BRPI0612737A2

BRPI0612737A2 - métodos para aumentar o rendimento de plantas com relação às plantas de controle, e para produzir uma planta transgênica tendo rendimento aumentado com relação às plantas de controle, planta, parte de planta ou célula de planta, molécula de ácido nucleico isolado, construção, planta transgênica, partes coletáveis de uma planta, produtos, e, uso de um gene ou variante do mesmo, ou uso de um polipeptìdeo ou homólogo do mesmo

Info

Publication number: BRPI0612737A2
Application number: BRPI0612737-1A
Authority: BR
Inventors: Valerie Frankard
Original assignee: Cropdesign Nv
Priority date: 2005-07-05
Filing date: 2006-07-04
Publication date: 2012-10-02
Also published as: AU2006265264B2; BRPI0612737A8; CN101218347A; MX2007015822A; CA2611250A1; US20090106861A1; WO2007003409A3; BRPI0612737B1; AU2006265264A1; CN101218347B; WO2007003409A2; AR054158A1; EP1902134A2

Abstract

MéTODOS PARA AUMENTAR O RENDIMENTO DE PLANTAS COM RELAçãO àS PLANTAS DE CONTROLE, E PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGêNICA TENDO RENDIMENTO AUMENTADO COM RELAçãO áS PLANTAS DE CONTROLE, PLANTA, PARTE DE PLANTA OU CéLULA DE PLANTA, MOLéCULA DE áCIDO NUCLEICO ISOLADO, CONSTRUçãO, PLANTA TRANSGêNICA, PARTES COLETáVEIS DE UMA PLANTA, PRODUTOS, E, USO DE UM GENE OU VARIANTE DO MESMO, OU USO DE UM POLIPEPTìDEO OU HOMóLOGO DO MESMO. A presente invenção refere-se a um método para aumentar o rendimento de plantas por modulação da expressão em uma planta de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou um homólogo de tal polipeptídeo. Um tal método compreende introduzir, em uma planta, um ácido nucleico de dois domínios WRKY ou variantes do mesmo. A invenção também refere-se a plantas transgências tendo introduzidas nas mesmas um ácido nucleico de dois domínios WRKY ou variante do mesmo, cujas plantas tem um rendimento aumentado com relação às plantas de controle. A presente invenção também refere-se a construções utilizáveis nos métodos da invenção. A invenção adicionalmente refere-se a seqüencias de ácido nucleico específicas codificando as proteínas acima mencionadas tendo a atividade de melhora do crescimento de plantas acima mencionada, construções de ácido nucleico, vetores e plantas contendo referidas seqüências de ácido nucleico.

Description

"MÉTODOS PARA AUMENTAR O RENDIMENTO DE PLANTAS COM RELAÇÃO ÀS PLANTAS DE CONTROLE, E PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA TENDO RENDIMENTO AUMENTADO COM RELAÇÃO ÀS PLANTAS DE CONTROLE, PLANTA, PARTE DE PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, CONSTRUÇÃO, PLANTA TRANSGÊNICA, PARTES COLETÁVEIS DE UMA PLANTA, PRODUTOS, E, USO DE UM GENE OU VARIANTE DO MESMO, OU USO DE UM POLIPEPTÍDEO OU HOMÓLOGO DO MESMO"

A presente invenção refere-se geralmente ao campo de biologia molecular e refere-se a um método para aumentar o rendimento de plantas com relação às plantas de controle. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um método para aumentar o rendimento de plantas compreendendo modular a expressão em uma planta de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou um homólogo deste polipeptídeo. A presente invenção refere-se também a plantas tendo expressão modulada de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou um homólogo deste polipeptídeo, cujas plantas tem rendimento aumentado com relação a plantas de controle. A invenção também provê construções utilizáveis nos método da invenção.

A invenção adicionalmente refere-se a seqüências de ácido nucleico específicas codificando para as proteínas acima mencionadas tendo a atividade de melhora do crescimento de plantas acima mencionada, construções de ácido nucleico, vetores e plantas contendo referidas seqüências de ácido nucléico.

A população mundial em crescimento constante e o suprimento diminuído de terras aráveis disponíveis para agricultura impulsionam as pesquisas para melhorar a eficiência da agricultura. Os meios convencionais para melhorar a horticultura e as culturas utilizam técnicas de criação seletivas para identificar plantas tendo características desejáveis. No entanto, estas técnicas de criação seletivas tem vários inconvenientes, ou seja, que estas técnicas são tipicamente de largo emprego de mão de obra e resultam em plantas que com freqüência contém componentes genéticos heterogêneos que podem nem sempre resultar no traço desejável ser passado adiante das plantas parentais. Os avanços em biologia molecular tem permitido à humanidade modificar o germplasma de animais e plantas. A engenharia genética de plantas acarreta o isolamento e manipulação de material genético (tipicamente na forma de DNA ou RNA) e a introdução subseqüente deste material genético em uma planta. Esta tecnologia tem a capacidade de distribuir culturas ou plantas tendo melhorados traços econômicos, agronômicos ou de horticultura. Um traço de particular interesse econômico é o rendimento. O rendimento é normalmente definido como a produtividade mensurável de valor econômico de uma cultura, necessariamente relacionado com uma cultura, área e/ou período de tempo especificados. Isto pode ser definido em termos de quantidade e/ou qualidade. O rendimento é diretamente dependente de vários fatores, por exemplo, o número e tamanho dos órgãos, arquitetura das plantas, (por exemplo o número de galhos), a produção de sementes e mais. O desenvolvimento de raízes, absorção de nutrientes e tolerância ao estresse podem ser também fatores importantes na determinação do rendimento. A otimização de um dos fatores acima mencionados pode assim contribuir para o aumento do rendimento da cultura.

A biomassa de plantas é o rendimento para culturas de forragem como alfafa, milho para silagem e feno. Muitas proxias para o rendimento tem sido usadas em culturas de grãos. A principal entre estas são as estimativas do tamanho das plantas. O tamanho das plantas pode ser medido em muitos modos dependendo da espécie e estágio de desenvolvimento, mas incluem peso seco de planta total, peso seco acima da terra, peso fresco acima da terra, área de folhas, volume do talo, altura da planta, diâmetro da roseta, comprimento da folha, comprimento da raiz, massa da raiz, número de rebentos, e número de folhas. Muitas espécies mantém uma relação conservativa entre o tamanho de partes diferentes da planta em um dado estágio de desenvolvimento. Estas relações alométricas são usadas para extrapolar de uma destas medidas de tamanho para outra (por exemplo Tittonell et al 2005 Agric Ecosys & Environ 105: 213). O tamanho da planta em um estágio de desenvolvimento inicial irá tipicamente correlacionar com o tamanho da planta depois no desenvolvimento. Uma planta maior com uma área de folha maior pode tipicamente absorver mais luz e dióxido de carbono do que uma planta menor e, assim, irá provavelmente ganhar um maior peso durante o mesmo período (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50:39). Isto está em adição à continuação potencial da vantagem genética ou micro- ambiental que a planta precisa alcançar o tamanho maior inicialmente. Existe um componente genético forte para a taxa de crescimento e tamanho da planta (por exemplo ter Steege et al 2005 Plant Physiology 139:1078) e assim para uma faixa de diversos genótipos, tamanho de planta sob uma condição ambiental irá provavelmente estar correlacionado com o tamanho sob outra (Hittalmani et al 2003 Theoretical Applied Genetics 107:679). Deste modo, um meio padrão é usado como uma proxia para os meios diversos e dinâmicos encontrados em diferentes locais e tempos de culturas no campo. O índice de colheita, a relação de rendimento de semente para peso seco acima da terra, é relativamente estável sob muitas condições ambientais e assim uma correlação robusta entre o tamanho de planta e o rendimento do grão pode ser obtida com freqüência (por exemplo Rebetzke et al 2002 Crop Science 42:739). Estes processos estão intrinsecamente ligados porque a maior parte da biomassa de grãos é dependente de produtividade fotossintética corrente ou armazenada pelas folhas e caule da planta. (Gardener et al 1985 Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, pp68-73) Assim, a seleção para tamanho da planta, mesmo em estágios iniciais de desenvolvimento, tem sido usada como um indicador para o rendimento potencial futuro (por exemplo Tittonell et al 2005 Agric Ecosys & Environ 105: 213). Quando testando o impacto de diferenças genéticas em tolerância ao estresse, a capacidade de padronizar as propriedades do solo, temperatura, e disponibilidade de água e nutrientes e intensidade da luz é uma vantagem intrínseca de estufa ou meios de câmara de crescimento de plantas comparado com o campo. No entanto, as limitações artificiais no rendimento devido a uma fraca polinização devido à ausência de vento ou insetos, ou espaço insuficiente para crescimento de canópia ou raiz madura, podem limitar o uso destes meios controlados para testar as diferenças de rendimento. Assim, medidas de tamanho de plantas em desenvolvimento inicial, sob condições padronizadas em uma câmara de crescimento ou estufa, são práticas padrões para prover indicação de vantagens de rendimento genético potencial.

A capacidade de aumentar o rendimento da planta deve ter muitas aplicações em áreas como agricultura, incluindo a produção de plantas ornamentais, arboricultura, horticultura e silvicultura. O aumento do rendimento também pode encontrar uso na produção de algas para uso em bio-reatores (para a produção biotecnológica de substâncias como fármacos, anticorpos ou vacinas, ou para a bioconversão de lixo orgânico) e outras tais áreas.

Os polipeptídeo de fator de transcrição são geralmente definidos como proteínas que mostram afinidade de ligação de DNA específico de seqüência e que são capazes de ativar e/ou reprimir a transcrição. As proteínas WRXY são uma família grande de fatores de transcrição específicos de plantas, funcionando ou sozinhos ou como parte de complexos proteína-DNA multiméricos. A maior parte destas proteínas está envolvida na defesa contra o ataque de uma ampla faixa de patógenos (Eulgem et al., EMBO J., 18, 1999: 4689 - 4699, Deslandes et ai, Proc. NatL Acad. Sei, USA, 99, 2002: 2404 - 2409, Li et al., Plant Cell 16, 2004: 319 - .331). Além disso, as proteínas, WRKY estão envolvidas em respostas aos estresses abióticos como machucados (Yoda et al., Mol. Genet. Genomics, .267, 2002: 154 - 161), seca, calor e frio (Fowler et al., Plant Cellj 14, 2002: 1675 - 1690, Maré et al., Plant MoL BioL9 55, 2004: 399 - 416). Alguns membros desta família foram também mostrados como desempenhando papéis regulatórios importantes na formação de tricomas (Johnson et al., Plant Cellj 14, 2002: 1359 - 1375), senescência (Hinderhofer et al., Planta, 213, .2001: 469 - 473, Guo et al., Plant Cell Environ., 27, 2004: 521 - 549), dormência e vias metabólicas.

As proteínas WRKY são uma família de múltiplos genes. Em Arabidopsis thaliana, mais de 74 membros da família são conhecidos (Uelker et al., Curr. Op. in Plant Biol., 7, 2004: 491 - 498). Eles contém pelo menos um domino WRKY altamente conservado, que tipicamente consiste de cerca de 60 aminoácidos conservados. O domínio WRKY compreende em sua extremidade amino-terminal um heptapeptídeo registrado WRKYGQK (onde Q em casos raros pode ser substituído por E ou K) e em sua extremidade carbóxi terminal um motivo de prolongamento de zinco distinto de outros motivos de prolongamento de zinco conhecidos. Para regular a expressão dos genes (por ativação e/ou repressão), o domínio WRKY liga aos elementos cis- atuantes no promotor de genes de marcação, com uma preferência para a caixa W, mas também para outros com SURE ou elementos SP8 (para estudo, ver Eulgem et al (2000) Trends Plant Sci 5(5): 199-206). A ligação de DNA pode ser bloqueio com quelantes de metal como EDTA ou o-fenatrolina e restaurada por adição de íons zinco. Os fatores de transcrição de WRKY são pertencendo aos assim chamados genes de "resposta prematura imediata", que significa que eles estão envolvidos nas respostas rápidas de plantas às feridas, aos patógenos e aos indutores de resistência a doenças. 6

As proteínas WRKY foram classificadas em três grupos principais com base no número de domínios WRKY e nos aspectos de seu motivo de prolongamento de zinco associado.

- Grupo I compreende proteínas com dois domínios WRKY e a Cys2His2 (ou C2-H2) motivo de prolongamento de zinco (mais precisamente C-X4_5-C-X22_23-H-Xi-H) ou Cys2HisCys (ou um motivo de prolongamento de zinco C2-HC) (mais precisamente C-X7-C-X23-H-XrC), onde C é Cys, H é His, e X é qualquer aminoácido);

Grupo Π (o grupo maior) compreende proteínas com um domínio WRKY e o mesmo motivo de prolongamento de zinco Cys2His2 como no grupo 1;

Grupo ΙΠ compreende proteínas com um domínio WRKY mas um motivo de.prolongamento de zinco Cys2HisCys (ou um C2-HC) (mais especificamente C-X4_5-C-X22-23-H-Xi-C ou C-X7-C-X23-H-XrC, onde C é Cys, H é His, e X é qualquer aminoácido) em vez de Cys2His2.

Pensa-se que o genoma de arroz codifica acima de 100 proteínas com pelo menos um domínio WRKY complete, e pelo menos 12 destes são relatados como contendo dois domínios WRKY. (Zhang & Wang (2005) BMC Evolutionary Biology 5:1). Neste 12, o domínio WRKY carbóxi-terminal é o sítio da atividade de ligação de DNA principal, enquanto o domínio WRKY amino-terminal facilita a ligação de DNA ou engata em interações proteína-proteína. O motivo de prolongamento de zinco em cada domínio WRKY pode estar envolvido na ligação de ou DNA ou proteínas.

Como outros fatores de transcrição, as proteínas WRKY tem uma abundância de domínios de repressão ou ativação de transcrição potencial. Um aspecto comum de muitos domínios afetando a transcrição é a predominância de alguns aminoácidos, incluindo alanina (ALA), glutamina (Glu), prolina (Pro), serina (Ser), Treonina (Thr), e aminoácidos carregados. Outro aspecto comum provavelmente a ser encontrado em proteínas WRKY é um sinal de localização nuclear básico (NLS)s que geralmente consiste de uma extensão curta de resíduos de aminoácidos básicos.

Verificou-se, agora, que a modulação da expressão em uma planta de um ácido nucleico codificando polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou um homólogo deste polipeptídeo dá plantas tendo aumentado rendimento com relação às plantas de controle.

De acordo com uma forma de realização da presente invenção, provê-se um método para aumentar o rendimento de plantas com relação às plantas de controle, compreendendo modular a expressão em uma planta de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou um homólogo de tal polipeptídeo.

Com vantagem, o desempenho dos métodos de acordo com a presente invenção resulta em plantas tendo rendimento aumentado, particularmente rendimento de sementes, com relação às plantas de controle.

Preferivelmente, o polipeptídeo usado no método da invenção tem dois domínios WRKY, ou o homólogo compreende de amino-término para carbóxi- término (i) um domínio rico em Pro-Ser; e (ii) dois domínios WRKY incluindo um motivo C2-H2 prolongamento de zinco.

A escolha de plantas de controle é uma parte de rotina da configuração experimental e pode incluir plantas de tipo selvagem correspondentes ou plantas correspondentes sem o gene de interesse. A planta de controle pode ser também um multizigoto da planta a ser comparada. Os nulizigotos são indivíduos faltando o transgene por segregação. Preferivelmente, a planta de controle é da mesma espécie, mais preferivelmente da mesma variedade que a planta a ser comparada. Uma "planta de controle" como usado aqui refere-se não somente às plantas completas, mas também a partes de plantas, incluindo sementes e partes de sementes.

Uma "referência", "planta de referência", "planta de controle", 8

tipo selvagem", ou "planta de tipo selvagem" é particularmente uma célula, um tecido, um órgão, uma planta, ou uma parte da mesma, que não foi produzida de acordo com o método da invenção. Assim, os termos "tipo selvagem", "controle" ou "referência" são interpermutáveis e podem ser uma célula ou uma parte da planta como um organelo ou tecido, ou uma planta, que não foi modificada ou tratada de acordo com o método aqui descrito de acordo com a invenção. Assim, a célula ou parte da planta como um organelo ou uma planta usada como tipo selvagem, controle ou referência corresponde à célula, planta ou parte da mesma como possível ou está em qualquer outra HO propriedade mas no resultado do processo da invenção como idêntica ao assunto da invenção na medida do possível. Assim, o tipo selvagem, controle ou referência é tratado de modo idêntico ou tão idêntico como possível, isto é que somente condições ou propriedades podem ser diferentes que não influenciam a qualidade da propriedade testada. Isto significa, em outras palavras, que tipo selvagem denota (1) uma planta, que transporta a forma não alterada ou não modulada de um gene ou alelo ou (2) o material de partida /planta da qual as plantas produzidas pelo processo ou método da invenção são derivadas.

Preferivelmente, qualquer comparação entre plantas de tipo selvagem e plantas produzidas pelo método da invenção é realizada sob condições análogas. O termo "condições análogas" significa que todas as condições como, por exemplo, condições de cultura ou crescimento, condições de teste (como composição de tampão, temperatura, substratos, cepa de patógeno, concentrações e outros) são mantidas idênticas entre as experiências a serem comparadas.

A "referência", "controle" ou "tipo selvagem" é preferivelmente um indivíduo, por exemplo, um organelo, uma célula, um tecido, uma planta que não foi modulada, modificada ou tratada de acordo com o processo aqui descrito da invenção e é em qualquer outra propriedade tão similar ao assunto da invenção como possível. A referência, controle ou tipo selvagem está em seu genoma,

transcriptoma, proteoma ou metaboloma tão similar como possível ao assunto da presente invenção. Preferivelmente, os termos organelo, célula, tecido ou planta de "referência", "controle" ou "tipo selvagem" referem-se a um organelo, célula, tecido ou planta que são quase geneticamente idênticos ao organelo, célula, tecido ou planta da presente invenção ou uma parte dos mesmos, preferivelmente 95%, mais preferido são .98%, ainda mais preferido são 99,00%, em particular 99,10%, 99,30%), .99,50%, 99,70%, 99,90%, 99,99%, 99, 999% ou mais. Mais preferível, "referência", "controle" ou "tipo selvagem" é preferivelmente um indivíduo, por exemplo, um organelo, uma célula, um tecido, uma planta que é geneticamente idêntico à planta, tecido, célula, organelo usados de acordo com o método da invenção exceto que as moléculas de ácido nucleico ou o produto de gene codificado pelos mesmos são mudadas, moduladas ou modificadas de acordo com o método da invenção.

Em caso, um controle, referência ou tipo selvagem diferindo do indivíduo da presente invenção somente por não ser submetido ao método da invenção não pode ser provido, um controle, referência ou tipo selvagem pode ser uma planta em que a causa para a modulação da atividade conferindo o aumento dos metabólitos, como descrito nos exemplos.

O termo "rendimento", em geral, significa uma produção mensurável de valor econômico, necessariamente relacionada com uma cultura especificada, a uma área e a um período de tempo. As partes de plantas individuais diretamente contribuem para o rendimento com base em seu número, tamanho e/ou peso. Apesar do rendimento real ser o rendimento por acre para uma cultura e ano, que é determinado por divisão da produção total (inclui tanto a produção coletada como a estimada) por acres plantados.

