ES2232000T3 - Metodo para producrir una planta tolerante a la sequedad. - Google Patents

Abstract

Las nuevas construcciones de síntesis y procedimientos de esta invención mejoran la resistencia de las plantas al estrés ambiental y al envejecimiento. Se describen ácidos nucleicos que codifican una farnesil transferasa vegetal, y también plantas transgénicas y semillas que incorporan estos ácidos nucleicos y proteínas. Se proporcionan también inhibidores naturales de la farnesil transferasa que, cuando se expresan, potencian la tolerancia de las plantas a la sequía, mejoran la resistencia al envejecimiento y modifican los hábitos de crecimiento.

Description

Método para producir una planta tolerante a la sequedad.

Fundamento de la invención

La mayoría de las plantas superiores encuentran como mínimo disminuciones transitorias en el contenido de agua relativo en alguna etapa de su ciclo vital y, como consecuencia, han desarrollado varios mecanismos de protección de la desecación. Si sin embargo, el cambio en el déficit de agua se prolonga, los efectos sobre el crecimiento y el desarrollo de la planta pueden ser profundos. El contenido de agua disminuido debido a la sequedad, el frío o tensiones salinas pueden dañar irreparablemente las células vegetales lo que a su vez limita el crecimiento de la planta y la productividad del cultivo en la agricultura.

Las plantas responden a condiciones adversas de sequedad, salinidad y frío con una variedad de cambios morfológicos y fisiológicos. Aunque nuestra comprensión de los mecanismos de tolerancia de la planta a estas tensiones es fragmentaria, se ha propuesto que la hormona vegetal ácido abscísico (ABA) es un mediador esencial entre estímulo medioambiental y respuestas de la planta. Los niveles de ABA aumentan en respuesta a los déficit de agua y aplicado exógenamente ABA imita muchas de las respuestas normalmente inducidas por carencias de agua. Una vez ABA se sintetiza causa el cierre de los estomas de la hoja disminuyendo por lo tanto la pérdida a través de la transpiración.

La identificación de los genes que transducen ABA en una respuesta celular, abre la posibilidad de explotar estos reguladores para aumentar la tolerancia a la desecación en las especies agrícolas. En principio, estos genes que señalizan ABA pueden acoplarse con los elementos de control apropiados para permitir el crecimiento y desarrollo óptimos de la planta. Así, no solo estos genes permitirían la adaptación genética de los cultivos para resistir agresiones medioambientales transitorias, sino que podrían también ampliar los entornos en los que puedan crecer los cultivos tradicionales.

Además, poco se sabe de los mecanismos genéticos que controlan el crecimiento y desarrollo de las plantas. Los genes que además afectan a otros procesos metabólicos como la senescencia y hábitos de crecimiento de las plantas pueden ser útiles en una amplia variedad de cultivos y plantas hortícolas.

Sumario de la invención

Esta invención se refiere a un método para aumentar la tolerancia a la sequedad de plantas como se define en las reivindicaciones anejas. Además, esta invención encuentra utilidad en el control de funciones reguladoras en los organismos fotosintéticos; por ejemplo, en el control del hábito de crecimiento, la floración, la producción de semillas, germinación de semillas, y senescencia en tales organismos.

Esta invención se basa en un método para aumentar la tolerancia a la sequedad de plantas por medio de alteraciones en ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican una proteína farnesil transferasa (Ftasa) o sus equivalentes funcionales.

Esta invención también se refiere a una planta transgénica obtenible por un método de la invención y una semilla transgénica obtenible por la planta transgénica.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A-1C muestran la secuencia de ácido nucleico de los genes ERA1 (SEQ ID NO:1) en la que los intrones están subrayados y el codón de partida (ATG) está en las posiciones de nucleótidos 1-3.

La Figura 2 es la secuencia de aminoácido del promotor ERA1 (SEQ ID NO:3).

La Figura 4 es la secuencia de aminoácido del dominio de farnesilación de subunidad \beta de Arabidopsis (Arab.) (SEQ ID NO:2) alineada con los dominios de farnesilación de subunidad \beta del guisante (SEQ ID NO:4), levadura (SEQ ID NO:5) y rata (SEQ ID NO:6). Los residuos que son idénticos a la secuencia de Arabidopsis se indican con un punto. Una raya indica un blanco. Las posiciones de aminoácidos de los genes de Arabidopsis se indican en el lado a mano derecha.

La Figura 5 es una fotografía de una planta Arabidopsis transformada con era1 comparada con la planta tipo salvaje (control: es decir, presente naturalmente) (izquierda) bajo condiciones extremadamente secas.

La figura 6 es una gráfica que compara el contenido de agua de plantas Arabidopsis con actividad Ftasa mutante o inactivada (M. Columbia, era 1-2) y controles (control M.C., control era 1-2).

La Figura 7 es una gráfica que compara la tasa de pérdida de agua para las plantas Arabidopsis con actividad Ftasa inactivada o mutante (M. Columbia, era 1-2) y controles (control M.C, control era 1-2).

\newpage

La Figura 8 es una comparación de envejecimiento de hojas de plantas control (tipo salvaje) y plantas mutantes era-2.

La Figura 9 es una comparación de niveles transcriptos en envejecimiento de hojas de plantas control (tipo salvaje) y plantas mutantes era-2.

Descripción detallada de la invención

Esta invención se refiere a un método como se define en las reivindicaciones anejas.

Cuando se incorpora a una planta, el promotor ERA1 se regula en las células de guarda de la planta y puede afectar a la pérdida de agua a través de los estomas. Este promotor consiste en un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO:3 (Figura 3).

Las plantas transgénicas y las semillas transgénicas obtenibles con este método son también parte de esta invención. El método puede usarse para producir un producto génico bajo el control de un promotor que opera principalmente en células de guarda a través de la expresión de un gen que codifica el producto génico en la célula de una planta que comprende las etapas de: transformar una célula vegetal con un constructo de DNA que comprende a) una región reguladora que comprende SEQ ID NO:3 o una de sus porciones funcionales, DNA que comprende un gen estructural que codifica un producto génico, y una región 3' no trasladada que contiene una región poliadenilada; regenerar una planta, organismo o cultivo de tejido fotosintético desde la célula, y situar la planta, organismo o cultivo de tejido fotosintético bajo condiciones de tal modo que el promotor induzca la transcripción del gen estructural y se exprese el producto génico.

En el contexto de esta descripción, la expresiones "región reguladora" o "promotor" se refieren a una secuencia de DNA, usualmente corriente arriba(5') a la secuencia de codificación de un gen estructural, que controla la expresión de la región de codificación proporcionando sitios de reconocimiento y de unión para polimerasa RNA y/o otros factores requeridos para que la transcripción comience en el sitio correcto. El término "porción funcional" o "fragmento funcional" se refiere a una secuencia truncada de un promotor de esta invención que mantiene la capacidad de inducir la transcripción de un gen estructural ERA bajo las condiciones descritas para actividad de una proteína Ftasa.

Los constructos y métodos descritos aquí pueden aplicarse a todos los tipos de plantas y oros organismos fotosintéticos, que incluyen, pero no se limitan a: angiospermas (monocot o dicot), gimnospermas, plantas que llevan esporas o que se reproducen vegetativamente y las algas, incluyendo las cianofitas (algas azul verdoso). Plantas particularmente preferidas son aquellas que proporcionan cosechas de valor comercial, como trigo, maíz, algodón,arroz, canola, azúcar de caña, azúcar de remolacha, girasoles, patatas, tomates, brócoli, zanahorias, lechuga, manzana, ciruela, naranja, limón, rosa, y similares.

Además, los constructos y métodos descritos aquí pueden adaptarse a cualquier parte de la planta, protoplastos, o cultivos de tejido en que el tejido se deriva de un organismo fotosintético. El término "parte de la planta" significa incluir una porción de una planta capaz de producir una planta regenerada. Partes de la planta preferibles incluyen raíces tallos y sus porciones meristemáticas. Otras partes de la planta abarcadas por esta invención son: hojas, flores, semillas, epicotilos, hipocotilos, cotiledones, nodos cotiledonarios, explantas, polen, óvulos, tejido embriónico o meristemático, protoplastos y similares. Las plantas transgénicas pueden regenerarse desde cualquiera de estas partes de plantas, incluyendo cultivos de tejidos o protoplastos, y también de explantas. Los métodos variarán según la especie de planta.

Las composiciones y constructos que comprenden ácidos nucleicos aislados (DNA y RNA) que codifican una Ftasa y sus porciones de organismos fotosintéticos se describen aquí. Las composiciones y constructos que comprenden ácidos nucleicos aislados que codifican un promotor Ftasa también se describen aquí. En particular, los genes ERA1 que codifican la subunidad \beta de Ftasa de Arabidopsis y una secuencia reguladora que regula la transcripción de los genes SRA1 se han aislado y secuenciado. Los ácidos nucleicos que codifican Ftasas de organismos fotosintéticos, y homólogos o análogos de estos ácidos nucleicos, se describen también.

