CN102471373B - rock2和rock3,两种新的细胞分裂素受体AHK2和AHK3的功能获得性变体 - Google Patents

rock2和rock3,两种新的细胞分裂素受体AHK2和AHK3的功能获得性变体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及两种新的细胞分裂素受体蛋白AHK2和AHK3的功能获得性变体，即rock2和rock3，涉及包括所述新的功能获得性细胞分裂素受体变体的至少之一的转基因生物，并且涉及一种用于制造包括这些新的功能获得性变体的至少之一的转基因植物的方法。

Description

rock2和rock3,两种新的细胞分裂素受体AHK2和AHK3的功能获得性变体
背景技术
为了能够给持续增长的人口供应食物和其他源于植物的产品，人们一直对改进农业生产力感兴趣。
可以通过不同的方式影响植物的生产力，例如通过改进植物生长特性或通过延迟叶子衰老。存在着已知的涉及植物生长和发育的若干机制和通路。
细胞分裂素是在植物生长和发育的许多方面起着正和负调控作用的植物激素。它刺激芽分生组织的形成和活力，能够建立库组织(sink tissue)，减缓叶子衰老，抑制根的生长和分枝，并且它在种子发芽和胁迫响应中起作用。细胞分裂素缺乏的植物的分析显示细胞分裂素植物在芽和根的分生组织中起相反的作用，并且提示该激素在器官生长的定量控制方面具有基本功能(Mok，D.W.S.& Mok，M.C.(2001)Ann.Rev.Plant Physiol.MoI.Bio.52，89-118)。对于模式植物拟南芥，已经显示细胞分裂素信号被细胞分裂素受体家族的三个成员所识别，它们是传感器组氨酸激酶类(Inoue(井上)，T.等人在(2001)Nature(自然)409，1060-3；Suzuki(铃木)，T.等人在(2001)Plant Cell Physiol.42，107-13；Yamada(山田)，H.等人在(2001)Plant Cell Physiol.42，1017-23.)。这三种细胞分裂素受体，AHK2、AHK3和CRE1/4(AHK4)，显示出高度的序列一致性，但是各自具有不同的特征。
最近，已经披露了细胞分裂素受体AHK3的一种功能获得性变体，并且被称为ore12(参见WO 2007/108931A1)。已经显示，在拟南芥中ore12的表达产生具有叶子衰老延迟的植物，而全株的总体外观与野生型植物相比没有显示出显著差异。虽然ore12的表达可以导致植物具有叶子衰老的延迟并且由此导致植物具有改进的生产力，但是ore12的表达在其他的植物生长特性方面并不具有显著作用。因此对植物生产力的进一步改进仍然存在需要。
发明内容
本发明的一个目标是提供适合于产生具有改进的生产力和/或生长特性的转基因植物的手段和方法。
通过本发明如以下详细所展示而实现这一目标。
本发明提供了两种新颖的细胞分裂素受体AHK2和AHK3的功能获得性变体，即rock2和rock3。具有氨基酸序列SEQ ID No.1的rock2多肽是拟南芥的细胞分裂素受体AHK2的一种组成型活性变体，并且可以由具有SEQ ID No.3的序列的核酸编码。具有氨基酸序列SEQ ID No.2的rock3多肽是拟南芥的细胞分裂素受体AHK3的一种组成型活性变体，并且可以由具有SEQ ID No.4的序列的核酸编码。如在此使用的，术语细胞分裂素受体AHK2或AHK3的“组成型活性变体”优选是指一种多肽，该多肽基本上与对应的野生型AHK受体AHK2或AHK3一样将靶结构磷酸化，但是其中所述组成型活性变体的激酶活性基本上独立于细胞分裂素的结合。因此，术语“组成型活性变体”还包括缺乏与细胞分裂素的任何特异性结合的多肽，以及可能甚至缺乏功能性或非功能性细胞分裂素结合域的多肽。技术人员熟知适合的如何测试给定多肽的针对它的激酶活性的方法。优选地，使用如(马洪恩)等人在“Cytokinins Regulatea Bidirectional Phosphorelay Network in Arabidopsis″Current Biology(2006)，16，1116-1122中所述的体外激酶测定。在一个特别优选的实施方案中，“组成型活性变体”对应地展示出至少30％的对应的野生型AHK受体AHK2或AHK3的激酶活性，更优选至少50％的AHK2或AHK3的激酶活性。
出人意料地发现包括具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列的多肽的转基因表达导致转基因植物展示出改进的生长特性和叶子衰老延迟。在植物中具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列的转基因表达对叶子衰老的作用相比于已经观察到的已知的AHK3的功能获得性变体ore12更显著。甚至更出人意料地，在与野生型比较时，第一次发现具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列的AHK2或AHK3功能获得性变体的转基因表达对生成的转基因植物的芽生长、每主茎的长角果的数量、茎粗和/或花大小具有显著作用，而表达ore12的植物缺乏这样一种作用。因此具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列的转基因表达导致植物展示出改进的生产力。
在本发明的一个第一方面，提供了一种分离核酸，包括编码以下序列的核酸序列：
i)具有SEQ ID No.1的氨基酸序列或它的直系同源物；
ii)相对于SEQ ID No.1的全序列长度具有至少48％、优选至少50％、更优选至少55％一致性的氨基酸序列；或者
iii)相对于具有SEQ ID No.5的SEQ ID No.1的50个氨基酸序列片段具有至少50％、优选至少53％、更优选至少55％一致性的氨基酸序列；
其中在相应于SEQ ID No.1的位置552的位置处，该氨基酸序列具有氨基酸苯丙氨酸(F)。SEQ ID No.5包括SEQ ID No.1的50个氨基酸残基，这些残基朝向在SEQ ID No.1的位置552处的氨基酸苯丙氨酸(F)的N端而直接定位。
本发明还提供了一种分离核酸，包括编码以下序列的核酸序列：
i)具有SEQ ID No.2的氨基酸序列或它的直系同源物；
ii)相对于SEQ ID No.2的全序列长度具有至少48％、优选至少50％、更优选至少55％一致性的氨基酸序列；或
iii)相对于具有SEQ ID No.6的SEQ ID No.2的50个氨基酸序列片段具有至少50％、优选至少55％、更优选至少60％一致性的氨基酸序列；
其中在相应于SEQ ID No.2的位置179的位置处，该氨基酸序列具有氨基酸异亮氨酸(I)。SEQ ID No.6包括SEQ ID No.2的50个氨基酸残基，这些残基朝向在SEQ ID No.2的位置179处的氨基酸异亮氨酸(I)的C端而直接定位。
优选地提供了一种分离核酸，包括编码具有SEQ ID No.1或2或其直系同源物的氨基酸序列的至少之一的核酸序列。如在此使用的术语“直系同源物”是指来自一个物种的核酸或氨基酸序列，该物种优选地不同于拟南芥，该序列对于拟南芥的特定核酸或氨基酸序列显示出最高的相似性，优选显示出最高的序列一致性，因为这两个基因源自一个共同祖先。本发明还提供了由本发明的一种分离核酸编码的分离多肽，优选地是包括具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列的至少之一的分离多肽。
在本发明的一个第二方面，提供了一种用于表达核酸的转基因表达盒，其中本发明的转基因表达盒包括根据本发明的一种分离核酸。本发明的转基因表达盒可以被如此设计，这样在一种宿主生物优选一种植物细胞中的至少一个启动子的控制下，它在一种植物组织中介导编码具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列的至少之一的核酸的转基因表达。