Os termos "aumentar", "melhorando" ou "melhorar" são 10

interpermutáveis e devem significar no sentido da aplicação de pelo menos a 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10%, preferivelmente pelo menos 15% ou 20%, mais preferivelmente 25%, 30%, 35% ou 40% mais produção e/ou crescimento em comparação com a planta de tipo selvagem como aqui definido.

O aumento referido à atividade das quantidades de polipeptídeo em uma célula, tecido, organelo, órgão ou organismo ou uma parte dos mesmos é preferivelmente a pelo menos 5%, preferivelmente a pelo menos 10% ou a pelo menos 15%, especialmente preferivelmente a pelo menos 20%, 25%», 30% ou mais, muito especialmente preferivelmente são a pelo menos 40%, 50% ou 60%, o mais preferivelmente são a pelo menos 70% ou mais em comparação com o controle, referência ou tipo selvagem.

O termo "rendimento aumentado" como definido aqui é tomado para significar um aumento em qualquer um ou mais dos seguintes, cada com relação às plantas de controle:

(i)aumentada biomassa (peso) de uma ou mais partes da planta, particularmente partes acima da terra (coletáveis), aumentada biomassa da raiz ou biomassa aumentada de qualquer outra parte coletável;

(ii)aumentado rendimento de semente total, que inclui um aumento na biomassa da semente (peso da semente) e que pode ser um aumento no peso de semente por planta ou em uma base de semente individual;

(iii)aumentado número de flores (floretes) por panícula,

(iv)aumentado número de sementes (cheias);

(v)aumentando tamanho da semente, que também pode influenciar a composição das sementes,

(vi)aumentado volume de semente, que também pode influenciar a composição de sementes (incluindo óleo, proteína, e teor total de carboidrato e composição), (vii) aumentada área de semente individual,

(viii) aumentando comprimento e/ou largura de semente

individual;

(ix) índice de colheita aumentado, que é expressado como uma relação do rendimento de partes coletáveis, como sementes, sobre a biomassa total, e

(x) aumentado peso de mil grãos aumentado (TKW), o que é extrapolado do número de sementes cheias contadas e seu peso total. Um TKW aumentado pode resultar de um tamanho de semente e/ou peso de semente aumentados. Um TKW aumentado pode resultar de um aumento no tamanho do embrião e/ou endosperma.

O termo "expressão" ou "expressão de genes" significa a transcrição de um gene especifico ou genes específicos. Preferivelmente, esta expressão leva ao aparecimento de um traço fenotípíco. O termo "expressão" ou "expressão de genes" particularmente significa a transcrição de um gene ou genes em RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA com subseqüente tradução do último em uma proteína. O processo inclui a transcrição de DNA, processamento do produto de mRNA resultante e sua tradução em uma proteína ativa.

O termo "modulação" significa em relação à expressão ou expressão de genes, um processo em que o nível de expressão é mudado pela referida expressão de genes em comparação com a planta de controle, preferivelmente o nível de expressão é aumentado. A expressão original, não modulada, pode ser de qualquer tipo de expressão de um RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA com subseqüente tradução. O termo "modulação da atividade" deve significar qualquer mudança da expressão das seqüências de ácido nucleico da invenção ou proteínas codificadas, que leva a um rendimento aumentado e/ou crescimento aumentado das plantas.

Tomando-se milho como exemplo, um aumento no rendimento pode ser manifestado como um ou mais dos seguintes: aumento no número de plantas por hectare ou acre, aumento no número de espigas por planta, aumento no número de fileiras, número de grãos por fileira, peso do grão, TKW, comprimento/ diâmetro da espiga, entre outros. Tomando arroz como um exemplo, um aumento no rendimento pode se manifestar como um aumento em um ou mais dos seguintes: número de plantas por hectare ou acre, número de panículas por planta, número de espiguetas por panícula, número de flores por panícula, aumento na taxa de enchimento das sementes, aumento em TKW, dentre outros. Um aumento no rendimento também pode resultar em arquitetura modificada, ou pode ocorrer como um resultado da arquitetura modificada.

De acordo com um aspecto preferido, o desempenho dos métodos da invenção resulta em plantas tendo rendimento de semente aumentado com relação às plantas de controle.

Em particular, este rendimento de semente aumentado inclui TKW aumentado, área de semente individual aumentado, comprimento de semente individual aumentado, largura de semente individual aumentada, número aumentado de sementes e número aumentado de flores por panícula, cada com relação às plantas de controle.

Porque as plantas transgênicas de acordo com a presente invenção tem rendimento aumentado, é provável que estas plantas demonstrem uma taxa de crescimento aumentado (durante pelo menos parte de seu ciclo de vida), com relação à taxa de crescimento de plantas de controle em um estágio correspondente em seu ciclo de vida. A taxa de crescimento aumentado pode ser específica para uma ou mais partes de uma planta (incluindo sementes) ou pode ser completamente substancialmente na planta completa. As plantas tendo uma taxa de crescimento aumentado pode demonstrar uma florescência prematura. A florescência retardada não é geralmente um traço agronômico desejável. O aumento na taxa de crescimento pode ocorrer em um ou mais estágios no ciclo de vida de uma planta ou durante substancialmente o ciclo de vida de planta total. A taxa de crescimento aumentada durante os estágios iniciais no ciclo de vida de uma planta pode refletir vigor melhorado. O aumento na taxa de crescimento pode alterar o ciclo de colheita de uma planta deixando as plantar ser semeadas depois e/ou colhidas antes do que seria de outra forma possível. Se a taxa de crescimento for aumentada de modo suficiente, pode permitir a outra semeadora de sementes da mesma espécie de planta (por exemplo semeando e colhendo plantas de arroz seguido por semeadura e colheita de outras plantas de arroz todas dentro de um período de crescimento convencional). Similarmente, se a taxa de crescimento for suficientemente aumentada, ela pode permitir outra semeadura das sementes de diferentes espécies de plantas (por exemplo a semeadura e colheita de plantas de arroz seguida, por exemplo, por semeadura e colheita opcional de feijão de soja, batata ou qualquer outra planta). Os tempos adicionais de colheita do mesmo material de raiz no caso de algumas plantas de cultura também pode ser possível. A alteração do ciclo de colheita de uma planta pode levar a um aumento na produção de biomassa anual por acre (devido a um aumento no número de vezes (digamos em um ano) que qualquer planta particular pode ter crescido e ser colhida). Um aumento na taxa de crescimento também pode permitir o cultivo de plantas transgênicas em uma área geográfica mais ampla do que suas contra-partes de tipo selvagem, porque as limitações territoriais para o cultivo de uma cultura são com freqüência determinadas por condições ambientais adversas no momento do plantio (estação prematura) ou no momento da colheita (estação tardia). Estas condições adversas podem ser evitadas se o ciclo de colheita for encurtado. A taxa de crescimento pode ser determinada por derivação de vários parâmetros das curvas de crescimento, como estes parâmetros podem ser: T-Mid (o tempo que leva para as plantas alcançarem 50% de seu tamanho máximo) e T-90 (tempo que leva para as plantas alcançarem 90% de seu tamanho máximo), dentre outros.

O desempenhos dos métodos da invenção dá plantas preferivelmente tendo uma taxa de crescimento aumentado. Assim, de acordo com a presente invenção, provê-se um método para aumentar a taxa de crescimento em plantas, cujo método compreende modular a expressão em uma planta de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou um homólogo deste polipeptídeo.

Um aumento no rendimento e/ou taxa de crescimento ocorre se a planta estiver sob condições de não estresse ou se a planta for exposta aos vários estresses comparada com as plantas de controle. As plantas tipicamente respondem a exposição a estresses por crescimento mais lento. Em condições de estresse severo, a planta pode mesmo parar de crescer no todo. Um estresse brando, por outro lado, é definido aqui como sendo qualquer estresse ao qual a planta é exposta e que não resulta na planta cessar de crescer no todo sem a capacidade de iniciar o crescimento. O estresse brando no sentido da invenção leva a uma redução no crescimento da plantas estressadas de menos do que 40%, 35% ou 30%, preferivelmente menos do que 25%, 20% ou 15%», mais preferivelmente menos do que 14%, 13%, 12%, 11% ou 10% ou menos em comparação com a planta de controle sob condições de não estresse. Devido a avanços nas práticas agrícolas (irrigação, fertilização, tratamentos com pesticidas), severos estresses não são com freqüência encontrados em plantas de cultura cultivadas. Como uma conseqüência, o crescimento comprometido induzido por estresse brando é com freqüência um aspecto indesejável para a agricultura. Os estresses brandos são os estresses típicos aos quais uma planta pode ser exposta, como os estresses bióticos e/ou abióticos (ambientais) de cada dia. Os estresses abióticos ou ambientais típicos incluem estresses de temperatura causados por temperaturas quentes ou frias/congelantes atípicas; estresses de sal; estresses de água (seca ou água em excesso). Os produtos químicos também causam estresses abióticos. Os estresses bióticos são tipicamente os estresses causados por patógenos, como bactérias, vírus, fungos e insetos. Preferivelmente, um aumento no rendimento e/ou taxa de crescimento ocorre de acordo com a invenção sob condições de não estresse ou condições de estresse biótico ou abiótico brando, preferivelmente condições de estresse abiótico.

As características acima mencionadas podem ser modificadas com vantagem em qualquer planta.

O termo "planta" como usado aqui engloba plantas completas, ancestrais e progênie das plantas e partes de plantas, incluindo sementes, pHO brotos, caules, folhas, raízes (incluindo tubérculos), frutos, hastes, mudas, flores, e células, tecidos e órgãos, que cada um dos acima mencionados compreende o material genético não encontrado em uma planta de tipo selvagem da mesma espécie, variedade ou cultivar. O material genético pode ser um transgene, um evento de mutagênese insercional, uma seqüência de etiquetagem de ativação, uma seqüência mudada ou um evento de recombinação homóloga. O termo "planta" também inclui culturas em suspensão, tecido de calo, embriões, regiões meristemáticas, gametófitos, esporófitos, pólen e microesporos, novamente em que cada um dos acima mencionados compreende o material genético não encontrado em uma planta de tipo selvagem da mesma espécie, variedade ou cultivar.

As plantas que são particularmente utilizáveis nos métodos ou processos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo alimentos vegetais ou forragem para animais, plantas ornamentais, culturas de alimentos, árvores, arbustos selecionados dentre a lista compreendendo Acacia spp.,Aeer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca eatechu, Astelia fragrans, Astragalus cieer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassiea spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon ampleetens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium reetum, Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine eoracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euelea sehimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glyeine javaniea, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, GreviUea spp., Guibourtia eoleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altíssima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, índigo incarnata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuea spp., Leueaena leueocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus spp., Maerotyloma axillare, Malus spp., Manihot eseulenta, Medieago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nieotianum spp., Onobryehis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum afrieanum, Pennisetum spp., Persea gratíssima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix eanariensis, Phormium eookianum, Photinia spp., Pieea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesü, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vertieillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinaeia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedesehia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargo, brocólis, couve-de- bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, folhas de couve verde, linho, repolho crespo, lentilha, colza de semente oleígena, okra, cebola, batata, arroz, soja, morango, beterraba-de-açúcar, cana-de-açúcar, girassol, batata, abóbora, chá, e algas, dentre outros. De acordo com a forma de realização preferida da presente invenção, a planta é uma planta de cultura como soja, girassol, canola, alfafa, semente de colza, algodão, tomate, batata ou tabaco. Mais preferivelmente, a planta é uma planta monocotiledônea, como cana de açúcar. Mais preferivelmente, a planta é um cereal como arroz, milho, cevada, milheto, centeio, sorgo ou aveia.

Outras plantas vantajosas são selecionadas dentre o grupo consistindo de

Asteraceae como os gêneros Helianthus, Tagetes por exemplo a espécie Helianthus annus [girassol], Tagetes lúcida, Tagetes erecta ou Tagetes tenuifolia [tagetes], Brassicaceae como os gêneros Brassica, Arabadopsis por exemplo a espécie Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza de semente oleígena, nabo silvestre] ou Arabidopsis thaliana. Fabaceae como os gêneros Glycine por exemplo a espécie Glycine max, Soja hispida ou Soja max [soja]. Linaceae como os gêneros Linum por exemplo a espécie Linum usitatissimum, [linho, linhaça]; Poaceae como os gêneros Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Oryza, Zea, Triticum por exemplo a espécie Hordeum vulgare [cevada]; Secale cereale [centeio], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [aveia], Sorghum bicolor [Sorgo, milheto], Oryza sativa, Oryza latifolia [arroz], Zea mays [milho, milho maize] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum ou Triticum vulgare [trigo, trigo de pão, trigo comum]; Solanaceae como os gêneros Solanum, Lycopersicon por exemplo a espécie Solanum tuberosum [batata], Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium ou Solanum lycopersicum [tomate].

O termo "polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou homólogo deste polipeptídeo" como definido aqui refere-se a um polipeptídeo compreendendo de término amino ao término carbóxi: (i) um domínio rico em Pro-Ser, e (ii) dois domínios WRKY incluindo um motivo C2-H2 de prolongamento de zinco.

Tipicamente, o polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou um homólogo de tal polipeptídeo pode ainda compreender um ou mais dos seguintes (i) uma extensão ácida entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre 6 aminoácidos são ou Asp (D) ou Glu (E); (ii) um NLS putativo entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre 4 aminoácidos são ou Lys (K) ou Arg (R); e (iii) um domínio conservado com pelo menos 50%, 60% ou 70%, preferivelmente 75% ou 80%, mais preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 91%, 92%, 93%, 94% ou .95%, o mais preferivelmente 96%, 97%, 98% ou 99% identidade para SEQ ID NO: 39.

O polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou um homólogo de tal polipeptídeo também pode compreender um motivo LXSP dentro do domínio rico em Pro-Ser (onde L é Leu, S é Ser, P é Pro e X é qualquer aminoácido). Além disso, o domínio rico em Pro-Ser pode ser pelo menos duas vezes tão rico em Pro e Ser comparado à composição de aminoácido média (em %) de proteínas do banco de dados de seqüência de proteína Swiss-Prot

Além disso, o polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou um homólogo de tal polipeptídeo refere-se a qualquer seqüência de aminoácido que, quando usada na construção de uma árvore filogenética de polipeptídeos compreendendo um ou dois domínios WRKY, está no e grupo que inclui polipeptídeos tendo dois domínios WRKY e um domínio rico em Pro-Ser (ver Figura 2).

Um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou homólogo de tal polipeptídeo é codificado por ácido nucleico / gene de dois domínios WRKY. Assim o termo " ácido nucleico / gene de dois domínios WRKY" como definido aqui é qualquer ácido nucleico /gene codificando um polipeptídeo tendo domínios WRKY ou um homólogo de tal polipeptídeo como definido acima.

Os polipeptídeos tendo dois domínios WRKY ou homólogos destes polipeptídeos podem prontamente ser identificados, usando técnicas de rotina bem conhecidas na arte como alinhamento de seqüência. Os métodos para o alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos na arte, estes métodos incluem GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443- .453) para encontrar o alinhamento de duas seqüências completas que maximizam o número de correspondências e minimiza o número de espaços. O algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula a identidade de seqüência percentual e realiza uma análise estatística da similaridade entre as duas seqüências. O software para realizar a análise BLAST é disponível ao público através do National Centre for Biotechnology Information. Os homólogos de um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY podem ser prontamente identificados usando, por exemplo, o algoritmo de alinhamento de seqüência múltipla ClustalW (versão 1.83), disponível em Kyoto University Bioinformatics Center, com os parâmetros de alinhamento aos pares de padrão e um método de classificação em porcentagem.

A edição manual mínima pode ser requerida em alguns casos para otimizar o alinhamento entre os motivos específicos, isto é comumente 20

realizado pelos versados na arte.Os valores de identidade de seqüência, que são indicados acima como a porcentagem foram determinados sobre o domínio conservado completo usando os programas mencionados acima usando os parâmetros de padrão.

Um versado na arte pode prontamente determinar se qualquer seqüência de aminoácido em questão está dentro da definição acima mencionada de um "polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou homólogo de tal polipeptídeo" usando técnicas bem conhecidas e software para fazer a árvore filogenética, como pacote GCG,. EBI ou CLUSTAL, usando parâmetros de padrão. Quando da construção desta árvore filogenética, as seqüências agrupadas dentro do grupo de polipeptídeos tendo dois domínios WRKY, e um domínio rico em Pro-Ser (ver seta na figura 2, após Eulgem et ai., 2000, Trends Plant Sci 5(5): 199-206) será considerado como estando dentro da definição de um "polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou homólogo de tal polipeptídeo". Os ácidos nucleicos codificando estas seqüências são utilizáveis na realização dos métodos da invenção.

O termo "domínio" refere-se a um conjunto de aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de um alinhamento de seqüências de proteínas relacionadas de modo evolucionário. Apesar de aminoácidos em outras posições poderem variar entre homólogos, os aminoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam aminoácidos que são essenciais na estrutura, a estabilidade, ou a atividade de uma proteína. Identificados por seu grau elevado e conservação em seqüências alinhadas de uma família de homólogos de proteína, eles podem ser usados como identificadores para determinar se qualquer polipeptídeo em questão pertence a uma família de polipeptídeos previamente identificados (neste caso, a família de polipeptídeos tendo dois domínios WRKY). O termo "motivo" refere-se a uma região conservada curta em uma seqüência de proteína. Os motivos são com freqüência partes altamente conservadas de domínios, mas também podem incluir somente parte do domínio, ou estarem localizados fora do domínio conservado (se todos os aminoácidos do motivo estiverem fora de um domínio definido).

As bases de dados especialistas existem para a identificação de domínios. Os domínios WRKY em um polipeptídeo podem ser identificados usando por exemplo SMART (Schultz et ai. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 5857-5864; Letunic et ai. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), hospedado pelo EMBL em Heidelberg, Alemanha), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318), hospedado pelo European Bioinformatics Institute (EBI) no Reino Unido), Prosite (Bucher e Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its funetion in automatic sequence interpretation. (em) ISMB-94; Proceedings .2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo et al, Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137,

(2004)).O servidor ExPASY proteomies é provido como um serviço para a comunidade científica (hospedado pelo Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) na Suíça ou Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276- .280 (2002), hospedado pelo e Sanger Institute no Reino Unido.). Na base de dados InterPro, o domínio WRKY é designado por IPR003657, PF03106 na base de dados Pfam e PS50811 na base de dados PROSITE.