Se describen los métodos que utilizan ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes (DNAo RNA). Los ácidos nucleicos se caracterizan por su capacidad para hibridar a (a) un ácido nucleico que codifica una proteína Ftasa o polipéptido, tal como un ácido nucleico que tiene las secuencias de SEQ ID NO:1 o b) una porción de lo precedente (por ejemplo, una porción que comprende los mínimos nucleótidos necesarios requeridos para codificar una proteína Ftasa funcional; o por la capacidad para codificar un polipéptido que la secuencia de aminoácido de una Ftasa (por ejemplo, SEQ ID NO:2, o para codificar sus equivalentes funcionales; por ejemplo, un polipéptido que tiene al menos un 80% de similitud de secuencia con SEQ ID NO:2, que cuando se incorpora en una célula vegetal, facilita el hábito de crecimiento, la germinación de la semilla, y el metabolismo en un organismo fotosintético de la misma manera que SEQ ID NO:1). Un equivalente funcional de una Ftasa, por consiguiente, tendrá al menos una secuencia de aminoácidos similar en un 80% y características similares a, o funcionará sustancialmente de la misma manera que, el polipéptido codificado por SEQ ID NO:2. Un ácido nucleico que hibrida a un ácido nucleico que codifica un polipéptido Ftasa como SEQ ID NO:2, puede ser mono o bicatenario. El porcentaje de similitud de secuencia de aminoácidos entre un polipéptido Ftasa como SEQ ID NO:2 y sus equivalentes funcionales es al menos del 60% (\geq 60%); o el porcentaje de similitud de secuencia de aminoácidos entre un polipéptido Ftasa y sus equivalentes funcionales es al menos aproximadamente un 75% (\geq 75%); o el porcentaje de similitud de secuencia de aminoácidos entre un polipéptido Ftasa y sus equivalentes funcionales es al menos aproximadamente un 80% o al menos un 90%, cuando se comparan aminoácidos consecutivos.

Los ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que satisfacen estos criterios comprenden ácidos nucleicos que tienen secuencias idénticas a secuencias de genes ERA1 presentes naturalmente y sus porciones, o variantes de los genes presentes naturalmente. Esas variantes incluyen mutantes que difieren en la adición, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos, ácidos nucleicos modificados en los que uno o más nucleótidos están modificados (por ejemplo, análogos de DNA o RNA), y mutantes que comprenden uno o más nucleótidos modificados.

Esos ácidos nucleicos, incluyendo DNA o RNA, pueden ser detectados y aislados por hibridación bajo condiciones de alto astringencia o moderado astringencia, por ejemplo, que se eligen para no permitir que la hibridación de ácidos nucleicos que tienen secuencias no complementarias. "Condiciones rigurosas" para hibridación es un término de la técnica que se refiere a las condiciones de temperatura y concentración de tampón que permiten la hibridación de un ácido nucleico particular a otro ácido nucleico en que el primer ácido nucleico puede ser perfectamente complementario del segundo, o el primero y el segundo pueden compartir el mismo grado de complementariedad que es menos que perfecta. Por ejemplo, pueden usarse ciertas condiciones de alta astringencia que distinguen perfectamente ácidos nucleicos complementarios de los de menos complementariedad. "Condiciones de alta astringencia" y "condiciones de astringencia moderada" para hibridaciones de ácido nucleico se explican en las páginas 2.10, 1-2.10.16 (véase especialmente 2.10.8-11) y páginas 6.3.1-6 en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Vol. 1 que contienen suplementos hasta Suplemento 29, 1995). Las condiciones exactas que determinan el astringencia de la hibridación dependen no solamente de la fuerza iónica, temperatura y la concentración de agentes de desestabilización como la formamida, sino también de factores como la longitud de la secuencia del ácido nucleico, la composición base, el porcentaje de desigualdad entre las secuencias de hibridación y la frecuencia de presencia de subseries de esa secuencia dentro de otras secuencias no idénticas. Así, las condiciones de astringencia alto o moderado pueden determinarse empíricamente.

Los procedimientos de hibridación pueden (1) emplear baja fuerza iónica y alta temperatura para lavado, como NaCl 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M, ph 7,0 (0,1 x SSC9 con dodecilsulfato sódico al 0,1% (SDS) a 50ºC; (2) emplear durante la hibridación formamida al 50% (vol/vol) con solución Denhardt's 5 x (albúmina de suero bovino altamente purificado al 0,1% peso/volumen/Ficoll al 0,1% peso/volumen/polivinilpirrolidona al 0,1% peso/volumen, tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 y SSC 5x a 42ºC; o(3) emplear hibridación con formamida al 50%, SSC 5 x, fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfatosódio al 0,1%, solución Denhardt's 5 x, DNA de esperma de salmón sonicado (50 \mug/l), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en SSC 0,2 x y SDS al 0,1%. Las condiciones de astringencia moderada serían similares excepto que la hibridación emplearía formamida al 25% en lugar de formamida al 50%.

Variando las condiciones de hibridación desde un nivel de astringencia en el que no ocurre la hibridación a un nivel en el que se observa primero la hibridación, pueden determinarse las condiciones que permitirán a una secuencia dada hibridar con las secuencias más similares en la muestra.

Condiciones ejemplares se describen en en Krause, M.H. y S.A. Aaronson (1991) Methods in Enzimology, 200:546-556. también véase especialmente la página 2.10.11 en Current Protocols in Molecular Biology (supra), que describe cómo determinar las condiciones de lavado para condiciones de moderada o baja astringencia. El lavado es la etapa en que se fijan las condiciones para determinar un nivel mínimo de complementariedad de los híbridos. Generalmente, desde la temperatura más baja en la que sólo ocurre hibridación homóloga, una desigualdad del 1% entre la hibridación de ácidos nucleicos da lugar a una disminución de 1ºC en la temperatura de fusión T_{m} para cualquier concentración de SSC elegida. Generalmente, doblar la concentración de SSC da lugar a un aumento en T_{m} de -17ºC. Utilizando estas directrices, la temperatura de lavado puede determinarse empíricamente para moderada o baja astringencia, dependiendo del nivel de desigualdad buscado.

Los ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que se caracterizan por su capacidad para hibridar a (a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido Ftasa, como los ácidos nucleicos representados como SEQ ID NO:1, (c) o una porción de (a) o (b) (por ejemplo, bajo condiciones de alta o moderada astringencia) pueden además codificar una proteína polipéptido que tiene al menos una característica funcional de un polipéptido Ftasa, tal como regulación de ramificación lateral bajo ciclos de luz diurna, o regulación de la respuesta a ABA, o regulación de senescencia.

Los ensayos enzimáticos, ensayos de complementación, u otros métodos convenientes pueden también usarse en procedimientos para la identificación y/o aislamiento de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido tal como un polipéptido de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2 o un equivalente funcional de este polipéptido. Las propiedades antígenas de proteínas o polipéptidos codificados por hibridación de ácidos nucleicos puede determinarse por métodos inmunológicos que emplean anticuerpos que se unen a un polipéptido Ftasa tal como inmunoblot, inmunoprecipitación y radioinmunoensayo. La metodología PCR, incluyendo RAGE (Amplificación rápida de extremos de DNA genómicos), puede también utilizarse para explorar y detectar la presencia de ácidos nucleicos que codifican proteínas y polipéptidos similares a Ftasa, y para ayudar a clonar esos ácidos nucleicos a partir del DNA genómico. Los métodos PCR para estos fines pueden encontrarse en Innis, M.A. et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Acaemic press, Inc., San Diego, CA.

Los ácidos nucleicos descritos aquí se usan en los métodos de esta invención para producción de proteínas o polipéptidos que se incorporan a células, tejidos, partes de plantas y otros organismos fotosintéticos. En una realización, DNA que contiene parte toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido Ftasa, o DNA que hibrida a DNA que tiene la secuencia SEQ ID NO:2 se incorpora a un vector para expresión del polipéptido codificado en células hospedadora convenientes. El polipéptido codificado que comprende una subunidad Ftasa o su equivalente funcional es capaz de actividad de farnesil transferasa. El término "vector" como se usa aquí se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha enlazado.

Los primers y sondas consistentes en 20 o más nucleótidos contiguos de los ácidos nucleicos descritos antes también se describen aquí. Así, un ácido nucleico comprende una secuencia específica de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 o más nucleótidos que son idénticos o complementarios a una secuencia específica de nucleótidos del DNA que codifica proteína Ftasa o transcriben mRNA. Estas sondas y primers pueden usarse para identificar y aislar ácido nucleico que codifica Ftasa a partir de otros organismos fotosintéticos.

Los ácidos nucleicos denominados aquí "aislados" son ácidos nucleicos apartados de los ácidos nucleicos del DNA genómico o RNA celular de su fuente de origen (por ejemplo, cuando existe en células o en una mezcla de ácidos nucleicos como una biblioteca), y pueden haber sufrido además tratamiento. Los ácidos nucleicos "aislados" incluyen los ácidos nucleicos obtenidos por métodos descritos aquí, métodos similares u otros métodos convenientes, incluyendo ácidos nucleicos esencialmente puros, ácidos nucleicos producidos por síntesis química, por combinaciones de métodos químicos y biológicos, y ácidos nucleicos recombinantes que están aislados. Ácidos nucleicos denominados aquí "recombinantes" son ácidos nucleicos que se han producido por metodología de DNA recombinante, incluyendo aquellos ácidos nucleicos que se han generado por procedimientos que descansan en un método de recombinación artificial, como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y/o clonación de un vector utilizando enzimas de restricción. Ácidos nucleicos "recombinantes" son también aquellos que resultan de eventos de recombinación que ocurren a través de mecanismos naturales de las células, pero se seleccionan después de la introducción a las células de ácidos nucleicos diseñados para permitir o hacer probable un evento de recombinación deseado. Porciones de los ácidos nucleicos aislados que codifican los polipéptidos que tienen una cierta función pueden identificarse y aislarse por, por ejemplo, el método de Jasin, M., et al., Patente de EE.UU. Nº 4.952.501.

La invención utiliza ácidos nucleicos antisentido u oligonucleótidos que son complementarios, en todo o en parte, de una molécula diana que comprende una cadena con sentido, y puede hibridar con la molécula diana. La diana puede ser DNA o su equivalente RNA (es decir, en que los residuos T del DNA son residuos U en el equivalente RNA). Cuando se introducen en una célula, los ácidos nucleicos antisentido pueden producirse por técnicas estándar. Véase por ejemplo, Shewmaker, et al., Patente de EE.UU. Nº 5.107.065.