在本发明的一个第三方面，提供了一种包括根据本发明的分离核酸或本发明的转基因表达盒的载体。
在一个第四方面，本发明是针对一种包括根据本发明的分离核酸、本发明的转基因表达盒或本发明的载体的转基因生物。
本发明提供了一种分离多肽，包括：
A)i)具有SEQ ID No.1的氨基酸序列或它的直系同源物；
ii)相对于SEQ ID No.1的全序列长度具有至少48％、优选至少50％、更优选至少55％一致性的氨基酸序列；或者
iii)相对于具有SEQ ID No.5的SEQ ID No.1的50个氨基酸序列片段具有至少50％、优选至少53％、更优选至少55％一致性的氨基酸序列；
其中在相应于SEQ ID No.1的位置552的位置处，该氨基酸序列具有氨基酸苯丙氨酸(F)；
或者
B)i)具有SEQ ID No.2的氨基酸序列或它的直系同源物；
ii)相对于SEQ ID No.2的全序列长度具有至少48％、优选至少50％、更优选至少55％一致性的氨基酸序列；或者
iii)相对于具有SEQ ID No.6的SEQ ID No.2的50个氨基酸序列片段具有至少50％、优选至少55％、更优选至少60％一致性的氨基酸序列；
其中在相应于SEQ ID No.2的位置179的位置处，该氨基酸序列具有氨基酸异亮氨酸(I)。
在一个优选的实施方案中，本发明的分离多肽包括和/或其组成为具有SEQID No.1或2的一个氨基酸序列。
本发明还涉及一种分离核酸，包括编码具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列的至少之一的核酸序列。
“分离的”核酸是一种实质上从该核酸的天然来源形式存在的其他核酸分子分离的核酸(例如编码其他多肽的序列)。优选地，在它的天然发生的复制子中，“分离的”核酸不含天然位于核酸侧翼的一些序列(即位于核酸的5′和3′端的序列)。例如，一个克隆的核酸被认为是分离的。在不同的实施方案中，本发明的分离核酸可以含有小于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、或0.1kb的核苷酸序列，这些核苷酸序列天然位于在该核酸自其衍生的细胞的基因组DNA中的核酸分子的侧翼。如果已经通过人为干预将它改变，或者置于不是它的天然位点的基因座或位置，或者如果将它导入一种细胞(例如通过农杆菌感染)，那么核酸也被认为是分离的。而且，一种“分离的”核酸(如cDNA分子)，可以不含与它天然相关的一些其他细胞材料、或当通过重组技术生产时的培养基、或当化学合成时的化学前体或其他化学品。特别排除在“分离核酸”的定义之外的是：天然发生染色体(如染色体分散)、基因组文库、以及天然发生源的全细胞基因组DNA或全细胞RNA制品(包括机械剪切或酶消化的全细胞制品)。本发明的核酸和/或多肽可以提供为分离的形式，即优选以实质上纯的或均匀的形式从天然环境中纯化，或者除了所希望的序列以外不含或基本不含源物种的核酸或基因。
根据本发明的核酸可以包括DNA、RNA、它们的混合物和/或功能替代物，特别是cDNA、基因组DNA和RNA并且可以是完全或部分合成的。本发明的核酸包括单链的或者完全或部分双链的多核苷酸序列。术语“分离的”包括所有这些可能性。为了本发明的目的，其中DNA序列是特定的，例如关于具体的SEQ ID No.，除非上下文另外要求，包括具有以T取代U(当其发生时)的RNA同等物。可以通过任何手段产生本发明的核酸，包括基因组制备、cDNA制备、体外合成、PCR、RT-PCR、和/或体外或体内转录。
本发明的分离核酸可以包括选自以下序列的至少之一的核酸序列：
i)SEQ ID No.3或4或其反向互补序列之一；
ii)相对于至少300个碱基对的编码序列、优选相对于至少500个碱基对的编码序列、更优选相对于全编码序列长度，与具有SEQ ID No.3或4的序列之一具有至少70％同源性、优选至少75％同源性、更优选至少80％同源性的功能等同序列或它的反向互补序列(并且它编码本发明的至少一种分离多肽，优选编码具有SEQ ID No.1或2的一个氨基酸序列)；或者
iii)在标准条件下与具有SEQ ID No.3或4的核酸序列或者与其互补的核酸序列之一杂交的功能等同序列或其反向互补序列(并且编码本发明的至少一种分离多肽，优选编码具有SEQ ID No.1或2的一个氨基酸序列)。
具有SEQ ID No.3的核酸序列编码具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的多肽，而具有SEQ ID No.4的核酸序列编码具有SEQ ID No.2的氨基酸序列的多肽。
为了本发明的目的，术语“功能等同序列”是指与SEQ ID No.3或4或者其反向互补序列之一不同的并且编码具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列的至少之一的任何序列。技术人员熟知允许许多不同的核酸序列编码相同的氨基酸序列的遗传密码简并，并且不难确定给定的核酸序列是否编码具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列的至少之一。
用于制备本发明的功能等同序列或片段的方法优选包括将突变导入由SEQID No.3或4所述的序列或其反向互补序列之一。诱变可以是随机的，在这种情况下，随后可以针对它们的特性通过尝试法筛选诱变的序列。用于诱变核酸序列的方法对于技术人员是已知的，并且作为举例，包括与有待突变(例如以位点特异性诱变的方式)的区域相比具有一个或多个突变的寡核苷酸的使用。典型地使用具有大约15至大约75个核苷酸或更多个核苷酸的引物，同时优选将大约10个至大约25个或更多个核苷酸残基定位在有待修饰的序列的两侧。用于所述诱变方法的细节和步骤是对于技术人员是熟悉的(Kunkel(坤克尔)等人在(1987)Methods Enzymol 154：367-382；Tomic(托米克)等人在(1990)Nucl Acids Res 12：1656；Upender(阿潘达)等人在(1995)Biotechniques18(1)：29-30；美国专利号4,237,224)。还可以通过用诱变处理剂(例如羟胺)处理例如包括本发明的核酸序列之一的转基因表达载体来实现诱变。
为了遵循所选择的可以用于转录本发明的核酸的生物的具体密码子使用，并且为了表达包括或其组成为具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列的至少之一的编码多肽，功能等同序列的使用可能是特别有益的。
本发明的分离核酸可以包括选自功能等同序列或其反向互补序列的至少一个核酸序列，相对于至少300个碱基对的编码序列片段、优选相对于至少500个碱基对的编码序列片段、更优选相对于全编码序列长度，这些序列具有与SEQID No.3或4的序列之一具有至少80％同源性、优选至少90％同源性、更优选至少95％同源性，并且编码具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列的至少之一。
在两个核酸序列之间的同源性或一致性被理解为的含义是，对应的序列在各自情况下相对于一个给定序列长度的一致性，这是通过借助于GAP程序算法(威斯康辛软件包版本10.0，威斯康辛大学，遗传学计算机组(Genetics ComputerGroup，GCG)，麦迪逊，美国)的比较进行计算的，设定了以下参数：
空位权重：12
长度权重：4
平均匹配：2.912
平均失配：-2.003
例如，在核酸基础上具有与SEQ ID No.：3或4的序列之一至少70％同源性或一致性的序列被理解为的含义是，通过具有以上设定参数的以上程序算法，在与序列SEQ ID No.3或4比较时具有至少70％同源性的序列。