Além disso, a presença de um domínio rico em Pro-Ser pode ser também prontamente identificado. A composição de aminoácido primária (em %) para determinar se um domínio de polipeptídeo é rico em aminoácidos específicos pode ser calculada usando programas de software do servidor ExPASy; em particular a ferramenta ProtParam (Gasteiger E et al (2003) ExPASy: the proteomies server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res 31:3784-3788). A composição da proteína de interesse pode ser então comparada com a composição de aminoácido média 22

(em %) no banco de dados da seqüência de proteína Swiss-Prot. Neste banco de dados, o teor de Pro (P) médio é de 4,85%, o teor de Ser (S) médio é de 6,89%. Como um exemplo, o domínio rico em Pro-Ser de SEQ ID NO: 2 compreende 22,03% de Pro (mais do que 5 vezes enriquecido) e 20,34% de Ser (mais do que 3 vezes enriquecido). Como definido aqui, um domínio rico em Pro-Ser tem um teor de Pro e Ser (em %) maior do que na composição de aminoácido média (em %) no banco de dados da seqüência de proteína Swiss- Prot. Além disso, preferivelmente, o domínio rico em Pro-Ser como definido aqui tem um teor de Pro e Ser (em %) que é pelo menos o dobro da composição de aminoácido média (em %) no banco de dados da seqüência de proteína Swiss-Prot. Mais preferivelmente, o domínio rico em Pro-Ser como definido aqui tem um teor de Pro e Ser (em %) que é pelo menos 2,1; 2,2; 2,3; 2,4 ou 2,5, mais preferivelmente 2,6; 2,7; 2,8; 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0 ou mais de tanto como a composição de aminoácido média (em %) de referido tipo de seqüências de proteína, que são incluídas no banco de dados da seqüência de proteína Swiss-Prot.

Exemplos de polipeptídeos tendo dois domínios WRKY ou homólogos de tais polipeptídeos incluem (codificado pelo número de acesso da seqüência de polinucleotídeo em parêntese), ver também tabela 1): Oryza sativa OrysaJWRKY53 (BK005056) SEQ ID NO: 2, Oryza sativa Orysa_WRKY24 (BK005027) SEQ ID NO: 4, Oryza sativa Orysa_WRKY70 (BK005073) SEQ ID NO: 6, Oryza sativa Orysa_WRKY78 (AK070537) SEQ ID NO: 8, Oryza sativa Orysa_WRKY30 (AY870610) SEQ ID NO: 10, Oryza sativa Orysa_WRKY35 (BK005038) SEQ ID NO: 12, Arabidopsis thaliana Arath_WRKY25 (NM_128578) SEQ ID NO: 14, Arabidopsis thaliana Arath_WRKY26 (AK117545) SEQ ID NO: 16, Arabidopsis thaliana Arath_WRKY33 (NMJ29404) SEQ ID NO: 18, Arabidopsis thaliana Arath_WRKY2 (AF418308) SEQ ID NO: 20, Arabidopsis thaliana 23

Arath_WRKY34 (AY052649) SEQ ID NO: 22, Arabidopsis thaliana Arath_WRKY20 (AF425837) SEQ ID NO: 24, Glycine max GlymaJWRKY 2X (contig de vários ESTs dentre os quais BM143621.1, BU578260.1, C0036102.1) SEQ ID NO: 26, Solanum chacoense Solca_WRKY 2X (AY366389) SEQ ID NO: 28, Ipomoea batatas Ipoba_WRKY 2X (D30038) SEQ ID NO: 30, Nicotiana attenuata Nicta WRKY 2X (AY456272) SEQ ID NO: 32, Saccharum officinarum Sacof_WRKY 2X SEQ ID NO: 34, Triticum aestivum Triae_WRKY 2X (contig de vários EST's dentre os quais BM135197.1, BM138255.1, BT009257.1) SEQ ID NO: 36, Hordeum vulgare HorvuJWRKY 2X (AY323206) SEQ ID NO: 38, Zea mays Zeama^WRKY 2X (contig de G310251.1, DR959456.1, DY235298.1) SEQ ID NO: 45, Lyeopersieon esculentum Lyces_WRKY 2X (contig de CN3 85 869.1, BI422509.1, CN38497745) SEQ ID NO: 47 e Lyeopersieon esculentum Lyces WRKY 2X II (contig de BI422692.1, BI923269.1, BI422137.1) SEQ ID NO: 49 e o mencionado no protocolo de seqüência sob SEQ ID NO: 51 de Zea mays..

Tabela 1: Seqüências sob a definição de "polipeptídeo tendo dois domínios

WRKY ou homólogo deste polipeptídeo".

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Deve-se entender que as seqüências dentro da definição de um "polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou homólogo deste polipeptídeo" não devem ser limitadas às seqüências de aminoácidos dadas na tabela 1 e mencionadas no protocolo de seqüência, mas que qualquer polipeptídeo compreendendo amino-término para carbóxi-término:: (i) um domínio rico em Pro-Ser3 e (ii) dois domínios WRKY incluindo um motivo de prolongamento de zinco C2-H2, podem ser apropriados para uso na realização dos métodos da invenção.

Além disso, o polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou homólogo deste polipeptídeo também pode compreender um ou mais dos seguintes (i) uma extensão ácida entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre 6 aminoácidos são ou Asp (D) ou Glu (E); (ii) um NLS putativo entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre 4 aminoácidos são ou Lys (K) ou Arg (R); e (iii) um domínio conservado com pelo menos 50%, 60% ou 70%), preferivelmente 75% ou 80%», mais preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 91%, 92%, 93%, 94% ou .95%, o mais preferivelmente 96%, 97%, 98% ou 99% identidade para SEQ ID NO: 39 (ainda exemplificado no Exemplo 4). Ainda mais preferivelmente, o polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou homólogo deste polipeptídeo pode ainda compreende um motivo LXSP dentro do domínio rico em Pro-Ser (onde L é Leu, S é Ser, P é Pro e onde X é qualquer aminoácido). O mais preferivelmente, o polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou um homólogo de tal polipeptídeo compreende um domínio rico em Pro-Ser pelo menos duas vezes tão rico em Pro e Ser comparado com a composição de aminoácido média (em %)de banco de dados da seqüência de proteína Swiss-Prot proteínas. Mais preferivelmente, o domínio rico em Pro-Ser como definido aqui tem um teor de Pro e Ser (em %) que é pelo menos 2,1; 2,2; 2,3; 2,4 ou .2,5, mais preferivelmente 2,6; 2,7; 2,8; 2,9 ou 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, .3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0 ou mais como tanto a composições de aminoácido média (em %) de referido tipo de seqüências de proteína, que são incluídas no banco de dados da seqüência de proteína Swiss-Prot.

Exemplos de ácidos nucleicos de dois domínios WRKY incluem mas não são limitados aos ácidos nucleicos dados na tabela 1 e mencionados no protocolo de seqüência. Os ácidos nucleicos/ genes de dois domínios WRKY e variantes dos mesmos podem ser usados na prática dos métodos da invenção. Os ácidos nucleicos/ genes de dois domínios WRKY variantes incluem porções de um ácido nucleico /gene de dois domínios WRKY e/ou ácidos nucleicos capazes de hibridizar com um ácido nucleico /gene de dois domínios WRKY. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 50 ou variantes dos mesmos são preferidos para uso nos métodos da presente invenção.

Uma outra forma de realização da invenção é uma molécula de ácido nucleico isolado compreendendo uma molécula de ácido nucleico selecionada dentre o grupo consistindo de: 26

a)uma molécula de ácido nucleico isolado, como mostrado em SEQ ID NO: 50;

b)uma molécula de ácido nucleico isolado, codificando a seqüência de aminoácido como mostrada em SEQ ID NO: 51;

c)uma molécula de ácido nucleico isolado, cuja seqüência pode ser deduzida de uma seqüência de polipeptídeo como mostrada em SEQ ID NO: 51, como um resultado da degenerescência do código genético;

d)uma molécula de ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade com a seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado por molécula de ácido nucleico de (a) a(c);

e)uma molécula de ácido nucleico isolado codificando um homólogo, derivado ou fragmento ativo da molécula de aminoácido como mostrado em SEQ ID NO: 51, cujo homólogo, derivado ou fragmento é de origem de planta e compreende com vantagem

(i)uma extensão ácida entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre os 6 aminoácidos são ou Asp (D) ou Glu (E);

(ii)um NLS putativo entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre os 4 aminoácidos são ou Lys (K) ou Arg (R); e

(iii)um domínio conservado com pelo menos 50%, 60% ou 70%, preferivelmente 75% ou 80%), mais preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95%, mais preferivelmente 96%, 97%, 98%, ou 99% identidade para SEQ ID NO: 39;

f)uma molécula de ácido nucleico isolado capaz de hibridizar com um ácido nucleico de (a) a (c) acima, ou seu complemento, em que a seqüência de hibridização ou o seu complemento codifica a proteína de planta de (a) a (e);

pelo que a molécula de ácido nucleico tem atividades de aumento do rendimento e/ou crescimento em plantas. Para os fins da invenção, "transgênico", "transgenes" ou "recombinante" significa compreendendo a por exemplo uma seqüência de ácido nucléico, um cassete de expressão (= construção de gene) ou um vetor compreendendo a seqüência de ácido nucleico ou um organismo transformado com as seqüências de ácido nucléico, cassetes de expressão ou vetores de acordo com a invenção, todas as construções ocasionadas por métodos recombinantes em que ou

a) as seqüências de ácido nucleico de acordo com a invenção, ou

b) seqüências de controle genético que é ligada operativamente com a seqüência de ácido nucleico de acordo com a invenção, por exemplo, um promotor, ou

c) a) e b)

não estão localizadas em seu meio genético natural ou foram modificadas por métodos recombinantes, sendo possível para a modificação tomar a forma de, por exemplo, uma substituição, adição, deleção, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeos. O meio genético natural é entendido como significando o Iocus genômico ou cromossômico na planta original ou a presença em uma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o meio genético natural da seqüência de ácido nucleico é preferivelmente retido, pelo menos em parte. O meio flanqueia a seqüência de ácido nucleico pelo menos em um lado e tem um comprimento de seqüência de pelo menos 50 bp, preferivelmente pelo menos 500 bp, especialmente preferivelmente pelo menos 1000 bp, o mais preferivelmente pelo menos .5000 bp. Um cassete de expressão de ocorrência natural - por exemplo a combinação de ocorrência natural do promotor natural das seqüências de ácido nucleico com a seqüência de ácido nucleico correspondente codificando um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou um homólogo de tal polipeptídeo - se torna um cassete de expressão transgênico quando este cassete de expressão é modificado por métodos não naturais, sintéticos ("artificiais") como, por exemplo, tratamento mutagênico. Os métodos apropriados são descritos, por exemplo, em US 5,565,350 ou WO 00/15815.

Uma planta transgênica para os fins da invenção é assim entendida como significando, como acima, que os ácidos nucleicos usados no método da invenção são estão em seus locus naturais no genoma da referida planta, sendo possível para os ácidos nucleicos serem expressados de modo homólogo ou heterólogo. No entanto, como mencionado, transgênico também significa que, enquanto os ácidos nucleicos de acordo com a invenção ou usados no método da invenção estão em sua posição natural no genoma de uma planta, a seqüência foi modificada com relação à seqüência natural, e/ou que as seqüências regulatórias das seqüências naturais foram modificadas. A expressão transgênica é preferivelmente entendida como significando a expressão dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção em um locus não natural no genoma, isto é, expressão homóloga ou, preferivelmente, heteróloga dos ácidos nucleicos ocorre. As plantas transgênicas preferidas são aqui mencionadas.

As plantas hospedeiras para os ácidos nucleicos, o cassete de expressão ou o vetor usado no método de acordo com a invenção ou para os ácidos nucleicos da invenção, o cassete de expressão ou construção ou vetor são, em princípio, vantajosamente para todas as plantas que são capazes de sintetizar os polipeptídeos usados no método da invenção.

Salvo indicado em contrário, os termos "polinucleotídeos", "ácido nucléico" e "molécula de ácido nucleico" como usado aqui são interpermutáveis. Salvo indicado em contrário, os termos "peptídeo", "polipeptídeo", e "proteína" são usados de modo interpermutável no presente contexto. O termo "seqüência" pode se relacionar com polinucleotídeos, ácidos nucleicos, moléculas de ácido nucleico, aminoácidos, peptídeos, polipeptídeos e proteínas, dependendo do contexto em que o termo "seqüência" é usado. Os termos 'gene(s)", "polinucleotídeo", "seqüência de ácido nucleico", "seqüência de nucleotídeo", ou "molécula(s) de ácido nucleico" como usados aqui referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, sejam ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Os termos se referem somente à estrutura primária da molécula.

Assim os termos "gene(s)", "polinucleotídeo", "seqüência de ácido nucleico", "seqüência de nucleotídeo", ou "molécula(s) de ácido nucleico" como usados aqui incluem DNA e RNA de filamento duplo ou único. Eles também incluem tipos conhecidos de modificações, por exemplo metilação, "capas", substituições de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo. Preferivelmente, a seqüência de DNA ou RNA da invenção compreende uma seqüência de codificação codificando o polipeptídeo aqui definido.

Uma "seqüência de codificação" é uma seqüência de nucleotídeo, que é transcrita em RNA ou mRNA estrutural e/ou traduzida em um polipeptídeo quando colocada sob o controle de seqüências regulatórias apropriadas. Os limites da seqüência de codificação são determinados por um códon de partida de tradução no término 5' e um códon de parada de tradução no término 3'. Uma seqüência de codificação pode incluir, mas não é limitada a mRNA, cDNA, seqüências de nucleotídeos recombinantes, ou DNA genômico, enquanto introns podem estar presentes assim como sob algumas circunstâncias.

Um polinucleotídeo "isolado" ou molécula de ácido nucleico é separado de outros polinucleotídeo s ou moléculas de ácido nucleico, que estão presentes na fonte natural a molécula de ácido nucleico. Uma molécula de ácido nucleico isolado pode ser um fragmento cromossômico de vários kb, ou preferivelmente, uma molécula somente compreendendo a região de codificação do gene. Conseqüentemente, uma molécula de ácido nucleico isolado da invenção pode compreender regiões cromossômicas, que são adjacentes 5' e 3' ou outras regiões cromossômcas adjacentes, mas preferivelmente compreende substancialmente poucas destas seqüências, que naturalmente flanqueiam a seqüência de molécula de ácido nucleico no contexto genômico ou cromossômico no organismo do qual a molécula de ácido nucleico se origina (por exemplo seqüências que são adjacentes às regiões codificando os 5' e 3' UTRs da molécula de ácido nucleico). Em várias formas de realização, a molécula de ácido nucleico isolado usada no processo de acordo com a invenção pode, por exemplo, compreender menos que aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb seqüências de nucleotídeos que naturalmente flanqueiam a molécula de ácido nucleico no DNA genômico da célula da qual a molécula de ácido nucleico se origina.

Uma molécula de ácido nucleico englobando a seqüência completa de moléculas de ácido nucleico usadas no processo, por exemplo, o polinucleotídeo da invenção, ou uma parte do mesmo pode ser adicionalmente isolada por reação de cadeia polimerase, iniciadores de oligonucleotídeos com base nesta seqüência ou em partes da mesma sendo usados. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico compreendendo a seqüência completa ou parte da mesma pode ser isolada por reação de cadeia polimerase usando iniciadores de oligonucleotídeos que foram gerados com base nesta mesma seqüência. Por exemplo, mRNA pode ser isolado de células (por exemplo por meio de método de extração de tiocianato de guanidínio de Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299) e cDNA pode ser gerado por meio de transcriptase reversa (por exemplo Moloney MLV transcriptase reversa, disponível de Gibco/BRL, Bethesda, MD, ou AMV transcriptase reversa, obtenível de Seikagaku America, Inc., St.Petersburg, FL).

As moléculas de ácido nucleico que são vantajosas para o processo de acordo com a invenção podem ser isoladas com base em sua homologia para as moléculas de ácido nucleico descritas aqui usando as seqüências ou parte das mesmas como sonda de hibridização e seguindo técnicas de hibridização padrões sob condições de hibridização estringentes. Neste contexto, é possível usar, porém, moléculas de ácido nucleico isoladas de pelo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 ou mais nucleotídeos, preferivelmente of pelo menos 15, 20 ou 25 nucleotídeos em comprimento que hibridizam sob condições estringentes com as moléculas de ácido nucleico acima mencionadas, particularmente as que englobam uma seqüência de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico usada no método da invenção ou codificando uma proteína usada na invenção ou a molécula de ácido nucleico da invenção. As moléculas de aumentada com 20, 50, 100, 250 ou mais nucleotídeos também podem ser usadas.

As seqüências de ácido nucleico usadas no processo da invenção, que são mostradas no protocolo de seqüência particularmente SEQ ID NO: 1 ou 50 são introduzidas com vantagem em uma construção de ácido nucléico, preferivelmente um cassete de expressão que torna a expressão das moléculas de ácido nucleico em uma planta possível.

Conseqüentemente, a invenção também refere-se a uma construção de ácido nucléico, preferivelmente a uma construção de expressão, compreendendo a molécula de ácido nucleico da presente invenção funcionalmente ligada a um ou mais elementos ou sinais regulatórios.

Como descrito aqui, a construção de ácido nucleico também pode compreender outros genes, que devem ser introduzidos nos organismos ou células. E possível e vantajoso introduzir em e expressar nos organismos hospedeiros genes regulatórios como genes para indutores, repressores ou enzimas que, devido à sua atividade enzimática, se engajam na regulação de um ou mais genes de uma via metabólica. Estes genes podem ser de origem heteróloga ou homóloga. Além disso, outros genes de biossíntese podem estar presentes com vantagem, ou também estes genes podem estar localizadas em um ou mais de outras construções de ácido nucléico. Os genes, que são empregados com vantagem são genes que influenciam o crescimento das plantas como seqüências reguladoras ou fatores. Uma melhora dos elementos reguladores pode ocorrer com vantagem no nível transcripcional usando sinais de transcrição fortes como promotores e/ou melhoradores. Além disso, no entanto, uma melhora da tradução é também possível, por exemplo por aumento da estabilidade de mRNA ou por inserção de uma seqüência de melhorador de tradução.

Em princípio, a construção de ácido nucleico pode compreender as seqüências reguladoras aqui descritas e ainda seqüências relevantes para a expressão dos genes compreendidos. Assim, a construção de ácido nucleico da invenção pode ser usada como cassete de expressão e assim pode ser usada diretamente para introdução na planta, ou também pode ser introduzida em um vetor. Conseqüentemente, em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico é um cassete de expressão compreendendo um promotor de microorganismo, ou um terminador de microorganismo ou ambos. Em uma forma de realização, o cassete de expressão engloba um promotor viral ou um terminador viral ou ambos. Em outra forma de realização, o cassete de expressão engloba um promotor de planta ou um terminador de planta, ou ambos.

Para introduzir uma molécula de ácido nucleico em uma construção de ácido nucleico, por exemplo como parte de um cassete de expressão, o segmento de gene é submetido com vantagem a uma reação de amplificação e ligação em um modo bem conhecido do versado. Prefere-se seguir um procedimento similar ao protocolo para a Pfu DNA polimerase ou uma mistura Pfu/Taq DNA polimerase. Os iniciadores são selecionados de acordo com a seqüência a ser amplificada. Os iniciadores devem ser selecionados de modo expediente em tal modo que o amplificado compreende a seqüência codogênica do início do códon de parada. Após a amplificação, o 33

amplificado é analisado de modo expediente. Por exemplo, a análise pode considerar qualidade e quantidade e ser realizada após spa por eletroforese de gel. A seguir, o amplificado pode ser purificado após um protocolo padrão (por exemplo Qiagen). Uma alíquota do amplificado purificado é então disponível p ara a etapa de clonagem subseqüente. O versado na arte geralmente conhece vetores de clonagem apropriados.

