente sensible al calcio.

3) Orígenes de replicación

[0057] Los orígenes de replicación aseguran la multiplicación de los casetes de expresión transgénica o vectores de expresión transgénica según la invención en, por ejemplo, la agrobacteria E. coli. Se pueden citar algunos ejemplos como OR1 (origen de replicación de ADN), pBR322 ori o P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2º Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Algunos ejemplos de orígenes de replicación prácticos en Agrobacterias son pRK2, pRi, PVS1 o pSA.

4) Secuencias límite

[0058] Las “secuencias límite” (como, por ejemplo, el límite derecho o izquierdo del ADN – T) permiten una transferencia mediada por una agrobacteria en células de plantas para la transferencia e integración en el genoma de la planta.

5) Los sitios de clonación múltiple (SCM) permiten y facilitan la inserción de una o más secuencia de ácido nucleico.

[0059] La invención también se refiere a vectores que comprende los ácidos nucleicos aislados anteriormente descritos de la invención o del casete de expresión transgénica de la invención. Los vectores, normalmente, se refiere a estructuras capaces de replicarse y, preferiblemente, específicas de huéspedes, y que permiten la absorción de secuencias de ácido nucleico y la transferencia a otras células. Algunos ejemplos de vectores pueden ser plásmidos, cósmidos, fagos, virus o agrobacterias. Se describen a continuación los vectores particularmente apropiados para los objetivos de biotecnología en plantas. Los vectores de la presente invención comprenden vectores de expresión transgénicos.

[0060] Otro sujeto de la invención se refiere a organismos transgénicos transformados o transfectados temporal o permanentemente con, al menos, un ácido nucleico aislado de la invención o, al menos, un casete de expresión transgénica según la invención o, al menos, un vector según la invención o un descendiente de dichos organismos transgénicos, en los que el organismo transgénico es una planta o un microorganismo, preferiblemente el organismo transgénico es una planta seleccionada de la familia Brassicaceae, más preferiblemente del género Brassica o Arabidopsis. Además, la presente invención se refiere a células, cultivos celulares, tejidos, partes similares, por ejemplo, en el caso de organismos planta, hojas, raíces y material de propagación similar derivado de dichos organismos, por ejemplo, de semillas de organismos transgénicos de la invención. Cabe señalar que para el objetivo de la presente invención, el término organismo transgénico no solo incluye el organismo en el que se ha introducido temporal o definitivamente el ácido nucleico de la invención, sino también la descendencia de dichos organismos independientemente de la distancia entre generaciones, por ejemplo, descendencia de primera generación, así como descendencia de X generación, siempre que estos organismos todavía comprendan el ácido nucleico de la invención.

[0061] Los organismos, organismos iniciales u organismos huésped se entienden como microorganismo u organismos planta. Los microorganismos preferentes son bacterias, levaduras, algas u hongos.

[0062] Las bacterias preferentes son bacterias del género Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacteirum, Alcaligenes o cyanobacteria, por ejemplo del género Synechocystis.

[0063] Son especialmente preferentes los microorganismos capaces de infectar plantas y, por tanto, transferir el ácido nucleico, el casete de expresión transgénica y / o el vector de la invención. Los microorganismos preferentes son aquellos del género Agrobacterium y, en particular, las especies Agrobacterium tumefaciens.

[0064] Los organismos huésped o iniciales preferidos como organismos transgénicos son, sobre todo, organismos planta. Los organismos planta se refieren, generalmente, a todos aquellos organismos capaces de realizar fotosíntesis. Se incluyen como organismos planta que abarca la invención todos los géneros y especie de plantas superiores o inferiores del reino planta. Las plantas maduras, semillas, tubérculos, raíces carnosas pivotantes, frutos, brotes y plantones, y también partes, material de propagación y cultivos, por ejemplos, también se incluyen los cultivos celulares derivados de los anteriores. Las plantas maduras se refieren a plantas en cualquier fase de desarrollo después de la fase de plantón. Plantón se refiere a una planta joven inmadura en una fase temprana de desarrollo. Son preferibles las plantas anuales, perennes, monocotiledóneas y dicotiledóneas como organismos huésped para preparar plantas transgénicas. Son preferentes las plantas de la siguiente familia de planta: Brassicaceae, en particular las plantas del género Brassica y Arabidopsis.