在两个氨基酸序列之间的一致性或同源性被理解为的含义是，在各自的情况下对应的序列相对于给定序列长度的一致性，这是通过使用软件包Bioedit(经由：http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html可得到)中的默认设置借助于ClusatW_Bioedit算法(Thompson(汤普森)JD等人在(1994)Nucleic Acids Res22：4673-4680)进行比较来计算的。
例如，在氨基酸基础上具有与SEQ ID No.1或2的序列之一至少48％同源性或一致性的序列被理解为的含义是，通过具有以上设定的参数的以上程序算法，在与序列SEQ ID No.1或2之一比较时，具有至少48％一致性的序列。
本发明的分离核酸可以包括选自功能等同序列或其反向互补序列的至少一个核酸序列，这些序列在标准条件下与具有SEQ ID No.3或4的核酸序列之一杂交或者与和其互补的核酸序列杂交，并且编码本发明的至少一种分离多肽(优选具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列)。
术语“标准杂交条件”将被宽泛地理解并且表示严谨和/或较不严谨的杂交条件二者。除其他之外，在Sambrook(萨姆布鲁克)J，Fritsch(弗里奇)E F，Maniatis(马尼亚蒂斯)T等人的Molecular Cloning-A Laboratory Manual第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，1989，第9.31-9.57页，或者在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons(约翰威利父子出版公司)，N.Y.(纽约)(1989)，6.3.1-6.3.6中，描述了这样的杂交条件。
例如，在一个或多个洗涤步骤期间的条件可以选自：具有低严谨性(在50℃，具有大约2*SSC和高严谨性(在50℃，优选在65℃，具有大约0.2*SSC)的那些所限制的条件范围(20*SSC：0.3M柠檬酸钠，3M NaCl，pH 7.0)。此外，在洗涤步骤期间的温度可以从在室温(大约22℃)的低严谨条件上升至在大约65℃的更严谨的条件。盐浓度和温度参数两者都可以同时变化，并且可能使这两个参数之一保持恒定而只有另一个参数发生变化。还可能在杂交期间使用变性剂(例如像甲酰胺或SDS)。优选在42℃在50％甲酰胺存在下进行杂交。以下给出了一些用于杂交和洗涤步骤的示例性条件：
(1)使用的杂交条件，例如
a)在65℃，4*SSC，或者
b)在65℃，6*SSC，0.5％SDS，100μg/ml变性的片段化鲑鱼精DNA，或者
c)在42℃，4*SSC，50％甲酰胺，或者
d)在50℃，2*或4*SSC，(低严谨条件)，或者
e)在42℃，2*或4*SSC，30％至40％甲酰胺，(低严谨条件)，或者.
f)在45℃，6*SSC，或者，
g)0.05M磷酸钠缓冲液，pH 7.0，2mMEDTA，1％BSA和7％SDS。
(2)洗涤步骤使用的条件，例如
a)在65℃，0.1*SSC，或者
b)在68℃，0.1*SSC，0.5％SDS，或者
c)在42℃，0.1*SSC，0.5％SDS，50％甲酰胺，或者
d)在42℃，0.2*SSC，0.1％SDS，或者
e)在65℃，2*SSC，(低严谨条件)，或者
f)40mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0，1％SDS，2mM EDTA。
本发明的分离核酸可以包括至少一个启动子序列，该启动子序列可以位于至少编码本发明的分离多肽(优选编码具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列)的核酸序列的5’位置的上游。
启动子序列是能够促进或增强特定基因的转录的核酸序列。在此提到的“启动子”以它的最宽泛的含义和背景来理解，并且包括源于经典的真核细胞基因组基因的转录调控序列，包括对于准确转录起始所需的TATA盒，具有或不具有响应于发育和/或外界刺激应答的或者以组织特异性的方式改变基因表达的CCAAT盒序列和另外的调控或控制元件(例如上游激活序列、抑制子、增强子和沉默子)。
术语“启动子”还可以包括经典的原核基因的转录调控序列，在这种情况下，它可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。
术语“启动子”还可以用来描述合成分子或融合分子、或衍生物，它在细胞、组织或器官中赋予、活化或增强核酸分子的表达。启动子可以含有一个或多个特异性调控元件的另外的拷贝，以进一步增强表达和/或以改变功能连接到其上的核酸分子的空间表达和/或时间表达。这样的调控元件可以置于邻近异源启动子序列以驱动响应于例如铜、糖皮质激素、地塞米松、四环素、赤霉素、cAMP、脱落酸、茁长素、创伤、乙烯、茉莉酸酯(jasmonate)或水杨酸的核酸分子的表达，或者将核酸的表达赋予特定细胞、组织或器官(如分生组织、叶子、根、胚芽、花、种子或果实)。
在本发明的背景下，启动子优选是一种植物可表达的启动子序列。本发明并不排除在非植物细胞(如细菌、酵母细胞、昆虫细胞和动物细胞)中也发挥作用或单独发挥作用的启动子。对于“植物可表达的”表示这样的启动子序列，其包括添加到其上或包含在其中的任何另外的调控元件，至少能够诱导、赋予、活化或增强在植物细胞、组织或器官(优选是单子叶或双子叶植物细胞、组织或器官)中的表达。关于启动子序列，当在此使用术语“植物可操作的”和“在植物中可操作的”时，应当被理解为等同于植物可表达的启动子序列。
对于熟练的技术人员而言，作为双元病毒植物表达系统的一部分的可调节启动子也是已知的(Yadav(亚达夫)1999-WO 99/22003；Yadav(亚达夫)2000-WO 00/17365)。在本背景下，“可调节启动子序列”是任选地在特定条件下能够赋予基因在植物的特定细胞、组织、或器官或者细胞、组织、或器官的组中的表达而在所有条件下通常并不赋予在植物各处的表达的启动子。因此，可调节启动子序列可以是在一系列特定条件下(例如在通过化合物或其他诱导子诱导基因表达以后)，在该植物内的特定位置或可替代地在该植物各处，赋予与它功能连接的基因的表达的启动子序列。优选地，用于进行本发明的可调节启动子赋予在植物内的特定位置的表达(组成型表达或在诱导之后，然而并不是在任何情况下在全株中)。包括在这样的启动子的范围内的是细胞特异性启动子序列、组织特异性启动子序列、器官特异性启动子序列、细胞周期特异性基因启动子序列、诱导性启动子序列和组成型启动子序列，已经将它们修饰以赋予在任何一个时间在该植物的特定部分的表达，如通过将所述组成型启动子整合在转座遗传因子(Ac、Ds、Spm、En、或其他转座子)内。类似地，术语“组织特异性”应当被理解为是指主要在特定组织或组织类型(优选是植物源的)中表达，虽然并不必然是唯一地在所述组织或组织类型中。类似地，术语“器官特异性“应当被理解为是指主要在特定器官(优选是植物源的)中的表达，虽然并不必然是唯一地在所述器官中。类似地，术语“细胞周期特异性“应当被理解为是指表达主要是周期性的并且发生在一个或多个连续的细胞周期时相(并不必然)中，虽然并不必然是唯一地在周期细胞(优选是植物源的)中。本领域的技术人员将知道的是，“诱导性启动子”是其转录活性响应于发育、化学、环境、或物理刺激而被增加或诱导的启动子。类似地，熟练的技术人员将理解的是，“组成型启动子”遍及一种生物(优选是植物)的主要部分(但并不必然是所有部分)在它的生长和发育的主要时期(但并不必然是所有时期)期间具有转录活性的启动子。本领域的技术人员将能够容易地选择适当的启动子序列，用于调节来自公开可得来源的细胞分裂素受体蛋白变体的适当表达，而无需经过过度的实验。
