CN108728455B

CN108728455B - 甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1

Info

Publication number: CN108728455B
Application number: CN201810839031.4A
Authority: CN
Inventors: 李富生; 何丽莲; 徐荣; 吴清莲; 孟玉; 曹哲群
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2038-07-27
Also published as: CN108728455A

Abstract

本发明公开一种甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1。所述WRKY转录因子基因SsWRKY1的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。该基因直接参与了甘蔗细茎野生种抗旱应答过程，是与抗旱直接相关的基因。本发明为深入研究该基因在甘蔗细茎野生种中的抗旱机制奠定了基础。

Description

甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因 SsWRKY1

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及干旱胁迫下的甘蔗细茎野生种WRKY转录因子基因，并基于该基因的序列设计引物，通过实时荧光定量PCR检测WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中干旱胁迫下差异表达的方法。

背景技术

甘蔗在生长发育过程中，会遭遇到低温、干旱等逆境胁迫，严重制约了甘蔗的生长、糖分及生物产量。因此，如何提高甘蔗对逆境胁迫的抗性、培育抗逆性强的新品种，已经成为甘蔗遗传育种研究的重要课题。甘蔗细茎野生种(Saccharum spontaneum L.)，又称割手密，是甘蔗属中分布最广的一个种，特点是纤维多，蔗汁少，空心，糖分低，优点是早熟、早花、易花，生势好，宿根性好，根群发达，有地下茎，早生快发，耐旱、耐瘠，抗逆性强，抗病虫害的能力强。(黄忠兴,周峰,王勤南,等.国内外割手密资源农艺性状表型遗传多样性分析[J].植物遗传资源学报,2012,13(5):825-829；许文花,杨清辉.甘蔗割手密无性系抗旱性鉴定[J].亚热带农业研究,2005,1(1):22-26；徐建云,陈超君,钟健,等.甘蔗育种、引种新理念的探讨[J].广西蔗糖,2005(2):3-7.)，因此，通过发掘甘蔗细茎野生种中的抗旱新基因，并从中克隆分离抗旱相关基因，对甘蔗抗旱育种具有重要意义。

WRKY转录因子(WRKY transcriptionfactor)是植物所特有的最大的转录因子家族之一，是一类DNA结合蛋白，参与植物的各个生理过程，涉及生长，发育和自我应激信号传导或与不同的基因和转录因子交叉调节。WRKY转录因子包含的WRKY结构域，是具有60个氨基酸长的DNA结合结构域，特征在于N端具有一个高度保守的WRKYGQK核心基序和CX_4-5CX_22- ₂₃HXH锌指结构(Ishiguro S,Nakamura K.Characterization of a cDNA encoding anovel DNA-binding protein,SPF1,that recognizes SP8 sequences in the 5’upstream regions of genes coding for sporamin and betaamylase from sweetpotato[J].Molecular Genetics and Genomics,1994,244(6)：563-571；Rushton,Paul J,Somssich,et al.WRKY transcription factors[J].Trends in Plant Science,2010,15(5)：247-258)。在高温、冷害、干旱等非生物胁迫在一定程度上会诱导WRKY转录因子表达上调或下调并引发信号级联网络，以提高植物的胁迫耐受性(Joshi R,Wani SH,Singh B,etal.Transcription factors and plants response to drought stress：currentunderstanding and future directions[J].Frontiers in Plant Science,2016,7：1029；Rushton DL,Tripathi P,Rabara RC,et al.WRKY transcription factors：Keycomponents in abscisic acid signalling[J].Plant Biotechnol J,2012,10(1)：2-11.)。但是，在甘蔗细茎野生种中尚无克隆到编码WRKY转录因子的基因及其受到干旱环境胁迫时功能的报道。

发明内容

本发明目的是为了提高现有栽培甘蔗品种的抗旱性，提高甘蔗的生物产量，并为进一步扩大甘蔗种植区域(由水肥条件好的地区转移至干旱贫瘠地区)，提供一个新的甘蔗细茎野生种中干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1，还提供一对扩增该基因的引物，以及一种检测该基因在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫差异表达的方法，从而进一步为甘蔗抗旱性育种奠定基础并提供候选基因。

本研究从受干旱胁迫的甘蔗细茎野生种中利用RT-PCR技术克隆获得一个编码WRKY转录因子的基因，在NCBI中经BLASTn比对分析，与高粱WRKY基因的同源性为83％，具有WRKY特有的WRKYGQK7肽和CX_4-5CX_22-23HXH锌指结构，推测该基因编码WRKY转录因子，故将该基因命名为WRKY转录因子基因SsWRKY1。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