[0065] La preparación de un organismo transformado o de una célula transformada requiere la introducción del ADN apropiado en la célula huésped apropiada. Están disponibles múltiples métodos para este proceso, denominado transformación (véase también Keown et al., 1990 Methods in Enzymology 185:527 - 537). Por tanto, por ejemplo, puede introducirse el ADN directamente mediante microinyección o bombardeo con micropartículas recubiertas de ADN. La célula puede, también, permeabilizarse químicamente, por ejemplo utilizando polietileno glicol, de manera que el ADN pueda entrar en la célula por difusión. El ADN también puede llevarse a cabo mediante fusión de protoplastos con otras unidades con ADN como minicélulas, células, lisosomas o liposomas. Otro método apropiado para introducir ADN es la electroporación en la que las células se permeabilizan reversiblemente mediante un impulso eléctrico.

[0066] En el caso de las plantas, los métodos descritos para transformar y regenerar plantas a partir de tejidos o células de plantas se utilizan para la transformación temporal o definitiva. Los métodos apropiados son, especialmente, la transformación de protoplastos mediante absorción de ADN inducido por polietileno glicol, el método biolístico utilizando la pistola de genes, el método del “bombardeo de genes”, la electroporación, la incubación de embriones secos en una solución con ADN y la microinyección.

[0067] Además de estas técnicas de transformación “directa”, también puede llevarse a cabo una transformación por una infección bacteriana mediante Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. Estas cepas contienen un plásmido (plásmido Ti o Ri), una parte (conocida como ADN – T) se transfiere a la planta tras la infección con Agrobacterium y se integra en el genoma de la célula de planta. La transformación mediada por Agrobacterium es la más apropiada para las células de plantas dicotiledóneas, en las que las técnicas de transformación directa son aptas para cualquier tipo de célula.

[0068] Un casete de expresión transgénica de la invención puede introducirse ventajosamente en las células, preferiblemente en células de plantas, mediante vectores, preferiblemente vectores de la invención.

[0069] En una realización ventajosa, el casete de expresión transgénica se introduce mediante vectores plásmidos. Son preferentes estos vectores de expresión transgénica que permiten una integración estable de un casete en el genoma huésped. En este conecto, el genoma huésped se refiere a la información hereditaria completa del huésped y comprende, por ejemplo, no solo el ADN cromosómico del núcleo, sino también el ADN de los plástidos y la mitocondria. Sin embargo, es preferible la inserción en el ADN cromosómico del núcleo.

[0070] En el caso de inyección o electroporación de ADN en las células de plantas, no se exigen requisitos particulares del plásmido empleado. Es posible utilizar plásmidos simples como los de las series pUC. Si tienen que regenerarse las plantas completas a partir de células transformadas, es necesario que esté presente en el plásmido un gen marcador de selección adicional.

[0071] Se han descritos técnicas de transformación para varias organismos planta monocotiledóneos y dicotiledóneos. Además, para introducir genes extraños en plantas, están disponibles varios posibles vectores plásmidos que contienen normalmente un origen de replicación para la propagación en E. coli y un gen marcador para la selección de bacterias transformadas. Algunos ejemplos son pBR322, las series pUC, las series M13 mp, pACYC184, etc.

[0072] El casete de expresión transgénica puede introducirse en el vector mediante un sitio de clivaje de restricción apropiado. El plásmido resultante, en primer lugar, se introduce en E. coli. Se seleccionan las células de E. coli correctamente transformadas, se cultivan y se obtiene el plásmido recombinante utilizando métodos familiares para los expertos en la disciplina. Pueden emplearse el análisis de restricción y la secuenciación para verificar la fase de clonación.