将核酸分子置于启动子序列的调节控制下，或者将其置于与启动子序列的功能连接或联接中，表示如此定位所述核酸分子，这样使得表达至少部分受到该启动子序列控制。启动子通常(但并不必然)被定位在上游(或在5′端)，并且在距离它调节的核酸分子的转录转录起始位点2kb之内，虽然增强子和沉默子也包括在术语“启动子”内，但是可以将它们置于更远离转录起始位点。所认为的是这些元件由于在间插序列外的成环与能够长距离发挥作用的蛋白质结合。在构建异源启动子/结构基因组合中，优选将启动子定位在离开基因转录起始位点的一个距离处，该距离大致与在它的天然环境中启动子与它控制的基因(即该启动子自其衍生的基因)之间的距离相同。如本领域所知，可以调节这个距离方面的一些变化，而没有启动子功能的损失。类似地，优选的调控序列元件相对于有待置于在它的控制下的异源基因(即它自其衍生的基因)的定位是由该元件在它的天然环境中的定位而确定的。而且，如本领域中所知，这个距离也可以发生一些变化。
根据本发明，可以使用任何启动子序列来产生本发明的分离核酸。优选地，该启动子序列位于核酸序列的上游，该核酸序列编码至少一种本发明的分离多肽，优选编码具有SEQ ID No.1或2的一个氨基酸序列。优选地，使用在植物的至少一种组织或细胞类型中是活性的和/或在微生物中是活性的启动子序列。为了适用于其目的，将该至少一种启动子序列和编码至少一种本发明的分离多肽(优选编码具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列)的核酸序列彼此功能连接。
本发明涉及进一步包括至少一个启动子序列的本发明的分离核酸，其中该至少一个启动子序列和编码至少一种本发明的分离多肽(优选编码具有SEQ IDNo.1或2的氨基酸序列)的核酸序列彼此功能连接。
本发明还指本发明的分离核酸，进一步包括至少一个启动子序列，其中编码至少一个本发明的分离多肽(优选编码具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列)的核酸序列位于该至少一个启动子的3’位置，并且其中该至少一个启动子序列与该核酸序列彼此功能连接。
如在此使用的，“功能连接”表示例如编码至少一种本发明的分离多肽(优选编码具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列)的核酸序列的至少一个启动子的顺序布置，并且如果适当的话，是其他调控元件(例如像终止子)的顺序布置，该顺序布置处于这样一种方式：即在编码至少一种本发明的分离多肽(优选编码具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列)的核酸序列的转基因表达中，每一调控元件能够执行它的预期的功能。这并不必需地要求在化学意义上的直接连接。遗传控制序列(例如像增强子序列)还可以距离更远的位置、或者实际上离开其他DNA分子而对靶序列发挥它们的功能。优选地在本发明的分离核酸中，至少编码本发明的分离多肽(优选编码具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列)的核酸序列定位在充当该至少一个启动子序列的序列的下游，这样这两个序列彼此共价结合。优选地，在该至少一个启动子序列与至少编码本发明的分离多肽(优选编码具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列)的核酸序列之间的距离小于200个碱基对，特别优选地小于100个碱基对，非常特别优选小于50个碱基对。可以选择该至少一个启动子与至少编码本发明的分离多肽(优选编码具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列)的核酸，并且以这样一种方式功能连接，以允许本发明的分离多肽(优选是具有SEQ ID No.1或2的氨基酸序列的至少之一)在转基因生物中的转基因表达。
在这个背景下，“表达”表示有待转基因表达的核酸序列的转录，但是还可以包括有待转基因表达的核酸序列的转录RNA被翻译成相应的多肽。
“转基因”表示——例如关于用于核酸的转基因表达的转基因表达盒、转基因表达载体、转基因生物或方法——所有那些是转基因方法的结果的构建体，或者所有使用它们的方法，其中本发明的分离核酸并不位于它们天然的遗传环境中，或者已经通过转基因方法而修饰，其中修饰可以例如是取代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基。优选地，相对于与它功能连接的、并且有待转基因表达的其他核酸序列，根据本发明的分离核酸的至少一个启动子序列是异源的。在这个背景下，“异源”是指不包括天然在所述启动子控制下的编码序列的其他核酸序列。
“天然遗传环境”表示在源生物中或者存在于基因组文库中的天然染色体位点。在基因组文库的情况下，优选至少部分保留核酸序列的天然遗传环境。该环境位于该核酸序列的侧翼的至少一侧，并且具有至少50bp、优选至少500bp、特别优选至少1000bp、非常特别优选至少5000bp的序列长度。在通过非天然、合成(“人工”)方法(例如像体外诱变)修饰这一组合时，天然发生的表达构建体变成转基因表达构建体。这样的方法已经说明(美国专利号5,565,350；WO 00/15815；还参见上文)。
关于表达的“转基因”(“转基因表达”)优选表示如以上或以下所定义的所有那些已经使用转基因表达盒、转基因表达载体或转基因生物进行的表达。
可以如所说明的那样，借助于常规重组和克隆技术产生该至少一个启动子与有待表达的核酸序列之间的功能连接，例如在Maniatis(马尼亚蒂斯)T等人在(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室，冷泉港，N.Y.(纽约)，以及在Silhavy(西尔哈维)T J等人(1984)Experiments with GeneFusions，冷泉港实验室，冷泉港，N.Y.(纽约)中，以及在Ausubel(奥苏贝尔)F M等人(1987)Current Protocols in Molecular Biology，格林出版协会和威利出版社中所述。例如，适合这一目的的方法是基于重组的GATEWAY(TM)克隆技术(英杰生命技术有限公司公司)。
除了该至少一个根据本发明的启动子序列，根据本发明的分离核酸可以包括其他遗传控制序列或元件。
遗传控制序列或元件的概念将被宽泛地理解，并且表示所有那些对根据本发明的分离核酸或转基因表达盒的来源或功能具有作用的序列。遗传控制序列例如修饰原核或真核生物中的转录和/或翻译。优选地，根据本发明的分离核酸或转基因表达盒包括在有待转基因表达的特定核酸序列的5′上游的至少一个启动子序列、以及作为另外的遗传控制序列的3′下游终止子，以及(如果适当的话)在每一情况下与有待转基因表达的核酸序列功能连接的其他常规调控元件。
遗传控制序列还可以包括能够修饰表达控制特性的其他启动子、启动子元件或最小启动子。因此，借助于遗传控制序列，可能依赖于某些胁迫因子例如另外发生组织特异性表达。
此外，遗传控制序列还包括5′非翻译区、内含子、非编码3′区或其他的基因序列。已经显示5′非翻译序列能够增强异源基因的瞬时表达。此外，它们可以促进组织特异性(Rouster(鲁斯特)J等人(1998)Plant J 15：435-440)。相反，不透明二号(opaque-2)基因的5′非翻译区抑制表达。缺失所讨论的区域导致基因活性增加(Lohmer(洛默尔)S等人(1993)Plant Cell 5：65-73)。