Eles incluem, particularmente, vetores que são capazes de replicação em sistemas de clonagem fáceis de manipular como sistemas à base de levedura bacteriana ou à base de células de insetos (por exemplo expressão de baculovírus), isto é, especialmente vetores que asseguram uma clonagem eficiente em cepas de E. coli ou de Agrobacterium, e que tornam possível transformar estavelmente as plantas. Vetores, que devem ser mencionados, particularmente são vários sistemas de vetor binários e co- integrados, que são apropriados para a transformação mediada por T-DNA. Estes sistemas de vetor são geralmente caracterizados em que eles contém pelo menos os genes vir, que são requeridos para a transformação mediada por Agrobacterium, e as seqüências de borda T-DNA.

Geralmente, os sistemas de vetor preferivelmente também compreendem outras regiões cis-regulatórias como promotores e terminadores, e/ou marcadores de seleção por meio dos quais os organismos apropriadamente transformados podem ser identificados. Apesar de genes vir e as seqüências de T-DNA estarem localizadas no mesmo vetor no caso de sistemas de vetor co-integrados, os sistemas binários são baseados em pelo menos dois vetores, um dos quais contém genes vir, mas sem T-DNA, enquanto um segundo contém T-DNA, mas não gene vir. Devido a este fato, os vetores mencionados por último são relativamente pequenos, fáceis de manipular e capazes de replicação em cepas de E. coli e em Agrobacterium. Estes vetores binários incluem vetores da série pBIB- HYG, pPZP, pBecks, pGreen. Os que são preferivelmente usados de acordo com a invenção são Bin 19, ρΒΙΙΟΙ, pBinAR, pGPTV e pCAMBIA. Um estudo geral de vetores binários e seu uso é dado por Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446-451. Os vetors são preferivelmente modificados em tal modo, que eles já contém os ácidos nucleicos da invenção, preferivelmente as seqüências de ácido nucleico codificando os polipeptídeos como mostrados em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 50.

Em um vetor de expressão recombinante, "ligação operativa" significa que a molécula de ácido nucleico de interesse é ligada aos sinais regulatórios em tal modo que a expressão da molécula de ácido nucleico é possível: elas são ligadas uma na outra em tal modo que as duas seqüências preenchem a função prevista designada à seqüência (por exemplo em um sistema de transcrição / tradução in vitro, ou em uma célula hospedeira se o vetor for introduzido na célula hospedeira).

O termo porção, como definido aqui, refere-se a uma peça de DNA codificando um polipeptídeo que realiza a mesma ou funções biológicas similares para o polipeptídeo intacto. Por exemplo, uma porção de dois domínios WRKY pode codificar um polipeptídeo compreendendo um motivo estrutural reconhecível e/ou domínio funcional como um sítio de ligação de DNA ou domínio que liga a uma região de promotor de DNA, um domínio de ativação ou repressão, um domínio para as interações de proteína-proteína, um domínio de localização e também pode ter a capacidade de iniciar ou inibir a transcrição. Uma porção pode ser preparada por exemplo ao fazer uma ou mais deleçÕes para um ácido nucleico de dois domínios WRKY. As porções podem ser usadas em forma isolada ou podem ser fundidas para outras seqüências de codificação (ou não codificação) a fim de, por exemplo, produzir uma proteína que combina várias atividades. Quando fundida em outras seqüências de codificação, o polipeptídeo resultante produzido quando da tradução pode ser maior do que o previsto para a porção de dois domínios WRKY. Os exemplos de porções podem incluir nucleotídeos codificando um polipeptídeo compreendendo de amino-término para carbóxi-término: (i) um domínio rico em Pro-Ser, e (ii) dois domínios WRKY incluindo um motivo C2-H2 de prolongamento de zinco. As porções podem opcionalmente y compreender qualquer um ou mais dos seguintes: (i) uma extensão ácida entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre 6 aminoácidos são ou Asp (D) ou Glu (E); (ii) um NLS putativo entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre 4 aminoácidos são ou Lys (K) ou Arg (R); e (iii) um domínio conservado com pelo menos 50%, 60% ou 70%, preferivelmente 75% ou 80%), mais preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 91%), 92%, 93%>, 94% ou 95%, o mais preferivelmente 96%, 97%, 98% ou 99% identidade para SEQ ID NO: 39. A porção pode ainda compreende um motivo LXSP dentro do domínio rico em Pro-Ser (onde L é Leu, S é Ser, P é Pro e X é qualquer aminoácido). A porção é tipicamente pelo menos 300, 400, 500, 600 ou 700 nucleotídeos em comprimento, preferivelmente pelo menos 750, 900, 850, 900 ou 950 nucleotídeos em comprimento, mais preferivelmente pelo menos 1000, 1100, 1200 ou 1300 nucleotídeos em comprimento e o mais preferivelmente pelo menos 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 ou 1600 nucleotídeos ou mais em comprimento. Preferivelmente, a porção é uma porção de qualquer um dos ácidos nucléicos dados na tabela 1 e/ou mencionados no protocolo da seqüência. O mais preferivelmente a porção é uma porção de um ácido nucleico como representado por SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 50.

Os termos "fragmento", "fragmento de uma seqüência" ou "parte de uma seqüência", "porção" ou "sua porção" significam uma seqüência truneada da seqüência original aqui referida. A seqüência truncada (seqüência de ácido nucleico ou proteína) pode variar amplamente em comprimento; o tamanho mínimo sendo uma seqüência de tamanho suficiente para prover uma seqüência com pelo menos uma função comparável e/ou atividade da seqüência original referida a ou hibridizando com a molécula de ácido nucleico da invenção ou usada no processo da invenção sob condições estringentes, enquanto o tamanho máximo não é crítico. Em algumas aplicações, o tamanho máximo geralmente não é substancialmente maior do que o requerido para prover a atividade e/ou função (ões) desejada(s) da seqüência original. Uma função original significa pelo menos 40%, 45% ou 50%, preferivelmente pelo menos 60%, 70%, 80% ou 90% ou mais da seqüência original.

Outra variante de um ácido nucleico / gene de dois domínios WRKY é um ácido nucleico capaz de hibridizar sob condições de estringência reduzida, preferivelmente sob condições estringentes, mais preferivelmente sob condições altamente estringentes, com um ácido nucleico /gene de dois domínios WRKY como aqui definido. A seqüência de hibridização pode incluir os nucleotídeos codificando um polipeptídeo compreendendo de amino-término para carbóxi-término: (i) um domínio rico em Pro-Ser, e (ii) dois domínios WRKY incluindo um motivo C2-H2 de prolongamento de zinco. A seqüência de hibridização pode opcionalmente compreender um ou mais dos seguintes: (i) uma extensão ácida entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre 6 aminoácidos são ou Asp (D) ou Glu (E); (ii) um NLS putativo entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre 4 aminoácidos são ou Lys (K) ou Arg (R); e (iii) um domínio conservado com pelo menos 50%, 60% ou 70%, preferivelmente 75% ou 80%), mais preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 91%, 92%, 93%», 94% ou 95%, o mais preferivelmente 96%, 97%, 98% ou 99% identidade para SEQ ID NO: 39. A seqüência de hibridização pode ainda compreender um motivo LXSP dentro do domínio rico em Pro-Ser (onde L é Leu, S é Ser, P é Pro e X é qualquer aminoácido). A seqüência de hibridização é tipicamente menos 100, 125, 150, 175, 200 ou 225 nucleotídeos em comprimento, preferivelmente pelo menos 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450 ou 475 nucleotídeos em comprimento, ainda preferivelmente pelo menos 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700 ou 725 nucleotídeos em comprimento, mais preferivelmente pelo menos 750, 800, 900, 1000, 1100, 1200 ou 1300 nucleotídeos em comprimento e o mais preferivelmente pelo menos 1400 nucleotídeos ou mais em comprimento. Preferivelmente, a seqüência de hibridização é uma que é capaz de hibridizar em qualquer um dos ácidos nucleicos dados na tabela 1 e/ou mencionados no protocolo de seqüência, ou a uma porção de qualquer uma das seqüências de ácido nucleico acima mencionadas. Mais preferivelmente, a seqüência de hibridização de um ácido nucleico hibridiza com um ácido nucleico como representado em

SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 50.

O termo "hibridização" como definido aqui é um processo em que seqüências de nucleotídeos complementares substancialmente homólogas anelam umas nas outras. O processo de hibridização pode ocorrer completamente em solução, isto é, ambos os ácidos nucleicos complementares estão em solução. O processo de hibridização também pode ocorrer com um ou mais ácidos nucleicos complementares imobilizados em uma matriz como contas magnéticas, contas Sepharose, ou qualquer outra resina. O processo de hibridização pode ainda ocorrer com um dos ácidos nucleicos complementares imobilizados em um suporte sólido como nitro- celulose ou membrana de náilon ou imobilizado por, por exemplo, fotolitografia para, por exemplo, um suporte de vidro silicioso (o último conhecido como arranjos de ácido nucleico ou micro-arranjos ou como pastilhas de ácido nucléico). A fim de permitir a ocorrência da hibridização, as moléculas de ácido nucleico são geralmente desnaturadas de modo térmico ou químico para fundir um filamento duplo em dois filamentos únicos e/ou para remover "grampos de cabelo" ou outras estruturas secundárias de ácidos nucleicos de filamento único. A estringência de hibridização é influenciada por condições como temperatura, concentração de sal, resistência iônica e composição de tampão de hibridização. "Condições de hibridização estringente" e "condições de lavagem de hibridização estringente" no contexto de experiências de hibridização de ácido nucleico como hibridizaçÕes Southern e Northern são dependentes de seqüência e são diferentes sob diferentes parâmetros ambientais. O versado conhece os vários parâmetros que podem ser alterados durante a hibridização e lavagem e que irão ou manter ou mudar as condições de estringência.

O Tm é a temperatura sob resistência iônica e pH definidos, em que 50% da seqüência de marcação hibridiza para uma sonda perfeitamente correspondida. O Tm é dependente das condições de solução e a composição de base e o comprimento da sonda. Por exemplo, seqüências mais longas hibridizam especificamente em maiores temperaturas. A taxa máxima de hibridização é obtida de cerca de 16 0C até 32 0C abaixo do Tm. A presença de cátions monovalentes na solução de hibridização reduz a repulsa eletrostática entre os dois filamentos de ácido nucleico assim promovendo a formação do híbrido; este efeito é visível para concentrações de sódio de até 0,4 Μ. A formamida reduz a temperatura de fusão de duplexes DNA-DNA e DNA- RNA com 0,6 a 0,7 0C para cada porcentagem de formamida, e adição de 50% de formamida permite que a hibridização seja realizada a 30 a 45 0C, apesar da taxa de hibridização poder ser abaixada. Os desalinhamentos dos pares de base reduzem a taxa de hibridização e a estabilidade térmica dos duplexes. Em sondas médias e para as grandes, o Tm diminui cerca de 1 0C por % de desalinhamento de base. O Tm pode ser calculado usando as seguintes equações, dependendo dos tipos de híbridos: 1. -híbridos de DNA-DNA (Meinkoth e Wahl, Anal. Biochem.,

138: 267-284, 1984):

Tm= 81,5°C + 16,6xlogio[Na+]a+ 0,41x%[G/Cb] - SOOxtLc]'1 - 0,61x% formamida

2. híbridos de DNA-RNA ou RNA-RNA: Tm= 79,8 + 18,5 (log10[Na+f) + 0,58 (%G/Cb) + 11,8 (%G/Cb)2 - 820/Lc

3)· híbridos oligo-DNA ou oligo-RNAd: Para <20 nucleotídeos: Tm= 2 (In)

Para 20-35 nucleotídeos: Tm= 22 + 1,46 (In) a ou para outro cátion monovalente, mas somente preciso na faixa de 0,01-0,4 M.

b somente preciso para %GC na faixa de 30% a 75%. cL = comprimento do duplex em pares de base. d Oligo, oligonucleotídeo; Ins comprimento efetivo do iniciador = 2x(no. de G/C)+(no. de A/T).

Nota: para cada 1% formamida, o Tm é reduzido em cerca de 0,6 a 0,7 0C, enquanto a presença de 6 M uréia reduz o Tm em cerca de 30 0C.

A especificidade de hibridização é tipicamente a função de lavagens pós-hibridização. Para remover o fundo resultante de hibridização não específica, amostras são lavadas com soluções de sal diluídas. Os fatores críticos destas lavagens incluem a resistência iônica e temperatura da solução de lavagem final: quanto menor a concentração de sal, maior a temperatura de lavagem, maior a estringência da lavagem. As condições de lavagem são tipicamente realizadas em ou abaixo da estringência de hibridização. Geralmente, as condições estringentes para testes de hibridização de ácido nucleico ou procedimentos de detecção de amplificação de genes são especificados acima. As condições de estringência maior ou menor também podem ser selecionadas. Geralmente, as condições de baixa estringência são selecionadas a cerca de 50 0C menores do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a seqüência específica em uma resistência iônica e pH definidos. As condições de estringência média são quando a temperatura é 20 0C abaixo de Tm, e condições de estringência elevada são quando a temperatura é 10 0C abaixo de Tm. Por exemplo, as condições estringentes são as que são pelo menos tão estringentes como, por exemplo, condições A-L; e condições de estringência reduzida são pelo menos tão estringentes como, por exemplo, condições M-R. A ligação não específica pode ser controlada usando qualquer uma de várias técnicas conhecidas como, por exemplo, bloqueio da membrana 5 com soluções contendo proteína, adições de RNA, DNA heterólogo, e SDS para o tampão de hibridização e tratamento com RNAse. Os exemplos de hibridização e condições de lavagem são relacionados na tabela 2 abaixo.

Tabela 2 - Exemplos de hibridização e condições de lavagem

<table>table see original document page 41</column></row><table> * O "comprimento do híbrido" é o comprimento antecipado

10 para a hibridização de ácido nucléico. Quando ácidos nucleicos de seqüência conhecida são hibridizados, o comprimento do híbrido pode ser determinado por alinhamento das seqüências e identificação das regiões conservadas aqui descritas.

r SSPE (lxSSPE é 0,15M NaCl, IOmM NaH2PO4, e l,25mM EDTA, pH7.4) pode ser substituído por SSC (lxSSC é 0,15M NaCl e 15mM citrato de sódio) nos tampões de hibridização e lavagem; as lavagens são realizadas durante 15 minutos após a hibridização estar completa. As hibridizações e lavagens podem adicionalmente incluir 5 χ reagente de Denhardt, 0,5-1,0% SDS, 100 μ^ιηΐ DNA de esperma de salmão fragmentado desnaturado, 0,5% pirofosfato de sódio, e até 50% formamida.

* Tb-Tr: a temperatura de hibridização para híbridos antecipados como sendo menores do que 50 pares de base de comprimento deve ser 5-10 0C menor do que a temperatura de fusão Tm dos híbridos: o Tm é determinado de acordo com as equações acima mencionadas.

± A presente invenção também engloba a substituição de qualquer um ou mais parceiros de híbridos de DNA ou RNA com ou um PNA, ou um ácido nucleico modificado.

Para os fins de definir o nível de estringência, referência pode

ser feita a

Sambrook et ai. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a' ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York ou Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989).

O ácido nucleico de dois domínios WRKY ou variante do mesmo pode ser derivado de qualquer fonte natural ou artificial. O ácido nucleico /gene ou variante do mesmo pode ser isolado de uma fonte microbiana, como levedura, fungos ou lodo, ou de uma fonte de planta, musgo, alga ou animal (incluindo humano). Este ácido nucleico pode ser modificado de sua forma nativa em composição e/ou meio genômico através de manipulação humana deliberada. O ácido nucleico é preferivelmente de origem de planta, seja da mesma espécie de planta (por exemplo para uma da qual deve ser introduzido) ou de uma espécie de planta diferente. O ácido nucleico pode ser isolado da espécie monocotiledônea, preferivelmente da família Poaceae, ainda preferivelmente de Oryza sativa ou Zea mays. Mais preferivelmente, o ácido nucleico de dois domínios WRKY isolado de Oryza sativa ou Zea mays é representado por SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 50, e a seqüência de polipeptídeo tendo dois domínios WRKY é como representada por SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 51.

A expressão de um ácido nucleico codificando um

polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou homólogo do mesmo pode ser modulada por introdução de uma modificação genética dentro do gene de dois domínios WRKY, ou em outro ponto no genoma da planta. O locus de um gene como aqui definido é tomado para significar uma região genômica, que inclui o gene de interesse e 10 kb a montante ou a jusante da região de codificação.

A modificação genética pode ser introduzida por, por exemplo, qualquer um (ou mais) dos seguintes métodos: ativação de T-DNA, TILLING, ou recombinação homóloga, mutagênese dirigida ao sítio, e evolução dirige ou por introdução e expressão em uma planta de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou um homólogo deste polipeptídeo. Após introdução da modificação genética, segue-se uma etapa de seleção de expressão modulada de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou homólogo do mesmo, cuja modulação em expressão dá plantas tendo rendimento aumentado com relação às plantas de controle.

A etiqueta de ativação de T-DNA (Hayashi et ai. Science (1992) 1350-1353) envolve a inserção de T-DNA, geralmente contendo um promotor (também pode ser um melhorador de tradução ou um íntron), na região genômica (locus) do gene de interesse ou 10 kb a montante ou a jusante da região de codificação de um gene em uma configuração como que o promotor dirige expressão do gene marcado. Tipicamente, a regulação de expressão do gene marcado por seu promotor natural é rompida e o gene cai sob o controle do promotor recentemente introduzido. O promotor é tipicamente envolvido em um T-DNA. Este T-DNA é aleatoriamente inserido no genoma da planta, por exemplo, através de infecção por Agrobacterium e leva à super-expressão de genes próximos do T_DNA inserido. As plantas transgênicas resultantes mostram fenótipos dominantes devido à super- expressão de genes próximo do promotor introduzido. O promotor a ser introduzido pode ser qualquer promotor capaz de dirigir a expressão de um gene no organismo desejado, neste caso uma planta. Por exemplo, promotores constitutivos, preferidos para tecidos, preferidos para tipo de células e indutíveis são todos apropriados para uso em ativação de T-DNA. Uma modificação genética também pode ser introduzida no

locus de um gene de dois domínios WRKY usando a técnica de TILLING (Targeted Induced Local Lesions In Genomes - lesões locais induzidas marcadas em genomas). Esta é uma tecnologia de mutagênese utilizável para gerar e/ou identificar e eventualmente isolar variantes mutageneizadas de um ácido nucleico de dois domínios WRKY capaz de exibir a atividade de WRKY modulada. As variantes mutantes também demonstram expressão de WRKY modificada, em resistência e em perfil de expressão (tempo e local) do que o exibido pelo gene em sua forma natural. TILLING também permite a seleção de plantas transportando estas variantes mutantes. TILLING combina mutagênese de alta densidade com métodos de triagem de elevada produção. As etapas tipicamente seguidas em TILLING são: (a) mutagênese EMS (Redei GP e Koncz C (1992) em Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, pp. 16-82; Feldmann et al., (1994) em Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J e Caspar T (1998), em J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91-104); (b) preparação de DNA e reunião dos indivíduos; (c) amplificação de PCR de uma região de interesse (d) desnaturação e anelamento para permitir a formação de heteroduplexes; (e) DHPLC, onde a presença de um heteroduplex em uma poça é detectada como um pico extra no cromatograma; (f) identificação do indivíduo mutante; e (g) seqüenciamento do produto PCR mutante. Métodos para TILLING são bem conhecidos na arte (McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; revisto por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

A recombinação homóloga permite a introdução em um genoma de um ácido nucleico selecionado em uma posição selecionada definida. A recombinação homóloga é uma tecnologia padrão usada como rotina em ciências biológicas para organismos inferiores como levedura e o musgo PhyscomitreIla. Os métodos para realizar a recombinação homóloga em plantas foram descritos não somente para plantas modelos (Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077-84) mas também para plantas de cultura, por exemplo, arroz (Terada et al (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; Iida e Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8). O ácido nucleico a ser marcado (que pode ser um ácido nucleico de dois domínios WRKY ou variante do mesmo, como acima definido) não precisa ser marcado no locus de um gene de dois domínios WRKY, mas pode ser introduzido por exemplo em regiões de expressão elevada. O ácido nucleico a ser marcado pode ser um alelo melhorado usado para substituir o gene endógeno ou pode ser introduzido além do gene endógeno.