[0073] Las células transformadas, es decir, aquellas que contienen el ADN introducido integrado en el ADN de la célula huésped pueden seleccionarse a partir de células no transformadas, si un marcador seleccionable forma parte del ADN introducido. Un marcador puede ser, por ejemplo, cualquier gen capaz de conferir una resistencia a antibióticos o herbicidas. Las células transformadas que expresan dicho gen marcador son capaces de sobrevivir en presencia de concentración de un antibiótico o herbicida apropiado, que mata a un tipo salvaje no transformado. Algunos ejemplos son el gen bar que confiere resistencia contra el herbicida fosfinotricina (Rathore K S et al., Plant Mol Biol. Marzo 1993; 21 (5) : 871 – 884), el gen nptII que confiere resistencia contra kanamicina, el gen hpt que confiere resistencia contra higromicina y el gen EPSP que confiere resistencia contra el herbicida glifosato.

[0074] Dependiendo del método de introducción de ADN, puede necesitarse otros genes en el plásmido vector. Si se emplea una agrobacteria, el casete de expresión transgénica tiene que integrarse en plásmidos específicos, ya sea en un vector intermediario (vector transportador) o un vector binario. Si, por ejemplo, se utiliza un plásmido Ti o Ri para la transformación, al menos el límite derecho, en la mayoría de los casos, sin embargo, los límites derecho e izquierdo, del plásmido Ti o Ri del ADN – T se conectan como región flanqueadora con el casete de expresión transgénica que se va a introducir. Es preferente el uso de vectores binarios. Los vectores binarios pueden replicarse tanto en E. coli como en Agrobacterium. Normalmente contienen un gen marcador de selección y un enlace o polienlace flanqueado por las secuencias límites derecha e izquierda del ADN – T. Pueden transformarse directamente en Agrobacterium (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181 – 187). El gen marcador de selección permite la selección de una agrobacteria transformada; un ejemplo es el gen nptII, que confiere resistencia contra kanamicina. La Agrobacterium, que en este caso actúa como organismo huésped, debería ya contener un plásmido en la región vir. Esta región es necesaria para la transferencia del ADN – T en la célula de planta. Un Agrobacterium transformado de esta manera puede emplearse para la transformación de células de planta.

[0075] El uso de ADN – T para la transformación de células de plantas se ha estudiado y descrito en profundidad (B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por Kung S D y Wu R, Academic Press (1993), págs. 128 - 143 y en Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205 – 225; EP 120516; Hoekema, En: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1 - 46 y An et al. (1985) EMBO J. 4: 277 - 287). Se conocen varios vectores binarios y se encuentran parcialmente disponibles comercialmente como, por ejemplo, pBIN19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12:8711f.; Clontech Laboratories, Inc. USA) o los derivados de PSUN (SunGene GmbH & Co. KGaA; WO 02 / 00900).

[0076] El ADN se transfiere a la célula de planta mediante cocultivo de explantes de plantas con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. Comenzando a partir de material de planta infectada (por ejemplo, partes de hojas, raíces o tallo, pero también propoplastos o suspensiones celulares de planta), es posible regenerar plantas completas utilizando un medio apropiado que puede contener, por ejemplo, antibióticos o biocidas para la selección de células transformadas. Las plantas obtenidas pueden analizarse a continuación para la presencia del ADN introducido, en este caso el casete de expresión transgénica de la invención. En cuanto el ADN se ha integrado en el genoma huésped, el genotipo correspondiente es, normalmente, estable y la correspondiente inserción también se encuentra en generaciones siguientes. Normalmente, el casete de expresión transgénica integrado contiene un marcador de selección que confiere a la planta transformada una resistencia contra un biocida (por ejemplo un herbicida), un inhibidor del metabolismo como un 2 – DOG o un antibiótico como Kanamicina, G418, bleomicina, higromicina o fosfinotricina, etc. El marcador de selección permite la selección de células transformadas a partir de células no transformadas (McCormick et al., (1986) Plant Cell Reports %: 81 – 84). Las plantas obtenidas pueden cultivarse y cruzarse normalmente. Debería cultivarse dos o más generaciones para asegurarse de que la integración genómica es estable y heredable.