分离核酸可以有利地包括处于与启动子的功能连接的一个或多个称为增强子序列的序列，这使得可能增加该核酸序列的转基因表达。还可以将另外的有利的序列(如其他调控元件或终止子)插入在有待转基因表达的核酸序列的3′端。有待转基因表达的核酸序列可以作为在根据本发明的转基因表达盒之一中的一个或多个拷贝而存在。
此外，控制序列被理解为的含义是，使得可能同源重组或插入宿主生物基因组中或允许从基因组缺失的那些。在同源重组的情况下，例如根据本发明的启动子之一可以取代特定基因的天然启动子。这样的序列将被理解为遗传控制序列。多种方法(如cre/lox技术)允许从宿主生物的基因组中组织特异性地并且在一些可诱导的情况下删除转基因表达盒(Sauer(萨奥尔)B(1998)Methods(Duluth)14(4)：381-92)。在此，将某些侧翼序列添加至靶基因(lox序列)，然后使得可能借助于cre重组酶删除。
为了选择已经成功经历同源重组或其他转化的细胞，通常另外需要导入选择标记(参见下文)。在高等真核生物中，特别是在植物中，同源重组是较罕见的事件。进入宿主基因组的随机整合是占优势的。删除随机整合的序列并且因此增加具有正确同源重组的细胞克隆的浓度的一个可能是使用如在美国专利号6,110,736中所述的序列特异性重组系统。
适合作为控制序列的聚腺苷酸化信号包括植物聚腺苷酸化信号，并且优选实质上对应于来自根癌农杆菌的T-DNA聚腺苷酸化信号的那些。在特别优选的实施方案中，分离核酸或转基因表达盒包括在植物中发挥功能的终止子序列。在植物中发挥功能的终止子序列通常表示在植物中能够引起DNA序列的转录终止的那些序列。适合的终止子序列的实例是OCS(章鱼碱合成酶)终止子和NOS(胭脂碱合成酶)终止子。然而，植物终止子序列是特别优选的。植物终止子序列通常是指是天然植物基因的一部分的那些序列。在这个背景下，特别优选的是马铃薯组织蛋白酶D抑制剂基因的终止子或芸豆贮藏蛋白基因VfLE1B3的终止子。这些终止子至少等同于在现有技术中描述的病毒终止子或T-DNA终止子。
根据本发明的分离核酸或转基因表达盒以及包含它们的载体可以包括其他功能元件。术语功能元件将被宽泛地理解并且表示所有那些对于根据本发明的转基因表达盒或对于衍生自它们的转基因表达载体或生物的产生、扩增或功能具有作用的元件。通过举例可以提到以下内容，但不是限制性的。
1.筛选标记
术语“筛选标记”不但包括赋予对抗生素、除草剂或其他杀生物剂的抗性的阳性筛选标记，而且包括赋予对正如上述各项的敏感性的阴性筛选标记，以及还有对转化生物赋予生长优势的标记(例如通过表达细胞分裂素生物合成的关键基因；Ebinuma(海老沼)H等人(2000)Proc Natl Acad Sci USA 94：2117-2121)。在阳性筛选的情况下，只有那些表达所讨论的筛选标记的生物生长旺盛，而在阴性筛选的情况下，正好是这些生物死亡。在转基因植物的产生中，优选使用阳性筛选标记。此外，优选使用赋予生长优势的筛选标记。当着手的任务在于从生物中消除某些基因或基因组片段(例如为了杂交过程)时，可以有利地使用阴性筛选标记。
i)阳性筛选标记：用转基因表达盒导入的选择标记对于成功转化的细胞赋予对一种杀生物剂的抗性，该杀生物剂例如是除草剂(如草胺膦、草甘膦或溴草腈)、代谢抑制剂(例如像2-脱氧葡萄糖-6-磷酸；WO 98/45456)或抗生素(例如像四环素、氨苄西林、卡那霉素、G 418、新霉素、博来霉素或潮霉素)。筛选标记允许从未转化的细胞中筛选出转化的细胞(McCormick(麦考密克)等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84)。特别优选的筛选标记是赋予对除草剂的抗性的那些。
ii)阴性筛选标记：阴性筛选标记使得可能例如筛选具有成功删除的序列的生物，这些删除的序列包括标记基因(Koprek(科普雷克)T等人(1999)The PlantJournal 19(6)：719-726)。在进行阴性筛选时，例如由于该导入植物的阴性筛选标记，例如将另外对植物无不利影响的化合物转化成不利的化合物。此外，具有不利影响的基因本身是适合的。
2)报告基因
报告基因编码易于定量的蛋白质(经由它们的颜色或酶活性)，这些蛋白质允许评定转化效率、表达位点或时间(还参见Schenbron(申布鲁恩)E，Groskreutz(格罗斯克鲁茨)D.Mol Biotechnol.1999；13(1)：29-44)。可以提到的实例是：“绿色荧光蛋白”(GFP)(Chui(崔)W L等人(1996)，Curr Biol 6：325-330；Leffel(勒菲尔)S M等人(1997)Biotechniques 23(5)：912-8；Sheen(希恩)等人(1995)Plant J 8(5)：777-784；Haseloff(哈泽洛夫)等人(1997)Proc Natl Acad SciUSA 94(6)：2122-2127；Reichel(莱歇尔)等人(1996)Proc Natl Acad Sci USA93(12)：5888-5893；Tian(田)等人(1997)Plant Cell Rep 16：267-271；WO97/41228)。氯霉素转移酶(Fromm(弗洛姆)等人(1985)Proc Natl Acad Sci USA82：5824-5828)。萤虫素酶(Millar(米勒)等人(1992)Plant Mol Biol Rep 10：324-414；Ow(欧)等人(1986)Science 234：856-859)；允许经由生物发光的检测。β-半乳糖苷酶，编码的一种酶，许多种显色底物对于它是有效的。β-葡萄糖醛酸酶(GUS)(Jefferson(杰弗逊)等人(1987)EMBO J.6：3901-3907)或uidA基因(它编码一种针对多种显色底物的酶)。R-位点基因产物：在植物组织中调节花色苷色素的产生(红化作用)的蛋白质，并且因此使得可能直接分析启动子活性，无需添加其他辅助物质或显色底物(Dellaporta(德拉波塔)等人(1988)In：Chromosome Structure and Function：Impact of New Concepts，18th StadlerGenetics Symposium，11：263-282)。酪氨酸酶(Katz(卡茨)等人(1983)J GenMicrobiol 129：2703-2714)，一种将酪氨酸氧化为多巴和多巴醌的酶，继之形成易于检测的黑色素。水母发光蛋白(Prasher(普拉舍)等人(1985)BiochemBiophys Res Commun 126(3)：1259-1268)，可以用于钙敏感生物发光检测中。
3)复制起点
复制起点确保根据本发明的转基因表达盒或转基因表达载体在例如大肠杆菌或农杆菌中的扩增。可以提到的实例是OR1(DNA复制起点)、pBR322起点或P15A起点(Sambrook(萨姆布鲁克)等人：Molecular Cloning.A LaboratoryManual，2<nd>ed.冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.(纽约)，1989)。在农杆菌中发挥功能的复制起点的实例是pRK2、pRi、PVS1或pSA。
4)边界序列
“边界序列”(例如像T-DNA的右或左边界)允许农杆菌介导的转移进入植物细胞，用于转移和整合进入植物基因组。
5)多克隆位点(MCS)允许和促进插入一个或多个核酸序列。
本发明还涉及多种载体，它们包括以上所述的本发明的分离核酸或本发明的转基因表达盒。载体通常表示能够复制并且优选是宿主特异性的结构，并且它们允许摄取核酸序列以及它们转移进入其他细胞。载体的实例可以是质粒、粘粒、噬菌体、病毒或农杆菌。将在下文示例性地描述特别适合植物生物技术目的的载体。本发明的载体包括转基因表达盒。