En una realización particular, un ácido nucleico u oligonucleótido antisentido es completa o parcialmente complementario a y puede hibridar con un ácido nucleico diana (DNA o RNA), en que el ácido nucleico diana puede hibridar a un ácido nucleico que tiene la secuencia del complemento de la cadena en SEQ ID NO:1. Por ejemplo, un ácido nucleico u oligonucleótido antisentido puede ser complementario a un ácido nucleico diana que tiene la secuencia mostrada como la cadena del marco de lectura abierta de SEQ ID NO:1, o a un ácido nucleico que codifica un equivalente funcional de Ftasa, o a una porción de estos ácidos nucleicos suficiente para permitir la hibridación. Una porción, por ejemplo, una sección de 16 nucleótidos podría ser suficiente para inhibir la expresión de la proteína. Fragmentos que comprenden 25 o más nucleótidos consecutivos complementarios a SEQ ID NO:1, también podrían usarse. O un ácido nucleico u oligonucleótido antisentido complementario a regiones 5' o 3' no trasladadas, o solapar el codón de iniciación de traslación (regiones 5' trasladadas y no trasladadas), de los genes ERA1, o un gen que codifica un equivalente funcional también puede ser efectivo. En otra realización, el ácido nucleico antisentido es completa o parcialmente complementario a y puede hibridar con un ácido nucleico diana que codifica un polipéptido Ftasa.

Además de los ácidos nucleicos antisentido, pueden construirse oligonucleótidos que se unirán a un ácido nucleico dúplex bien en el gen o el complejo de transcripción DNA:RNA, para formar un ácido nucleico triples o que contiene una hélice triple estable para inhibir la transcripción y/o expresión de un gen que codifica un polipéptido Ftasa o su euqivalente funcional. Frank-Kamenetski, M. D. Y Mirkin, S.M. (1995) Ann.Rev. Biochem. 64; 65-95. Esos oligonucleótidos se construyen utilizando las reglas de apareamiento de bases de formación de triple hélice y la secuencia de nucleótidos de los genes o mRNA para Ftsa. Estos oligonucleótidos pueden bloquear la actividad tipo Ftasa de varias maneras, incluyendo prevención o transcripción de los genes ERA1 o por unión a mRNA cuando es transcrito por los genes.

Las proteínas o los polipéptidos son codificados por los ácidos nucleicos descritos aquí. Las proteínas y polipéptidos pueden ser aislados y/o recombinantes. Las proteínas o polipéptidos denominados aquí "aislados" son proteínas o polipéptidos purificados hasta un estado más allá del que existían en las células. Son al menos un 10% puros, es decir, sustancialmente purificados. Las proteínas o polipéptidos "aislados" incluyen proteínas y polipéptidos obtenidos por métodos descritos infra, métodos similares u otros métodos convenientes, e incluyen esencialmente proteínas o polipéptidos puros, proteínas o polipéptidos producidos por síntesis química o por combinaciones de métodos químicos o biológicos, y proteínas o polipéptidos recombinantes que están aislados. Proteínas o polipéptidos llamados aquí "recombinantes" son proteínas o polipéptidos producidos por la expresión de ácidos nucleicos recombinantes.

La proteína o su porción tiene al menos una función característica de una Ftasa; por ejemplo, que afecta a la actividad catalítica, por ejemplo, ramificación lateral normal, florecillas/inflorescencia, germinación de semillas, o apertura de estomas, y función de unión, y/o función antígena (por ejemplo, unión de anticuerpos que también se unen a Ftasa presente naturalmente). Como tales, esas proteínas se denominan Ftasas de origen vegetal, e incluyen, por ejemplo, Ftasa presente naturalmente, variantes (por ejemplo, mutantes) de esas proteínas y/o sus porciones. Esas variantes incluyen mutantes que difieren por la adición, deleción o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos, o polipéptidos modificados en que uno o más residuos están modificados, y los mutantes comprenden uno o más residuos modificados.

La invención utiliza una secuencia de ácido nucleico que codifica la subunidad \beta de una proteína Ftasa. Pueden obtenerse porciones de la enzima que tengan función total o parcial por sí mismas, o que cuando se mezclan juntas (aunque solas total, parcialmente o no funcionalmente), espontáneamente se reúnen con uno o más polipéptidos para reconstituir una proteína funcional que tiene al menos una característica funcional de una Ftasa.

Se han identificado varios genes que son inducidos por ABA. Esto sugiere que la tolerancia inducida por ABA en condiciones medioambientales adversas es un evento multigénico complejo. Así, la identificación y transferencia de genes únicos a plantas de cultivo que mejora la viabilidad de la planta bajo diferentes condiciones medioambientales debido a aumentada sensibilidad a ABA es algo nuevo y extremadamente útil.

Para identificar los genes que podrían ser controladores más globales de procesos de plantas regulados por ABA, se aplicaron pantallas genéticas en varias especies de plantas para aislar mutaciones que alteran la respuesta de la planta a la hormona.

Las mutaciones que confieren respuesta aumentada a ASBA(era) en semillas Arabidopsis se identificaron por su capacidad para prevenir la germinación de semilla con bajas concentraciones de ABA que normalmente permiten germinación de semillas tipo salvaje (controles, es decir, presentes naturalmente). De estas, la clase mutante era1 que incluye una línea DNA (T-DNA) transferida (era1-1, ecotipo Wassiewskija) y dos mutantes generados por neutrones (era1-2 y era1-3, ecotipo Columbia), era de interés añadido porque esta clase mostraba eficacia de germinación disminuida bajo posimbibición normal. Las mutaciones que aumentan la sensibilidad a ABA deberían, en principio, ser más inactivas. El reposo vegetativo en los alelos era1 se alivió por un período de congelación de 4 días; la eficacia de la germinación de era1 aumentó con la duración de tiempo que las semillas estaban congeladas. En muchas especies de plantas, la interrupción del reposo vegetativo para permitir la germinación requiere vernalización y exposición a un ambiente húmedo, y temperatura baja durante un período dilatado (Baskin et Baskin, 1971). El perfil de germinación de mutantes era, podría reflejar un estado aumentado de reposo vegetativo inducido por ABA; consecuentemente estas semillas requieren más larga vernalización para germinar. La base de este argumento es que procede de la construcción de dobles mutantes de era1 tanto con mutantes biosintéticos ABA (aba 1-1) como con mutantes no sensitivos (abi 1-1 y abi 3-6). En todos los casos, los mutantes dobles han reducido el reposo vegetativo en comparación con era1, indicando que el reposo vegetativo aumentado observada en semillas era1 era dependiente de la síntesis o sensibilidad de ABA.

Aparte de ensanchar el espectro de nuevos mutantes de respuesta a ABA, se usaron también exploraciones de supersensibilidad para identificar reguladores negativos de sensibilidad a ABA. Es decir, la inhibición de estas funciones génicas aumenta la respuesta a ABA. Uno de estos genes (ERA1) se ha clonado y se ha demostrado que codifica la subunidad \beta de una proteína heterodímera farnesiltransferasa (Ftasa) (Cutler et al, 1996). La mutación era1-1, que se debe a una inserción T-DNA, permitió el aislamiento de regiones genómicas que flanquean las inserciones. Utilizando las regiones que flanquean como sondas, se aislaron los clones genómicos y cDNA tipo salvaje. El análisis de secuencia de estos describió un gen que abarcaba 3,5 kb de DNA genómico. El gen contiene 13 intrones que se subrayan en las Figuras 1A-1C y el sitio de inserción de T-DNA en era1-1 es en intron 8. El análisis de (DNA) meridional de DNA tipo salvaje, era1-2, y era1-3 probado con Era1cDNA reveló que ambos alelos de neutrón rápido contenían deleciones que abarcaban el lugar ERA1. La mutagénesis de neutron rápido indujo pequeñas deleciones en Arabidopsis (Shirley et al, 1992), y el subsiguiente análisis genómico con una sonda de 14-kb que abarcaba el lugar ERA1 determinó que el tamaño de la deleción de era1-2 era aproximadamente 7,5 kb y la deleción de era1-3 era ligeramente más grande. Así los tres alelos era1 contenían disrupciones de DNA en el mismo lugar, confirmando la identidad del lugar
ERA.

La traslación conceptual del marco de lectura abierto más grande (404 aminoácidos) en el gen ERA1 produjo una proteína (Figuras 2 y 4) con una elevada similitud de secuencia con la levadura, guisante, y genes de subunidad \beta de proteína farnesil transferasa de mamífero. (Goodman et al., 1988; Chen et al., 1991; Yang et al, 1993). Las farnesiltrasferasas comprenden subunidades \alpha y \beta que dimerizan, formando una enzima que cataliza la unión de farnesilpirofosfato (15 carbonos) a proteínas que contienen un resto CaaX con terminal COOH (Scahfer y Rine, 1992), donde C designa residuo de cisteína, aa es usualmente aminoácidos alifáticos, y X puede designar un residuo de cisteína, serina, metionina, o glutamina. Ambos genes de subunidad \beta de plantas contienen una región de aproximadamente 50 aminoácidos cerca de su extremo COOH que está ausente en levadura y genes de subunidad \beta animales.