[0077] En cuanto una célula de planta transformada se ha preparado, es posible obtener una planta completa utilizando métodos conocidos por los expertos en la disciplina. Con este fin, se utilizan cultivos de callo como punto de inicio, por ejemplo. A partir de estas masas celulares todavía no diferenciadas, es posible inducir la formación de brotes y raíces de maneras conocidas. Los brotes obtenidos pueden plantase y cultivarse.

[0078] La integración del ADN – T puede determinarse, por ejemplo, en base a la eficacia de la expresión de los ácidos nucleicos que se van a expresar transgénicamente o del marcador de selección, por ejemplo in vitro mediante propagación de los meristemos del brote utilizando uno de los métodos de selección anteriormente descritos.

[0079] La invención se refiere, además, a células, cultivos celulares, partes como, por ejemplo, raíces, hojas, etc. en el caso de organismos planta transgénicos, y material de propagación transgénico como semillas, tubérculos, raíces carnosas pivotantes o frutos derivados de los organismos transgénicos anteriormente descritos y / o que comprenden un ácido nucleico aislado de la invención, un casete de expresión transgénica de la invención o un vector de la invención.

[0080] También pueden utilizarse las plantas genéticamente modificadas de la invención, que pueden consumirse por animales y humanos, por ejemplo directamente o tras la preparación conocida per se, como productos alimenticios o piensos.

[0081] La invención también se refiere al uso de los organismos transgénicos anteriormente descritos de la invención y a las células, cultivos celulares, partes, como por ejemplo raíces, hojas, etc. en el caso de organismos planta transgénicos, y material de propagación transgénico como semillas, tubérculos, raíces carnosas pivotantes o frutos derivados de los mismos para la producción de piensos o productos alimenticios, productos farmacéuticos o de química fina.

[0082] La invención también se refiere al uso de un ácido nucleico de la invención, un casete de expresión según la invención o un vector de la invención para la fabricación de una planta transgénica.

[0083] La presente también se refiere a un método para la fabricación de una planta transgénica, que comprende los siguientes pasos:

a) Introducir en una o más células de planta un ácido nucleico aislado de la invención, un casete de expresión de la invención o un vector de la invención para producir células transgénicas; y b) Seleccionar las células transgénicas que comprenden dicho ácido nucleico aislado, casete de expresión o vector de la invención integrado de manera estable en el genoma; y c) Regenerar plantas intactas a partir de dichas células transgénicas.

[0084] Se detalla a continuación información sobre cómo llevar a cabo estos pasos.

[0085] Además, la presente invención se refiere a un método para mejorar el crecimiento del bulbo de una planta, comprendiendo:

i) Introducir en una planta un ácido nucleico aislado de la invención; y ii) Expresar el ácido nucleico introducido de la invención.

[0086] Se describe a continuación la presente invención mediante ejemplos. Figuras:

[0087]

FIG. 1 Muestra el crecimiento vegetativo de los mutantes rock2, rock3 y ore12 en comparación al tipo salvaje: (A.) Foto de plantones 19 DTG (días tras la germinación). Las plantas se cultivaron en condiciones de día largo (B.) Comparación de hojas de las plantas mostradas en (A.), sin ore12. (C.) Comparación del peso fresco 18 DTG. N= 10; *, • = p < 0,01; **, •• = p < 0,005; ***, ••• = p < 0,0001. * = comparado al TS; • = comparado al ore12.

