CN103387609B

CN103387609B - 一种提高植物抗逆境能力的基因及其用途

Info

Publication number: CN103387609B
Application number: CN201310175390.1A
Authority: CN
Inventors: 张鹏; 安冬
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for excellence and innovation in molecular plant science, Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2013-05-13
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2033-05-13
Also published as: WO2013166996A1; CN103387609A

Abstract

本发明涉及一种提高植物抗逆境能力的基因及其用途。本发明人首次分离到一种新的对于调节植物抗逆境能力有用的基因，其可极好地应用于植物品种的改良，提高植物对于逆境的抵抗力。本发明还提供了所述基因的启动子，其具有诱导目的基因在逆境下表达的功能。本发明对延长植物种植时间、扩大植物种植面积、提高植物产量有重要意义。

Description

一种提高植物抗逆境能力的基因及其用途

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种提高植物抗逆境能力的基因及其用途。

背景技术

植物抗逆是植物对抗不良环境，比如抗旱、抗冷、抗盐碱的能力。在自然界条件下，由于不同的地理位置和气候条件以及人类活动等多方面原因，造成了各种不良环境，超出了植物正常生长、发育所能忍受的范围，致使植物受到伤害甚至死亡。这些对植物产生伤害的环境称为逆境或胁迫。而植物对不良环境的适应性和抵抗力为抗逆性或抗性。

逆境的种类多种多样，包括物理的、化学的、生物因素等，可分为生物逆境和非生物逆境两大类。对植物产生重要影响的非生物逆境主要有水分(干旱和淹涝)、温度(高、低温)、盐碱等理化逆境。

低温胁迫是影响植物正常生长的主要障碍因子之一，植物尤其是经济作物的抗冷性强弱直接影响作物产量。近年来，本领域技术人员已对植物抗冷性进行了较多研究，探讨出植物抗冷性的鉴定方法，对植物抗冷性生理生化机理及各生理生化指标与植物抗冷性的关系有了更深入的了解；通过分子标记技术，在分子水平上对植物抗冷性基因进行分析，获得了部分与抗冷性有关的基因。

然而，还需要在此基础上进一步地鉴定和分离抗逆境相关的基因，并深入研究其抗逆境机制，更重要地是切实地将之应用于生产实践。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高植物抗逆境能力的基因及其用途。

本发明的目的还在于提供一种具有诱导目的基因在逆境下表达功能的启动子。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，所述多肽选自下组：

(a)如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽；

(b)如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽；或

(c)将SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-50个，较佳地1-20个，更佳地1-10，更佳地1-5个，如2个、3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物抗逆境能力功能的由(a)或(b)衍生的多肽。

在一个优选例中，该多肽是如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽；或

该多肽是相对于SEQ ID NO:3氨基酸序列，第40-53位、第56-112位、第114-117位氨基酸序列不变而其它位置经过一个或多个(如1-50个，较佳地1-20个，更佳地1-10，更佳地1-5个，如2个、3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物抗逆境能力功能的由(a)衍生的多肽；或

该多肽是相对于SEQ ID NO:4，第52-65位、第68-124位、第126-129位氨基酸序列不变而其它位置经过一个或多个(如1-50个，较佳地1-20个，更佳地1-10，更佳地1-5个，如2个、3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物抗逆境能力功能的由(b)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的植物选自(但不限于)：大戟科植物、旋花科植物、茄科植物、十字花科植物、禾本科植物、木本科植物。

在另一优选例中，所述植物选自大戟科的木薯、橡胶、蓖麻、乌桕；或旋花科放入甘薯；或茄科的马铃薯；或禾本科的水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等；或十字花科的拟南芥。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(1)编码所述多肽的多核苷酸；或

(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

在一个优选例中，该多核苷酸编码如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽。

在一个优选例中，该多核苷酸：

(i)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；或

(ii)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体。

在本发明的另一方面，提供一种制备植物的方法，其包括将所述的多核苷酸转入植物中。

在一个优选例中，所述方法包括：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的多核苷酸；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入了所述的多核苷酸的植物细胞或组织或器官；和

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植物。

在本发明的另一方面，提供一种植物，其包含前面任一项所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽的制备方法，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用于提高植物抗逆境能力或制备提高植物抗逆境能力的物质。

在一个优选例中，所述的逆境是冷(胁迫)环境、高盐(胁迫)环境、干旱(胁迫)环境、氧化(胁迫)环境、渗透(胁迫)环境。

在另一优选例中，所述的多肽或编码该多肽的多核苷酸还用于：

降低植物(较佳地为逆境或胁迫环境下的植物)地上部分的Na⁺浓度，增加K⁺浓度；

降低植物(较佳地为逆境或胁迫环境下的植物)中积累的H₂O₂量；

提高植物(较佳地为逆境或胁迫环境下的植物)中超氧化物歧化酶(SOD)或过氧化氢酶(CAT)的酶活性；

提高植物(较佳地为逆境或胁迫环境下的植物)中CBF信号通路基因(如FAD7、COR47和GolS3)的表达；

提高植物(较佳地为逆境或胁迫环境下的植物)中叶绿素含量；

提高植物(较佳地为逆境或胁迫环境下的植物)中脯氨酸含量；

提高植物(较佳地为逆境或胁迫环境下的植物)的抗失水能力；

改善植物在冷环境(如10℃左右的低温环境)下的生长状态；

提高植物在冷环境(如10℃左右的低温环境)下的生物量(如鲜重或干重)；

提高植物在冷环境(如10℃左右的低温环境)下的叶长叶宽。

在本发明的另一方面，提供一种提高植物抗逆境能力的方法，所述方法包括：提高植物中所述的多肽的表达或活性。

在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽或其编码基因的激动剂。

在本发明的另一方面，提供一种受逆境诱导表达的启动子，所述的启动子选自下组：

(1)如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的多核苷酸；

(2)在严格条件下能够与(1)限定的多核苷酸序列杂交且具有诱导目的基因在逆境下表达功能的多核苷酸；或

(3)与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有70%(优选80%以上，更优选90%以上，最优选95%以上，如98%，99%)以上相同性且具有诱导目的基因在逆境下表达功能的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的启动子选自下组：

相对于SEQ ID NO:5的核苷酸序列，第574-579位、第716-720位、第130-133位、第417-420位、284-289、第649-654位碱基序列不变而其它位置经过一个或多个(如1-50个，较佳地1-20个，更佳地1-10，更佳地1-5个，如2个、3个)碱基的取代、缺失或添加而形成的，且具有诱导目的基因在逆境下表达功能的多核苷酸；或

相对于SEQ ID NO:6的核苷酸序列，第745-749位、第1340-1345位、第533-536位、第878-881位、第302-307位、第482-487位、第510-515位、第744-749位、第1155-1160位、第1278-1283位、第1306-1311位、第1375-1380位碱基序列不变而其它位置经过一个或多个(如1-50个，较佳地1-20个，更佳地1-10，更佳地1-5个，如2个、3个)碱基的取代、缺失或添加而形成的，且具有诱导目的基因在逆境下表达功能的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供所述的启动子的用途，用于诱导目的基因在逆境下表达。