En la levadura y sistemas de mamíferos, las Ftasas modifican varias proteínas de transducción de señal para localización de membrana. Esto se consigue por la unión de la cadena lateral de farnesilo lipofílica a la proteína diana por vía de la Ftasa. La unión del grupo farnesilo causa un cambio en la hidrofobicidad en su conjunto de la diana permitiendo a la proteína anclarse ella misma en la membrana donde usualmente interactúa con otras moléculas de transducción de señal. La pérdida de actividad de farnesilación en el mutante era1 conduce a una respuesta aumentada de la semilla a ABA, lo que sugiere que una proteína diana en Arabidopsis debe localizarse en la membrana para atenuar la señal ABA. Así, la farnesilación en Arabidopsis parece requerirse para la función normal de un regulador negativo de sensibilidad a ABA.

El trabajo subsiguiente ha demostrado que la pérdida de la función de gen ERA1 en Arabidopsis confiere una tolerancia aumentada a tensiones medioambientales a nivel de la planta madura. Por ejemplo, una comparación de plantas tipos silvestre y plantas mutantes era1 crecidas en suelo bajo condiciones estándar de laboratorio (24 horas de luz, 150\muEm^{-2} sec^{-1}, 30% de humedad) mostraron que los mutantes no requieren agua tan frecuentemente como las plantas tipo salvaje para mantener la viabilidad. (Figura 5). Cuando las plantas mutantes y las plantas tipo salvaje se desarrollaron hasta la floración, se interrumpió el aporte de agua y se observaron las plantas durante cada día para observar signos de estrés. La pérdida de agua fue significativamente reducida en las plantas mutantes en comparación con las de tipo salvaje (Figuras 6 y 7).

Para determinar si la observada tolerancia aumentada a la sequedad de los mutantes era estaba relacionada con la función del gen ERA1, se construyeron plantas transgénicas que contenían una fusión de promotor ERA1 a un gen GUS reporter (hecho por inserción de un fragmento de 5 kb del promotor ERA 1 en un plásmido GUS T-DNA sin promotor). El análisis de las plantas transgénicas mostró que ERA 1 se expresa transcripcionalmente en el tejido epidérmico de Arabidopsis y que esta expresión es específica de célula de guarda, la expresión de ERA 1 también se observó en el tejido meristemático de las plantas y los pelos de las raíces. La expresión de célula de guarda de ERA1 es coherente con la tolerancia a la sequedad del mutante ya que estas células son los principales reguladores de la transpiración de agua hacia la planta. Debe esperarse que la conductancia estomatal regulada por ERA1 requerirá expresión del gen ERA 1 en las células de guarda. De aquí que la pérdida de la función génica ERA1 da lugar a células de guarda que son más sensibles a ABA, lo que a su vez, conduce a regulación de célula de guarda más sensible a la sequedad. Por consiguiente, la modificación o actividad de la expresión de Ftasa en plantas superiores, tendrá profundos efectos sobre la conductancia estomatal y las tasas de transpiración en las plantas.

La naturaleza de la mutación era1 en Arabidopsis demuestra que la inhibición de farnesilación aumentará las respuestas ABA en una planta y alteración de esta actividad enzimática en especies de cultivo. La inhibición de la actividad Ftasa en plantas de cultivo puede conseguirse por varios métodos. Por ejemplo, la tecnología antisentido de genes ERA1 cognados en una variedad de especies de cultivo puede utilizarse para reducir la actividad Ftasa, aumentando así la tolerancia a la sequedad. Produciendo específicamente RNA antisentido de ERA1 en células de guarda, la cantidad de Ftasa sintetizada puede reducirse a un nivel que imitaría los fenotipos mutantes de era. El promotor ERA1 se regula en varios tejidos diferentes que oscilan desde los meristemas del tallo a los pelos de la raíz. Determinando los elementos del promotor ERA1 que permiten la expresión en tejidos específicos., es posible acomodar la expresión de antisentido ERA1 a solamente un tejido o tipo de célula, como las células de guarda. Otro método para inhibir la actividad Ftasa en plantas es la producción de inhibidores peptídicos específicos de farnesilación en plantas transgénicas. En sistemas de levaduras y de mamíferos, la secuencia diana con terminal carboxílico (CaaX, donde C= cisteína, x = alifático, X = aminoácido) que permite la unión del grupo farnesilo a proteínas específicas se ha definido claramente. Se han hecho péptidos que imitan estas secuencias diana y se ha demostrado que inhiben la farnesilación de las proteínas diana endógenas en estos sistemas. Además CAIM es farnesilado in vivo en Arabidopsis. Así, inhibidores similares pueden aplicarse plantas superiores para inhibir competitivamente Ftasa in vivo. De nuevo, esto puede hacerse a través de expresión de péptidos inhibidores en plantas transgénicas sintetizando la secuencia DNA para un péptido CaaX y fusionándolo a un promotor específico de célula guarda. En ambos métodos, utilizando los promotores apropiados, la Ftasa antisentido o los inhibidores peptídicos pueden ser diana específicamente y s controlados.

Así, esta invención proporciona un método para producir plantas tolerantes a la sequedad que comprende: preparar un constructo de ácido nucleico que comprende un promotor unido operablemente a un ácido nucleico que comprende o codifica antisentido a SEQ ID NO:1, o un ácido nucleico que comprende un equivalente funcional del antisentido; insertar el constructo de ácido nucleico en un vector; transformar una planta, tejido vegetal o una célula vegetal con el vector y hacer crecer la planta o regenerar una planta a partir del cultivo de tejido o célula vegetal; en que se produce una planta tolerante a la sequedad.

Puede usarse este método en que dicho ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende 25-200 o más ácidos nucleicos consecutivos de SEQ ID NO:1 o su complemento, o un ácido nucleico que codifica un inhibidor peptídico de farnesiltransferasa.

Además de la regulación estomatal que es extremadamente sensible a ABA, las plantas era también demuestran senescencia retrasada bajo condiciones de sequedad, indicando que la farnesilación regula negativamente varias respuestas inducidas por la sequedad en Arabidopsis. Las plantas era desarrolladas bajo condiciones de laboratorio normales tardan más en ponerse amarillas. Las plantas mutantes permanecen verdes y viables largo tiempo después de que las de tipo salvaje han sufrido senescencia y han muerto. Las hojas desprendidas de una planta mutante era no amarillean tan rápidamente como las hojas desprendidas de una planta tipo salvaje (Figura 8). Hojas de tamaño similar que se desarrollaron de manera idéntica se tomaron de las de tipo salvaje y de las plantas mutantes y se colocaron sobre placas petri con agar (Véase Ejemplo 7). Normalmente, una hoja de tipo salvaje empieza a perder clorofila aproximadamente cinco días después y eventualmente blanquea. Las hojas de las plantas mutantes permanecen verdes dos veces más tiempo, debido a que las hojas están en constante contacto con el agar no sufren la sequedad, indicando que la reducida senescencia de la mutante era1 no es un fenómeno inducido por la sequedad.

Además, bajo un ciclo de 10 h dia/16 h noche, el ciclo de vida de la planta puede duplicarse respecto a las plantas de tipo salvaje (3 meses). Parece, por consiguiente, que las señales de movimiento de clorofila y la senescencia se alteran en el mutante era1. Por ejemplo, las plantas tipo salvaje y las mutantes se desarrollaron en tiestos bajo condiciones de buen riego hasta etapas de desarrollo donde las hojas de plantas de tipo salvaje empezaron a sufrir senescencia (aproximadamente el tiempo del desarrollo de la flor). En este momento hojas desarrolladas similarmente se ensayaron respecto a genes marcadores inducidos por senescencia por análisis de northern blot (Ejemplo 8). Dos genes, SAG12 y SAG 13, en que la transcripción se induce normalmente durante la senescencia en plantas de tipo salvaje, no se indujeron en el mutante era1/Figura 9). Reunidos los datos, estos resultados indican que el programa de inducción de senescencia en mutantes era1 se retrasa en comparación con plantas tipo salvaje, mostrando que la pérdida de la actividad de farnesilación causa un retraso de la inducción de senescencia en la planta incluso bajo condiciones en que el estrés por el agua no es un factor medioambiental.

Además de los efectos sobre senescencia y pérdida de agua, los mutantes era1 muestran una diferencia en el hábito de ramificación y floración cuando crecen bajo ciclos de luz diurna. Bajo luz continua, la pauta de ramificación de mutantes no difiere de la de las plantas de tipo salvaje. Sin embargo, cuando se da un período de oscuridad, los mutantes no producen tantas ramas laterales como las plantas de tipo salvaje. Cuando se mide, las plantas con pérdida de actividad de farnesilación producen sólo 2,4 ramas por planta, en comparación con 3,6 ramas laterales en las plantas de tipo salvaje. Esto representa una disminución del 30% en las ramas laterales por planta.

La floración se ve afectada por pérdida de actividad Ftasa asimismo. Las plantas que carecen de actividad Ftasa producen más flores por planta (25-30 capullos por inflorescencia) que las plantas de tipo salvaje (10-15 capullos/inflorescencia). Así, por término medio hay dos veces más capullos de flores en plantas mutantes que en las de tipo salvaje.

Estos efectos pleiotrópicos de la pérdida era1 de mutantes de función sobre el desarrollo total de la planta indican que el gen ERA1 puede ser un regulador de coordinación de una serie de funciones de desarrollo de las plantas.

Hasta ahora, no se sabía de función conocida para la farnesilación en las plantas superiores, que incluía un papel en la transducción de señal de ABA. Las ftasas se han encontrado en varias plantas superiores, como el tomate y el guisante, así que está claro que esta enzima tiene funciones a través de los límites de las especies. Además, la sobreproducción de péptidos diana de farnesiltransferasa o el uso de inhibidores de farnesilación inactiva completamente la Ftasa en sistemas de levaduras y de mamíferos. Así, inhibidores similares pueden aplicarse a plantas superiores para inactivar Ftasa in vivo. En ambos casos con los promotores apropiados, Ftasa antisentido o inhibidores peptídicos pueden ser específicamente elegidos como diana y controlados.