A mutagênese sítio-dirigida pode ser usada para gerar variantes de ácidos nucleicos de dois domínios WRKY. Vários métodos são disponíveis para obter a mutagênese sítio-dirigida, o mais comum sendo os métodos à base de PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds. http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html).

A evolução dirigida pode ser também usada para gerar variantes de ácidos nucleicos de dois domínios WRKY. Isto consiste de iterações de embaralhamento de DNA seguido por triagem apropriada e/ou seleção para gerar variantes de ácidos nucleicos de dois domínios WRKY ou porções dos mesmos codificando polipeptídeos tendo dois domínios WRKY ou porções do mesmo tendo uma atividade biológica modificada [Castle et ai, (2004) Science 304(5674): 1151-4; patentes US 5.811.238 e 6.395.547].

A ativação de T-DNA, TILLING, recombinação homóloga, mutagênese sítio-dirigida e evolução dirigida são exemplos de tecnologias que permitem a geração de novos alelos e variantes de ácidos nucleicos de dois domínios WRKY.

Um método preferido de introdução de uma modificação genética (que neste caso não precisa estar no locus de um gene de dois domínios WRKY) é para introduzir e expressar em uma planta um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou um homólogo de tal polipeptídeo.

"Homólogos" de um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY também pode ser utilizável na presente invenção. Os homólogos englobam peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas tendo substituições de aminoácido, deleções e/ou inserções com relação à proteína não modificada em questão e tendo atividade biológica e funcional similar como a proteína não modificada da qual eles são derivados. Para produzir estes homólogos, aminoácidos da proteína podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo propriedades similares (como hidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão similares para formar ou romper as estruturas a- helicoidais ou estruturas de β-folha). As tabelas de substituição conservativa são bem conhecidas na arte (ver por exemplo Creighton (1984) Proteínas. W.H. Freeman e Company e Tabela 3 abaixo).

Também englobado pelo termo "homólogos" são duas formas especiais de homologia, que incluem seqüências ortólogas e seqüências parálogas, que englobam conceitos evolucionários usados para descrever relações ancestrais de genes. O termo "parálogo" refere-se a duplicação de genes dentro do genoma de uma espécie levando a genes parálogos. O termo "ortólogo1 refere-se a genes homólogos em organismos diferentes devido à especialização. Os exemplos de homólogos de um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY são dados na tabela 1 ou no protocolo de seqüência abaixo.

Ortólogos em, por exemplo, espécies de plantas

monocotiledôneas podem ser facilmente encontrados por realização de uma assim chamada busca blast recíproca. Isto pode ser feito por uma primeira BLAST envolvendo a busca BLAST envolvendo a seqüência de consulta BLAST (por exemplo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 51) contra qualquer base de dados de seqüência,a, como a base de dados NCBI disponível ao público. BLASTN ou TBLASTX (usando valores de padrão padrões) podem ser usados quando partindo de uma seqüência de nucleotídeo e BLASTP ou TBLASTN (usando valores de padrão padrões) podem ser usados quando partindo de uma seqüência de polipeptídeos. Os resultados BLAST podem ser opcionalmente filtrados. As seqüências de comprimento completo ou dos resultados filtrados ou resultados não filtrados são então passados de novo por BLAST (segundo BLAST ) contra seqüências do organismo do qual a seqüência de consulta é derivada (onde a seqüência de consulta é SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 51), o segundo BLAST deve então ser contra seqüências Oryza ou Zea). Os resultados do primeiro e segundo BLASTs são então comparados. Um parálogo é identificado se um acerto de alta classificação do primeiro BLAST for da mesma espécie do que a da qual a seqüência de consulta é derivada, um novo BLAST então idealmente resulta na seqüência de consulta como uma acerto de alta classificação (além da própria seqüência de parálogo); um ortólogo é identificado se um acerto de alta classificação no primeiro BLAST não for da mesma espécie como da qual a seqüência de consulta é derivada e preferivelmente resulta de dois domínios WRKY de novo na seqüência de consulta dentre os acertos maiores. Os acertos de alta classificação são os 47

tendo um valor E baixo. Quanto menor o valor E, mais significante o escore (ou em outras palavras quanto menor a possibilidade do acerto ser encontrado por acaso). A computação do valor E é bem conhecida na arte. Além dos valores E, comparações são também classificadas por identidade percentual. A identidade percentual refere-se ao número de nucleotídeos idênticos (ou aminoácidos) entre as duas seqüências de ácido nucleico comparadas (ou polipeptídeo) sobre um comprimento particular. No caso de famílias grandes, ClustalW pode ser usado, seguido por uma árvore de união vizinha, para ajudar a visualizar o agrupamento.

Um homólogo pode estar na forma de uma "variante substancional" de uma proteína, isto é, onde pelo menos um resíduo em uma seqüência de aminoácido foi removida e um resíduo diferente inserido em seu lugar. As substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos únicos, mas podem ser agrupadas dependendo das limitações funcionais colocadas no polipeptídeo; as inserções serão geralmente da ordem de cerca de 1 a 10 resíduos de aminoácidos. Preferivelmente, as substituições de aminoácidos compreendem substituições de aminoácidos conservativas. As tabelas de substituição conservativa são prontamente disponíveis na arte. A tabela abaixo dá exemplos de substituições de aminoácidos conservadas.

Tabela 3: Exemplos de substituições de aminoácidos conservados

<table>table see original document page 48</column></row><table>

Um homólogo também pode estar na forma de um "variante insercional" de uma proteína, isto é onde um ou mais resíduos de aminoácidos são introduzidos em um sítio pré-determinado de uma proteína. As inserções podem compreender fusões N-terminal e/ou C-terminal assim como inserções intra-seqüências de aminoácidos únicos ou múltiplos. Geralmente, as inserções dentro da seqüência de aminoácido serão menores do que as fusões N- ou C-terminais, da ordem de cerca de 1 a 10 resíduos. Exemplos de proteínas de fusão N- ou C-terminal ou peptídeos incluem o domínio de ligação ou domínio de ativação de um ativador transcripcional, como usado no sistema de dois híbridos de levedura, proteínas de capa de fagos, (histidina)-ó-etiqueta, glutatationa S-transferase-etiqueta, proteína A, proteína de ligação a maltose, dihidrofolato redutase, epítopo Tag-100, epítopo c-myc, epítopo FLAG®-, IacZ, CMP (peptídeo de ligação a calmodulina), epítopo HA, epítopo proteína C e epítopo VSV.

Os homólogos na forma de "variantes de deleção" de uma proteína são caracterizados pela remoção de um ou mais aminoácidos de uma proteína.

As variantes de aminoácidos de uma proteína podem ser feitas prontamente usando técnicas sintéticas de peptídeos bem conhecidas na arte, como síntese de peptídeo de fase sólida, e outras, ou por manipulação de DNA recombinante. Os métodos para a manipulação de seqüências de DNA para produzir variantes de substituição, inserção ou deleção de uma proteína são bem conhecidas na arte. Por exemplo, as técnicas para fazer mutações de substituição em sítios pré-determinados em DNA são bem conhecidas dos versados na arte e incluem mutagênese Ml3, mutagênese T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH), mutagênese de tipo QuickChange Site Directed (Stratagene, San Diego, CA), mutagênese dirigida ao sítio mediada por PCR ou outros protocolos de mutagênese dirigidos ao sítio.

O polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou homólogo do mesmo pode ser um derivado. "Derivados" incluem peptídeo, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas que podem compreender substituições, deleções ou adições de resíduos de aminoácido de ocorrência natural ou não natural comparados com a seqüência de aminoácidos de uma forma de ocorrência natural da proteína. "Derivados" incluem peptídeos oligopeptídeos, polipeptídeos proteínas e enzimas que podem compreender resíduos de aminoácidos de ocorrência natural alterados, glicosilados, acilados, premiados, sumulados ou não de ocorrência natural comparados com a seqüência de aminoácido de forma de ocorrência natural do polipeptídeo. Um derivado também pode compreender um ou mais substituintes não aminoácido comparado com a seqüência de aminoácido da qual ele é derivado, por exemplo, uma molécula repórter ou outro ligando, ligado covalentemente ou não covalentemente à seqüência de aminoácido, como uma molécula repórter que é ligada para facilitar sua detecção, e resíduos de aminoácidos não de ocorrência natural com relação à seqüência de aminoácido de uma proteína de ocorrência natural.

O polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou seu homólogo pode ser codificado por uma variante de emenda de um ácido nucleico /gene de dois domínios WRKY. O termo "variante de emenda alternativa" como usado aqui engloba variantes de uma seqüência de ácido nucleico em que íntrons e/ou exons selecionados foram excisados, substituídos, ou adicionados, ou em que íntrons foram encurtados ou alongados. Estas variantes serão as em que a atividade biológica da proteína é substancialmente retida, isto pode ser obtido por seletivamente retendo os segmentos funcionais da proteína. Estas variantes de emenda podem ser encontradas na natureza ou podem ser feitas pelo homem. Os métodos para fazer estas variantes de emenda são bem conhecidos na arte. A variante de emenda pode incluir os nucleotídeos codificando um polipeptídeo compreendendo de amino-término para carbóxi -término: (i) um domínio rico em Pro-Ser, e (ii) dois domínios WRKY incluindo um motivo C2-H2 de prolongamento de zinco. A variante de emenda pode opcionalmente compreender qualquer um ou mais dos seguintes: (i) uma extensão ácida entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre 6 aminoácidos são ou Asp (D) ou Glu (E); (ii) um NLS putativo entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre 4 aminoácidos são ou Lys (K) ou Arg (R); e (iii) um domínio conservado com pelo menos 50%, 60% ou 70%, preferivelmente 75% ou 80%), mais preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 91%), 92%, 93%, 94% ou 95%, o mais preferivelmente 96%, 97%, 98% ou 99% identidade para SEQ ID NO: 39. A emenda pode ainda compreender um motivo LXSP dentro do domínio rico em Pro-Ser (onde L é Leu, S é Ser, P é Pro e X é qualquer aminoácido). As variantes de emenda preferidas são variantes de emenda de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY como representado em qualquer um dos ácidos nucleicos dados na Tabela 1 e/ou no protocolo de seqüência. A mais preferida é uma variante de emenda de um ácido nucleico como representado por SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 50.

O homólogo também pode ser codificado por uma variante . alélica de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou um homólogo do mesom. As variantes alélicas existem na natureza, e está englobado nos métodos da presente invenção o uso destes alelos naturais. As variantes alélicas englobam polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) assim como polimorfismos de inserção/ deleção pequenos (INDELs). O tamanho de INDELS é geralmente menor que 100 bp. SNPs e INDELs formam o maior conjunto de variantes de seqüência em cepas polimórficas de ocorrência natural da maior parte dos organismos. A variante alélica pode incluir os nucleotídeos codificando um polipeptídeo compreendendo de amino-término para carbóxi-término: (i) um domínio rico em Pro-Ser, e (ii) dois domínios WRKY incluindo um motivo C2-H2 de prolongamento de zinco. A variante alélica pode opcionalmente compreender qualquer um ou mais dos seguintes: (i) uma extensão ácida entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre 6 aminoácidos são ou Asp (D) ou Glu (E); (ii) um NLS putativo entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre 4 aminoácidos são ou Lys (K) ou Arg (R); e (iii) um domínio conservado com pelo menos 50%, 60% ou 70%, preferivelmente 75% ou 80%, mais preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 91%, 92%, 93%, 94% ou 95%, o mais preferivelmente 96%, 97%, 98% ou 99% identidade para SEQ ID NO: 39. A variante alélica pode ainda compreender um motivo LXSP dentro do domínio rico em Pro-Ser (onde L é Leu, S é Ser, P é Pro e X é qualquer aminoácido). As variantes alélicas preferidas são variantes alélicas de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY como representado por qualquer um dos ácidos nucleicos dados na tabela 1 e/ou no protocolo de seqüência. Os mais preferidos são variantes alélicos de um ácido nucleico como representado por SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 50.

As variantes de emenda e variantes alélicas de ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY são exemplos de ácidos nucleicos utilizáveis na realização dos métodos da invenção.

De acordo com um aspecto preferido da presente invenção, a expressão modulada de ácido nucleico de dois domínios WRKY ou variante do mesmo é visada. Os métodos para aumentar a expressão de genes ou produtos de genes são bem documentados na arte e incluem, por exemplo, a super-expressão dirigida por promotores apropriados, o uso de melhoradores de transcrição, ou melhoradores de tradução. Os ácidos nucleicos isolados que servem como elementos de promotor ou melhorador podem ser introduzidos em uma posição apropriada (tipicamente a montante) de uma forma não heteróloga de um polinucleotídeo de modo a regular de modo positivo a expressão de um ácido nucleico de dois domínios WRKY ou sua variante. Por exemplo, os promotores endógenos podem ser alterados in vivo por mutação, deleção e/ou substituição (ver, Kmiec, Pat. US No. 5.565.350; Zarling et al., PCT/US93/03 868), ou promotores isolados podem ser introduzidos em uma célula de planta na orientação apropriada e distância de um gene da presente invenção de modo a controlar a expressão do gene. Os métodos para reduzir a expressão de genes ou produtos de genes são bem documentados na arte e incluem, por exemplo, a regulação de modo negativo de expressão por técnicas anti-sentido, co-supressão, técnicas de RNAi usando RNAs de grampo de cabelo (hpRNAs), RNAs pequena interferência (siRNAs), microRNA(miRNA), etc.

Se a expressão de polipeptídeo for desejada, é geralmente desejável incluir uma região de poliadenilação na extremidade 3' de uma região de codificação de polinucleotídeo. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de outros genes de plantas, ou de T-DNA. A seqüência de terminação 3' a ser adicionada pode ser derivada de, por exemplo, genes de nopalina sintase ou octapina sintase, ou 15 alternativamente de outro gene de planta, ou menos preferivelmente de qualquer outro gene eucariótico.

Uma seqüência de íntron pode ser também adicionada para a região 5' não traduzida ou a seqüência de codificação da seqüência de codificação parcial para aumentar a quantidade de mensagem madura que acumula no citosol. A inclusão de um íntron emendável na unidade de transcrição em construções de expressão tanto de plantas como de animais foi mostrada como aumentando a expressão dos genes em níveis de mRNA e de proteína em até 1000 vezes; Buchman e Berg, MoL Cell biol. 8:4395-4405 (1988); Callis et ai, Genes Dev. 1:1183-1200 (1987). Esta melhora de introns de expressão de genes é tipicamente maior quando colocada próximo da extremidade 5' da unidade de transcrição. Os usos de introns de milho Adhl-S íntron 1, 2, e 6, o íntron Bronze-I são bem conhecidos na arte. Ver geralmente The Maize Handbook, Cap. 116, Freeling e Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994). A invenção também prove construções genéticas e vetores para facilitar a introdução e/ou expressão das seqüências de nucleotídeos utilizáveis nos métodos de acordo com a invenção.

Assim, prove-se uma construção de genes compreendendo:

(i) um ácido nucleico de dois domínios WRKY ou variante do mesmo, como definido acima,

(ii) uma ou mais seqüências de controle capazes de dirigir a expressão da seqüência de ácido nucleico de (i) e opcionalmente

(iii) uma seqüência de terminação de transcrição.

As construções utilizáveis nos métodos de acordo com a presente invenção podem ser construídas usando tecnologia de DNA recombinante bem conhecida dos versados na arte. As construções de genes podem ser inseridas em vetores, que pode ser comercialmente disponíveis, apropriados para transformação em plantas e apropriado para expressão do gene de interesse nas células transformadas. A invenção assim provê o uso de uma construção de genes como definido acima nos métodos da invenção.

As plantas são transformadas com um vetor compreendendo a seqüência de interesse (isto é, um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou homólogo deste polipeptídeo). A seqüência de interesse é ligada operativamente a uma ou mais seqüências de controle (pelo menos a um promotor). Os termos "elemento regulador", "seqüência de controle" e "promotor" são todos usados e modo interpermutável aqui e devem ser tomados em um contexto amplos para fazer referência a seqüências de ácido nucleico regulatórias capazes de efetuar a expressão das seqüências a quais elas são ligadas. Estão englobadas pelos termos acima mencionados as seqüências regulatórias de transcrição derivadas de um gene genômico eucariótico clássico (incluindo a caixa TATA que é requerida para a iniciação da transcrição precisa, com ou sem uma seqüência de caixa CCAAT) e elementos regulatórios adicionais (isto é, seqüências de ativação a montante, melhoradores e silenciadores), que alteram a expressão dos genes em resposta aos estímulos de desenvolvimento e/ou externos, ou em um modo específico de tecido. Também está incluída no termo uma seqüência regulatória de transcrição de um gene procariótico clássico, neste caso, ele pode incluir uma seqüência de caixa -35 e/ou seqüências regulatórias de transcrição caixa -10. O termo "elemento regulatório" também engloba uma molécula de fusão sintética ou derivado que confere, ativa ou melhora a expressão de uma molécula de ácido nucleico, em uma célula, tecido ou órgão. O termo "ligado operativamente" como usado aqui refere-se a uma ligação funcional entre a seqüência do promotor e o gene de interesse, de modo que a seqüência de promotor é capaz de iniciar a transcrição do gene de interesse.

Os promotores apropriados, que são funcionais em plantas, são geralmente conhecidos. Eles podem tomar a forma de promotores constitutivos ou indutíveis. Os promotores apropriados podem permitir a expressão específica de desenvolvimento e/ou tecido em eucarióticos de múltiplas células; assim promotores específicos de folhas, raízes, flores, sementes, estomatas, tubérculos, ou frutas podem ser usados com vantagem nas plantas.

Os promotores de plantas diferentes utilizáveis em plantas são promotores como, por exemplo, os promotores USP, LeB4-, DC3 ou o promotor de ubiquitina de salsa.

Um promotor de "planta" compreende elementos regulatórios, que mediam a expressão de um segmento de seqüência de codificação em células de plantas. Conseqüentemente, um promotor de plantas não precisa ser de origem de plantas, mas pode se originar de vírus ou microorganismos, particularmente por exemplo de vírus que atacam as células de plantas.

O promotor de "planta" também pode se originar de uma célula de plantas, por exemplo, da planta, que é transformada com a seqüência de ácido nucleico a ser expressada no processo da invenção e aqui descrita. Isto também se aplica a outros sinais regulatórios de plantas, por exemplo, em terminadores de "plantas".