在本发明的另一方面，提供一种构建物，所述的构建物含有所述的受逆境诱导表达的启动子。

在另一优选例中，所述构建物中，受逆境诱导表达的启动子的下游含有至少一个多克隆位点(如酶切位点)，其与所述的受逆境诱导表达的启动子可操作性连接，用于插入目的基因。

在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。

在另一优选例中，所述的构建物含有以下可操作性连接的元件：

所述的启动子；和目的基因。

在另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。

在另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。

在另一优选例中，所述的目的基因可编码具有特定功能的蛋白。

在另一优选例中，所述的目的基因位于所述启动子的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp(优选的，小于1000bp；更优选的，小于500bp；最优选的，小于300bp)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了Southern印迹的结果，显示木薯CBF基因可能存在两个拷贝。

图2显示了MeCBF1和MeCBF2核苷酸序列比对(A)和MeCBF1和MeCBF2蛋白序列比对。NLS、AP2和DSW为CBF保守序列。

图3显示了MeCBF1在受冷胁迫(A)及其它逆境胁迫条件下(B)表达水平的变化，以及MeCBF1的组织特异性表达情况(C)。其中，“GA-冷”指：GA预处理3h后再4℃处理3h后的基因表达情况。

图4显示了MeCBF2在受冷胁迫(A)及其它逆境胁迫条件下(B)表达水平的变化，以及MeCBF2的组织特异性表达情况(C)。其中，“GA-冷”指：GA预处理3h后再4℃处理3h后的基因表达情况。

图5A显示了MeCBF1和MeCBF2洋葱表皮细胞定位试验。

图5B显示了MeCBF1和MeCBF2烟草原生质体定位。

图6显示MeCBF1过表达拟南芥抗冷性增强。将野生型Col-0和3个单拷贝过表达纯合株系(SM1-13-3、SM1-14-19、SM1-19-10)的种子，经表面消毒后铺于基本培养基上。4°C春化3天后，将其分别放于22°C和10°C光照培养箱中水平和垂直培养。培养一段时间后观察幼苗生长状态。

图7显示了低温条件下MeCBF1过表达拟南芥具有较好的长势。分别取水平培养30d的Col-0与过表达株系叶片，称量其鲜重和干重，n=20。并测量低温(10°C)水平培养30d幼苗子叶的叶长与叶宽。**代表p<0.01。

图8显示了低温冷处理比较过量表达MeCBF1的拟南芥与野生型拟南芥的抗冷能力。SM1-19、SM1-17为两种T2代植株。

图9显示了平皿实验比较过量表达MeCBF1的拟南芥与野生型拟南芥的抗冷能力。

图10显示了正常萌发的SM1转基因拟南芥较野生型明显抗盐。

图11显示了MeCBF1启动子受冷诱导表达。

图12显示了BL21(pET32a-MeCBF1)和BL21(pET32a)重组原核表达菌株在抗性筛选培养基上的生长状态。

图13显示MeCBF1具有专一的DNA结合活性。其中，A中上图为重组载体pGAD424-MeCBF1的部分结构示意图。A中中图为重组载体pHISi-3wDRE-HS/3wDRE-HA的部分结构示意图。A中下图为重组载体pHISi-3mDRE-HS2/3mDRE-HA2的部分结构示意图。B显示转入不同的重组载体后，酵母细胞的生长状况。

图14显示MeCBF1的C端具有转录激活活性。A图为用于酵母杂交系统的各重组载体的部分元件示意图。B图为各酵母转化子的显色结果。

图15显示MeCBF1过表达拟南芥植株具有较高抗盐能力。图中所示两次独立重复实验的结果，Col-0为野生型，其余三个株系(14-19、19-10、13-3)为pCAMBIA1301-35S::MeCBF1独立的纯合株系。

图16显示MeCBF1过表达拟南芥植株(SM1-14-19、SM1-19-10、SM1-13-3)具有较低的Na⁺浓度和较高的K⁺浓度。

图17显示MeCBF1过表达拟南芥植株(SM1-14-19、SM1-19-10、SM1-13-3)具有明显的抗渗透胁迫能力。

图18显示MeCBF1过表达拟南芥植株具有较强的抗干旱能力。

图19显示MeCBF1过表达拟南芥植株(SM1-14-19、SM1-19-10、SM1-13-3)具有明显的抗氧化胁迫能力。

图20显示MeCBF1过表达拟南芥植株(SM1-14-19、SM1-19-10、SM1-13-3)积累较低的H₂O₂含量。

图21显示MeCBF1过表达拟南芥植株(SM1-14-19、SM1-19-10、SM1-13-3)在低温处理条件下具有较高的SOD(A)和CAT酶活性(B)。

图22显示Southern Blotting检测MeCBF1过表达转基因木薯的拷贝数。Lane1和Lane2证明相应植株为单拷贝株系(SM1-1，SM1-2)，Lane3证明相应植株为为多拷贝株系(SM1-3)。

图23显示MeCBF1过表达木薯植株诱导CBF-靶基因的表达情况。

图24显示MeCBF1过表达木薯植株中MeCBF1蛋白的表达量增加。

图25显示MeCBF1过表达木薯植株在培养基下培育时，具有较高的抗低温能力。

图26显示MeCBF1过表达木薯植株在大田培育时，表现出较高的抗低温能力。

图27显示MeCBF1过表达木薯大田苗具有较高的叶绿素(A)和脯氨酸(B)含量。

图28显示MeCBF1过表达木薯植株具有较高的抗氧化胁迫的能力。

图29显示MeCBF1过表达木薯植株具有较高的叶绿素含量。

图30显示MeCBF1过表达木薯植株具有较强的抗失水能力。

图31显示MeCBF1过表达木薯植株具有较强的复水能力。

图32显示MeCBF1过表达木薯植株具有较强的抗失水能力。

图33显示MeCBF1过表达木薯植株具有较强的抗干旱能力。

图34显示MeCBF1过表达木薯田间表型。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，首次分离到一种新的对于调节植物抗逆境能力有用的基因。本发明的基因可极好地应用于植物品种的改良，提高植物对于逆境的抵抗力。并且，本发明对延长植物种植时间、扩大植物种植面积(如种植北移)、提高植物产量有重要意义。在此基础上完成了本发明。

本发明中，对于适用于本发明的植物(或作物)没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，或适合于进行基因敲除的操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。