1.甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.扩增技术方案1所述的甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1的专用引物，由上游引物WP-F和下游引物WP-R组成，所述上游引物WP-F的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述下游引物WP-R的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

3.一种检测技术方案1所述的WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达方法，包括(1)干旱处理，(2)总RNA的提取，(3)cDNA第一链的合成，(4)实时荧光定量PCR技术检测WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达情况，其特征在于：

在所述的(4)实时荧光定量PCR技术检测WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达情况中，使用的引物为引物WQF和引物WQR：所述引物WQF的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，引物WQR的碱基序列如SEQ ID NO：5所示。

4.根据技术方案3所述的一种检测权利要求1所述的WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达方法，其特征在于：

在所述的(4)实时荧光定量PCR技术检测WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达情况中，PCR反应体系为：总体积25μl，其中，2×SuperRealPreMix Plus 10μl，10μM引物WQF 0.6μl，10μM引物WQR 0.6μl，cDNA模板1μl，50×ROXReference Dye 0.6μl，RNase-free ddH₂O 12.2μl；PCR反应程序为：95℃预变性15min，95℃变性10s，60℃退火32s，40个循环。

5.根据技术方案3所述的一种检测权利要求1所述的WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达方法，其特征在于：

在所述的(1)干旱处理中：供试的甘蔗细茎野生种分为实验组和对照组，对照组按常规管理浇水；实验组分为3个处理，处理1：先按常规管理浇水，待甘蔗细茎野生种长到15～20cm高时，连续2d不浇水；处理2：先按常规管理浇水，待甘蔗细茎野生种长到15～20cm高时，连续4d不浇水；处理3：先按常规管理浇水，待甘蔗细茎野生种长到15～20cm高时，连续6d不浇水。

本发明首次提出了甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1。通过实时荧光定量PCR检测了WRKY转录因子基因SsWRKY1在不同干旱胁迫时间下的甘蔗细茎野生种叶片中的3个时期的差异表达情况，发现WRKY转录因子基因SsWRKY1在没有干旱胁迫的情况下表达量极低，而在干旱处理的3个时期中，均检测到了WRKY转录因子基因SsWRKY1的表达，WRKY转录因子基因SsWRKY1的表达量随着处理时间逐渐升高，而且WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受到干旱胁迫时表达量逐步增强、表达水平持续上调。因此，WRKY转录因子基因SsWRKY1属于甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的诱导型表达基因，表明从甘蔗细茎野生种中得到的WRKY转录因子基因SsWRKY1直接参与了甘蔗细茎野生种抗旱应答过程。

采用本发明检测WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达的方法，通过检测WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种叶片中受干旱胁迫后的2d、4d、6d中的3个时期的表达情况，获得WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫后的表达谱，为认识WRKY转录因子基因SsWRKY1的功能和深入研究该基因在甘蔗细茎野生种中的抗旱机制奠定了基础，为甘蔗抗旱性分子育种提供了技术支撑和候选基因。

序列表中SEQ ID NO：1所示的是WRKY转录因子基因SsWRKY1的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：2所示的是扩增WRKY转录因子基因SsWRKY1专用引物的上游引物WP-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：3所示的是扩增WRKY转录因子基因SsWRKY1专用引物的下游引物WP-R的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：4所示的是引物WQF的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO：5所示的是引物WQR的碱基序列。

附图说明

图1：甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1的扩增结果。图中，M为DNA Marker，0d：对照零天干旱处理(即对照按常规管理浇水)，2d：2天干旱处理(处理1)，4d：4天干旱处理(处理2)，6d：6天干旱处理(处理3)。

图2：WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达检测图。图中，横坐标表示干旱处理天数，其中，0d表示对照零干旱处理，2d表示两天干旱处理，4d表示4天干旱处理，6d表示6天干旱处理，纵坐标表示基因表达量。

具体实施方式

以下实施例用于对本发明作进一步说明。各实施例中无特殊说明的为常规方法。

实验材料：甘蔗细茎野生种(Saccharum spontaneum L.)种植于云南农业大学温室大棚中，该材料可以通过采集或通过本申请人获得，本申请人云南农业大学地址：云南省昆明市盘龙区沣源路452号，邮编650201。