本发明的另一个主题涉及用本发明的至少一种分离核酸、或根据本发明的至少一种转基因表达盒或根据本发明或根据本发明的至少一种载体进行瞬间或稳定转化或转染的转基因生物，或涉及这样的转基因生物的子代。此外，本发明涉及细胞、细胞培养物、组织、部分，例如像植物生物、叶子、根等等，或源于这样的生物的繁殖材料(例如本发明的转基因生物的种子)的情况。应当理解的是，出于本发明的目的，术语“转基因生物”不但包括其中已经瞬间或稳定导入本发明的核酸的生物，而且还指不论代距的这样的生物的子代，例如第一代的子代连同第X代的子代，条件是这些生物仍然包括本发明的核酸。
优选地，该转基因生物是植物或微生物，更优选该转基因生物是选自十字花科、甚至更优选是选自芸苔属或拟南芥属的植物。
生物、起始生物或宿主生物被理解为的含义是原核或真核生物，例如像微生物或植物生物。优选的微生物是细菌、酵母、藻类或真菌。
优选的细菌是埃希菌属、欧文菌属、农杆菌属、黄杆菌属、产碱杆菌属或蓝细菌(例如集胞藻属)的细菌。
特别优选的是能够感染植物并且因此转移本发明的核酸、转基因表达盒和/或载体的微生物。优选的微生物是来自农杆菌属的那些，特别是根癌农杆菌类。
最重要的是，优选作为转基因生物的宿主或起始生物是植物生物。植物生物通常表示所有那些能够光合作用的生物。被包括作为本发明的范围之内的植物生物是植物界的所有属和种的高等或低等植物。还包括由此衍生的成熟植物、种子、块茎、甜菜根/膨大的主根、果实、芽和幼苗以及还有它们的部分、繁殖材料和培养物(例如细胞培养物)。成熟植物是指除了幼苗以外的在任何发育阶段的植物。幼苗是指在早期发育阶段的幼小不成熟的植物。对于制备转基因植物而言，一年生植物、多年生植物、单子叶植物和双子叶植物是优选的宿主生物。优先给出的是以下植物科的植物：十字花科，特别是芸苔属和拟南芥属的植物。
制备转化生物或转化细胞需要将适当的DNA导入适当的宿主细胞中。用于被称为转化的这个过程的许多方法是可得的(还参见Keown(基翁)等人1990Methods in Enzymology 185：527-537)。因此，作为举例，通过微注射或通过用DNA包被的粒子进行显微注射或轰击可以直接导入DNA。还可以例如使用聚乙二醇化学渗透细胞，这样DNA可以经由扩散进入细胞。还可以经由与其他含有DNA的单元(如微细胞、细胞、溶酶体、脂质体)的原生质体融合来进行DNA的导入。用于导入DNA的另一个适合的方法是电穿孔，其中通过电脉冲反相渗透细胞。
在植物的情况下，使用了描述的用于从植物组织或植物细胞转化和再生植物的方法以用于瞬间或稳定转化。适合的方法特别是通过聚乙二醇诱导的DNA摄取的原生质体转化、使用基因枪的基因枪法、“粒子轰击”法、电穿孔、在含有DNA的溶液中孵育干胚以及显微注射。
除了这些“直接”转化技术，还可以通过借助于根癌农杆菌或发根农杆菌的细菌感染进行转化。这些菌株含有一种质粒(Ti或Ri质粒)，它的一部分(也被称为T-DNA)在用农杆菌感染以后被转移到植物中并且整合到植物细胞的基因组中。农杆菌介导的转化最适合于双子叶植物细胞，而直接转化技术适合任何细胞类型。
通过使用载体(优选本发明的载体)，可以有利地将本发明的转基因表达盒导入细胞(优选植物细胞)中。
在一个有利的实施方案中，该转基因表达盒是通过质粒载体导入的。优先给出的是使得能够将转基因表达盒稳定整合到宿主基因组中的那些转基因表达载体。在这个背景下，宿主基因组是指宿主的全部遗传信息，并且例如不但包括细胞核的染色体DNA，而且还包括质体和线粒体的DNA。然而，插入到细胞核的染色体DNA中是优选的。
在将DNA注射或电穿孔进入植物细胞中的情况下，对于所使用的质粒不作特殊的要求。有可能使用简单的质粒，如pUC系列的那些。如果将从转化的细胞再生成完整植物，那么在该质粒上需要存在另外的选择标记。
已经描述了用于不同的单子叶和双子叶植物生物的转化技术。此外，对于将外源基因导入植物，通常含有用于在大肠杆菌中的复制起点和用于筛选转化细菌的标记基因的各种可能的质粒载体是可得的。实例是pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。
可以经由适合的限制性酶切位点将转基因表达盒导入载体中。首先将生成的质粒导入大肠杆菌。使用技术工作人员熟悉的方法选择、培养正确转化的大肠杆菌细胞，并且获得重组质粒。可以使用限制性分析并测序以检验克隆步骤。
转化的细胞，即如果选择标记是导入的DNA的一部分，那么就是含有导入的DNA的那些细胞，这些脱氧核糖核酸(DNA)被整合到可以从未转化的细胞中选择的宿主细胞的DNA中。作为举例，标记可以是能够赋予对抗生素或除草剂的抗性的任何基因。在适当的杀死未转化野生型的抗生素或除草剂浓度存在下，表达这样的标记基因的转化细胞能够生存。实例是赋予对除草剂草胺膦的抗性的bar基因(Rathore(拉索尔)K S等人，Plant Mol Biol.1993 March；21(5)：871-884)、赋予对卡那霉素的抗性的nptII基因、赋予对潮霉素的抗性的hpt基因以及赋予对除草剂草甘膦的抗性的EPSP基因。
取决于DNA导入方法，在载体质粒上可能需要其他基因。如果使用农杆菌，则该转基因表达盒将被整合到特定质粒中，或者整合到中间载体(穿梭载体)中抑或整合到二元载体中。例如，如果有待使用Ti或Ri质粒用于转化，则至少该Ti或Ri质粒的T-DNA的右边界(然而，在多数情况下，是右边界和左边界)将作为侧翼区而与有待导入的转基因表达盒连接。优先使用二元载体。二元载体在大肠杆菌中和农杆菌中都可以复制。它们通常含有筛选标记和接头或聚合接头，该接头或聚合接头位于右和左T-DNA边界序列的侧翼。可以将它们直接转化到农杆菌中(Holsters(霍尔斯特)等人，Mol.Gen.Genet.163(1978)，181-187)。筛选标记基因允许筛选转化的农杆菌；一个实例是赋予对卡那霉素的抗性的nptII基因。在这种情况下充当宿主生物的农杆菌应当已经含有具有vir区的质粒。这个区对于将T-DNA转移到植物细胞上是需要的。以这种方式转化的农杆菌可以用于转化植物细胞。
已经密集地研究和描述了T-DNA用于转化植物细胞的用途(B.Jenes(詹斯)等人，Techniques for Gene Transfer，in：Transgenic Plants，Vol.1，Engineeringand Utilization，edited by Kung(龚)S D and Wu(吴)R，Academic Press(1993)，pp.128-143and in以及在Potrykus(伯特利库斯)(1991)Annu Rev Plant PhysiolPlant Molec Biol 42：205-225中；EP 120516；Hoekema(胡克马)，In：The BinaryPlant Vector System，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblas serdam，Chapter V；Fraley(法利)等人，Crit.Rev.Plant.Sci.，4：1-46and An et al.(1985)EMBO J.4：277-287)。各种二元载体是已知的并且部分商业可得的，例如像pBIN19(Bevan(贝文)等人(1984)Nucl Acids Res 12：8711f.；Clontech Laboratories公司，美国)或PSUN衍生物(SunGene GmbH & Co.KGaA；WO 02/00900)。可以将根据本发明的表达盒插入这些二元载体中并且如上文和/或下文所述将其整合到植物基因组中。