较佳地，所述的“植物”或“作物”包括但不限于：大戟科(Euphorbiaceae)植物、旋花科植物、茄科植物、十字花科植物、禾本科植物、木本科植物等。更优选的，所述的大戟科植物包括但不限于：木薯(Manihot esculenta)、橡胶、蓖麻、乌桕等；所述的旋花科植物包括但不限于：甘薯；所述的茄科植物包括但不限于：马铃薯；所述的禾本科植物包括但不限于：水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等；或所述的十字花科植物包括但不限于：拟南芥。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的提高植物抗逆境能力的多肽”、“分离的MeCBF蛋白”或“分离的MeCBF多肽”是指MeCBF蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化MeCBF蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本发明中，所述的MeCBF蛋白可以是MeCBF1蛋白和MeCBF2蛋白。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括MeCBF蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的MeCBF蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“MeCBF蛋白”指具有提高植物抗逆境能力或提高植物对盐的敏感性功能的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列的多肽。该术语还包括具有提高植物抗逆境能力提高植物对盐的敏感性功能的、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括MeCBF蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与MeCBF蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗MeCBF蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含MeCBF蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了MeCBF蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有MeCBF蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供MeCBF蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然MeCBF蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“MeCBF蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val;Leu;Ile	Val
Arg(R)	Lys;Gln;Asn	Lys
			Asn(N)	Gln;His;Lys;Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro;Ala	Ala
			His(H)	Asn;Gln;Lys;Arg	Arg
Ile(I)	Leu;Val;Met;Ala;Phe	Leu
			Leu(L)	Ile;Val;Met;Ala;Phe	Ile
Lys(K)	Arg;Gln;Asn	Arg
			Met(M)	Leu;Phe;Ile	Leu
Phe(F)	Leu;Val;Ile;Ala;Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr;Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp;Phe;Thr;Ser	Phe
Val(V)	Ile;Leu;Met;Phe;Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明MeCBF蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的蛋白质，但与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在80%以上，较好至少90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码MeCBF蛋白的多聚核苷酸。

本发明的MeCBF蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或MeCBF蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的MeCBF蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码MeCBF蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，MeCBF蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含MeCBF蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的MeCBF蛋白有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗MeCBF蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组MeCBF蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激MeCBF蛋白功能的多肽分子。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用MeCBF蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测MeCBF蛋白的转录产物。

本发明还涉及一种改良作物的方法，该方法包括提高所述植物中MeCBF基因的表达或蛋白活性。从而使得所述植物具有更优良的抗逆境(包括：冷环境、高盐环境或干旱环境)能力。

增加MeCBF基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过转入携带MeCBF编码基因的表达构建物使植株过表达MeCBF；或可通过用强启动子驱动从而增强MeCBF基因的表达；或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该MeCBF基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35S启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。

抑制MeCBF基因表达的方法也是本领域周知的。例如，可通过RNA干扰(RNAi)或基因沉默(敲除)的技术来实现。

作为本发明的一种优选方式，获得MeCBF高表达的植株的方法如下：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有MeCBF蛋白的DNA编码序列；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该MeCBF蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入所述MeCBF蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织；和

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。

其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。

本发明还包括MeCBF蛋白或其编码基因的激动剂。由于MeCBF的激动剂可调节MeCBF的活性或表达，因此，所述的MeCBF的激动剂也可通过对MeCBF的影响来提高植物的抗逆境能力，从而达到性状改良的目的。

所述的MeCBF的激动剂是指任何可提高MeCBF的活性、维持MeCBF的稳定性、促进MeCBF表达、延长MeCBF有效作用时间、或促进MeCBF的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于提高植物的抗逆境能力有用的物质。

在本发明的一个实例中，提供了一种MeCBF1基因，其基因组序列如SEQ ID NO:1所示，编码一个含有219个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO:3)。所述的MeCBF1基因可以为植物的抗逆境改良提供新的途径，因而具有巨大的应用前景。

在本发明的另一个实例中，提供了一种MeCBF2基因，其基因组序列如SEQ ID NO:2所示，编码一个含有231个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO:4)。所述的MeCBF2基因可以为植物的抗逆境改良提供新的途径，因而具有巨大的应用前景。

启动子及其应用

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变异体，该变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。所述变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

如本文所用，所述的“可操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

本发明提供一种启动子，所述的启动子选自下组：

(1)具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列的多核苷酸；或

(2)在严格条件下能够与(1)限定的多核苷酸序列杂交且具有诱导目的基因在逆境下表达功能的多核苷酸。

在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在80%以上，较好至少90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有诱导目的基因在逆境下表达的功能。

多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少60%，更佳地至少70%，更佳地至少80%，更佳地至少85%，更佳地至少90%(例如95%、96%、97%、98%、或99%)相同性的多核苷酸。

本发明的启动子是诱导目的基因在逆境下表达的，例如诱导目的基因在冷环境下表达。在本发明的实例中，本发明人发现，在本发明的启动子的指导下，可以使MeCBF1或GUS基因特异地在逆境诱导下表达。

本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子可以是外源(异源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(优选结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白。

本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加表达量，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。

此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。

任何一种前述的启动子和目的基因序列可被包含在构建物中，更具体地如重组载体中。

所述的重组载体一般包括可操作性连接的(通常从5’到3’方向)：引导目的基因转录的启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。

通常，所述的目的基因位于所述受逆境诱导表达的启动子的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp(优选的，小于1000bp；更优选的，小于500bp；最优选的，小于300bp)。

重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是：组织特异性的、组成型的或诱导型的。

包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、木薯抗逆基因的获得

木薯为热带和亚热带作物，对低温非常敏感。为了研究木薯cassava(Manihotesculenta Crantz)非生物胁迫调控机制，本发明人首先根据CBF保守序列-AP2结构域，试图克隆木薯类似序列，再通过5’和3’-RACE获得全长序列，但此方法未获成功。

接着，本发明人通过筛选木薯一个干旱处理后叶片和块根混合组织的cDNA文库(全长cDNA RIKEN文库序列参考文献Sakurai T,Plata G,Rodriguez-Zapata F,SekiM,Salcedo A,Toyoda A,Ishiwata A,Tohme J,Sakaki Y,Shinozaki K et al:Sequencinganalysis of20,000full-length cDNA clones from cassava reveals lineage specificexpansions in gene families related to stress response.Bmc Plant Biology2007,7:)，得到一条类似DREB1A/CBF序列，通过设计引物(序列：正义引物：atggatgttttctctcagtactc，反义引物：ttatacagaaaaactccataatgg)，本发明人分离到一个基因，命名为MeCBF1，其序列如SEQ ID NO:1所示。