实施例1甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1的获得

一、设计扩增甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1的专用引物

根据前期试验获得的甘蔗细茎野生种的转录组测序数据，利用生物软件Primer5.0、Oligo 7设计扩增WRKY转录因子基因SsWRKY1的专用引物，该专用引物由上游引物WP-F和下游引物WP-R组成，所述上游引物WP-F的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述下游引物WP-R的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，该专用引物送上海生工公司合成。

二、以干旱处理的甘蔗细茎野生种叶片提取总RNA

(1)样品的处理

将甘蔗细茎野生种的植株种植在花盆内，将种植的甘蔗细茎野生种分为1个对照和3个干旱处理。对照：按常规管理浇水，所述按常规管理浇水是隔1天浇一次透水，对照即0d干旱处理。干旱处理即处理1、处理2和处理3，处理1：先按常规管理浇水，待所述甘蔗细茎野生种的植株长到15～20cm高时，连续2天不浇水，处理1即干旱处理2d；处理2：先按常规管理浇水，待甘蔗细茎野生种的植株长到15～20cm高时，连续进行4天不浇水,处理2即干旱处理4d；处理3：先按常规管理浇水，待甘蔗细茎野生种的植株长到15～20cm高时，连续进行6天不浇水,处理3即干旱处理6d。

在同一天分别收集干旱处理了的0d、2d、4d、6d的4个时期的甘蔗细茎野生种叶片，分别置于研钵中加液氮快速磨碎，每100mg样品加入1ml TRIzol提取液于试管中，涡旋振荡15s，每个时期的取样为一个样品，共4个样品；4个处理样品均按如下方法操作：

(2)提取总RNA

①将步骤(1)所述的样品在18～22℃放置5min；加入氯仿，氯仿的用量为每使用1ml TRIzol加入200μl氯仿，盖好试管盖，涡旋振荡15s，18～22℃放置3min。

②4℃，12000rpm离心15min，此时溶液分为三层：黄色的是有机相，中间层和上层无色的是水相，RNA主要存在水相中，把水相转移至另一新的无RNase离心管中。

③向得到的水相中加入等体积的异丙醇，混匀，18～22℃放置20-30min。

④4℃，12000rpm离心10min，弃上清。

⑤加入用RNase-Free ddH₂O配制的75％的乙醇洗涤沉淀，用量为每使用1mlTRIzol，用1ml RNase-Free ddH₂O配制的75％的乙醇。

⑥4℃，5000rpm离心3min，用枪头小心吸出上层液体，保留沉淀即RNA；

⑦18～22℃晾干沉淀2-3min，加入30-100μl无RNase的双蒸水，充分溶解RNA后，置于-80℃冰箱保存。

(3)cDNA第一链的合成

①将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RTBuffer、RNase-Free ddH₂O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心(转速6000rpm，30s)以收集残留在管壁的液体。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。

②按照以下体系的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心(转速6000rpm，15s)，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。

gDNA去除反应体系：

5×gDNA Buffer 2μl

Total RNA 2μl

RNase-Free ddH₂O 补足到10μl。

③按照以下体系的反转录反应体系配制混合液：

反转录反应体系：

10×Fast RT Buffer 2μl

RT Enzyme Mix 1μl

FQ-RT Primer Mix 2μl

RNase-Free ddH₂O 补足到10μl。

④将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42℃，孵育15min，95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA用于后续实验，或低温-80℃保存。

(4)甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1的扩增

以步骤二(3)④反转录获得的cDNA作为PCR反应的模板，以步骤一中设计的专用引物作为PCR反应引物，扩增甘蔗细茎野生种叶片中受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1，PCR反应体系：Template 1μL；上游引物WP-F 1μL；下游引物WP-R 1μL；Buffer 2μL；dNTP 2μL，Pfu酶0.5μL；ddH₂O补足到20μL；总体积为20μL。PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s；54℃退火30s；72℃延伸2min，35个循环；72℃,6min，后4℃保存。

(5)目的基因的回收(百泰克生物公司提供的多功能DNA纯化回收试剂盒)