通过将植物外植体与根癌农杆菌或发根农杆菌共培养而将DNA转移到植物细胞中。从感染的植物材料(例如叶子、根或茎部分，而且还有原生质体或植物细胞悬浮液)开始，有可能通过使用适合的介质(该介质例如可以含有用于筛选转化细胞的抗生素或杀生物剂)再生出全株植物。在本发明的转基因表达盒的情况下，然后就导入的DNA的存在筛选所获得的植物。一旦已经将DNA整合到宿主基因组中，则相应的基因型通常是稳定的并且该相应的插入也再次发现于后续子代中。通常，整合的转基因表达盒含有筛选标记，该标记对转化的植物赋予对杀生物剂(例如除草剂)、代谢抑制剂(如2-DOG)或抗生素(如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素)或草胺膦等的抗性。筛选标记允许从未转化细胞中筛选出转化细胞(McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84)。可以按普通方式培养和杂交所获得的植物。应当培养两代或更多代，以确保基因组整合是稳定的和可遗传的。
一旦已经制备一种转化植物细胞，有可能通过使用熟练的技术人员已知的方法获得一种全植物。为此，作为举例，将愈伤组织培养物用作起始点。有可能以已知的方式从这些还尚未分化的细胞团诱导芽和根的形成。可以将这些获得的芽移植到户外并且进行培养。
例如使用上述这些选择方法之一在体外通过芽分生组织繁殖，基于有待转基因表达的这些核酸的表达效果或基于该选择标记，可以对该T-DNA的整合进行确定。
本发明进一步涉及细胞、细胞培养物、部分(例如像在转基因植物生物的情况下的根、叶子等等)以及转基因繁殖材料(如源于上述这些转基因生物和/或包括本发明的一种分离核酸、本发明的一种转基因表达盒或本发明的一种载体的种子、块茎、甜菜根/膨大的主根或果实)。
可以被人类和动物消费的本发明的遗传修饰植物还可以被用作(例如直接地或在本身已知的制备之后)食品或饲料。
本发明进一步涉及所发明的上述转基因生物以及细胞、细胞培养物、部分(例如像在转基因植物生物的情况下的根、叶子等等)以及转基因繁殖材料(如源于它们的用于生产食物或饲料、药物或精细化学品的种子、块茎、甜菜根/膨大的主根或果实)的用途。
本发明还涉及所发明的一种分离核酸、根据本发明的一种转基因表达盒或本发明的用于制造转基因植物的一种载体的用途。
本发明进一步涉及一种用于制造转基因植物的方法，该方法包括以下步骤：
a)将本发明的一种分离核酸、本发明的一种转基因表达盒或本发明的一种载体导入到一种或多种植物细胞中以便产生转基因细胞；以及
b)选择包括所述分离核酸、稳定地整合到基因组中的本发明的表达盒或载体的转基因细胞；以及
c)从所述转基因细胞再生出完整的植物。
在上文详细给出了这些步骤可以如何进行的信息。
此外，本发明涉及一种用于改进植物芽生长的方法，该方法包括：
i)将本发明的一种分离核酸导入到一种植物中；以及
ii)表达该导入的本发明的核酸。
在下面通过实例对本发明进行进一步描述。
附图说明
图1显示了与野生型相比较的rock2、rock3以及ore12的营养生长：(A.)幼苗19DAG(萌发后天数)的照片。植物在长日照条件下生长。(B.)来自(A.)中所示的植物的叶子的比较，没有ore12。(C.)18DAG的鲜重的比较；n＝10；*，·＝p＜0，01；**，··＝p＜0，005；***，···＝p＜0，0001。*＝与WT相比较；·＝与ore12相比较；
图2显示了在长日照条件下的rock和ore12的叶子6的自然衰老：(A.)从16天到37DAE(出苗后天数)的光系统II的光合效率的降低。(B.)16天到35DAE的叶绿素含量的降低。(C.)来自(A.)和(B.)中所示的植物的叶子的比较。n＝10；·＝p＜0，01；与ore12相比较··＝p＜0，005；
图3显示了rock2、rock3和ore12突变体植物以及表达pAHK2：rock2或pAHK3：rock3的转基因系的芽参数。(A.)rock2以及转基因rock2和rock3突变体植物的植物高度增加了。(B.)rock2突变体以及转基因rock2和rock3系在主茎上形成了更多的长角果。n＝10；*，·＝p＜0，01；***，···＝p＜0，0001；*＝与WT相比较；·＝与ore12相比较；
图4显示了rock2、rock3和ore12突变体植物以及表达pAHK2：rock2或pAHK3：rock3的转基因系的芽参数：(A.，B.)rock2和rock3突变体以及转基因rock2和rock3系形成了(A.)更厚的茎以及(B.)更大的花。n＝10；***，···＝p＜0，0001；*＝与WT相比较；·＝与ore12相比较；
图5显示了相比于野生型的两种独立的pAHK3：rock3转基因系的种子产量。相比于野生型植物的转基因系具有一个高达47％的种子产量的增加。n＝10；**＝p＜0，005；与WT相比较***＝p＜0，0001。
具体实施方式
材料与方法
基于rock2和rock3等位基因的抑制细胞分裂素缺乏的表型结果的能力，对这些等位基因进行了鉴定和分离，该细胞分裂素缺乏是由编码细胞分裂素氧化酶/脱氢酶的CKX基因的过表达引起的。
植物材料和生长条件
将拟南芥的Columbia(哥伦比亚)(Col-0)生态型用作野生型。这些植物生长在温室中的土壤上或在无菌条件下的含有ATS-培养基的培养皿中(Estelle(埃斯特尔)，M.A.，以及Somerville(萨默维尔)，C.(1986).Auxin-resistantmutants of Arabidopsis thaliana with an altered morphology.Mol.Gen.Genet.206，200-206)。所有的植物都生长在22℃下并且在长日照条件下(16h光照/8h黑暗)。
诱变
在室温下在100ml 0.2％(v/v)的甲磺酸乙酯中将大约25000个35S：CKX1种子浸泡16小时(Werner(维尔纳)，T.，Motyka(莫蒂卡)，V.，Laucou(洛库)，V.，Smets(斯麦茨)，R.，Van Onckelen(范奥克伦)，H.，和Schmülling(施米林)，T.(2003).Cytokinin-deficient transgenic Arabidopsis plants show multipledevelopmental alterations indicating opposite functions of cytokinins in theregulation of shoot and root meristem activity.Plant Cell 15，2532-2550)。该M1代生长为单个植株并且就具有野生型样表型的植物对该M2代进行筛选。
遗传分析
通过将rock235S：CKX1与rock335S：CKX1植物与野生型生态型Landsbergerecta进行杂交产生了针对rock2和rock3的作图群体。这些F2子代植物被用来对rock2和rock3进行作图。
为了分析野生型中的rock2和rock3突变的结果，在35S：CKX1背景下将rock2和rock3抑制基因突变型与野生型Columbia(哥伦比亚)进行杂交。来自此杂交的F1子代植物仍然显示出回复突变体表型，这表明rock2和rock3等位基因是显性的。在野生型背景中就rock2和rock3植物(则称为rock2和rock3突变体)对该F2代进行筛选。
转基因系的建立