FIG. 2 Muestra la senescencia de la hoja 6 de las plantas mutantes rock y ore12 en condiciones de día largo: (A.) Reducción de eficacia fotosintética del fotosistema II de 16 a 37 DTE (días tras la emergencia). (B.) Reducción del contenido de clorofila de 16 a 35 DTE. (C.) Comparación de hojas de las plantas mostradas en (A.) y (B.). n = 10; • = p < 0,01; •• = p < 0,005 comparadas a ore12.

FIG. 3 Muestra los parámetros del brote de las plantas mutantes rock2, rock3 y ore12 y las líneas transgénicas que expresan pAHK2: rock 2 o pAHK3 : rock3. (A.) La altura de la planta de rock2 y las plantas mutantes transgénicas rock2 y rock3 se incrementa. (B.) los mutantes rock2 y las líneas transgénica rock2 y rock3 forman más silicuas en el tallo central. N = 10, *, • = p < 0,01; ***, ••• = p < 0,0001; * = comparado al TS; • = comparado a ore12.

FIG. 4 Muestra los parámetros de brote de plantas mutantes rock2, rock3 y ore12 y de líneas transgénicas que expresan pAHK2: rock 2 o pAHK3 : rock3. (A., B.) Los mutantes rock2 y rock3 y las líneas transgénica rock2 y rock3 forman (A.) tallos más finos y (B.) flores más grandes. N= 10; ***, ••• = p < 0,0001; * = comparado al TS; • = comparada a ore12.

FIG. 5 Muestra el rendimiento de las semillas de dos líneas transgénicas independientes de pAHK3 : rock3 en comparación al tipo salvaje. Las líneas transgénicas tienen un incremento del 47 % de rendimiento de las semillas en comparación a las plantas de tipo salvaje. N = 10. ** = p < 0,005; *** = p < 0,0001 comparado al TS.

Ejemplos:

Materiales y métodos

[0088] Se identificaron y aislaron los alelos rock2 y rock3 en base a su capacidad para suprimir las consecuencias fenotípicas de la deficiencia de citoquinina causada por la sobreexpresión de un gen CKX que codifica una citoquinina oxidasa / deshidrogenasa.

Material de planta y condiciones de crecimiento

[0089] Se utilizó el ecotipo Columbia (Col – 0) de Arabidopsis thaliana como tipo salvaje. Las plantas se cultivaron en invernadero en tierra o en condiciones estériles en placas de Petri con medio ATS (Estelle, M. A. y Somerville, C. (1986). Auxin-resistant mutants of Arabidopsis thaliana with an altered morphology. Mol. Gen. Genet. 206, 200 – 206). Todas las plantas se cultivaron a 22 ºC en condiciones de día largo (16 h de luz / 8 h de oscuridad).

Mutagénesis

[0090] Se pusieron en remojo aproximadamente 25.000 semillas 35S : CKX1 (Werner, T., Motyka, V., Laucou, V., Smets, R., Van Onckelen, H., and Schmülling, T. (2003). Cytokinin-deficient transgenic Arabidopsis plants show multiple developmental alterations indicating opposite functions of cytokinins in the regulation of shoot and root meristem activity. Plant Cell 15, 2532 – 2550) durante 16 h en 100 ml de etil metano sulfonato 0,2 % (v / v) a temperatura ambiente. La generación M1 se cultivó como plantas únicas y se analizó la generación M2 para plantas con el fenotipo similar al tipo salvaje.

Análisis genético

[0091] El mapeo de las poblaciones de rock2 y rock3 se generó cruzando las plantas rock2 35S: CKX1 y rock3 35S: CKX1 con el ecotipo de tipo salvaje Landsberg erecta. Las plantas progenitoras F2 se utilizaron para mapear rock2 y rock3. Para analizar las consecuencias de las mutaciones de rock2 y rock3 en el tipo salvaje, se cruzaron los mutantes supresores de rock2 y rock3 en el antecedente 35S: CKX1 con el tipo salvaje Columbia. Las plantas progenitoras F1 de este cruce que todavía mostraban el fenotipo revertido sugerían que los alelos rock2 y rock3 eran dominantes. Se analizó la generación F2 para las plantas rock2 y rock3 en el antecedente de tipo salvaje (llamados entonces mutantes rock2 y rock3).