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，将凝胶中的目的条带进行胶回收，步骤如下：

①在紫外灯下将目的条带胶块切下，尽量将不含DNA片段的空白凝胶去掉后放入1.5ml离心管中；

②按每100μl胶块加入500μl溶胶液的比例向胶块中加入溶胶液DB，置60℃溶胶约10min，期间不断摇动；

③胶块完全溶解后将溶胶液转移到吸附柱中，18～22℃，12000rpm离心30s，去掉废液；

④向吸附柱中加入500μl漂洗液WB，18～22℃，12000rpm离心30s，倒掉废液；

⑤重复步骤4，倒掉废液后空管12000rpm离心2min完全去掉废液；

⑥将吸附柱移至干净的1.5ml的离心管中，18～22℃放置2min使其残存于漂洗液中乙醇的挥发干；

⑦向吸附柱膜中央加入30μl-50μl的洗脱缓冲液，18～22℃放置1-2min，12000rpm离心2min洗脱DNA，即获得甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1(见图1)，经测序，所获得甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

实施例2本发明所提供的一种检测WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中干旱胁迫差异表达的方法，包括以下步骤：

(1)干旱处理：

①花盆(花盆直径50cm，高度30cm)里种植的甘蔗细茎野生种，每盆种植1-2株，分为实验组和对照组，实验组分3个干旱处理即处理1、处理2和处理3，其中，处理1：先按常规管理浇水，待所述甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高时，连续进行2天不浇水，处理1即为干旱处理2d；处理2：先按常规管理浇水，待所述甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高时，连续进行4天不浇水，处理2即为干旱处理4d；处理3：先按常规管理浇水，待所述甘蔗细茎野生种苗长到15～20cm高时，连续进行6天不浇水，处理3即为干旱处理6d。

②对照组：按常规管理浇水，所述按常规管理浇水是隔1天浇一次透水，对照组即为0d干旱处理。

(2)总RNA的提取

①样品处理

在同一天分别收集经干旱处理2d、4d、6d的3个时期的甘蔗细茎野生种叶片以及对照组甘蔗细茎野生种叶片，分别置于各研钵中加液氮快速磨碎后，分别置于各离心管中，每100mg样品加入1ml TRIzol提取液，涡旋振荡15s后作为处理样品和对照样品，共3个处理样品和1个对照样品。各样品(以下统称为样品)均按下述方法进行：

②提取总RNA

A、将样品在18～22℃放置5min；加入氯仿，氯仿的用量为每使用1ml TRIzol加入200μl氯仿，盖好管盖，涡旋振荡15s，18～22℃放置3min；

B、4℃，12000rpm离心15min，此时溶液分为三层：黄色的是有机相，中间层和上层无色的是水相，RNA主要存在水相中，把水相转移至另一新的无RNase离心管中；

C、向得到的水相中加入等体积的异丙醇，混匀，18～22℃放置20-30min；

D、4℃，12000rpm离心10min，弃上清；

E、加入用RNase-Free ddH₂O配制的75％的乙醇洗涤沉淀，用量为每使用1mlTRIzol，用1ml RNase-Free ddH₂O配制的75％的乙醇；

F、4℃，5000rpm离心3min，用枪头小心吸出上层液体，保留沉淀即RNA；

G、15～30℃晾干沉淀2-3min，加入30-100μl无RNase的双蒸水，充分溶解RNA后，对照样品于-70℃保存，3个时期的处理样品分别于-80℃保存。

(3)cDNA第一链的合成

用逆转录试剂盒Fast Quant RT Super Mix(Tiangen,KR108)反转录获得cDNA第一链，参照说明书进行，具体操作步骤如下：

①将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RTBuffer、RNase-Free ddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心(转速6000rpm，15s)以收集残留在管壁的液体。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。

②按照以下体系的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心(转速6000rpm，30s)，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。

gDNA去除反应体系：

5×gDNA Buffer 2μl

Total RNA 2μl

RNase-Free ddH₂O 补足到10μl。

③按照以下体系的反转录反应体系配制混合液。

反转录反应体系：

10×Fast RT Buffer 2μl

RT Enzyme Mix 1μl

FQ-RT Primer Mix 2μl

RNase-Free ddH₂O 补足到10μl。

④将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀，42℃，孵育15min，95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA用于后续实验，或-80℃低温保存。

(4)实时荧光定量PCR技术检测WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中受干旱胁迫的差异表达情况，实验在ABI公司7500荧光量PCR仪上进行，对干旱处理前后的基因表达情况进行分析(见图2)。

①PCR反应体系：

引物WQF的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，引物WQR的碱基序列如SEQ ID NO：5所示。