由于CBF主要以基因家族形式存在于各物种中，因此以此序列为探针，经三种限制性内切酶(EcoRI、HindIII、XbalI)分别酶解木薯TMS60444(瑞士联邦理工大学)基因组，通过Southern印迹实验检测该基因的拷贝数，结果显示该基因可能有两个拷贝(图1)。根据同源序列，本发明人也克隆到了另一个MeCBF基因，命名为MeCBF2(克隆过程：我们用克隆MeCBF1的引物，PCR得到序列后连接到T-18载体后测序，在测序结果中发现主要是MeCBF1序列，但同时也有另一种序列，通过序列比对发现，这两条序列在引物位置只有几个碱基的差别，并且与MeCBF1同源性很高，因此命名为MeCBF2。正义引物：atggatgttttctctcagtactc，反义引物：ttatacagaaaaactccataatgg)。核苷酸和蛋白序列比对得知，这两个基因同源性很高，特别是在保守区域NLS(相对于SEQ ID NO:3氨基酸序列，第40-53位；相对于SEQ ID NO:4氨基酸序列，第52-65位)、AP2/EREBP(相对于SEQ ID NO:3氨基酸序列，第56-112位；相对于SEQ ID NO:4氨基酸序列，第68-124位)、DSW(相对于SEQ ID NO:3氨基酸序列，第114-117位；相对于SEQ ID NO:4氨基酸序列，第126-129位)，见图2。

实施例2、验证MeCBF蛋白是否参与木薯抗逆信号途径

为验证MeCBF蛋白是否参与了木薯抗逆信号途径。本发明人在4℃冷处理扦插一个月的木薯(TMS60444)苗0hr、2hr、4hr、9hr、25hr，通过Realtime-PCR检测MeCBF1的表达情况(引物序列为：正义引物：TTCTTGGTCGCCTGATACCTG，反义引物：GCTTCTTGGGATAGCTGGAAG)，发现MeCBF1在2hr时明显上调，之后4hr略微下降，9hr后又上升直至25hr(本实验已重复3次)，结果预示MeCBF受冷诱导表达，提示其参与冷信号途径，见图3A。

同时，本发明人观察到MeCBF1在4hr出现下调，提示这是该基因被某种机制反馈调控，也就是说，如果基因被诱导达到一定的量后，植物会启动反馈机制抑制该基因继续上调，然而冷胁迫仍然存在，所以为发挥抗冷的作用该基因会继续上调，而这时它被上调的程度往往会高于第一次。本发明人推测，该反馈机制的存在是由于CBF的高表达会对植株正常生长起负调控作用，因此出于保护自身的原因，此反馈机制会抑制CBF基因的过高表达。

然而，进一步还要验证MeCBF1是否也受其它胁迫调控。实验结果显示MeCBF1特异性受冷诱导表达，而对其它胁迫条件不响应。具体实验如下：本发明人先将20天的木薯(TMS60444)组培苗根部的培养基洗净，再用MS营养液预处理4-5天，之后，分别用250mM NaCl、25%PEG、100μM ABA、4℃处理6hr(本实验重复2次)，Realtime-PCR结果显示MeCBF1在盐胁迫和干旱胁迫和ABA条件下略微诱导，但是非常强烈的受冷诱导表达，这说明MeCBF1可能在冷胁迫条件下起主要作用(图3B)。同时，本发明人发现预先用80μM GA处理组培苗，之后再4℃处理，MeCBF1的表达量明显受到抑制，降至50%左右，这说明MeCBF1与GA信号途径存在一定的相互作用(crosstalk)。

GA预处理明显抑制MeCBF1基因的表达，这可能是植物生长与抵抗胁迫需要一定的平衡：如果植物需要茁壮生长，就会降低对恶劣环境的耐受力，而为了提高抗逆境能力，就必须以影响正常的生长为代价；换句话说，在适宜的环境条件下，植物会完成正常的生理周期，而在逆境环境下，植物会以牺牲生长为代价来抵抗周边不适环境以求生存。为进一步研究该基因的组织特异表达情况，本发明人分别提取了温室4-5株木薯苗的不同组织的RNA，这些组织包括非常幼嫩的顶芽(AP：apical buds)、幼叶(YL:young leaves)、成熟叶(第一片伸展叶)(ML:mature leaves)、老叶(第10或11片伸展叶)(OL:old leaves)、茎(ST:stem)、周边形成层(CA:cambia)及须根(RT:fibrousroot)等组织，通过定量PCR验证，该基因主要在茎中高表达，在成熟叶片及须根中也有微弱的表达，结果见图3C。此结果同样说明：在幼嫩组织如顶芽、幼叶，主要表达与生长相关基因，而与胁迫响应相关基因主要在成熟组织如茎、成熟叶等组织中表达。这也同样解释了为什么在胁迫条件下，生长能力强的幼嫩组织最先受到伤害，而成熟组织受胁迫表型却不明显。

同样的，本发明人也检测了MeCBF2在冷胁迫、多种逆境胁迫条件下的表达及组织特异性表达(引物：正义引物：atggatgttttctctcactaccc，反义引物：gcaaccgtgatcagataaagaaga)，发现MeCBF2有类似的表达谱特征，见图4。

实施例3、MeCBF基因的定位

在分析了MeCBF基因在多种胁迫条件及组织表达后，本发明人通过Genomewalking(试剂盒：GenomeWalker Universal Kit User Manual，货号为：Cat.No.638904)和TAIL-PCR(引物：扩增MeCBF1启动子引物：MeCBFL1-1：ttgcagcactgcaggtatcagg，MeCBFL1-2：agggagtgagtcagagtactgagag，MeCBFL1-3：agaagtagagagtgtgagtgtgtaag；扩增MeCBF2启动子引物(两次扩增结果)：MeCBF2-GSP1-1：CGAGGAGCACTGCAACCGTGATCAGAT，MeCBF2-GSP1-2：GGGTCAGGGTAGTGAGAGAAAACATCC； MeCBF2-GSP2-1 ：ATATACTCTATCTCTT TGGGCAGCTGT， MeCBF2-GSP2-2 ：ATGGAGGTTGGTCTATGAAGTAGAGGT)的方法克隆了MeCBF1的启动子(SEQ IDNO:5)和MeCBF2的启动子(SEQ ID NO:6)，分别约为1kb和1.5kb。通过分析(软件：PLACE,http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)得知，这两个基因的启动子区域存在多个与胁迫相关的顺式作用元件，包括与干旱胁迫(ACGT)、盐胁迫(ACGTG)、冷胁迫(CANNTG)等相关的基序，见表2，也预示着MeCBF1和MeCBF2参与植物胁迫响应。