Para expressão em plantas, a molécula de ácido nucleico deve, como descrito acima, ser ligada operativamente a ou compreender um promotor apropriado que expressa o gene no ponto correto em tempo e em modo específico de células ou tecido. Os promotores utilizáveis são promotores constitutivos (Benfey et ai, EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), como os que se originam de vírus de plantas, como 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 19S CaMV (ver também US 5352605 e WO 84/02913), 34S FMV (Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443), ou promotores de plantas, como o promotor de ubiquitina de salsa, como o promotor de subunidade pequena Rubisco descrito em US 4,962,028 ou os promotores de plantas PRPl [Ward et al, Plant. MoL Biol. 22 (1993)], SSU, PGEL1, OCS, [Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553-2557], lib4, usp, mas [Cornai (1990) Plant Mol Biol 15 (3):373-381], STLS1, ScBV (Schenk (1999) Plant Mol Biol 39(6):1221-1230), B33, SADl ou SAD2 (promotores de linho, Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696-1701) ou nos [Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20):7831-7846]. Outros exemplos de promotores de plantas constitutivos são os promotores de beterraba de açúcar V-ATPase (WO 01/14572). Exemplos de promotores constitutivos sintéticos são o promotor Super (WO 95/14098) e promotores derivados de caixas G (WO 94/12015). Se apropriado, promotores indutíveis químicos também podem ser além disso usados, comparar EP-A 388186, EP-A 335528, WO 97/06268. A expressão constitutiva estável das proteínas de acordo com a invenção em uma planta pode ser vantajosa. No entanto, a expressão indutível do polipeptídeo da invenção é vantajosa, se uma expressão tardia antes da colheita for de vantagem, como manipulação metabólica pode levar a retardo no crescimento de plantas.

A expressão de genes de plantas pode ser facilitada também via um promotor indutível químico (para um estudo, ver Gatz 1997, Annu. Rev. Plant PhysioL Plant MoL Biol., 48:89-108). Os promotores quimicamente indutíveis são particularmente apropriados quando se deseja expressar o gene em um modo específico no tempo. Os exemplos destes promotores são promotor indutível de ácido salicílico (WO 95/19443), e promotor indutível de ácido abscíssico (EP 335 528), um promotor indutível de tetraciclina (Gatz et ai. (1992) Plant J. 2, 397-404), um promotor indutível de um ciclohexanol ou etanol (WO 93/21334) ou outros como descrito aqui.

Outros promotores apropriados são os que reagem às condições de estresse biótico ou abiótico, por exemplo, o promotor de gene PRPl induzido por patógeno (Ward et ai., Plant. MoL BioL 22 (1993) 361- 366), o promotor hsp80 indutível por calor de tomate (US 5,187,267), o promotor alfa-amilase indutível por frio da batata (WO 96/12814) ou o promotor pinll indutível por ferida (EP-A-O 375 091) ou outros como descrito aqui.

Os promotores preferidos são particularmente os que ocasionam a expressão de genes tem tecidos e órgãos, em células de sementes, como células de endosperma e células do embrião em desenvolvimento. Os promotores apropriados são o promotor do gene napina de colza de semente oleígena (US 5,608,152), o promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et aL, Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), o promotor oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), o promotor faseolina de Phaseolus vulgaris (US 5.504.200), o promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980), o promotor arc5 de feijão, o promotor DcG3 de cenoura, ou o promotor B4 de Legumina (LeB4; Baeumlein et aL, 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9), e promotores que ocasionam a expressão específica em semente em plantas monocotiledôneas como milho, cevada, trigo, centeio, arroz e outras. Os promotores específicos de sementes vantajosos são o promotor de proteína de ligação de sacarose (WO/26388), o promotor faseolina e o promotor napin. Os promotores apropriados que devem ser considerados são o promotor de gene lpt2 ou Iptl de cevada (WO 95/15389 e WO 95/23230), e os promotores descritos em WO 99/16890 (promotores de gene hordeina de cevada, o gene glutelina de arroz, o orizina de arroz, o gene prolamina de arroz, o gene gliadina de trigo, o gene glutelina de tribo, o gene zeína de milho, o gene glutelina de aveia, o gene kasirina de sorgo, e o gene secalina de centeio). Outros promotores apropriados são Amy32b, Amy 6-6 e Aleurain [US 5.677.474], Bce4 (colza de semente oleígena ) [US 5.530.149], glicinina (soja) [EP 571 741], fosfoenolpiruvato carboxilase (soja) [JP 06/62870], ADRl2-2 (soja) [WO 98/08962], isocitrato liase (colza de semente oleígena) [US 5.689.040] ou α-amilase (cevada) [EP 781 849]. Outros promotores que são disponíveis para a expressão dos genes em plantas são promotores específicos de folhas, com os descritos em DE-A 19644478 ou promotores regulados pela luz, como por exemplo, o promotor petE de ervilha.

Outros promotores de plantas apropriados são o promotor FBPase citosólico ou o promotor ST-LSI de batata (Stockhaus et aL, EMBO J. 8, 1989, 2445), o promotor fosforibosilpirofosfato amidotransferase de Glycine max (GenBank Acesso No. U87999) ou promotor específico de nódulo descrito em EP-A-O 249 676.

Com vantagem, qualquer tipo de promotor pode ser usado para dirigir a expressão da seqüência de ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor indutível, isto é, tendo uma iniciação de transcrição induzida ou aumentada em resposta a um produto químico estímulo físico ou ambiental. Um exemplo de um promotor indutível é um promotor indutível por estresse, isto é, um promotor ativado quando uma planta é exposta a várias condições de estresse. Adicionalmente ou alternativamente, o promotor pode ser um promotor específico de tecido, isto é, um que é capaz de preferivelmente iniciar a transcrição em alguns tecidos, como as folhas, raízes, tecido de sementes, etc, Em uma forma de realização, o ácido nucleico de dois domínios WRKY ou variante do mesmo é ligado operativamente a um promotor constitutivo. Um promotor constitutivo é transcripcionalmente ativo durante a maior parte, mas não necessariamente todas, as fases de seu crescimento ou desenvolvimento e é substancialmente expressado de modo ubíquo. Preferivelmente, o promotor constitutivo é um promotor GOS2 (de arroz (SEQ ID NO: 42). Os exemplos de outros promotores constitutivos que também podem ser usados para dirigir a expressão de um ácido nucleico de dois domínios WRKY são mostrados na tabela 4 abaixo.

Tabela 4: Exemplos de promotores constitutivos

<table>table see original document page 59</column></row><table> Em outra forma de realização, o ácido nucleico de dois

domínios WRKY ou variante do mesmo é ligado operativamente a um promotor específico de semente, preferivelmente um promotor específico de embrião e/ou aleurona. Preferivelmente, o promotor específico de embrião e/ou aleurona é um promotor de oleosina mais preferivelmente o promoto específico de embrião e/ou aleurona é um promotor de oleosina de 18 kDa, ainda preferivelmente o promotor específico de embrião e/ou aleurona é um promotor de oleosina de 18 kDa de arroz (Wu et al (1998) J Biochem 123(3): 386-91), mais preferivelmente o promotor específico de embrião e/ou aleurona é substancialmente similar à seqüência como representada por SEQ ID NO: 43, ou é como representado em SEQ ID NO: 43. Os exemplos de outros promotores específicos de semente que podem ser usados para dirigir a expressão de um ácido nucleíco de dois domínios WRKY são mostrados na tabela 5 abaixo.

Tabela 5: Exemplos de promotores específicos de semente <table>table see original document page 60</column></row><table>

Deve ser evidente que a aplicabilidade da presente invenção não é limitada ao ácido nucleico de dois domínios WRKY representado por SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 50, nem a aplicabilidade da presente invenção limitada à expressão de um ácido nucleico de dois domínios WRKY quando dirigida por ou promotor GOS2 ou um promotor de oleosina.

Opcionalmente, uma ou mais seqüências de terminador podem ser também usadas na construção introduzida em uma planta. O termo "terminador" engloba uma seqüência de controle que é uma seqüência de DNA no final de unidade de transcrição que assinala o processamento e poliadenilaçao de 3' do transcrito primário e terminação de transcrição. Os elementos regulatórios adicionais podem incluir melhoradores de transcrição assim como de tradução. Os versados na arte saberão as seqüências de terminador e melhorador que podem ser apropriadas para uso na realização da invenção. Estas seqüências devem ser conhecidas ou podem ser prontamente obtida por um versado na arte. As construções genéticas da invenção podem ainda incluir uma seqüência de origem de replicação que é requerida para a manutenção e/ou replicação em um tipo de células específico. Um exemplo é quando uma construção genética é requerida para ser mantida em uma célula bacteriana como um elemento genético epissomal (por exemplo molécula de plasmídeo ou cosmídeo). As origens preferidas de replicação incluem, mas não são limitadas a fl-ori e colEl.

Para a detecção e/ou seleção da transferência com sucesso de seqüências de ácido nucleico como mostrado no protocolo de seqüência e usado no processo da invenção, é vantajoso usar genes marcadores (= genes repórter). Estes genes marcadores permitem a identificação de uma transferência com sucesso das moléculas de ácido nucleico via uma série de diferentes princípios, por exemplo, via identificação visual com a ajuda de fluorescência, luminescência ou na faixa de comprimento de onda de luz que é discernível para o olho humano, por uma resistência a herbicidas, ou antibióticos, via os que são conhecidos como marcadores nutritivos (marcadores de auxotrofismo) ou marcadores anti-nutritivos, vias testes de enzimas ou via fitohormônios. Os exemplos destes marcadores que podem ser mencionados são GFP (= proteína fluorescente verde), o sistema luciferina/ luciferase, β-galactosidase com seus substratos coloridos, por exemplo, X- Gal, a resistência aos herbicidas, por exemplo, imidazolinona, glifosato, fosfmotricina ou sulfonil uréia, resistência aos antibióticos por exemplo, bleomicina, higromicina, estreptomicina, canamicina, tetraciclina, cloramphenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina ou blasticidina, para mencionar apenas alguns, marcadores nutritivos, como a utilização de manose ou xilose, ou marcadores anti-nutritivos, como resistência a 2-desoxiglucose. Esta lista é um número pequeno de marcadores possíveis. O versado é muito familiarizado com estes marcadores. Os marcadores diferentes são preferidos, dependendo do organismo e o método de seleção.

Assim, a construção genética pode opcionalmente compreender um gene marcador selecionável. Como usado aqui, o termo "marcador selecionável" ou " gene de marcador selecionável" inclui qualquer gene que confere um fenótipo em uma célula em que ele é expressado para facilitar a identificação e/ou seleção de células que são transfectadas ou transformadas com uma construção de ácido nucleico da invenção. Os marcadores apropriados podem ser selecionados de marcadores que conferem resistência a antibiótico ou herbicida, que introduzem um novo traço metabólico ou que permitem uma seleção visual. Os exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem genes conferindo resistência a antibióticos (como nptll, que fosforila neomicina e canamicina, ou hpt, fosforilando higromicina), a herbicidas (por exemplo bar que provê resistência a Basta, aroA ou gox provendo resistência contra glifosato) ou genes que provêem um traço metabólico (como manA que permite às plantas usar manose como a única fonte de carbono). Os genes marcadores visuais resultam na formação de cor (por exemplo β- glucuronidase, GUS), luminescência (como luciferase), ou fluorescência (proteína fluorescente verde, GFP, e seus derivados).

Conhece-se que a integração estável ou transiente de ácidos

nucleicos em células de plantas em que somente uma minoria das células absorve o DNA estranho e, se desejado, integra o mesmo em seu genoma, dependendo do vetor de expressão usado e a técnica de transfecção usada. Para identificar e selecionar estes integrantes, um gene codificando para um marcador selecionável (como descrito acima, por exemplo, resistência a antibióticos) é geralmente introduzido nas células hospedeiras junto com o gene de interesse. Os marcadores selecionáveis preferidos em plantas compreendem os que conferem resistência a um herbicida como glifosato ou glufosinato. Outros marcadores apropriados são, por exemplo, marcadores que codificam genes envolvidos em vias biossintéticas de, por exemplo, açúcares ou aminoácidos, como β-galactosidase, ura3 ou ilv2. Os marcadores que codificam genes como luciferase, gfp, ou outros genes fluorescentes, são do mesmo modo apropriados. Estes marcadores e os marcadores acima mencionados podem ser usados em mutantes dos quais estes genes não são funcionais porque, por exemplo, eles foram deletados por métodos convencionais. Além disso, as moléculas de ácido nucleico que codificam um marcador selecionável, podem ser introduzidas em uma célula hospedeira no mesmo vetor como estes, que codificam os polipeptídeos da invenção ou usados no processo ou também em um vetor separado. As células que foram transfectadas estavelmente com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas por exemplo por seleção (por exemplo células que foram integradas no marcador selecionável sobrevivem, enquanto as outras células morrem).

Porque os genes marcadores, como uma regra especificamente o gene para resistência a antibiótico e herbicidas, não são mais requeridos ou não são desejados na célula hospedeira transgênica uma vez que os ácidos nucleicos foram introduzidos com sucesso, o processo de acordo com a invenção para a introdução de ácidos nucleicos com vantagem emprega técnicas que permitem a remoção, ou excisão, destes genes marcadores. Um tal método é o conhecido como co-transformação. O método de co- transformação emprega dois vetores simultaneamente para a transformação, um vetor contendo o ácido nucleico de acordo com a invenção e um segundo contendo o(s) gene(s) marcador(es). Uma grande proporção de transformantes recebe, ou no caso de plantas, compreende (até 40% dos transformantes e acima), ambos os vetores. No caso de transformação com Agrobacteria, os transformantes geralmente recebem somente uma parte do vetor, a seqüência flanqueada por T-DNA, que geralmente representa o cassete de expressão. Os genes marcadores podem subseqüentemente ser removidos da planta transformada por realização de cruzamentos. Em outro método, os genes marcadores integrados no transposon são usados para a transformação junto com o ácido nucleico desejado (conhecida com a tecnologia Ac/Ds). Os transformantes podem ser cruzados com um recurso de transposase ou os transformantes são transformados com uma construção de ácido nucleico conferindo expressão de uma transposase, transientemente ou estável. Em alguns casos (aproximadamente 10%), o transposon pula fora do genoma da célula hospedeira uma vez que a transformação ocorreu com sucesso e é perdido. Em um outro número de casos, o transposon pula para um local diferente. Nestes casos, o gene marcador deve ser eliminado por realização de cruzamentos. Em microbiologia, as técnicas foram desenvolvidas que tornam possível, ou facilitam, a detecção destes eventos. Um outro método vantajoso se baseia no que é conhecido como sistemas de recombinação; cuja vantagem é que a eliminação por cruzamento pode ser dispensada. O melhor sistema conhecido deste tipo é o conhecido como o sistema Cre/lox. Crel é uma recombinase, que remove as seqüências localizadas entre as seqüências IoxP. Se o gene marcador for integrado entre as seqüências IoxP, ele é removido, uma vez que a transformação ocorreu com sucesso, por expressão da recombinase. Outros sistemas de recombinação são os sistemas HIN/HIX, FLP/FRT e REP/STB (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al, J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). Uma integração sítio- específica no genoma da planta das seqüências de ácido nucleico de acordo com a invenção é possível. Naturalmente, estes métodos também podem ser aplicados a microorganismos como leveduras, fungos ou bactérias. A presente invenção também engloba plantas obteníveis pelos

métodos de acordo com a presente invenção. A presente invenção assim provê plantas, partes de plantas, (incluindo sementes) e células de plantas obteníveis pelo método de acordo com a presente invenção, cujas plantas, partes de plantas e células de plantas têm introduzidas nas mesmas um ácido nucleico de dois domínios WRKY ou variante do mesmo.

A invenção também provê um método para a produção de plantas transgênicas tendo aumentado rendimento com relação às plantas de controle, compreendendo a introdução e expressão em uma planta de um ácido nucleico de estringência ou uma variante do mesmo.

Mais especificamente, a presente invenção provê um método para a produção de plantas transgênicas tendo rendimento aumentado com relação às plantas de controle, cujo método compreende:

(i)introduzir e expressar em uma planta ou célula de plantas um ácido nucleico de dois domínios WRKY ou variante do mesmo; como definido aqui, e

(ii)cultivar a célula de planta sob condições promovendo o crescimento e desenvolvimento da planta.

O ácido nucleico pode ser introduzido diretamente em uma célula de planta ou na própria planta (incluindo introdução em um tecido, órgão, ou qualquer outra parte de uma planta). De acordo com um aspecto preferido da presente invenção, o ácido nucleico é preferivelmente introduzido em uma planta por transformação.

O termo "introdução" ou "transformação" como referidos aqui engloba a transferência de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, sem levar em conta o método usado para a transferência. Tecido de planta capaz de propagação clonal subseqüente, seja por organogenese ou embriogenese, pode ser transformado com uma construção genética da presente invenção e uma planta completa regenerada da mesma. O tecido particular selecionado irá variar dependendo dos sistemas de propagação clonais disponíveis ou, e melhor apropriados para, a espécie particular sendo transformada. As marcações de tecido exemplares incluem discos de folha, pólen, embriões, cotilédones, hipocótiles, megagametófitos, tecido de calo, tecido meristemático existente, (por exemplo meristema apical, brotos axilares, e meristemas de raiz) e tecido de meristema induzido (por exemplo meristema de cotilédone e meristema de hipocótilo). O polinucleotídeo pode ser introduzido de modo transiente ou estável em uma célula hospedeira e pode ser mantido não integrado, por exemplo, como um plasmídeo. Alternativamente, ele pode ser integrado no genoma do hospedeiro. A célula de planta transformada resultante pode ser então usada para regenerar uma planta transformada em um modo bem conhecido dos versados na arte.