②PCR反应程序：

95℃预变性15min，

95℃变性10s，

60℃退火32s，

40个循环。

②PCR检测WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种叶片未干旱处理的对照和干旱处理2d、4d、6d的3个时期的差异表达情况；WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种叶片中的表达量存在明显差异。干旱处理2天的材料，其WRKY转录因子基因SsWRKY1的表达量明显高于对照组(0天)，是对照组的50倍。干旱处理4天的材料，其WRKY转录因子基因SsWRKY1的表达量又略高于2天干旱处理的基因表达量，是干旱处理2天的1.1倍。而干旱处理6天的材料，其WRKY转录因子基因SsWRKY1的表达量大幅升高，是对照的160倍，是干旱处理两天的3.2倍。由此可见，随着干旱胁迫时间的延长，WRKY转录因子基因SsWRKY1的表达量在持续升高，该WRKY转录因子基因SsWRKY1属于干旱胁迫的诱导型表达基因。

结果分析：WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种叶片中的差异表达检测表明，WRKY转录因子基因SsWRKY1在干旱处理的甘蔗细茎野生种叶片中表达显著上调，而在没有干旱处理的对照叶片中基本检测不到该基因的表达(图2所示)，从而验证了WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种中是受干旱胁迫而诱导表达的，属于诱导型表达基因，且该WRKY转录因子基因SsWRKY1在甘蔗细茎野生种干旱处理后的3个时期中的表达量表现出了明显的差异，该基因的表达量随着干旱处理时间持续增加，表明和验证了WRKY转录因子基因SsWRKY1直接参与了甘蔗细茎野生种抗旱应答过程，是与抗旱直接相关的基因。

序列表

<110> 云南农业大学

<120> 甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1083

<212> DNA

<213> 甘蔗细茎野生种(Saccharum spontaneum L.)

<400> 1

atggatccat ggatcagcag ccagccttct ctgagccttg acctgcacgt cggcctgccg 60

ccgctcagcc tccaccaggc gccggtggcc gtcgccttgg cccggcccaa ggtgctcgtc 120

gaggagaact tcctgcctcc aaagaaagaa ccagaggtcg cggctctcga gacggagctg 180

cagcggatga gcgaggagaa ccggcgcctg acggaggcgc tggcggcggc ggcgtccagg 240

tacgaggcgc tgcggagcca gtacacggag atggtggcca ccgcgggcgg gaacgggaac 300

aacccgtcgt ccacgtcgga gggcgggtcc gtgtcgccgt cgcggaagcg caagagcgag 360

agcatggaca ccgcgccgcc gccgccgcct gccgccgccg cgcagcaccc tggcccgcac 420

ccgcacctgc accacccggc ggaccagacg gagtgcacct ccggcgagcc gtgcaagcgc 480

atccgggagg agtgcaagcc caaggtgtcg aagctgtacg tgcacgccga ccccgccgac 540

ctcagcctgg tggtgaagga cggctaccag tggcgcaagt acgggcagaa ggtgaccaag 600

gacaacccgt gcccgagggc atacttccgc tgctccttcg ccccggcctg ccccgtcaag 660

aagaaggtgc agcggagcgc cgacgacacc tccatcctcg tcgccacgta cgagggcgag 720

cacaaccacg gccagccccc gccggcgccg tcgcagcagg cgcaggctgc ccacgacggc 780

tcggcggccc cgggcgccaa caagaacgcc gcggtcgcga agccgccgtc gccgccgagg 840

ccggccgctg ccgtcgcccc ggcgccgcac cgcccgcagc tgcagctcca ccaccaccag 900

cagcagcagg acgctgtcgc gatgaacggc gagccgcccg tgggcgcggc ggcgtcggag 960

atgatccggc gcaacctcgc ggagcagatg gcgatgacgc tgacgcggga ccccagcttc 1020

aaggcggcgc tcgtcaccgc gctgtccggc cgcatcctcg agctgtcgcc caccaaggat 1080

tga 1083

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgaccgctct acacgacatc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctgtggca gtatttcgca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aggtgtcgaa gctgtacgtg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgcaccttct tcttgacggg 20

Claims

1.甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

2.扩增权利要求1所述的甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1的专用引物，由上游引物WP-F和下游引物WP-R组成，所述上游引物WP-F的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述下游引物WP-R的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

3.一种检测权利要求1所述的甘蔗细茎野生种受干旱胁迫表达的WRKY转录因子基因SsWRKY1荧光定量差异表达的特异性引物，其用于检测该基因在不同甘蔗品种中的表达量，所述特异性引物由引物WQF和引物WQR组成，所述引物WQF的碱基序列如中SEQ ID NO：4所示，所述引物WQR的碱基序列SEQ ID NO：5所示。