表2、MeCBF1和MeCBF2启动子顺式作用元件分析

上表序列中，K表示T或G；M表示A或C；B表示T或C或G；Y表示C或T；N表示任意核苷酸；V表示A或C或G。

为验证木薯MeCBF蛋白是否也位于细胞核，本发明人构建了pA7-MeCBF1::GFP和pA7-MeCBF2::GFP载体，同时以pA7-GFP空载体(购自TAKARA)为阴性对照，以拟南芥AtCBF4基因为阳性对照，构建了pA7-AtCBF4::GFP阳性克隆。载体构建方法如下：设计5’端含有XhoI和3’端含有SpeI酶切位点的正向和反向引物，通过PCR方法，分别以木薯和拟南芥基因组为模板，分别得到目的条带，再分别与pMD18Tvector(购自TAKARA公司)连接，通过XhoI和SpeI双酶切验证目的片段已插入到T载体中。选取测序正确的克隆，测序过程中发现一个克隆插入的不是MeCBF1，而是MeCBF2，因此同时构建了MeCBF2瞬时表达载体)，通过XhoI和SpeI双酶切得到目的带后与pA7-GFP(购自Invitrogen公司，已经XhoI和SpeI酶切)经T4连接酶连接，连接液转化Top10大肠杆菌(购自Invitrogen公司)感受态后，挑单克隆，再经XhoI和SpeI酶切验证正确即为最终载体，可以用于洋葱定位实验。

引物序列如下：

MeCBF1/2-XhoI cactcgagATGGATGTTTTCTCTC(SEQ ID NO:7)

MeCBF1/2-SpeI gcactagTACAGAAAAACTCCATAATG(SEQ ID NO:8)

AtCBF4-XhoI cactcgagATGAATCCATTTTACTCTAC(SEQ ID NO:9)

AtCBF4-SpeI tcactagtacCTCGTCAAAACTCCAGAG(SEQ ID NO:10)

通过常规的基因枪轰击洋葱细胞(分离自商购的普通洋葱)表皮实验，将目标载体(即pA7-MeCBF1::GFP，pA7-MeCBF2::GFP载体和pA7-AtCBF4::GFP)转入细胞内。激光共聚焦显微镜观察到：MeCBF1和MeCBF2绿色GFP荧光信号除了位于细胞膜外，主要存在于细胞核，与拟南芥的AtCBF4具有类似的细胞定位，而pA7-GFP空载体的荧光信号则位于整个细胞内(图5A)。因此，确信MeCBF1和MeCBF2为核定位蛋白。

另外，将上述载体通过烟草原生质体瞬时转化实验(方法参见Sheen，J.2002，Atransient expression assay using Arabidopsis mesophyll protoplasts)，激光共聚焦显微镜观察到：MeCBF1和MeCBF2绿色GFP荧光信号存在于细胞核，与拟南芥的AtCBF4具有类似的细胞定位，而pA7-GFP空载体的荧光信号则位于整个细胞内(图5B)，因此可以确信MeCBF1和MeCBF2为核定位蛋白。同时，木薯MeCBF细胞核定位预示其功能是转录因子。

实施例4、MeCBF的生物学功能验证

为了进一步研究MeCBF的生物学功能，本发明人借助模式生物拟南芥简单快捷的遗传转化体系，在拟南芥中过量表达MeCBF1(pCAMBIA1301-35S::MeCBF1，简称SM1)。pCAMBIA1301-35S::MeCBF1的构建以及转基因拟南芥的制备方法如下：根据已知的MeCBF1核苷酸信息，设计引物(atggatgttttctctcactaccc(SEQ ID NO:11)和ttatacagaaaaactccataatgg(SEQ ID NO:12))，以冷处理TMS60444木薯苗cDNA为模板PCR扩增得到目的带(实施例1方法)，割胶回收后与pMD18T vector载体连接，连接液转化Top10大肠杆菌感受态后，挑单克隆再经EcoRI和HindIII酶切验证目的带已插入T载体后送去测序，选取测序正确，同时插入方向是SalI-ATG-MeCBF1-TAA-XbaI的克隆。将该克隆通过SalI和XbaI双酶切后与改造的pCAMBIA1301-35S(改造方法：在商业化的pCAMBIA1301载体(购自Invitrogen公司)的多克隆位点的一端接入35S启动子，另一端接入NOS终止子)(已经SalI和XbaI双酶切)连接，连接液转化Top10大肠杆菌感受态后，挑单克隆，再经XhoI和SpeI酶切验证正确即为最终载体，将载体转化农杆菌GV3101(购自Invitrogen)，验证正确后即可用于拟南芥转化。

除非另外说明，拟南芥转化采用经典的flower dip方法，该方法已广泛应用，可参考文献：Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using thefloral dip method(Nature Protocols1，641-646(2006)Xiuren Zhang，RossanaHenriques1，Shih-Shun Lin1，Qi-Wen Niu&Nam-Hai Chua)。

将野生型Col-0和过表达株系(SM1-13-3、SM1-14-19、SM1-19-10)的种子，经表面消毒后铺于基本培养基上。4℃春化3天后，水平或垂直置于22℃和10℃条件下培养，发现SM1株系生长状态明显好于野生型，见图6。测量20株30天(d)的幼苗鲜重、干重、叶长和叶宽，发现在正常培养条件下，转基因株系的鲜重和干重与野生型无明显差异；但在低温培养下，转基因株系的鲜重和干重都明显高于野生型，见图7。同时，水平低温培养条件下，转基因株系的叶长和叶宽都明显大于野生型，见图7。

经-6℃处理两天恢复培养5天后观察，发现野生型Col-0全部死亡，而转基因T2代植株则保持较高的存活率：SM1-19为86.7%，SM1-17为64.7%，见图8。

为进一步验证上述结果，本发明人用平皿实验重复此实验：在MS基本培养基上萌发约14天的小苗经-5℃处理11hr，恢复5天，发现Col-0大部分苗叶片发白，只有最中央叶片保留绿色；相比之下，转基因苗则大部分叶片呈绿色，保持良好生存活力，见图9。

本发明人还注意到，在正常培养条件下，转基因苗生长较野生型矮化，提示这与组成型表达MeCBF1有关。从这两个实验结果看，MeCBF1转基因苗表现出较野生型明显抗冷，说明MeCBF1为具有抗冷功能的蛋白，这在拟南芥体系中得到了较好的验证。

本发明人分析了MeCBF1蛋白的结构域，MeCBF1的主要结构域为NLS(相对于SEQ ID NO:3氨基酸序列，第40-53位)、AP2/EREBP(相对于SEQ ID NO:3氨基酸序列，第56-112位)、DSW(相对于SEQ ID NO:3氨基酸序列，第114-117位)，见图2B，这些结构域是蛋白发挥抗逆境作用的关键性位点。基于以上分析，本发明人建立了多个MeCBF1蛋白的变异体序列，依次如下：

基于MeCBF1蛋白(SEQ ID NO:3)序列，其中第11位氨基酸由L变异为I，获得MeCBF1-M1变体。

基于MeCBF1蛋白(SEQ ID NO:3)序列，其中第210位氨基酸由A变异为V，获得MeCBF1-M2变体。

基于MeCBF1蛋白(SEQ ID NO:3)序列，其中第1-3位氨基酸缺失，获得MeCBF1-M3变体。

基于MeCBF1蛋白(SEQ ID NO:3)序列，其中第210-214位氨基酸缺失，获得MeCBF1-M4变体。

基于MeCBF1蛋白(SEQ ID NO:3)序列，其中C末端添加4个氨基酸ATAA，获得MeCBF1-M5变体。

首先将SEQ ID NO:1所示的MeCBF1基因的CDS序列克隆入pCAMBIA1301-35S载体的多克隆位点中，获得含有该CDS的重组载体。然后根据以上设计的蛋白变体序列，利用常规的定点突变技术，分别对重组载体中编码相应位点氨基酸的碱基进行碱基突变或碱基缺失或碱基添加，获得含有相应的变体的重组载体。