Los mutantes deficientes en farnesilación también son supersensibles a auxina exógena. Que esos mutantes muestran ramificación reducida y alteraciones menores en la organización meristemática, puede explicarse por regulación alterada de la auxina. Así, otras funciones de hormonas están afectadas en este mutante, lo que indica que además de la trayectoria ABA, otras trayectoria reguladas por hormonas son controladas por la actividad Ftasa. Estos resultados demuestran que el gen ERA1 proporciona un mecanismo molecular para coordinar la regulación de diferentes moléculas que señalan hormonas.

De acuerdo con esta invención, las plantas incluidas dentro del alcance de esta invención son plantas superiores e inferiores del reino vegetal. Plantas maduras, plántulas y semillas se incluyen en el alcance de esta invención. Una planta madura incluye una planta en cualquier etapa de desarrollo más allá de las plántulas. Una plántula es una planta muy joven, inmadura en las primeras etapas de desarrollo. Partes de plantas, protoplastos y cultivos de tejidos se proporcionan también en esta invención.

Se incluyen plantas transgénicas dentro del alcance de esta invención que tienen el fenotipo caracterizado por la mutación era1. Esta invención proporciona semillas de plantas transgénicas y se pueden usar para propagar más plantas que contengan los constructos de esta invención.

La función ERA1 en varias plantas de cultivo puede inhibirse para aumentar la respuesta de la planta a condiciones adversas medioambientales que requieren señalización mediada por ABA. El control de la farnesilación en plantas superiores regula la respuesta de tejido embriónico y vegetativo a esta hormona (Cutler, et al., 1996). La sensibilidad aumentada se traduce en una respuesta más rápida del tejido a las condiciones de estrés lo que a su vez confiere mayor protección de la planta al estrés medioambiental. Como esto sólo requiere el control de un único gen, ERA1, sería posible controlar la farnesilación en una variedad de plantas controlando la síntesis actividad de esta enzima. Además, el trabajo descrito aquí claramente indica que alterar la vía de transducción de señal de ABA manipulando los genes que controlan la respuesta ABA hace posible mejorar la respuesta de la planta a condiciones adversas de agua.

Para producir plantas transgénicas de esta invención, un constructo que comprende el gen que codifica Ftasa, o el ácido nucleico que codifica su equivalente funcional, y un promotor, se incorporan en un vector mediante métodos conocidos y utilizados por aquellos expertos en la técnica. El promotor puede comprender todo o parte de SEQ ID NO:3. El constructo también puede incluir cualquier otro regulador necesario tales como terminadores o similares, operablemente enlazados a la secuencia de codificación. También puede ser beneficioso incluir una secuencia líder 5', como el líder no trasladado desde mRNA de proteína de lana de virus de mosaico de la alfalfa (Jobling, S.A. y Gehrke, L. (1987) Nature 325:622-625) o el líder del virus moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel, S.A., et al.,(1991) Virology 81:382-385). Los expertos en la técnica reconocerán la aplicabilidad de otras secuencias líder para otros fines.

Las secuencias de elección de diana también son útiles y pueden incorporarse a los constructos. Una secuencia de elección de diana se traslada usualmente a un péptido que dirige el producto polipéptidico de la secuencia de ácido nucleico codificante a una ubicación deseada dentro de la célula, como el plástido, y llega a separarse del péptido después de que el tránsito del péptido es completo o concurrentemente con el tránsito. Ejemplos de secuencias de elección de diana útiles en esta invención incluyen, pero no se limitan a, presecuencia mitocondrial de levadura (Schmitz, et al. (1989) Plant Cell 1: 783-791), la secuencia de elección de diana desde el gen relativo a la partenogénesis (PR-1) del tabaco (Cornellisen, et al. (1986) EMBO J. 5:37-40), señales de elección de diana de vacuolas (Chrispeels, M.J. and Raikhel, N.V. (1992) Cell 68: 613-616), secuencias de vía secretoria como las de ER o Golgi (Chrispeels, M.J. (1991) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:21-53). Secuencias intraorganelares pueden ser también útiles para sitios internos, por ejemplo, tilakoides en cloroplastos. Theg, S.M. and Scott, S.V. (1993) Trends in Cell Biol. 3:186-190.

Además de las secuencias líder 5', las secuencias de terminación se incorporan usualmente en el constructo. En los constructos de plantas, una región no trasladada 3' (3'UTR9 es generalmente parte del plásmido de expresión y contiene una secuencia de terminación poliA. La región de terminación que se emplea será generalmente una de conveniencia, ya que las regiones de terminación parecen ser relativamente intercambiables. Las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa, derivadas del plásmido Ti de A. Tumefaciens, son convenientes para ese uso en la invención.

Cualquier técnica conveniente puede utilizarse para introducir los ácidos nucleicos y constructos de esta invención para producir plantas transgénicas con un genoma alterado. Para plantas como maíz, puede usarse el bombardeo con microproyectiles (véase por ejemplo Sanfor, J.C. et al., Patente de EE UU., Nº 5.100.792 (1992). En esta realización, un constructo nucleótido o un vector que contiene el constructo se recubre con pequeñas partículas que se introducen entonces en el tejido diana (células) por vía de penetración balística a alta velocidad. El vector puede ser cualquier vector que permita la expresión del DNA exógeno en células de plantas en las que el vector se introduce. Las células transformadas se cultivan después bajo condiciones apropiadas para la regeneración de plantas, dando lugar a producción de plantas transgénicas.

Las plantas transgénicas que llevan el constructo se examinan respecto al deseado fenotipo utilizando una variedad de métodos que incluyen pero no se limitan a un marcador fenotípico apropiado, tal como resistencia a antibiótico o resistencia a herbicida, u observación visual del tiempo de inducción floral en comparación con el de las plantas presentes naturalmente.

Otros métodos conocidos de insertar constructos de ácido nucleico en plantas incluyen transformación mediada por Agrobacterium (véase por ejemplo Smith R.H. et al., Patente de EE.UU. Nº 5.164.310 (1992)), electroporación (véase, por ejemplo, Calvin, N., patente de EE.UU. Nº 5.098.843 (1992)), introducción utilizando rayos láser (véase por ejemplo, Kasuya, T. et al., patente de EE UU. Nº 5.013.660 (1991)) o introducción utilizando agentes como polietilenglicol (véase por ejemplo, Golds, T. et al., (1993) Biotechnology, 11:95-97), y similares. En general, las células vegetales pueden transformarse con una variedad de vectores, como vectores virales, episomales, vectores de plásmido T y similares, de acuerdo con procedimientos bien conocidos. El método de introducción del ácido nucleico en la célula vegetal no es crítico para esta invención.

Los métodos de esta invención pueden usarse con técnicas de transformación en planta o en semillas que no requieren cultivo o regeneración. Ejemplos de estas técnicas se describen en Bechtold, N., et al. (1993) CR Acad. Sci. Paris/Life Sciences 316:116-93; Chang, S.S., et al. (1990) Abstracts of the Fourth International Conference on Arabidopsis Research, Viena, p. 28; Feldmann, K.A. and Marks, D.M. (1987) Mol. Gen. Genet. 208:1-9; Ledoux, L., et al. (1985) In: Methods in Arabidopsis Research (Eds. Koncz, C., Chua, N-H, Schell, J.) pp. 274-289; Chee, et al., EE.UU. patent, Serial Nº 5.376.543.

La región de iniciación transcripcional puede proporcionar expresión constitutiva o expresión regulada. Además del promotor ERA1, se dispone de muchos promotores que son funcionales en las plantas.

Promotores constitutivos para la expresión de genes en plantas incluyen, pero no se limitan a, promotores de octopina sintasa, nopalina sintasa o manopina sintasa de Agrobacterium, el promotor del virus mosaico de la coliflor (35S), el promotor del virus mosaico de escrofularia (FMV) y el promotor del virus mosaico del tabaco (TMV).La expresión de genes constitutivos en plantas puede proporcionarse también por el promotor de glutamina sintasa (Edwards, et al (1990) PNAS 87:3459-3463), el promotor 1 de sacarosa sintetasa de maíz (Yang et al (1990) PNAS 87: 4144-4148), el promotor desde el gwen RoI-C del TLDNA de plásmido Ri (Sagay eta l (1989) Plant Cell Physiolo. 30:649-654) y la región específica de floema del promotor pRVC-S-3A (Aoyagui, et al., 1988) Mol. Gen. Genet., 213:179-185).

Son también útiles, promotores de choque térmico, el promotor de pequeña subunidad (ssu) de carboxilasa de ribulosa-1,6-bifosfato (RUBP), promotores específicos de tejidos, y similares para expresión regulada de los genes de las plantas. Promotores regulados por el desarrollo, inducidos por tensión, inducidos por herida o inducidos por patógenos, son también útiles.

La región reguladora puede ser sensible a un estímulo físico, como la luz, como con el promotor ssu de carboxilasa RUBP, señales de diferenciación, o metabolitos. El tiempo y nivel de expresión de la orientación sentido o antisentido puede tener un efecto definido sobre el fenotipo producido. Por consiguiente, los promotores elegidos, combinados con la orientación del DNA exógeno, y el lugar de integración de un vector en el genoma, determinarán el efecto del gen introducido.