为了构建pAHK2：rock2转基因，通过PCR对AHK2的一个2124bp的启动子区(来自拟南芥Col-0的基因组DNA)进行扩增，并且用GatewayTM技术将其克隆到pDONRTMP4-P1R入门载体中(Invitrogen，卡尔斯鲁厄，德国)。在用GatewayTM技术将该AHK2编码序列克隆到该pDONRTM221入门载体(Invitrogen)之后，通过基于PCR的诱变用“QuickChange Site-Directed Mutagenesis”试剂盒(Stratagene，拉荷亚，美国)导入rock2点突变，以获得rock2等位基因。用MultisiteGatewayTM重组克隆在pK7m24GW，3载体中结合两个片段(Karimi(卡利米)等人，2005)。为了获得pAHK3：rock3构建体，通过PCR对AHK3的一个2062bp的启动子区(来自拟南芥Col-0的基因组DNA)进行扩增，并且将该片段插入到pDONRTMP4-P 1R入门载体中(Invitrogen)。对来自拟南芥Col-0的包含该基因的开放阅读框的AHK3cDNA进行PCR扩增，并且克隆到pDONRTM222入门载体中(Invitrogen)。为了导入rock3点突变，使用了“QuickChange Site-DirectedMutagenesis”试剂盒(Stratagene，拉荷亚，美国)来获得rock3等位基因。用MultisiteGatewayTM重组克隆在pK7m24GW，3载体中使AHK3启动子与ROCK3cDNA结合(Karimi(卡利米)，M.，De Meyer(德迈耶)，B.，以及Hilson(希尔森)，P.(2005).Modular cloning in plant cells.Trends Plant Sci.10，103-105)。将两个构建体导入根癌农杆菌菌株GV3101中，并且使用花序浸渍法转化拟南芥Col-0植物(Clough(克拉夫)，S.J.，以及Bent(本特)，A.F.(1998).Floral dip：a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.16，735-743)。使用卡那霉素选择转基因系，并且使这些系繁殖成T3或T4代。
形态测量
在萌发之后18天，对莲座叶丛拍摄数字照片，并且使用Scion图像程序对莲座叶丛的直径进行测量(Scion(塞恩)公司，佛雷德里克，马里兰，美国)。对在阶段14的花进行照相，并且使用Scion(塞恩)图像程序也测量了它们的大小。
鲜重、最后的植物高度以及产量参数的确定
通过称重或者这些植物的莲座叶丛(没有莲座叶丛的嫩芽)或者这些植物的全部空中的部分，对鲜重进行测量。在开花终止之后确定最终株高和长角果的数量。为了分析种子产量，在开花终止之后将植物放入纸袋中。在将这些植物保持干燥另外三周之后，确定种子的总重量。
光合参数
用FluorCam(Photon Systems Instruments，布尔诺，捷克共和国)测量暗适应植物的PSII光化学最大效率(Fv/Fm比率)。使用叶绿素计SPAD-502测量个体叶子的叶绿素含量(柯尼卡美能达公司，不来梅，德国)，取在同一片叶子上的两个测量值的平均值。
结果
1.在35S：CKX1背景中的突变体等位基因的分析
为了将rock3突变的结果与ore12突变的结果进行比较，将后者基因渗入35S：CKX1背景中(在此背景中鉴定rock3)。将会显示的是该ore12突变部分地回复了CKX1过表达的表型结果。然而，在发育过程中的不同时间点，回复的程度不如用rock3等位基因所实现的回复强。这个差异对于幼苗大小以及莲座叶丛直径而言是最明显的。这两个参数对于CKX1ox植物的细胞分裂素状态的改变是很好的指示物。
2.在野生型背景中的突变体等位基因的分析
然后比较在野生型背景(Col-0)下的所有三个突变体等位基因(rock2、rock3以及ore12)的结果。在图1中显示的是，只有rock2和rock3等位基因显著增强了野生型植物的营养生长，然而该ore12等位基因并没有导致显著的生长增强。已经可以在种子萌发之后看到这种作用(图1A)并且在随后的发育阶段根据叶子大小的比较也是明显的(图1B)。rock2和rock3等位基因的这些作用不仅相比于野生型植物而且相比于ore12等位基因是显著更强的。相比于野生型，rock2和rock3两者在18个萌发后天数(DAG)都引起了大于75％的鲜重的增加。贯穿植物的完整生命周期的莲座叶丛以及全株鲜重的增加的分析表明，在鲜重差异方面的增加在32至40个DAG之间是特别明显的，并且用rock2等位基因的该作用是最强的。
已知的是由rock2等位基因引起的细胞分裂素状态的增强延迟了叶子衰老。比较了在野生型植物、ore12突变体植物以及rock突变体中的叶子衰老。图2清楚地显示了相比于野生型的所有突变体植物中的叶子衰老开始的延迟。在野生型植物中的6`s莲座叶在大约17DAE并且在突变体植物中大约21DAE到23DAE的PS II的光合效率(Fv/Fm)开始降低(图2A)。在这些植物中，rock2植物显示了最早的叶子衰老的开始，随后是ore12和rock3。维持了叶子衰老时间方面的这种差异，从而导致了与野生型叶子相比较的大约十天更长的rock3叶子寿命(图2A)。通过测量衰老的另一个参数，叶绿素的减少(图2B)连同叶子的目测(图2C)证实了这个结果。
3.rock等位基因的转基因表达的分析
在下一个步骤中，分析了显性rock等位基因的转基因表达的结果。为此，我们用基因转化了拟南芥属Col-0植物，这些基因对应地包括AHK2和AHK3的5′上游调控区的ca.2kb以及对应的rock2和rock3编码序列。这些基因对应地命名为pAHK2：rock2和pAHK3：rock3，并且在图3至图5中被标记为pAHK2：rock2和pAHK3：rock3。通常发现的是，在rock突变体植物中改变的表型性状的进一步增强。图3和图4显示的是，相比于野生型或ore12植物，pAHK2：rock2和pAHK3：rock3转基因植物具有显著的苗高增加(图3A)、主茎上的角果数的显著增加(图3B)、由在径向尺寸上更大的细胞引起的更粗的茎(图4A)以及花的大小的显著增加(图4B)。如在图5中所示，相比于野生型，可以显示的是pAHK3：rock3转基因植物具有显著更高的种子产量。

Claims (10)

1.一种分离核酸，所述分离核酸由编码如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的核酸序列组成；
其中，该氨基酸序列在对应于SEQ ID No.1的第552位的位置处具有氨基酸苯丙氨酸(F)。
2.一种分离核酸，所述分离核酸由编码如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的核酸序列组成；
其中，该氨基酸序列在对应于SEQ ID No.2的第179位的位置处具有氨基酸异亮氨酸(I)。
3.如权利要求1和2中任一项所述的分离核酸，所述分离核酸进一步包括至少一个启动子序列，其中该至少一个启动子序列与编码的核酸序列彼此功能连接。
4.一种转基因表达盒，该转基因表达盒用于表达包括如权利要求1至3中任一项所述的分离核酸的核酸。
5.一种载体，包括如权利要求1至3中任一项所述的分离核酸或如权利要求4所述的转基因表达盒。
6.如权利要求1至3中任一项所述的分离核酸、如权利要求4所述的转基因表达盒或如权利要求5所述的载体用于制造转基因植物的用途，其中，所述植物选自十字花科。
7.一种用于制造转基因植物的方法，包括以下步骤：
a)将如权利要求1至3中任一项所述的分离核酸、如权利要求4所述的转基因表达盒或如权利要求5所述的载体导入一个或多个植物细胞中，以生产转基因细胞；
b)选择包括稳定地整合到基因组中的所述分离核酸、表达盒或载体的转基因细胞；以及
c)从所述转基因细胞或自其衍生的细胞再生出完整植物，其中所述植物选自十字花科。
8.一种通过如权利要求1至3中任一项所述的分离核酸编码的分离多肽。
9.一种分离多肽，所述分离多肽由如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中的至少一种组成。
10.一种用于改进植物芽生长的方法，该方法包括：
i)将权利要求1至3中任一项所述的分离核酸导入植物中；以及
ii)表达导入的如权利要求1至3中任一项所述的核酸，
其中，所述植物选自十字花科。
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