将以上构建的重组载体转入农杆菌中，并转化拟南芥，分别获得拟南芥转基因植株M1-Line1、M1-Line2；M2-Line1、M2-Line2；M3-Line1、M3-Line2；M4-Line1、M4-Line2；M5-Line1、M5-Line2。

用平皿实验进行验证：在MS基本培养基上萌发约14天的小苗经-5℃处理11hr，恢复5天，观察植株性状。结果发现，与野生型(叶片发白)相比，转基因苗绝大部分叶片呈绿色，保持良好生存活力。

实施例5、MeCBF1的抗盐性

在拟南芥体系中，除了发现MeCBF1转基因植株有较明显的抗冷表型外，本发明人还观察了其在盐胁迫条件下的萌发率。

为验证SM1转基因苗在NaCl培养基上生长是否受影响，本发明人将转基因和野生型拟南芥种子先在正常培养基上萌发4天后转移至100mM NaCl培养基上，培养16天后发现，转基因苗叶片较伸展，生长状态也较对照好(图10)。以上结果证明，已正常萌发的SM1转基因苗较野生型有更好的抗盐性。

实施例6、MeCBF1和MeCBF2启动子在逆境下诱导表达

MeCBF1启动子含有多个胁迫诱导元件，同时MeCBF1mRNA受逆境诱导表达。为进一步验证MeCBF1启动子是否受逆境诱导表达，本发明人构建了MeCBF1promoter::GUS载体。载体构建方法如下：设计引物并两端加PstI和NcoI酶切位点，以TMS60444木薯苗基因组为模板PCR，获得目的带后割胶回收连接pMD18T-vector(购自TAKARA)，之后转化大肠杆菌感受态，得到阳性克隆，经测序正确，通过PstI和NcoI酶切连入pCAMBIA1303载体(获自CAMBIA公司)中，连接液转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，经验证正确后转化GV3101农杆菌，得到阳性克隆后按照拟南芥转化方法转化拟南芥。引物如下：

MeCBF1-P-P：GCCTGCAGTCAAAGTATATTTCGACTTC(SEQ ID NO:13)；

MeCBF1-P-N：TACCATGGAGAAGTAGAGAGTGTGAGTG(SEQ ID NO:14)。

将上述构建的载体进行拟南芥转化，拿到了至少3个T3代纯合系。转基因拟南芥苗经4℃处理不同时间后用于GUS染色，同时取未经冷处理的拟南芥苗GUS染色作为对照。

结果显示，MeCBF1启动子是受冷诱导表达的，在冷处理9-10h时表达最强，并且这种表达有组织特异性，在顶芽，幼叶和成熟叶的叶脉中高表达，而在根中未发现GUS信号(图11)。基于类似实验，MeCBF2启动子也是受冷诱导表达的。

启动子变体：

根据前述实施例3中的分析，MeCBF1的启动子(SEQ ID NO:5)和MeCBF2的启动子(SEQ ID NO:6)存在多个与胁迫相关的顺式作用元件。经分析其中与干旱胁迫(ACGT)、盐胁迫(ACGTG)、冷胁迫(CANNTG)等相关的基序是决定其功能所关键的序列。因此，本发明人根据这些关键序列，在这些序列保守的前体下改变所述启动子其它位点的序列，获得一些启动子变体如下：

基于MeCBF1的启动子(SEQ ID NO:5)序列，其中第6位碱基由G变异为C，第25位碱基由C变异为G，第318位碱基由T变异为A，获得MeCBF1-P1变体。

基于MeCBF1的启动子(SEQ ID NO:5)序列，其中第857位碱基由T变异为A，第495-497位ATA缺失，获得MeCBF1-P2变体。

基于MeCBF1的启动子(SEQ ID NO:5)序列，其中5’端加上碱基AGTCC，3’端缺失4个碱基获得MeCBF1-P3变体。

基于MeCBF2的启动子(SEQ ID NO:6)序列，其中第40位碱基由A变异为T，第243-246碱基缺失，第1465位由C变异为G，获得MeCBF2-P4变体。

基于MeCBF2的启动子(SEQ ID NO:6)序列，其中5’端添加4个碱基ATGG，第1576-1583位碱基缺失，获得MeCBF2-P5变体。

将上述启动子变体构建入MeCBF1promoter::GUS载体，构建方法如下：设计引物并两端加PstI和NcoI酶切位点，以基因组为模板PCR，获得目的带后割胶回收连接pMD18T-vector(购自TAKARA)，之后转化大肠杆菌感受态，得到阳性克隆，经测序正确，通过PstI和NcoI酶切连入pCAMBIA1303载体(获自CAMBIA公司)中，连接液转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，经验证正确后转化GV3101农杆菌，得到阳性克隆后按照拟南芥转化方法转化拟南芥。将以上构建的重组载体转入农杆菌中，并转化拟南芥，分别获得拟南芥转基因植株P1-Line1、P1-Line2；P2-Line1、P2-Line2；M3-Line1、P3-Line2；P4-Line1、P4-Line2；P5-Line1、P5-Line2。转基因拟南芥苗经4℃处理不同时间后用于GUS染色，同时取未经冷处理的拟南芥苗GUS染色作为对照。结果显示，MeCBF1启动子是受冷诱导表达的，在冷处理9-10h时表达最强，并且这种表达有组织特异性。

实施例7、在原核体系中MeCBF1有明显的抗盐和抗旱功能

利用原核重组蛋白高效表达体系，本发明人将MeCBF1基因构建到pET32a载体中。构建pET32a-MeCBF1载体所需引物如下：

MeCBF1-EcoR1：cggaattcATGGATGTTTTCTCTC(SEQ ID NO:15)

MeCBF1-HindIII：ccaagcTTcTACAGAAAAACTCCAT(SEQ ID NO:16)

通过以上引物克隆到目的带后经测序正确，通过EcoR1和HindIII酶切，连入pET32a载体(Novagen公司)，连接液转化BL21感受态，经筛选得到阳性克隆BL21(pET32a-MeCBF1)。

通过IPTG诱导重组蛋白的表达，分析重组菌(BL21)在含有不同浓度的NaCl和甘露醇(mannitol)的LB培养基上的生长情况。具体方法如下：分别挑取新活化的BL21(pET32a-MeCBF1)和对照BL21(pET32a)单克隆，接种于5mlLB(Kan)中，37℃振荡培养过夜。分别取过夜培养物按1%比例接菌到LB(Kan)培养基中(10ml)，直至OD为0.5-0.8(约培养2hr)，加诱导剂0.5mmol/L IPTG继续培养4h后用于胁迫实验。取含有不同浓度的NaCl和mannitol的抗性LB平板，将两种菌分别在平板上划线，倒置培养12h左右，观察这两种菌的生长情况。