Ejemplos específicos de promotores regulados también incluyen pero no se limitan a, los promotores Kinl y cor6.6 (Wang et al. (1995) Plant Mol. Biol. 28:619-634), el promotor inducible ABA (Marcotte Jr et al. (1989) Plant Cell 1:969-976), promotores de choque térmico como el promotor de choque térmico hsp70 inducible de Drosophilia melanogaster Freeling, M., et al. (1985) Ann. Rev. Of Genetics 19, 297-323), el promotor inducible en frío de B. napus (White, T.C., et al. (1994) Plant Physiol. 106:917), el promotor alcohol deshidrogenasa que es inducido por etanol (Nagao, R.T., et al., Miflin, B.J., Ed. Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology, Vol. 3, p. 384-438, Oxford University Press, Oxford 1986), el promotor ASUS1 de sintasa sacarosa específico de floema desde Arabidopsis (Martín, et al. (1993) Plant J. 4:367-377), el promotor ACS1 (Rodrigues Pousada, et al. (1993) Plant Cell 5:897-911), el promotor de proteína zein 22kDa desde el maíz (Unger et al. (1993) Plant Cell 5:831-841), el promotor de lectina ps 1 de guisante (de Pater, et al. (1993) Plant Cell 5:877-886), el promotor phas de Phaseolus vulgaris (Frisch, et al., (1995) Plant. J. 7:503-512), el promotor lea (Thomas T.L. (1993) Plant Cell 5:1401-1410), el promotor de gen E8 del tomate (Cordes, et al. (1989) Plant Cell 1:1025-1034), el promotor PCNA (Kosugi, et al. (1995) Plant J. 7:877-886), el promotor NTP303 (Weterings, et al. (1995) Plant J. 8:55-63), el promotor OSEM (Hattori, et al. (1995) Plant J. 7:913-925), el promotor ADP GP de la patata (Muller-Rober, et al. (1994) Plant Cell 6:601-604), el promotor Myb de cebada (Wissenbach, et al. (1993) Plant J. 4:411-422), y el promotor de plastocianina de Arabidopsis (Vorst et al. (1993) Plant J. 4:933-945).

El vector puede introducirse en células por un método apropiado al tipo de células hospedadora (por ejemplo transformación, electroporación, transfección). Para los fines de esta descripciónm los términos "transformado con", "transformante", "transformación", "transfeccionado con", y "transfección" se refieren todos a la introducción de un ácido nucleico en una célula por uno de los numerosos métodos conocidos por personas expertas en la técnica. Transformación de células procarióticas, por ejemplo, se consigue comúnmente tratando las células con cloruro cálcico de modo que se conviertan en "competentes" para recibir DNA exógeno, y después mezclar ese DNA con las células competentes. Las células procarióticas también pueden infectarse con un vector bacteriófago recombinante. Los ácidos nucleicos pueden introducirse en las células de organismos superiores por infección viral, transferencia mediada por bacterias (por ejemplo, sistema de suministro de T-DNA de Agrobacterium), electroporación, coprecipitación con fosfato cálcico, microinyección, lipofección, bombardeo con partículas revestidas con ácido nucleico u otras técnicas, dependiendo del tipo particular de célula. Para plantas como maíz y sorgo, se puede usar el bombardeo con microproyectiles descrito por ejemplo, en Sanford, J.C. et al., patente de Ee.UU. Nº 5.100.792 (1992). Otros protocolos útiles para la transformación de células vegetales se proporcionan en Gevin et al., 1992. Protocolos convenientes para transformar y transfeccionar células se encuentran también en Sambrook et al., 1989. los constructos de ácido nucleico de esta invención pueden también incorporarse a partes de plantas específicas como las descritas supra mediante las técnicas de transformación y transfección descritas aquí.

Para ayudar a la identificación de células de plantas transformadas, los constructos pueden ser además manipulados para incluir genes que codifican marcadores seleccionables de plantas. Marcadores seleccionables útiles incluyen enzimas que proporcionan resistencia a un antibiótico como gentamicina, higromicina, kanamicina, o similares. Similarmente, son útiles las enzimas que proporcionan producción de un compuesto identificable por cambio de color como la (\beta-gluronidasa) GUS, o por luminiscencia, como la luciferasa.

Por ejemplo, Ftasa antisentido se puede producir integrando un complemento del gen ERA1 enlazado a DNA que comprende SEQ ID NO:3 en el genoma de un virus que entra en las células hospedadoras.

Cuando se obtienen las células o protoplastos que contienen el gen antisentido dirigido por un promotor de esta invención, las células o protoplastos se regeneran en plantas completas. Las células transformadas se cultivan entonces bajo condiciones apropiadas para la regeneración de plantas, dando lugar a la producción de plantas transgénicas. La elección de la metodología para la etapa de la regeneración no es crítica, disponiendo de protocolos convenientes para muchas variedades de plantas, tejidos y otros organismos fotosintéticos. Véase, por ejemplo, Gelvin S.B. y Schiperoort R.A., eds. Plant Molecular Biology Manual, Second Edition, Suppl. 1 (1995) Kuwer Academic Publisher, Boston MA, EE.UU.

Las plantas transgénicas que llevan el constructo se examinan para el deseado fenotipo utilizando una variedad de métodos que incluyen pero no se limitan a un marcador fenotípico apropiado, como resistencia a un antibiótico o resistencia a herbicida como se ha descrito supra, u observaciones visuales de su crecimiento en comparación con el crecimiento de plantas presentes naturalmente bajo las mismas condiciones.

Como se usa aquí, el término plantas transgénicas incluye plantas que contienen DNA o RNA que no está presente de forma natural en las plantas (nativas) tipo salvaje, o variantes conocidas, o copias adicionales o invertidas del DNA presente naturalmente y que se introduce como se ha descrito aquí. Las plantas transgénicas incluyen aquellas en las que se han introducido ácidos nucleicos aislados y sus descendientes, producidos a partir de semillas, propagación vegetativa, cultivo de célula, tejido o protoplasto, o similarmente.

Las semillas se pueden obtener de la planta regenerada o de un cruce entre la planta regenerada y una planta conveniente de la misma especie. Alternativamente, la planta puede propagarse vegetativamente cultivando partes de la planta bajo condiciones convenientes para la regeneración de esas partes de la planta.

La invención puede usarse para proporcionar cultivo de tejido vegetal y protoplastos que contienen DNA que comprende ácido nucleico ERA1 alterado o antisentido operablemente enlazado a un promotor ERA1,que altera la respuesta del cultivo del tejido o protoplastos para condiciones medioambientales variables.

Los métodos de esta invención pueden también usarse con técnicas de transformación in planta o de semilla que no requieren cultivo o regeneración. Ejemplos de estas técnicas se describen en Bechtold, N., et al. (1993) CR Acad. Sci. Paris/Life Sciences 316:118-93; Chang, S.S., et al. (1990) Abstracts of the Fourth International Conference on Arabidopsis Research, Vienna, p. 28; Feldmann, K.A. and Marks, D.M. (1987) Mol. Gen. Genet. 208:1-9; Ledoux, L., et al. (1985) Arabidopsis Inf. Serv. 22:1-11; Feldmann, K.A (1992) In: Methods in Arabidopsis Research (Eds. Koncz, C., Chua, N-H, Schell, J.) pp. 274-289; Chee, et al., EE.UU. patent, Serial Nº 5.376.543.

Realizaciones

Los constructos y métodos de esta invención tienen numerosas aplicaciones de valor comercial, especialmente en la prevención de la desecación de tejidos de plantas bajo períodos de falta de agua. La manipulación genética de plantas de cultivo que incorpora inhibidores de Ftasa o inactivación del gen que codifica la Ftasa vegetal endógena permitiría a esas plantas resistir tensiones medioambientales transitorias y podría ampliar los ambientes en los que pueden crecer esas plantas. Así, mejorando la tolerancia de las plantas de cultivo al frío, el exceso de sal y la sequedad, se puede mejorar la producción de las plantas bajo esas adversas condiciones.

La tecnología descrita aquí puede también emplearse para alterar el tiempo de la cosecha y la calidad de la cosecha de plantas. Por ejemplo, la sobreexpresión de Ftasa conduciría a tiempos de secado más rápidos de cosechas, como maíz y otros cereales. El secado del maíz implica grandes cantidades de gas propano. Los tiempos de secado de plantas como el heno, que se seca naturalmente en los campos, podrían acortarse, haciendo menos probable que la lluvia llegue a deteriorar la cosecha.

Además, la inhibición de la farnesilación en las plantas puede también usarse para controlar el programa de senescencia de las plantas de modo que las hojas puedan mantenerse en estado verde más tiempo y las frutas puedan mantenerse sin madurar. Por ejemplo, si un constructo antisentido de constructo de proteína inhibidor de ERA1 p caja CaaX se sitúa bajo control de un promotor inducido por senescencia, la planta induciría un inhibidor farnesilación cuando se inicia el programa de senescencia, lo que su vez inhibiría la senescencia. El resultado sería una planta que permanece verde o frutas que permanecen no maduras, Así la planta podría mantenerse produciendo un producto, como una parte vegetativa, flor o fruto mucho más tiempo. Así los horticultores podrían producir plantas que permanecen verdes y continúan creciendo incluso aunque una planta tipo salvaje de la misma variedad alcance la senescencia bajo las mismas condiciones. Las flores cortadas durarían más tiempo. O una fruta se mantendría sin madurar, algo importante para la industria frutícola, donde la duración de vida en el mercado es extremadamente importante.

Además, la inhibición de Ftasa en frutos y vegetales puede reducir el marchitamiento. Así, el marchitamiento del producto durante el transporte y expedición se podría reducir. Las frutas y vegetales en la tienda de comestibles también requerirían menos humedad para mantenerlo frescos y sabrosos, y habría menos necesidad de aplicarles cera, como a pepinos, manzanas y naranjas para protegerlos de la sequedad.