Establecimiento de líneas transgénicas

[0092] Para la construcción del trasgén pAHK2: rock2 se amplificó una región promotora 2124 bp de AHK2 mediante PCR a partir de ADN genómico de A. thaliana de Col – 0 y se clonó con tecnología GatewayTM en el vector de entrada pDONRTM P4 – P1R (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Tras la clonación de la secuencia codificadora de AHK2 con tecnología GatewayTM en el vector de entrada pDONRTM 221 (Invitrogen), el punto de mutación de rock2 se introdujo mediante PCR basada en la mutagénesis con el kit “QuickChange Site-Directed Mutagenesis” (Stratagene, La Jolla, E.E.U.U) para obtener el alelo rock2. Ambos fragmentos se combinaron con Multisite GatewayTM recombinacional clonando en el vector pK7m24GW, 3 (Karimi et al., 2005). Para obtener el constructo pAHK3: rock3 se amplificó una región promotora 2062 bp de AHK3 mediante PCR a partir de ADN genómico de A. thaliana de Col – 0 y el fragmento se insertó en un vector de entrada pDONRTM P4 – P1R (Invitrogen). El ADNc de AHK3 con el marco de lectura abierto del gen se amplificó mediante PCR a partir de Col – 0 de A. thaliana y se clonó en el vector de entrada pDONRTM222 (Invitrogen). Para introducir el punto de mutación rock3 se utilizó el kit “QuickChange Site – Directed Mutagenesis” (Stratagene, La Jolla, E.E.U.U) para conseguir el alelo rock3. El promotor AHK3 y el ADNc ROCK3 se combinaron con Multisite GatewayTM recombinacional clonando en el vector pK7m24GW, 3 (Karimi, M., De Meyer, B., and Hilson, P. (2005). Modular

cloning in plant cells. Trends Plant Sci. 10, 103 – 105). Ambas estructuras se introdujeron en la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens y las plantas Col – 0 de A. thaliana se transformaron utilizando el método de inmersión floral (Clough, S.J., and Bent, A.F.

(1998). Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, 735 – 743). Las líneas transgénicas se seleccionaron utilizando kanamicina y se propagaron en la generación T3 o T4.

Medidas morfométricas

[0093] Tras 18 días desde la germinación, se tomaron fotografías digitales de las rosetas y se midió el diámetro de las mismas utilizando el programa Scion Image (Scion Corporation, Frederick, Maryland, E.E.U.U.). Las flores en la fase 14 se fotografiaron y se midió su tamaño utilizando también el programa Scion Image.

Parámetros de determinación del peso fresco, de la altura final de la planta y del rendimiento

[0094] Los pesos frescos se midieron pesando las rosetas, los brotes sin rosetas o las partes aéreas al completo de las plantas. La altura final de la planta y el número de silicuas se determinaron tras la floración. Para el análisis el rendimiento de la semilla, las plantas se dispusieron en bolsas de papel tras la floración. Después de conservar las plantas secas durante tres semanas más, se determinó el peso total de la semilla.

Parámetros fotosintéticos

[0095] La eficacia máxima de la fotoquímica PSII (proporción Fv / Fm) de la oscuridad adaptada a las plantas se midió con FluorCam (Photon Systems Instruments, Brno, Czech Republic). El contenido de clorofila de cada hoja se midió utilizando el Chlorophyll Meter SPAD – 502 (Konika Minolta, Bremen, Alemania), tomando el valor medio de dos medidas de la misma hoja.