结果发现，在对照LB培养基上，两种菌的生长状态类似，然而在0.4M NaCl、0.6M NaCl、0.4M mannitol和0.6M mannitol培养基上，BL21(pET32a-MeCBF1)生长明显好于对照BL21(pET32a)(图12)。

从该结果可以看出，在原核表达体系中，MeCBF1有明显的抗盐和抗旱功能。

本发明人同时验证了MeCBF1的变体MeCBF1-M1、MeCBF1-M2、MeCBF1-M3、MeCBF1-M4、MeCBF1-M5的抗盐和抗旱功能。将它们的编码基因构建到pET32a载体中，转化BL21，经过上述同样培养后，将菌在不同浓度的NaCl和mannitol的抗性LB平板上划线，倒置培养，观察菌的生长情况。结果发现，这些菌也能够正常生长，状态显著好于对照BL21(pET32a)。

实施例8、MeCBF1具有专一的DNA结合活性和转录激活活性

为了验证MeCBF1是否具有DNA结合活性，本发明人首先引物合成正常的和突变的DRE/CRT序列，分别命名为3wDRE-HS/3wDRE-HA和3mDRE-HS2/3mDRE-HA2。引物序列分别为：

3wDRE-HS：GTGAATTCTACCGACATTACCGACATTACCGACATTCTAGACT(SEQ ID NO:17)；

3wDRE-HA：AGTCTAGAATGTCGGTAATGTCGGTAATGTCGGTAGAATTCAC(SEQ ID NO:18)；

3mDRE-HS2：GTGAATTCTAaatcaATTAaatcaATTAaatcaATTCTAGACT(SEQ IDNO:19)；

3mDRE-HA2：AGTctagAATtgattTAATtgattTAATtgattTAGAATTCAC(SEQ ID NO:20)。

通过PCR方法将正反义引物序列退火成双链，分别命名为野生型DRE/CRT和突变型DRE/CRT，之后通过EcoRI，XbaI酶切连入pHISi载体(Clontech)中，测序验证重组载体构建正确，分别获得重组载体pHISi-3wDRE-HS/3wDRE-HA和pHISi-3mDRE-HS2/3mDRE-HA2，如图13A。

同样，设计引物MeCBF1-EcoR1：cggaattcATGGATGTTTTCTCTC(SEQ ID NO:21)，MeCBF1-SalI：gagtcgaccTACAGAAAAACTCCATA(SEQ ID NO:22)，以木薯基因组DNA为模板，通过PCR扩增到目的片段，连入pMDT18-vector载体(购自TAKARA)中，测序验证片段序列正确性。之后通过EcoRI和SalI酶切连入pGAD424载体(Clontech)中，获得重组载体pGAD424-MeCBF1，如图13A。

按照常规酵母转化方法，首先分别将重组载体pHISi-3wDRE-HS/3wDRE-HA和pHISi-3mDRE-HS2/3mDRE-HA2转入酵母菌株(菌株YM4271,购自Clontech)中，通过施加不同浓度的3-AT筛选压验证转化子对3-AT的本底抗性。实验证明，转化子可以在缺失His的培养基上生长，但添加15mM的3-AT即能抑制该菌的生长，说明获得的转化子有较低的本底抗性，可以用于进一步实验。

之后，本发明人将含有目的基因的pGAD424载体和空pGAD424载体分别转化含正确DNA序列(正常的DRE/CRT序列)和突变DNA序列(突变的DRE/CRT序列)的两种转化子中，在SD/-Leu,-His培养基培养2-3天，发现所有转化都长出克隆，但如果施加15mM的3-AT，则只有同时含有目的基因的pGAD424载体与正确DNA序列的pHISi载体可以长出克隆，其它的转化都未长出克隆，如图13B。上述结果说明，MeCBF1可以和正确的DRE/CRT基序相互作用，不能和突变的DRE/CRT基序相互作用，同样证明了这种互作的专一性。

为了验证MeCBF1是否具有转录激活活性，本发明人首先扩增了全长MeCBF1(SEQ ID NO:1，full CDS)，5’端-MeCBF1序列(SEQ ID NO:1中，第1-354bp，MeCBF1-N)和3’端-MeCBF1序列(SEQ ID NO:1中，第355-660bp，MeCBF1-C)，连入pMDT18-vector载体(购自TAKARA)中，测序正确后通过EcoRI和SalI酶切连入pGBKT7载体(购自Clontech)中，之后分别将其转化酵母菌株(酵母菌株:AH109,购自Clontech)，pGBKT7空载体为阴性对照。所有转化子都可以在SD/-Trp生长，但只有阳性转化子可以在三缺的培养板上(SD/-Trp，-His，-Ade)生长，同时在培养基上加X-Gal，阳性转化子可以显示蓝色。结果显示，全长MeCBF1及3’端-MeCBF1具有转录激活活性，而5’端-MeCBF1是没有激活活性的，如图14。

实施例9、MeCBF1过表达拟南芥植株具有较强的抗盐和干旱能力

将pCAMBIA1301-35S::MeCBF1转基因拟南芥种子消毒后点播在含NaCl的培养基上，培养2周后，发现转基因拟南芥植株叶片颜色偏绿，叶片数目多，在高度的盐胁迫条件下苗的存活率高，因此，转基因材料较野生型明显抗盐，如图15。

之后，本发明人检测了盐胁迫条件下转基因和野生型材料地上部分的Na⁺和K⁺浓度，结果如图16所示，发现转基因株系的Na⁺浓度较野生型低，而K⁺浓度较野生型高。这个结果说明转基因苗通过降低地上部分Na⁺浓度，增加K⁺浓度来对抗盐胁迫。聚乙二醇PEG处理可以引发渗透胁迫，模拟干旱胁迫。本发明人将pCAMBIA1301-35S::MeCBF1转基因拟南芥和野生型种子消毒后点播在正常培养基上，待其萌发两天后转移至含20%PEG的培养基上，检测过表达植株对于渗透胁迫是否具有抗性。

经过20天的培养，发现大多数转基因苗可以形成明显的子叶，而野生型生长受到明显的抑制，基本不能形成明显的子叶，如图17。因此，MeCBF1过表达拟南芥植株具有较强的抗渗透胁迫能力。

为进一步验证转基因植株的抗干旱能力，将温室生长约10天的野生型和转基因拟南芥植株进行干旱处理。种植前倒入相同质量的土壤，干旱处理开始阶段，选择生长一致的盆栽，测定土壤相对含水量，保持每个盆中土壤湿度一致后停止浇水。结果发现野生型和转基因株系虽然都可以抽苔完成生长周期，但是可以看到野生型干枯死亡，而转基因苗仍然存活，见图18。