Menos uso de agua también significaría que los ataques por hongos y bacterias sobre las cosechas, o frutas o vegetales, se reducirían. Por ejemplo, las enfermedades de las plantas en el campo que resultan del salpicado de agentes patógenos desde el suelo a las hojas y frutos de las plantas, se inhibirían. En el campo de la horticultura, se pueden producir muchas variedades resistentes a la sequedad con fines paisajísticos y como plantas ornamentales domésticas. Especialmente valiosas son las variedades de plantas que se usan para macetas, como ornamento dentro y fuera de casa y oficinas, y que pueden sobrevivir con poca agua. Esto sería una considerable ayuda para los jardineros, especialmente si durante los meses de verano se olvidaron plantas a pleno sol que se secaron rápidamente. Además, las plantas desarrolladas bajo árboles y en otras áreas umbrías a menudo experimentan condiciones de sequedad y luz limitada. La tecnología proporcionada aquí puede proporcionar variedades de plantas que pueden sobrevivir mejor bajo estas condiciones.

Los horticultores podrán encontrar muchos usos para plantas en que la ramificación lateral y/o el número de flores se pueden regular con ciclos de luz/oscuridad. Ejemplos de plantas en los que tallos más largos, sin ramificaciones laterales pueden significar ventajas comerciales incluyen las rosas, claveles, lilas y similares. La capacidad para aumentar el número de florecillas o flores en la planta es también una cuestión de gran valor: estas características también serán útiles para muchos cultivos agrícolas ya que la producción puede incrementarse de manera que también la recogida de la cosecha sea más fácil.

Otro beneficio de los constructos y métodos proporcionados aquí es que el promotor ERA es activo en las células de guarda de las hojas. Una porción del promotor de gen ERA1 puede fusionarse a un ácido nucleico antisentido al gen ERA1 de modo que la actividad de la Ftasa disminuya solamente en las células de guarda.

Una realización adicional es el uso de un rasgo resistente a la sequedad como un marcador seleccionable de transformación en plantas, células vegetales y tejidos vegetales. Un método para detectar transformación en las plantas consiste en a): incorporar un constructo de ácido nucleico que comprende un promotor operablemente enlazado a un ácido nucleico que comprende antisentido o SEQ ID NO:1 o un ácido nucleico que comprende un equivalente funcional del antisentido; b)insertar el constructo de ácido nucleico en una planta, célula vegetal o tejido vegetal; c) hacer crecer la planta o regenerar una planta desde la célula vegetal o el tejido vegetal hasta que se forman los estomas y d) colocar la planta o planta regenerada bajo condiciones en las que la planta está sufriendo sequedad, en que la supervivencia de la planta bajo las condiciones de sequedad en comparación con las plantas no transformadas es indicadora de transformación. Así, esta tecnología puede emplearse como un marcador genético elegible, es decir, un marcador visual especialmente cuando se combina con esquemas de selección y transformación de plantas.

Además, sin recurrir a una planta transgénica, el hábito de ramificación y/o floración de plantas con pérdida de la función Ftasa difiere sustancialmente del de las plantas de tipo salvaje y puede usarse como un marcador para una transformación con éxito. Este método será especialmente útil donde se han aplicado las técnicas de transformación in planta. Bajo condiciones de luz diurna, los retoños de plantas transgénicas mostrarán menos ramificación lateral que los de retoños no transformados, indicando así pérdida efectiva de actividad de Ftasa sin uso de marcadores antibióticos selectivos.

Ejemplificación Ejemplo 1 Condiciones de mutagénesis

Las plantas Arabidopsis empleadas en este estudio crecieron bajo luz continua placas petri que contenían suelo o agar, como se ha descrito (Haughn y Somerville 1986). Se usaron dos tipos silvestres distintos de Arabidopsis: Meyerowitz's Colombia (Col) (Leihe Sedes, Dripping Springs, TX) y Wassilewskija (Ws) (ABRC, Ohio State University. Los mutantes aislados por selección de semillas mutagenizadas T-DNA eran del fondo Wassilewskija. Se obtuvieron de la colección de reserva de Arabidopsis. Números de reserva de ABRC CS2606-2654) La colección de semillas de T-DNA estaba formada por 49 conjuntos de 1200 descendientes (T4) de cuarta generación derivados de 100 padres mutagenizados. Un padre mutagenizado se obtiene incubando durante la noche semillas tipo salvaje (T1) en un cultivo de Agrobacterium saturado que contiene un plásmido T-DNA. Las semillas se lavaron en agua y se plantaron en tiestos. Semillas de generación T2 se obtuvieron de cada planta y se investigaron respecto a la resistencia a la kanamicina (que se lleva sobre el T-DNA). Las plantas resistentes a la kanamicina se adelantaron a la generación T3. las plantas de generación T4 se dieron al centro de reserva. Cada conjunto se examinó separadamente.

Los mutantes aislados explorando la semillas irradiadas con neutrones rápidos estaban en el fondo de Meyerowitz's Columbia. Las semillas tipo salvaje mutagenizadas (N1) se irradiaron con 60 Gy de neutrones rápidos y se cultivaron a la siguiente generación. Las semillas N2 se obtuvieron cono conjuntos de aproximadamente 11.000 semillas generadas a partir de padres 1387 N1. Diez de estos conjuntos se examinaron separadamente respecto a mutaciones supersensibles a ABA. En la exploración inicial las semillas se almacenaron a 4ºC durante una semana y se depositaron sin imbibición. Para todas las reexploraciones subsiguientes las semillas se imbibieron a 4ºC durante una semana en ABA 0,3 \muM y se marcó la emergencia del cotiledón después de 5-7 días a 22ºC a la luz.

Ejemplo 2 Análisis genético

Las líneas mutantes se retrocruzaron a tipo salvaje tres veces. La mutaciones de T-DNA se retrocruzaron a Ws y los mutantes de neutrones rápidos a MCol. La segregación del fenotipo era se siguió depositando semillas F2 sobre 0,3 \muM ABA e imbibiendo cuatro días a 4ºC. Después de la imbibición, las placas se transfirieron a temperatura ambiente a la luz. La germinación se midió como la presencia o ausencia de cotiledones en las plántulas una semana después de la imbibición. Se construyeron mutantes dobles cruzando líneas homozigóticas para cada mutación después de la segregación e identificando las líneas que llevaban uno de los fenotipos mutantes. El alelo abi3 usado en este estudio es abi3-6 (Nambara et al., 1994) y abi1 es abi1-1 (Koorneef et al., 1982). El alelo era1-2 se usó como padre era. El análisis de segregación sugiere que era1 parcialmente suprimió la insensibilidad de abi1 así que las plantas F2 fueron las primeras investigadas respecto a la insensibilidad a ABA 3 mM y las semillas F3 de estas plantas se marcaron respecto a la sensibilidad a ABA 0,3 \muM. En los mutantes dobles putativos se ensayó la progenie en la generación F4 y se verificó por polimorfismos de DNA para Abi1 y Era1. Para mutantes dobles era1 abi3, las semillas F2 se examinaron respecto a insensibilidad (3 \muM ABA) y las plantas maduras se marcaron respecto a carpelos salientes y semillas verdes inmaduras (Nambara et al., 1994). Las líneas de mutantes dobles putativos se verificaron por polimorfismos de DNA para Abi3 y Era1.

Ejemplo 3 Análisis de DNA y RNA

Los métodos de extracción de DNA (Dellaporta et al., 1983) y RNA (Verwoerd et al.,1989) se hicieron como se ha descrito. Se llevó a cabo Southern de alta astringencia a 65C como también se ha descrito (Smabrook et al., 1989). Toda la exploración de bibliotecas genómicas y cDNA se hizo sobre membranas Gelman BioTrace NT de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes (Gelman Sciences). Para clonar uniones de inserción entre T-DNA y DNA genómico en el mutante T12W (era1-1) una biblioteca de T12W DNA se hizo en \gamma-ZAPII (Stratagene). El análisis por Southern blot genómico de T12W DNA sometido a digestión con EcoRI y a una sonda con T-DNA (RB) de margen derecho produjo tres bandas (13 kb, 7,0 kb y 8,0 kb). Los análisis subsiguientes con otras enzimas de restricción verificaron que las bandas 7 y 8 kb contenían los puntos de inserción de T-DNA y flanqueaban el DNA de plantas. Estos fragmentos se clonaron por digestión de DNA genómico con EcoRI y el DNA se fraccionó utilizando una Prep Cell (Pharmacia). Las fracciones que contienen los fragmentos 7 y 8 se identificaron por análisis Southern de fracciones de los conjuntos utilizando el RB como una sonda. Estos conjuntos se ligaron a los brazos \gamma-ZAPII conforme a las instrucciones del fabricante (Stratagene). Se examinó una biblioteca de 40.000 recombinantes. Se identificaron cinco placas positivas y se excindieron formas plásmido de los insertos clonados conforme al fabricante(Stratagene). Dos plásmidos designados pL4B y pL7, que hibridan con sonda RB se caracterizaron entonces. Utilizando pBluescript, un fragmento Bam-HI de EcoRI de pl4B de 2,3 kb se subclonó y se designó pSC10 y un fragmento BamHI HindIII de pL7 de 1,3 kb se subclonó y se designó pSC11. Estos dos plásmidos contenían aproximadamente 1,2 kb de T-DNA unido al DNA genómico vegetal flanqueante. PSC10 se usó como una sonda para examinar una biblioteca cDNA de Arabidopsis, PRL2 1-Ziplox (ABRC, Stock CD4-7). Cinco cDNA positivos se identificaron y el inserto más largo de cDNA, pZL23, se usó para explorar un fago PRL2 200.000 adicional. A partir de esta exploración, se aisló un inserto cDNA más largo, pZL51, (1,35 kb). Estos clones se secuenciaron y se usaron para explorar 30.000 \gamma-ZAPII placas hechas de DNA genómico Columbia tipo salvaje EcoRI parcialmente sometido a digestión. La construcción de esta biblioteca fue como se ha descrito antes excepto sin fraccionamiento del DNA sometido a digestión. Se identificaron cuatro clones positivos. Los insertos se excindieron y se secuenció completamente una región de 6 kb que abarcaba el clon pZL51. El inserto genómico y un inserto genómico de 14 kb aislado de una biblioteca genómica erecta Lansberg 1-FIX por métodos similares (ABRC Stock CD4-8) se usaron como sondas para determinar el tamaño de deleciones en los mutantes por neutrones rápidos (era1-2, era1-3).