Resultados

1. Análisis de los alelos mutantes en el antecedente de 35S : CKX1

[0096] Para comparar las consecuencias de la mutación de rock3 con la mutación de ore12, se introgresó este último en el antecedente de 35S : CKX1 (se identificó el rock3 en este antecedente). Podría mostrarse que la mutación ore12 revierte parcialmente las consecuencias fenotípicas de la sobreexpresión de CKX1. Sin embargo, en diferentes puntos de tiempos durante el desarrollo, el grado de reversión es menos severo que la reversión alcanzada con el alelo rock3. Esta diferencia es más evidente para el tamaño de la semilla y el diámetro de la roseta. Estos dos parámetros son buenos indicadores del estado cambiado de citoquinina de las plantas CKX1ox.

2. Análisis de alelos mutantes en antecedentes de tipo salvaje

[0097] A continuación, se compararon las consecuencias de los tres alelos mutantes (rock2, rock3 y ore12) en el antecedente de tipo salvaje (Col – 0) se compararon. En la Fig. 1 se muestra que solo los alelos rock2 y rock3 mejoran significativamente el crecimiento vegetativo de las plantas de tipo salvaje, en las que el alelo ore12 no da como resultado mejora en el crecimiento significativa. Este efecto puede verse poco después de la germinación de las semillas (Fig. 1A) y también resulta evidente a partir de la comparación del tamaño de las hojas en una fase de desarrollo tardía (Fig. 1B). Los efectos de los alelos rock2 y rock3 no solo fueron significativamente más fuertes en comparación a las plantas de tipo salvaje, sino también en comparación al alelo ore12. Tanto rock2 como rock3 causaron un incremento > 75 % del peso fresco 18 días después de la germinación (DTG) en comparación al tipo salvaje. Un análisis del incremento del peso fresco de las rosetas y de la planta completa en el ciclo de vida de las plantas mostró que el incremento de la diferencia del peso fresco es particularmente evidente de 32 a 40 DTG y que el efecto es más fuerte con el alelo rock2.

[0098] Es conocido que el estado mejorado de la citoquinina causado por el alelo ore12 retrasa la senescencia de la hoja. La senescencia foliar se comparó en plantas de tipo salvaje, en plantas mutantes ore12 y en los mutantes rock. La Fig. 2 muestra claramente un comienzo retrasado de la senescencia foliar en todas las plantas mutantes comparadas al tipo salvaje. La eficacia fotosintética de PS II (Fv / Fm) comenzó a disminuir en la hoja de la roseta 6's de las plantas de tipo salvaje alrededor del día 17 DTE y del día 21 al 23 DTE en las plantas mutantes (Fig. 2A). Entre estas, las plantas rock2 mostraron el comienzo más temprano de senescencia foliar, seguidas de ore12 y rock3. Esta diferencia de tiempo de senescencia foliar se mantuvo, llegando a un tiempo de vida diez días más largo en las hojas rock3 en comparación a las hojas de tipo salvaje (Fig. 2A). Este resultado se confirmó midiendo otro parámetro de senescencia, la disminución de clorofila (Fig. 2B), así como la inspección visual de las hojas (Fig. 2C).

3. Análisis de la expresión transgénica de los alelos rock

[0099] En la siguiente fase se analizaron las consecuencias de la expresión transgénica de los alelos rock dominantes. Para este fin, se transformaron plantas Col – 0 de Arabidopsis con genes que contenían ca. 2 kb de las regiones reguladoras 5' aguas arriba de AHK2 y AHK3, respectivamente, y las secuencias codificadoras rock2 y rock3, respectivamente. Estos genes se denominaron pAHK2: rock2 y pAHK3: rock3, respectivamente, y se marcan como pAHK2: rock2 y pAHK3: rock3 en la Fig. 3 a la Fig. 5. Normalmente, se encontró una mejora de los atributos fenotípicos que se alteraron en las plantas mutantes rock. Las Figs. 3 y 4 muestran que las plantas transgénicas pAHK2: rock2 y pAHK3: rock3 que se han comparado al tipo salvaje o a las plantas ore12 un incremento significativo en la altura del bulbo (Fig. 3A), un incremento significativo en el número de silicuas del tallo central (Fig. 3B), tallos más finos causados por el aumento en el número de células más largas en la dimensión radial (Fig. 4A) y un incremento significativo del tamaño de las flores (Fig. 4B). Como se demuestra en la Fig. 5, podría mostrarse que las plantas transgénicas pAHK3: rock3 tienen un rendimiento de las semillas significativamente mayor que las de tipo salvaje.