A transferência de genes estranhos no genoma de uma planta é chamada transformação. Ao fazer isto, os métodos descritos para a transformação e regeneração de plantas a partir de tecidos de plantas ou células de plantas são usados para transformação estável ou transiente. Um método de transformação vantajoso é a transformação in planta. Para isto, é possível, por exemplo, deixar as agrobactérias atuarem sobre as sementes de plantas ou inocular o meristema da planta com agrobactérias. Foi provado ser particularmente expediente de acordo com a invenção permitir uma suspensão de agrobactérias transformadas atuarem sobre a planta intacta ou pelo menos os primórdios da flor. A planta é subseqüentemente cultivada até as sementes da planta tratada serem obtidas (Clough e Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Para selecionar as plantas transformadas, o material de planta obtido na transformação é como uma regra, submetido a condições seletivas de modo que as plantas transformadas podem ser distintas de plantas não transformadas. Por exemplo, as sementes obtidas no modo acima descrito podem ser plantadas e, após um período de crescimento inicial, submetidas a uma seleção apropriada por pulverização. Uma outra possibilidade consiste em crescimento de sementes, se apropriado, após esterilização, em placas de agar usando um agente de seleção apropriado de modo que somente as sementes transformadas podem crescer em plantas. Outros métodos de transformação vantajosos, particularmente para plantas, são bem conhecidos dos versados e descritos abaixo. A transformação de espécies de plantas é agora uma técnica de rotina conveniente. Com vantagem, qualquer um dos vários métodos de transformação pode ser usado para introduzir o gene de interesse em uma célula ancestral apropriada. Os métodos de transformação incluem o uso de lipossomas, eletroporação, produtos químicos que aumentam a absorção de DNA livre, injeção de DNA diretamente na planta, bombardeio de pistola de partículas, transformação usando vírus ou pólen e microprojeção. Os métodos podem ser selecionados dentre o método de cálcio/ polietileno glicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); eletroporação de protoplastos (Shillito ~hê R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); microinjeção no material de * plantas (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); . bombardeio de partículas revestidas com DNA ou RNA (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) infecção com vírus (não-integrativos) e semelhantes. As plantas de arroz transgênicas expressando um ácido nucleico/ gene de dois domínios WRKY são preferível mente produzidas via transformação mediada por Agrobacterium usando qualquer um dos métodos bem conhecidos para a transformação de arroz, como descrito em qualquer um dos seguintes: pedido de patente européia publicado EP 1198985 Al, Aldemita e Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), cujas descrições são incorporadas por referência aqui como completamente especificadas. No caso de transformação de milho, o método preferido é como descrito em ou Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) ou Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002), cujas descrições são incorporadas por referência aqui como completamente especificadas. Os referidos métodos são ainda descritos por meio de exemplo em B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer5 em: Transgenic Plants, VoL 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 e em Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. BioL 42 (1991) 205-225). Os ácidos nucleicos ou a construção a ser expressada são preferivelmente clonados em um vetor, que é apropriado para a transformação de Agrobacterium tumefaciens, por exemplo, pBinl9 (Bevan et ai., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Agrobactérias transformadas por este vetor podem ser então usadas em modo conhecido para a transformação de plantas, particularmente plantas de cultura como a título de exemplo plantas de tabaco, por exemplo, por banho das folhas machucadas ou folhas cortadas em uma solução agrobacteriana e então cultivando as mesmas em meio apropriado. A transformação de plantas por

meio de Agrobacterium tumefaciens é descrita, por exemplo, por Hõfgen e

Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 ou é conhecida inter alia de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38. Geralmente, após transformação, as células de plantas ou

grupamentos de células são selecionados pela presença de um ou mais marcadores que são codificados pelos genes expressáveis em plantas co- transferidos com o gene de interesse, após o que o material transformado é regenerado em uma planta completa. Como mencionado, agrobactérias transformadas com um vetor

de expressão de acordo com a invenção também podem ser usadas no modo conhecido por si para a transformação de plantas como plantas experimentais como Arabidopsis ou plantas de cultura, como por exemplo, cereais, milho, aveia, centeio, cevada, trigo, soja, arroz, algodão, beterraba de açúcar, canola, girassol, linho, cânhamo, batata, tabaco, tomate, cenoura, pimentão, colza de semente oleígena, tapioca, cassava, araruta, tagetes, alfafa, alface e as várias espécies de árvores, nozes, e vinhedos, particularmente planta de cultura contendo óleo, como soja, amendoim, planta de óleo de rícino, girassol, milho, algodão, linho, colza de semente oleígena, coco, palma de óleo, cártamo (Carthamus tinctorius) ou bagos de cacau, por exemplo, por banho das folhas escarificadas ou segmentos de folhas em uma solução agrobacteriana e subseqüentemente cultivando as mesmas em meios apropriados.

Além da transformação de células somáticas, que então precisam ser regeneradas em plantas intactas, é também possível transformar as células de meristemas de plantas e em particular as células que se desenvolvem em gametas. Neste caso, os gametas transformados seguem o desenvolvimento das plantas natural, dando lugar a plantas transgênicas. Assim, por exemplo, sementes de Arabidopsis são tratadas com agrobactérias e sementes são obtidas das plantas em desenvolvimento das quais uma certa proporção é transformada e assim transgênica [Feldman, KA e Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:274-289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua e J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274-289]. Os métodos alternativos são baseados na remoção repetida das inflorescências e incubação do sítio de excisão no centro da roseta com agrobactérias transformadas, assim as sementes transformadas podem do mesmo modo ser obtidas em um ponto posterior em tempo (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). No entanto, um método especialmente efetivo é o método de infiltração a vácuo com suas modificações como o método de "imersão floral". No caso de infiltração a vácuo de Arabidopsis, as plantas intactas sob pressão reduzida são tratadas com uma suspensão agrobacteriana [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sei, 316: 1194-1199], enquanto no caso do método de "imersão floral" o tecido floral em desenvolvimento é incubado brevemente com uma suspensão agrobacteriana tratada com tensoativo [Clough, SJ e Bent, AJF (1998). The Plant J. 16, 735-743]. Uma certa proporção de sementes transgênicas são coletadas em ambos os casos, e estas sementes podem ser distintas de sementes não transgênicas por cultivo sob as condições seletivas acima mencionadas. Além disso, a transformação estável de plastídeos é de vantagem porque os plastídeos são herdados maternalmente na maior parte das culturas, reduzindo ou eliminando o risco de fluxo de transgenes através do pólen. A transformação do genoma do cloroplasto é geralmente obtida por um processo, que foi esquematicamente mostrado em Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. Brevemente, as seqüências a serem transformadas são clonadas juntas com um gene marcador selecionável entre as seqüências de flanco homólogas ao genoma do cloroplasto. Estas seqüências de flanco homólogas dirigem a integração específica de sítio no plastoma. A transformação plastidial foi descrita para muitas espécies de plantas diferentes e um estudo pode ser obtido de Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3):425-38 ou Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends BiotechnoL 21, 20-28. Outro progresso biotecnológico foi recentemente relatado na forma de transformantes de plastídeos isentos de marcador, que podem ser produzidos por gene marcador co-integrado transiente (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).

As células de plantas geneticamente modificadas podem ser regeneradas via todos os métodos com os quais o versado está familiarizado. Os métodos apropriados podem ser encontrados nas publicações acima mencionadas por S.D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hõfgen e Willmitzer.

Após a transferência e regeneração do DNA, as plantas putativamente transformadas podem ser avaliadas, por exemplo, usando análise Southern, pela presença do gene de interesse, número de cópias e/ou organização genômica. Alternativamente ou adicionalmente, os níveis de expressão do DNA recentemente introduzido podem ser monitorados usando análise Northern e/ou Western, ou PCR quantitativo, todas as técnicas sendo bem conhecidas dos versados na arte. As plantas transformadas geradas podem ser propagadas por vários meios, como por propagação elonal ou técnica de criação clássicas. Por exemplo, uma planta transformada de primeira geração (ou TI) pode ser auto- cruzada para dar transformantes de segunda geração homozigóticos (ou T2), e as plantas T2 ainda propagadas através de técnicas de criação clássicas.

Os organismos transformados gerados podem tomar várias formas. Por exemplo, eles podem ser quimeras de células transformadas e células não transformadas; transformantes clonais (por exemplo todas as células transformadas para conter o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados ou não transformados (por exemplo em plantas, um material de

raiz transformado enxertado em um rebento não transformado).

A presente invenção claramente se estende a qualquer célula de planta ou planta produzida por qualquer um dos métodos aqui descritos, e a todas as partes de plantas e propágulos das mesmas. A presente invenção se estende ainda para englobar a progênie de uma célula, tecido, órgão ou planta completa transformada ou transfectada primária que foi produzida por qualquer um dos métodos acima mencionados, a única exigência sendo que a progênie demonstre as mesmas característica(s) genotípicas e/ou fenotípicas como as produzidas pelo parental nos métodos de acordo com a invenção. A invenção também inclui as células hospedeiras contendo um ácido nucleico dois domínios WRKY isolado ou variante do mesmo. As células hospedeiras preferidas de acordo com a invenção são células de plantas. A invenção também se estende a partes coletáveis de uma planta como, mas não limitadas a sementes, folhas, frutos, flores, culturas de caules, rizomas, tubérculos e bulbos. A invenção além disso refere-se a produtos derivados dos mesmos, preferivelmente produtos diretamente derivados de uma parte coletável de uma tal planta, como pelotas ou pós secos, óleo, gordura, e ácidos graxos, amido ou proteínas.

A presente invenção também engloba o uso de ácidos nucleicos de dois domínios WRKY ou variantes dos mesmos e uso de polipeptídeos tendo dois domínios WRKY ou homólogos dos mesmos, como definido aqui.

Um tal uso refere-se à melhora do rendimento, especialmente rendimento de sementes. O rendimento de sementes é definido acima e preferivelmente inclui um ou mais dos seguintes: TKW aumentado, comprimento de semente aumentado, largura de semente aumentada, número aumentado de sementes e número aumentado de flores por panícula.

Os ácidos nucleicos de dois domínios WRKY ou variantes os mesmos, ou polipeptídeos tendo dois domínios WRKY ou homólogos dos mesmos podem encontrar uso na criação de programas em que um marcador de DNA é identificado que pode ser geneticamente ligado a um gene de dois domínios WRKY ou variante do mesmo. Os ácidos nucleicos / genes de dois domínios WRKY ou suas variantes, ou polipeptídeos tendo dois domínios WRKY ou homólogos dos mesmos podem ser usados para definir um marcador molecular. Este marcador de DNA ou proteína pode ser então usado em programas de criação para selecionar plantas tendo rendimento aumentado. O gene de dois domínios WRKY ou variante do mesmo pode, por exemplo, ser um ácido nucleico como representado por qualquer um dos ácidos nucleicos dada na tabela 1 e/ou no protocolo de seqüência.

As variantes alélicas de um ácido nucleico / gene de dois domínios WRKY também encontram uso em programas de criação auxiliada por marcador. Estes programas de criação às vezes requerem a introdução de uma variação alélica por tratamento mutagênico das plantas, usando por exemplo mutagênese EMS; alternativamente, o programa pode partir com uma coleção de variantes alélicas de assim chamada origem "natural" causada não intencionalmente. A identificação de variantes alélicas então ocorre, por exemplo, por PCR. Isto é seguido por uma etapa para seleção de variantes alélicas superiores da seqüência em questão e que dão um rendimento aumentado. A seleção é tipicamente realizada por monitoração do desempenho de crescimento de plantas contendo variantes alélicas diferentes da seqüência em questão, por exemplo, variantes alélicas diferentes de qualquer um dos ácidos nucleicos dados na tabela 1.

O desempenho de crescimento pode ser monitorado em uma

estufa ou no campo. Outras etapas opcionais incluem o cruzamento de plantas, em que a variante alélica superior foi identificada, com outra planta. Isto pode ser usado, por exemplo, para fazer uma combinação de aspectos fenotípicos interessantes. Um ácido nucleico de dois domínios WRKY ou variante do

mesmo também pode ser usado como sondas para geneticamente e fisicamente mapear os genes que são uma parte de, e como marcadores de traços ligados a estes genes. Esta informação pode ser utilizável em criação de plantas a fim de desenvolver linhagens com fenótipos desejados. Este uso de 15 ácidos nucleicos de dois domínios WRKY ou variantes dos mesmos requer somente uma seqüência de ácido nucleico de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos de comprimento. Os ácidos nucleicos de dois domínios WRKY ou variantes dos mesmos podem ser usados como marcadores de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP). Southern blots (Sambrook J, Fritsch EF e Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) de DNA genômico de plantas digerido por restrição pode ser sondado com os ácidos nucleicos de dois domínios WRKY ou variantes dos mesmos. Os padrões de banda resultantes podem ser então submetidos a análises genéticas usando programas de computador como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174-181) a fim de construir um mapa genético. Além disso, os ácidos nucleicos podem ser usados para sondar Southern blots contendo DNAs genômicos tratados com endonuclease de restrição de um conjunto de indivíduos representando parentais e progênies de um cruzamento genético definido. A segregação dos polimorfismos de DNA é notada e usada para calcular a posição do ácido nucleico de dois domínios WRKY ou variante do mesmo no mapa genético previamente obtido usando esta população (Botstein et ai. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331).

A produção e uso de sondas derivadas de genes de plantas para uso em mapeamento genético são descritos em Bernatzky e Tanksley (1986) Plant Mol. BioL Repórter 4: 37-41. Numerosas publicações descrevem o mapeamento genético de clones de cDNA específicos usando a metodologia dada acima ou suas variações. Por exemplo, as populações de inter- cruzamento F2, populações de retro-cruzamento, populações casadas aleatoriamente, linhagens isogênicas próximas, e outros conjuntos de indivíduos podem ser usados para o mapeamento. Estas metodologias são bem conhecidas dos versados.

As sondas de ácido nucleico também podem ser usadas para mapeamento físico (isto é, colocação de seqüências em mapas físicos, ver Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, e suas referências citadas ).

Em outra forma de realização, as sondas de ácido nucleico podem ser usadas em mapeamento com hibridização in situ de fluorescência direta (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). Apesar de métodos correntes de mapeamento FISH favorecerem o uso de clones grandes (vários kb a várias centenas de kb; ver Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13-20), melhoras na sensibilidade podem permitir um desempenho de mapeamento de FISH usando sondas mais curtas.

Vários métodos com base em amplificação de ácido nucleico para mapeamento genético e físico podem ser realizados usando os ácidos nucleicos. Os exemplos incluem amplificaçao específica de alelo (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332), ligação específica para alelo (Landegren et al. (1988) Science 241:1077- 74

1080), reações de extensão de nucleotídeos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), mapeamento de híbridos com radiação Walter et ai. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) e "Happy Mapping" (Dear e Cook (1989) Nueleie Aeid Res. 17:6795-6807). Para estes métodos, a seqüência de um ácido nucleico é usada para projetar e produzir pares de iniciadores para uso na reação de amplificação ou em reações de extensão de iniciador. O projeto destes iniciadores é bem conhecido dos versados na arte. Em métodos empregando mapeamento genético com base em PCR, pode ser necessário identificar diferenças de seqüência de DNA entre os parentais do cruzamento do mapeamento na região correspondendo à presente seqüência de ácido nucléico. Isto, no entanto, não é geralmente necessário para métodos de mapeamento.

Os métodos de acordo com a presente invenção resultam em plantas tendo rendimento aumentado, como descrito acima. Estas características de crescimento vantajosas também podem ser combinadas com outros traços economicamente vantajosos, como outros traços de melhora do rendimento, tolerância a vários estresses, traços modificando vários aspectos arquitetônicos e/ou aspectos bioquímicos e/ou fisiológicos.

Descrição das figuras A presente invenção será agora descrita com referência às seguintes figuras em que

A figura 1 mostra a estrutura de domínio típica de um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY. O domínio rico em Pro-Ser está localizado na ext amino-terminal da proteína; o motivo LXSP (L para Leu, S para Ser, P para Pro e X para qualquer aminoácido) está contido nesta região e é indicado. Os dois domínios WRKY estão em caixa em preto. Entre os dois domínios WRKY, estão a extensão ácida (AC) e o sinal localização nuclear putativa (NLS). O motivo de SEQ ID NO: 39 que representa do domínio WRKY carbóxi-terminal também está em caixa. Fig. 2 é a análise filogenética de 58 membros da família Arath_WRKY (de Eulgem et al (2000) Trends Plant Sci 5(5): 199-206). A seta preta indica o agrupamento de polipeptídeos tendo dois domínios WRKY e um domínio rico em Pro-Ser em seu amino-término.

Fig. 3 mostra um alinhamento múltiplo de vários polipeptídeos

tendo dois domínios WRKY criados usando o programa de alinhamento múltiplo VNTI AlignX, baseado em um algoritmo ClustalW modificado (InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com), com configurações de padrão para penalidade de abertura de espaço de 10 e uma extensão de espaço de 0,05). A edição manual menor foi também realizada quando

necessário para melhor posicionar algumas regiões conservadas. Os domínios importantes de amino- término para carbóxi -término estão em caixa através dos polipeptídeos da planta: o domínio rico em Pro-Ser e seu motivo LXSP (onde L é Leu, S é Ser, P é Pro e X é qualquer aminoácido), o domínio WRKY amino-terminal (e seu heptapeptídeo) incluindo seu domínio de ligação de zinco C2H2, a extensão ácida, o NLS, o motivo de SEQ ID NO: 39, e o domínio WRKY carbóxi-terminal (e seu heptapeptídeo) incluindo seu domínio de ligação de zinco C2H2 estão ou em caixa ou escritos em negrito. O motivo LXSP de SEQ ID NO: 2 é de aminoácido para aminoácido, a extensão ácida de aminoácido 304 para aminoácido 309, o NLS de aminoácido 311 para aminoácido 314.

Fig. 4 mostra um vetor binário p0700 e p0709, para expressão

em

Oryza sativa de um polipeptídeo de Oryz sativa tendo dois domínios WRKY sob o controle de respectivamente um promotor GOS2 (referência interna

PROO129; representado como em SEQ ID NO: 42) e um promotor de oleosina (referência interna PR00218; representado como em SEQ ID NO: 43). Fig. 5 detalha exemplos de seqüências utilizáveis na realização dos métodos de acordo com a presente invenção, do códon de partida para o códon de parada no caso de seqüências de polinucleotídeos de (comprimento completo) codificando polipeptídeos com dois domínios WRKY.

Exemplos

A presente invenção será agora descrita com referência aos seguintes exemplos, que são a título de ilustração apenas.

Manipulação de DNA: salvo indicado em contrário, as técnicas de DNA recombinantes são realizadas de acordo com os protocolos padrões descritos em

(Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) ou em Volumes 1 e 2 de Ausubel et ai. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Os materiais padrões e métodos para o trabalho molecular de plantas são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado por BIOS ScientifIc Publications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications (UK).

Exemplo 1: Clonagem de genes de dois domínios WRKY de

Oryza sativa

O gene de dois domínios WRKY de Oryza sativa de SEQ ID NO: 1 foi amplificado por PCR usando como gabarito uma biblioteca de cDNA de mudas de Oriza sativa (Invitrogen, Paisley, UK). Após a transcrição reversa de RNA extraído de mudas, os cDNAs foram clonados em pCMV Sport 6.0. Um tamanho de inserto médio do banco foi de 1,66 kb e o número

η

original de clones foi da ordem de 2,67 χ 10 cfu. O título original foi determinado para ser de 3,34 χ IO5 cfu/ml após a primeira amplificação de IO10 cfu/ml. Após a extração de plasmídeos,, 200 ng de gabarito foram usados em uma mistura 50 μΐ PCR. Os iniciadores prm05769 (SEQ ID NO: 40; sentido, códon de partida em negrito, sítio AttBl em itálico: 5'- GGGGA CAA GTTTGTA CAAAAA A GCA GGCTTAA AC A ATGGCGTCCTCG ACG 3') e prm05770 (SEQ ID NO: 41; reverso, complementar, sítio AttB2 em itálico: 5'

GGGGA CCA CTTTGTA CAA GAAA GCTGGGTGG CTCGACTAGC AG AGGA .3'), que incluem os sítios AttB para recombinação Gateway, foram usados para a amplificação PCR. PCR foi realizado usando Hifl Taq DNA polimerase em condições padrões. Um fragmento de PCR de 1535 bp (incluindo sítios attB) foi amplificado e purificado também usando métodos padrões. A primeira etapa do procedimento Gateway, a reação BP, foi então realizada durante o que o fragmento de PCR recombina in vivo com o plasmídeo pDONR201 para produzir, de acordo com a terminologia Gateway, um "clone de entrada", p06983. Plasmídeo pDC)NR201 foi adquirido de Invitrogen, como parte da tecnologia Gateway®.