Ejemplo 4 Ensayo de farnesil transferasa proteínica

Los ensayos de farnesil transferasa (Ftasa) se llevaron a cabo utilizando extractos libres de células de planos de tipo salvaje y de mutantes como la fuente de Ftasa y heptapéptidos sintéticos como sustrato para la reacción. Los péptidos se obtuvieron de Genemed Biotechnologies, Inc. Las secuencias apropiadas para los péptidos se basaron en los datos de Randal et al., (1993); estos fueron GGCCAIM (-CAIM) y GGCCCCCAIL (-CAIL). Las soluciones de péptidos se prepararon en dimetisulfóxido al 100% (DMSO) que contenía ditiotreitol (DDT) 10mM y se diluyó en DTT 10 mM en la ausencia de DMSO. La fuente de Ftasa para ensayos de transferasa fueron extractos proteínicos solubles de los brotes de plantas de tres semanas de edad. En ambos casos, plantas tipo salvaje y mutantes, se recogieron 1 g (peso en fresco) de brotes y se homogeneizaron en un tampón que contenía Hepes 50 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 5 mM, EGTA 1 mM, DTT 5 mM, 2 \mug/ml de leupeptina, 2 \mug/ml de aprotinina, y PMSF 1 mM. Se eliminaron desechos y membranas celulares por centrifugación a 4ºC a 10.0000 g por minuto y 100.000 g durante 30 minutos. El sobrenadante se retiró y la cuantificación de la proteína total soluble se evaluó conforme a Bradford (1976). Extractos solubles se incubaron a 30ºC con un sustrato peptídico y ^{3}H-farnesilpirofosfato (Amersham) durante 40 minutos. Cada mezcla de reacción contenía los siguientes componentes en un volumen final de 25 \mul: Hepes 50 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 5 mM, DTT 5 mM, péptido 50 \muM,[^{3}H]FPP 0,5 \muM y 100 \mug de extracto de proteína soluble. Como control, una reacción contenía extractos solubles que se habían hervido durante cinco minutos. Las reacciones se terminaron añadiendo EDTA hasta una concentración final de 50 mM y después marcando puntos sobre placas de cromatografía en capa fina de gel de sílice 60 (Millipore). Las placas se desarrollaron con n-propanol-agua (7,3 v/v9 durante 4-5 horas. Las placas se secaron, se pulverizaron con En^{3}Hance (New England Nuclear), y se expusieron a película Kodak X-OMAT AR a -70ºC durante 4 días.

Ejemplo 5 Constructos de genes ERA1-GUS y plantas transgénicas

Los constructos de fusión ERA1-GUS se hicieron insertando un fragmento genómico EcoR1-HinIII de 5 kb del promotor ERA1 en el plásmido sin promotor GUS T-DNA (pBI121). Este constructo se transformó en cepa de Agrobacterium LB4404. El Agrobacterium se desarrolló (0.8 O.D. unidades, 595 nm) y después se lavó extensamente con agua, las células se volvieron a suspender en glicerol al 10% y después se sometieron a electroporación a 200 Ohms 25 \muF, 2,5 kvolts. Las células se situaron después sobre medio L3 plus Ampicilina (100 \mug/ml y se desarrollaron dos días a 28ºC. Se usaron transformantes resistentes a ampicilina en los subsiguientes experimentos de transformación de plantas. Las plantas transgénicas se hicieron infiltrando en vacío plantas con un cultivo de saturación de Agrobacterium (0,8 O.D. unidades, 595 nm) Las plantas de tipo salvaje se desarrollaron bajo condiciones de laboratorio estándar (25ºC, 150\muEm^{-2} seg^{-1}, humedad, luz constante) hasta que produjeron sus primeros brotes a aproximadamente 5 semanas. Los tallos se retiraron y las plantas se sumergieron en una solución de Agrobacterium y se situaron bajo vacío (20 mbares) durante 5 minutos. Después de interrumpir el vacío las plantas se transfirieron al suelo y se dejaron recuperar bajo condiciones de laboratorio estándar. Las plantas produjeron nuevas flores y semillas que se recogieron después de dos meses y se dejaron secar durante dos semanas. Las semillas de plantas individuales se plantaron sobre placas MS con medios mínimos que contenían 50 \mug/ml de kanamicina. Las plántulas verdes resistentes a kanamicina se identificaron y se llevaron al suelo después de dos semanas y se dejaron crecer hasta semilla. Estas semillas germinaron y las plántulas se ensayaron respecto a actividad GUS utilizando el sustrato de GUS fluorescente Imagene Green (Molecular Probes, Eugene, Oregon). El ensayo se hizo suspendiendo plántulas en tampón GUS (fosfato sódico 50 mM pH 7,0, EDTA 10 mM, Triton X-100 0,1%, sarcosil sódico 0,1%, Imagene Green 4mM9 durante 2.4 horas en la oscuridad a temperatura ambiente. Las plántulas se observaron directamente bajo un microscopio (25 X) utilizando luz de excitación azul para una señal fluorescente positiva que es amarilla sobre un fondo autofluorescente de clorofila rojo.

Ejemplo 6 Experimentos de sequedad

Seis plántulas de tipo salvaje simples y seis plántulas era1-2 se desarrollaron durante cuatro semanas en luz constante con humectación constante (25ºC, 150\muEm^{-2} seg^{-1}, 70% de humedad, luz constante). Los tiestos se cubrieron entonces de lámina de estaño para retardar la evaporación del suelo y la planta y el tiesto se pesaron. En este momento, las plantas no se regaron más y cada día se pesó cada tiesto. Al final del experimento las plantas se retiraron y los tiestos se dejaron secar otras dos semanas y después se pesaron para determinar el peso del suelo y el tiesto secos. Este peso se sustrajo de cada muestra.

Ejemplo 7 Cambios relacionados con la edad en las hojas desprendidas

El contenido de clorofila en las hojas de rositas adultas en Columbia tipo salvaje y en mutantes era1-2 se compararon después de desprenderse de estas plantas de Arabidopsis. Las plantas se desarrollaron bajo luz constante (150 \muEinsteins/m^{2} seg) y temperatura (22ºC) a una edad de desarrollo similar (3 semanas después de la germinación). En este momento, las cinco hojas de varias plantas que habían emergido después de la germinación se retiraron y se colocaron en placas petri sobre agar al 0,8% con sales mínimas. Las placas se sellaron y se situaron a 22ºC bajo luz constante(150 \mu Einsteins/m^{2} seg) durante 12 días. Se tomaron fotografías y se hicieron comparaciones de color a 0, 3, 3, 9, y 12 días.

Ejemplo 8 Determinación de niveles transcriptos para genes seleccionados en hojas en envejecimiento

Las plantas se desarrollaron bajo luz constante(150 \muEinsteins/m^{2} seg)y temperatura (22ºC) a una edad de desarrollo similar (4 semanas después de la germinación), en cuyo momento la quinta hoja de la rosita que ha emergido después de la germinación se separa de las plantas mutantes (era1-2) y de las plantas tipo salvaje. Estas plantas se ensayaron respecto a la expresión de tres genes (CAB, SAG12, SAG13) por análisis northern (0,4,8 días después de que las plantas han salido a flor. EL Gen CAB codifica la proteína de unión a clorofila de Arabidopsis que está implicada en capturar la luz para la fotosíntesis. CAB se requiere para el color verde de la hoja y es un buen marcador del movimiento de la clorofila en la planta. CAB en plantas tipo salvaje muestra reducción del nivel transcripto una vez se ha inducido la senescencia. No se observa reducción del nivel transcripto en las hojas en envejecimiento de mutantes era1-2. SAG12y SAG13 son genes de Arabidopsis clonados por expresión diferencial durante la aparición de la senescencia en plantas tipo salvaje de Arabidopsis. Se determinó que estos genes no fueron inducidos bajo las mismas condiciones de desarrollo en los mutantes era1-2.

Claims (6)

1. Un método de producción de una planta tolerante a la sequedad que comprende:

a)

proporcionar un constructo de ácido nucleico que comprende un promotor unido operablemente a un ácido nucleico antisentido de una secuencia de ácido nucleico que codifica una subunidad beta de un polipéptido de farnesiltransferasa;

b)

insertar dicho constructo de ácido nucleico en un vector;

c)

transformar una planta, tejido vegetal o una célula vegetal con el vector y

d)

hacer crecer la planta o regenerar una planta a partir del cultivo de tejido o de la célula vegetal;

en que se produce una planta tolerante a la sequedad.

2. El método de la reivindicación 1, en que dicho ácido nucleico antisentido comprende 25 o más ácidos nucleicos consecutivos complementarios a SEQ ID NO:1 mostrado en la Figura 1.

3. El método de la reivindicación 1, en que dicho promotor es un promotor específico de célula de guarda.

4. El método de la reivindicación 1, en que dicho promotor es el promotor era-1 que posee la secuencia SEQ ID NO:3 mostrada en la figura 3.

5. Una planta transgénica tolerante a la sequedad, obtenible por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Semilla transgénica que se obtiene por vía de la planta transgénica según la reivindicación 5, en que dicha semilla produce una planta tolerante a la sequedad.