LISTADO SECUENCIAL

[0100]

<110> FU Berlin Institut für Biologie Angewandte Genetik

<120> rock2 y rock3, dos nuevas variantes con ganancia de función de los receptores de citoquinina AHK2 y AHK3

<130> P658809EP

<160> 6

<170> Patente versión 3.3

<210> 1

<211> 1176

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

<210> 2

<211> 1036

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

<210> 3

<211> 4595

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 3

<210> 4

<211> 4248

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

<210> 5

<211> 50

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 5 <210> 6

<211> 50

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 6

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante activa constitutivamente del receptor de citoquinina AHK3 con:

   una secuencia aminoácida con la SEC ID Nº 2 o un ortólogo de la misma; en la que la secuencia aminoácida tiene el aminoácido isoleucina (I) en una posición correspondiente a la posición 179 de la SEC ID Nº 2.

2. 2.

   Un ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, que comprende, además, al menos una secuencia promotora, en la que, al menos, una secuencia promotora y una secuencia de ácido nucleico codificadora están unidas funcionalmente la una a la otra.

3. 3.

   Un casete de expresión transgénica para la expresión de ácidos nucleicos que comprenden un ácido nucleico aislado de una de las reivindicaciones 1 a 2.

4. 4.

   Un vector que comprende un ácido nucleico aislado de una de las reivindicaciones 1 a 2 o un casete de expresión transgénica de la reivindicación 3.

5. 5.

   Un organismo transgénico transformado o transfectado temporal o definitivamente con un ácido nucleico aislado de las reivindicaciones 1 a 2, un casete de expresión de la reivindicación 3 o un vector de la reivindicación 4

   o un descendiente de dicho organismo transgénico, en el que el organismo en una planta o un microorganismo.

6. 6.

   Un organismo transgénico de la reivindicación 5, en el que el organismo es una planta seleccionada de la familia Brassicaceae, preferiblemente del género Brassica o Arabidopsis.

7. 7.

   Una célula, un cultivo celular, una parte, órgano, tejido o material de propagación transgénico derivados de una planta o microorganismo que comprende un ácido nucleico aislado de las reivindicaciones 1 a 2, un casete de expresión transgénica de la reivindicación 3 o un vector de la reivindicación 4.

8. 8.

   La utilización de un ácido nucleico aislado de las reivindicaciones 1 a 2, un casete de expresión transgénica de la reivindicación 3 o un vector de la reivindicación 4 para la fabricación de una planta transgénica.

9. 9.

   Un método para la fabricación de una planta transgénica que comprende las siguientes etapas: a) Introducir en una o más células de planta un ácido nucleico aislado de la reivindicación 1 a 2, un casete de expresión transgénica de la reivindicación 3 o un vector de la reivindicación 4 para producir células transgéicas; b) Seleccionar células transgénicas que comprenden dicho ácido nucleico aislado, dicho casete de expresión o dicho vector integrado definitivamente en el genoma; y c) Regenerar plantas intactac a partir de dichas células transgénicas o células derivadas de las mismas.

10. 10.

    Un polipéptido aislado codificado por un ácido nucleico aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

11. 11.

    Un polipéptido aislado que comprende, al menos, la secuencia aminoácida con la SEC ID Nº 2.

12. 12.

    Un método para mejorar el crecimiento del brote de una planta, que comprende:

    i) Introducir en una planta un ácido nucleico aislado de la reivindicación 1 a 2; y ii) Expresar el ácido nucleico introducido de la reivindicación 1 a 2.