Exemplo 2: Construção de vetor O clone de entrada p06983 foi subseqüentemente usado em

uma reação LR com p00640, um vetor de destinação usado para transformação de Oryza sativa. Este vetor contém, como elementos funcionais, dentro das bordas do T-DNA: um marcador selecionável para planta, cassete de expressão de marcador triável, e um cassete Gateway destinado para recombinação LR in vivo com a seqüência de interesse já clonada no clone de entrada. Um promotor GOS2 de arroz (SEQ ID NO: 42) para a expressão constitutiva (PR00129) estava localizado a montante deste cassete Gateway.

O clone de entrada p06983 foi usado em uma segunda reação LR com p00831 outro vetor de destino usado para a transformação de Oryza sativa. Um promotor de oleosina 18 kDa de arroz (SEQ ID NO: 43) para expressão específica de embrião e/ou aleurona (PR00218) estava localizado a montante do cassete Gateway.

Após a etapa de recombinação LR, o vetor de expressão resultante,

p0700 e p0709 (Figura 2 e 4 ) foi transformado estavelmente em cepa de Agrobacterium LBA4044 e subseqüentemente separadamente em plantas de Oryza sativa. As plantas de arroz transformadas foram deixadas crescer e foram então examinadas para os parâmetros descritos no Exemplo 3.

Exemplo 3: Avaliação e resultados de plantas transgênicas de dois domínios WRKY de Oriza sativa

Aproximadamente 15 a 20 transformantes independentes TO de arroz foram gerados. Os transformantes primários foram transferidos de uma câmara de cultura de tecido para uma estufa para crescer e coletar a semente TI. Quatro a cinco eventos, dos quais a progênie de TI, segregaram 3:1 para a presença/ ausência do transgene, foram retidos. Para cada um destes eventos, aproximadamente 10 mudas Tl contendo o transgene (hetero- e homo-zigotos) e aproximadamente 10 mudas Tl faltando o transgene (nulizigotos) foram selecionadas por monitoração da expressão do marcador visual. As plantas transgênicas e os nulizigotos correspondentes foram cultivados lado a lado em posições aleatórias. Do estágio de semeadura até o estágio de maturidade, as plantas foram passadas várias vezes através de uma cabine de formação de imagem digital. Em cada ponto de tempo, imagens digitais (2048x1536 pixels, 16 milhões de cores) foram tomadas de cada planta de pelo menos 6 ângulos diferentes.

Quatro eventos T' foram ainda avaliados na geração de T2 após o mesmo procedimento de avaliação como para a geração de Tl com mais indivíduos por evento. Análise estatística- Teste F

Um ANOVA de dois fatores (análises de variância) foi usado como modelo estatístico para a avaliação global de características fenotípicas de plantas. Um teste F foi realizado em todos os parâmetros medidos de todas as plantas de todos os eventos transformados com o gene da presente invenção. O teste F foi realizado para verificar um efeito do gene sobre todos os eventos de transformação e para verificar um efeito global do gene, também chamado aqui efeito de gene global. O limiar para a significância para um efeito de gene global verdadeiro é fixado a 5% de nível de probabilidade para o teste F. Um valor de teste F significante aponta para um efeito de gene, significando que não paenas a presença ou posição do gene que está causando as diferenças no fenótipo.

Medidas de parâmetros relacionados com sementes As panículas primárias maduras foram coletadas, ensacadas, rotuladas com código de barras e então secadas durante três dais no forno a 37 0C. As panículas foram então debulhadas e todas as sementes coletadas e contadas, dando o número total de sementes. O número total de sementes dividido pelo número de panículas primárias deu uma estimativa do número de floretes por panícula. As cascas debulhadas cheias foram separadas das vazias usando um dispositivo de sopro de ar. Os debulhados vazios foram descartados e a fração restante contada novamente. Os debulhados cheios foram pesados em uma balança analítica. O número de sementes cheias foi determinado por contagem do número de debulhados cheios que permaneceram após a etapa de separação. O rendimento de semente total foi medido por peso de todos os debulhados cheios coletados de uma planta. O peso de mil grãos (TKW), é extrapolado do número de sementes cheias

contadas e seu peso total. O índice de colheita foi derivado da relação do

* 2

rendimento de semente total e a área acima da terra (mm ), multiplicado por

um fator IO6. O número total de flores por panícula como definido na presente invenção é a relação entre o número total de sementes e o número de panículas primárias maduras. A taxa de enchimento de semente como definido na presente invenção é a proporção (expressada como %) e o número de sementes cheias sobre o número total de sementes (ou floretes). A planta acima da terra foi determinada por contagem do número total de pixels das fotografias das partes de plantas acima da terra descriminados do fundo. Este valor foi obtido em média das fotografias tomadas no mesmo ponto de tempo de diferentes ângulos e convertidos em um valor de superfície física expressado em mm quadrado por calibre. As experiências mostram que a área de planta acima da terra deste modo está correlacionada com a biomassa da planta.

3.1. Avaliação e resultados de plantas transgênicas de Oryza sativa com um promotor constitutivo a montante de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo com dois domínios WRKY Os resultados das medidas de TKW para as plantas

transgênicas de dois domínios WRKY de Oryza sativa são mostrados na tabela 6. A diferença percentual entre os transgênicos e os nulizigotos correspondentes é também mostrada. O número de eventos com um aumento significante em TKW é indicado, assim como os valores P do teste F para as gerações Tlea T2.

O TKW foi aumentado de modo significante nas gerações Tl e T2 para as plantas transgênicas de dois domínios WRKY de Oryza sativa comparadas com suas contra-partes nulas (tabela 6).

Tabela 6: - Resultados de médias de TKW na geração Tl e T2 de plantas transgênicas de dois domínios WRKY comparadas com suas contra-partes nulas

<table>table see original document page 81</column></row><table> Os parâmetros de sementes individuais (largura, comprimento

e área) foram medidos em sementes das plantas T2, usando um dispositivo feito sob encomenda, consistindo de dois componentes principais, um dispositivos de pesagem e de formação de imagem, acoplado a um software para análise da imagem. Os resultados de medida de área de semente individual, comprimento e largura médias das sementes T3 (coletadas das plantas T2) para as plantas transgênicas de dois domínios WRKY de Oryza sativa são mostrados na tabela 7. A diferença percentual entre os transgênicos e os nulizigotos correspondentes é também mostrada. O número de eventos com um aumento significante em um parâmetro é indicado, assim como os valores ρ do Teste F.

A área de semente individual, comprimento e largura médios das sementes T3 das planta transgênicas T2 de dois domínios WRKY de

Oryza sativa foram todos aumentados de modo significante comparados com

suas contra-partes nulas (tabela 7).

Tabela 7: Medidas de área de semente individual, comprimento e largura das sementes T3 (coletadas das plantas T2) das plantas transgênicas T2 de dois domínios WRKY de Oryza sativa comparadas com suas contra-partes nulas.

<table>table see original document page 82</column></row><table>

3.2. Avaliação e resultados de plantas transgênicas de Oryza

sativa com um promotor específico de embrião e/ou aleurona a montante de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo com dois domínios WRKY

O número total de resultados de medida de sementes para as plantas transgênicas de dois domínios WRKY de Oryza sativa é mostrado na tabela 8. A diferença percentual entre os transgênicos e os nulizigotos correspondentes é também mostrada. O número de eventos com um aumento significante no número total de sementes é indicado, assim como os valores P do teste F para as gerações Tl e T2.

O número total de sementes foi aumentado de modo significante nas gerações Tl e T2 para as plantas transgênicas de dois domínios WRKY de Oryza sativa comparadas com as suas contra-partes nulas (Tabela 8).

Tabela 8: Resultados do número total de medidas de sementes na geração Tl e T2 de plantas transgênicas de dois domínios WRKY de Oryza sativa comparadas com suas contra-partes nulas.

<table>table see original document page 83</column></row><table> O número total de resultados de medidas de flores por panícula

para as plantas transgênicas de dois domínios WRKY de Oryza sativa é mostrado na tabela 9. A diferença percentual entre os transgênicos e os nulizigotos correspondentes é também mostrada. O número de eventos com um aumento significante no número total de sementes é indicado, assim como os valores P do teste F para as gerações Tl e T2.

O número total de flores por panícula foi aumentado de modo significante nas gerações Tl e T2 para as plantas transgênicas de dois domínios WRKY de Oryza sativa comparado com suas contra-partes nulas (tabela 9).

Tabela 9:- Resultados de número total de medidas de flores por panícula na geração Tl e T2 para as plantas transgênicas de dois domínios WRKY de Oryza sativa comparado com suas contra-partes nulas

<table>table see original document page 83</column></row><table> Exemplo 4: Determinação de similaridade global e

identidade entre polipeptídeos tendo dois domínios WRKY utilizáveis na realização dos métodos da invenção

As porcentagens globais de similaridade e identidade entre polipeptídeos tendo dois domínios WRKY foram determinadas usando um dos métodos disponíveis na arte, o software MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using proteína ou DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; software hosted by Ledion Bitincka). O software MatGAT gera matrizes de similaridade / identidade para seqüências de DNA ou proteína sem precisar do pré-alinhamento dos dados. O programa realiza uma série de alinhamentos à feição de pares usando o algoritmo de alinhamento global Myers e Miller (com uma penalidade de abertura de espaço de 12, e uma penalidade de extensão de espaço de 2), calcula a similaridade e identidade usando, por exemplo, Blosum 62 (para polipeptídeos) e então coloca os resultados em uma matriz de distância. A seqüência de SEQ ID NO: 2 está na linha 17.

Os resultados da análise de software são mostrados na tabela .10 para a similaridade e identidade global sobre o comprimento de SEQ ID NO: 39 (domínio conservado de 76 aminoácidos) dos polipeptídeos tendo dois domínios WRKY. A identidade percentual é dada acima, a diagonal e similaridade percentual é dada abaixo da diagonal. A identidade percentual entre os parálogos e ortólogos tendo dois domínios WRKY está na faixa entre .70 e 100%, refletindo a conservação de identidade de seqüência elevada entre os mesmos dentro deste domínio conservado.

Tabela 10: Identidade percentual e similaridade do domínio conservado (como representado por SEQ ID NO: 39) entre polipeptídeos ortólogos e parálogos tendo dois domínios WRKY. A identidade percentual é dada acima da diagonal e a similaridade percentual é dada abaixo da diagonal.

<table>table see original document page 84</column></row><table> <table>table see original document page 85</column></row><table> <table>table see original document page 86</column></row><table>

Claims

1.Método para aumentar o rendimento de plantas com relação às plantas de controle, caracterizado pelo fato de compreender modular a expressão em uma planta de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou um homólogo de tal polipeptídeo, e opcionalmente selecionar por plantas tendo rendimento aumentado, em que referido polipeptídeo tendo dois domínios WRXY ou homólogo compreende a partir de amino-término até carbóxi-término: (i) um domínio rico em Pro- Ser, e (ii) dois domínios WRKY incluindo um motivo C2-H2 de prolongamento de zinco.

1 REIVINDICAÇÕES

2.Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou homólogo ainda compreende um ou mais dos seguintes: (1) uma extensão ácida entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre os 6 aminoácidos são ou Asp (D) ou Glu (E); (ii) um NLS putativo entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre os 4 aminoácidos são ou Lys (K) ou Arg (R); e (iii) um domínio conservado com pelo menos 50%, 60% ou 70%, preferivelmente 75% ou 80%, mais preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95%, mais preferivelmente 96%, 97%, 98%, ou 99% identidade para SEQ ID NO: 39.

3.Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que referido polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou homólogo ainda compreende um motivo LXSP dentro do referido domínio rico em Pro-Ser (onde L é Leu, S é Ser, P é Pro e X é qualquer aminoácido).

4.Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a .3, caracterizado pelo fato de que referido domínio rico em Pro-Ser é pelo menos duas vezes tão rico em Pro e Ser comparado com uma composição de aminoácido média (em %) de proteínas do banco de dados de seqüência de proteína Swiss-Prot.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que referida expressão modulada é efetuada por introdução de uma modificação genética, preferivelmente no Iocus de um gene codificando um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY ou um homólogo de tal polipeptídeo.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que referida modificação genética é efetuada por um dentre: ativação de T-DNA, TILLING, recombinação homóloga, mutagênese sítio-dirigida ou evolução dirigida.

7. Método para aumentar o rendimento com relação às plantas de controle, caracterizado pelo fato de compreender introduzir e expressar em uma planta um ácido nucleico de dois domínios WRKY, como definido na reivindicação 1 ou um variante do mesmo.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que referida variante é uma porção de um ácido nucleico de dois domínios WRKY ou uma seqüência capaz de hibridizar em um ácido nucleico de domínios WRKY, cuja porção ou seqüência de hibridização codifica um polipeptídeo compreendendo a partir do amino-término para o carbóxi- término: (i) um domínio rico em Pro-Ser; e (ii) dois domínios WRKY incluindo um motivo C2-H2 de prolongamento de zinco.

9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o referido ácido nucleico de dois domínios WRKY ou variante do mesmo é superexpressado em uma planta.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que referido ácido nucleico de dois domínios WRKY ou variante do mesmo é de origem de planta, preferivelmente de uma planta monocotiledônea, ainda preferivelmente da família Poaceae, mais preferivelmente o ácido nucleico é de Oryza sativa ou Zea mays.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que referida variante codifica um ortólogo ou parálogo do polipeptídeo representado por SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 51.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ali, caracterizado pelo fato de que referido ácido nucleico de dois domínios WRKY ou variante do mesmo é ligado operativamente a um promotor constitutivo.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que referido promotor constitutivo é um promotor GOS2.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ali, caracterizado pelo fato de que referido ácido nucleico de dois domínios WRKY ou variante do mesmo é ligado operativamente a um promotor específico de embrião e/ou aleurona.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que referido promotor específico de embrião e/ou aleurona é um promotor de oleosina.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que referido rendimento aumentado é rendimento de sementes aumentado.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que referido rendimento aumentado é selecionado dentre um ou mais dos seguintes: TKW aumentado, área de semente individual aumentada, comprimento de semente individual aumentado, largura de semente individual aumentada, número aumentado de sementes, número aumentado de flores por panícula, cada relativo às plantas de controle.

18. Planta, parte de planta ou célula de planta, caracterizadas pelo fato de serem obteníveis pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

19. Molécula de ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de compreender uma molécula de ácido nucleico selecionada dentre o grupo consistindo de: a) uma molécula de ácido nucleico isolado, como mostrado em SEQ ID NO: 50; b) uma molécula de ácido nucleico isolado, codificando a seqüência de aminoácido como mostrada em SEQ ID NO: 51; c) uma molécula de ácido nucleico isolado, cuja seqüência pode ser deduzida de uma seqüência de polipeptídeo como mostrada em SEQ ID NO: 51, como um resultado da degenerescência do código genético; d) uma molécula de ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade com a seqüência de aminoácido do polipeptídeo codificado por molécula de ácido nucleico de (a) a(c); e) uma molécula de ácido nucleico isolado codificando um homólogo, derivado ou fragmento ativo da molécula de aminoácido como mostrado em SEQ ID NO: 51, cujo homólogo, derivado ou fragmento é de origem de planta e compreende com vantagem (i) uma extensão ácida entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre os 6 aminoácidos são ou Asp (D) ou Glu (E); (ii) um NLS putativo entre os dois domínios WRKY onde pelo menos 3 dentre os 4 aminoácidos são ou Lys (K) ou Arg (R); e (iii) um domínio conservado com pelo menos 50%, 60% ou .70%, preferívelmente 75% ou 80%, mais preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95%, mais preferivelmente 96%, .97%, 98%, ou 99% identidade para SEQ ID NO: 39; f) uma molécula de ácido nucleico isolado capaz de hibridizar com um ácido nucleico de (a) a (c) acima, ou seu complemento, em que a seqüência de hibridização ou o seu complemento codifica a proteína de planta de (a) a (e); pelo que a molécula de ácido nucleico tem atividades de aumento do rendimento e/ou crescimento em plantas.

20. Construção, caracterizada pelo fato de compreender: (i) um ácido nucleico de dois domínios WRKY, como definido na reivindicação 1, ou variante do mesmo; (ii) uma ou mais seqüências de controle capazes de dirigir a expressão da seqüência de ácido nucleico de (i); e opcionalmente (iii) uma seqüência de terminação de transcrição; ou (iv) uma seqüência de ácido nucleico como definida na reivindicação 19.

21. Construção de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que referida seqüência de controle é um promotor constitutivo.

22. Construção de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que referido promotor constitutivo é um promotor GOS2.

23. Construção de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que referido promotor GOS2 é como representado por SEQ ID NO: 42.

24. Construção de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que referida seqüência de controle é um promotor específico para embrião e/ou aleurona.

25. Construção de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que referido promotor específica para embrião e/ou aleurona é um promotor de oleosina.

26. Construção de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que referido promotor de oleosina é como representado por SEQ ID NO: 43.

27. Planta, parte de planta ou célula de planta, caracterizadas pelo fato de serem transformadas com uma seqüência de ácido nucleico como definida na reivindicação 19, ou com uma construção como definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 26.

28. Método para produzir uma planta transgênica tendo rendimento aumentado com relação às plantas de controle, caracterizado pelo fato de que o método compreende: (i) introduzir e expressar em uma planta ou célula de planta um ácido nucleico de dois domínios WRKY, como definido na reivindicação 1 ou variante do mesmo; (ii) cultivar a célula de planta sob condições promovendo o crescimento e desenvolvimento da planta.

29. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de ter rendimento aumentado resultante de um ácido nucleico de dois domínios WRKY ou uma variante do mesmo introduzido na referida planta.

30. Planta de acordo com a reivindicação 18, 27 ou 29, caracterizada pelo fato de que referida planta é uma planta monocotiledônea como cana de açúcar, ou em que a planta é um cereal, como arroz, milho, trigo, cevada, milheto, centeio, aveia ou sorgo.

31. Partes coletáveis de uma planta, caracterizadas pelo fato de serem como definidas em qualquer uma das reivindicações 18, 27, 29 ou 30.

32. Partes coletáveis de uma planta de acordo com a reivindicação 31, caracterizadas pelo fato de que as referidas partes coletáveis são sementes.

33. Produtos, caracterizados de serem diretamente derivados de uma planta como definida na reivindicação 30 e/ou de partes coletáveis de uma planta como definida nas reivindicações 31 ou 32.

34. Uso de um ácido nucleico /gene de dois domínios WRKY, como definido na reivindicação 1, ou variante do mesmo, ou uso de um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY, como definido na reivindicação 1, ou homólogo deste polipeptídeo, caracterizado pelo fato de ser para melhorar o rendimento, especialmente o rendimento de sementes, com relação às plantas de controle.

35. Uso de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que referido rendimento de semente é um ou mais dos seguintes: TKW aumentado, área de semente individual aumentada, comprimento de semente individual aumentado, largura de semente individual aumentada, número total aumentado de sementes ou número aumentado de flores por panícula.

36. Uso de um ácido nucleico / gene de dois domínios WRKY, como definido na reivindicação 1, ou variante do mesmo, ou uso de um polipeptídeo tendo dois domínios WRKY, como definido na reivindicação 1 ou homólogo deste polipeptídeo, como um marcador molecular.