实施例10、MeCBF1过表达拟南芥植株具有较强的抗氧化胁迫能力

DAB染液常用于检测H₂O₂的积累量。因此，本实施例中，本发明人采用DAB染色法检测MeCBF1过表达拟南芥植株的抗氧化胁迫能力。

本发明人将在正常培养基上生长14天左右的幼苗低温(10℃)处理7天后进行DAB染色。

DAB染色方法如下：在50ml离心管中加入10ml DAB染色液，取一定量用于染叶片，抽真空10min；将叶片浸没于DAB液体中，放置在光下，随时观察颜色变化，染色6-8h；显色时，倒掉染色液，加入95%乙醇，80℃脱色10min。

H₂O₂含量的测定如下：1)1g叶片+10ml0.1%预冷的TCA溶液，冰浴上研磨，匀浆液12000g，15min；2)1ml上清，添加1ml100mM磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.0)，2mlKI(1mol/L)；摇匀，静置片刻(10min)，390nm测OD值(紫外分光光度计)；3)根据标准曲线求得H₂O₂含量。

CAT酶和SOD酶活测定方法如下：

1)1g的样品加入5ml酶提取缓冲液(50mM磷酸缓冲液，1%PVP，1mM EDTA)研磨，4℃，10000rpm离心20min，取上清，将酶液转移至EP管中(约3-4ml)，置冰上；

2)CAT酶活测定：2ml反应体系=1.6ml酶提取缓冲液+0.2ml0.1mol/L酶液+0.2ml0.1mol/L的H₂O₂。加完H₂O₂立即计时，试管上下颠倒混匀，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测5min。以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(u)；

3)SOD酶活测定：显色反应：取透明度、质地相同玻璃试管5支，3支为测定、2支为对照，按表3加入试剂。

表3

按照表3混匀后，给1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应10min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，视酶活性高低适当调整反应时间)。当对照管变蓝，而样品管仍为黄色时，结束反应，测定各管的吸光度。

SOD活性＝(A0-AS)×VT/A0×0.5×FW×V1

A0：照光对照光管的光吸收值；AS：样品管的光吸收值；VT：样液总体积(ml)；V1：测定时样品用量(ml)；ＦW：样品鲜重(g)。

DAB染色检测结果，发现转基因苗和野生型都被染成褐色，但是转基因染色较野生型浅，如图19，说明在低温处理下，转基因材料积累的H₂O₂量可能少于野生型。本发明人检测了低温处理条件下，转基因和野生型材料的H₂O₂的积累量，发现无论在正常条件下还是低温胁迫条件下，转基因苗中积累的H₂O₂量明显少于野生型材料，如图20，从而验证上面的推测。

植物具有ROS清除机制，其中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)发挥重要作用。由于在低温处理条件下，转基因苗具有较低的H₂O₂含量，本发明人进一步检测了这两种酶的酶活性，发现在正常条件下野生型和转基因苗有相同的酶活性，但在低温处理条件下，转基因苗中SOD和CAT的酶活性高于野生型，如图21。该结果提示，由于这两种酶活性的提高，降低了H₂O₂含量，使转基因苗具有较高的抗氧化胁迫的能力。

实施例11、MeCBF1过表达木薯植株的获得

为了进一步验证MeCBF1的功能，本发明人将同样的过表达载体(pCAMBIA1301-35S::MeCBF1，简称SM1)转化了木薯，得到了3个独立的转基因株系，为验证MeCBF1过表达转基因木薯的拷贝数，通过Southern blotting方法鉴定出两个单拷贝株系(SM1-1，SM1-2)和一个多拷贝株系(SM1-3)，如图22。

在模式植物拟南芥中CBF介导的冷胁迫信号通路已研究的比较透彻，CBF作为早期冷胁迫响应的转录因子，能激活下游COR等基因的表达，这其中包括FAD7(脂肪酸去不饱和酶)、COR47(脱水素蛋白)、KIN1(抗冻蛋白)、COR15a(定位于叶绿体，保护叶绿体)、GolS3(肌醇半乳糖苷转移酶3)、Rd29a、COR6.6(cold regulated gene)。以这些基因的DNA和cDNA序列在木薯基因组中Blast比对，仅FAD7、COR47和GolS3找到木薯同源基因，分别命名为MeFAD7、MeCOR47和MeGolS3。

首先，本发明人检测了MeCBF1过表达木薯中这三个基因的表达情况，以Meactin为内参。从图23中可以看出，在木薯体系中同样存在着CBF信号通路，且MeCBF1过表达可以使这些下游基因的表达量上调。但是，从另一个方面可以看出，木薯中的CBF信号通路并不完善，因为在木薯基因组中，未找到许多在拟南芥中广为报道的下游基因的同源序列。这提示木薯不完善或者不强大的抗逆信号通路使木薯对低温非常敏感。

用于测定各基因表达情况的引物序列如下：

MeFAD7-F:CCATGATTGTGGTCATGGGAGC(SEQ ID NO:23)；

MeFAD7-R:GGTACCAGGGAAGTTTGTCCTC(SEQ ID NO:24)；

MeCOR47-F:CTGAGGAGCACCACAACAAGG(SEQ ID NO:25)；

MeCOR47-R:GGCGTAGCTACCTCTTCAGGC(SEQ ID NO:26)；

MeGolS3-F:GGCTTACGTGACTTTCTTGGC(SEQ ID NO:27)；

MeGolS3-R:CACTGTTGGCAGTAGCCGATC(SEQ ID NO:28)。

同时，本发明人以MeCBF1全长蛋白为抗原常规方法制备了抗MeCBF1的多克隆抗体。为验证过表达木薯中MeCBF1蛋白含量是否增加，提取了转基因植株和野生型对照中的核蛋白。Western blotting结果表明，在转基因木薯植株中MeCBF1蛋白有增加，并且在单拷贝植株的增加量多于多拷贝的株系，以组蛋白H3为内参，如图24。

实施例12、MeCBF1过表达木薯植株具有具有明显的抗冷能力

将继代T1代约10天的木薯组培苗放4℃光照培养箱中处理10天后恢复培养，发现转基因苗部分叶片保持绿色，芽点仍有活力，而对照C3叶片全部发白，芽点失去活力，在后续的培养中，转基因苗仍可以继续生长，而C3却不能，如图25。此结果说明MeCBF1过表达的木薯材料具有较高的抗冷能力，同样证明了MeCBF1蛋白也有同其他物种保守的抗低温功能。为进一步验证转基因材料的抗冷性，本发明人将转基因和对照材料种于田间，观察自然界的低温天气对其影响。由于今年入秋早，并且多次寒流袭击过实验所在地上海，实验从11月中旬开始，本发明人观察到转基因材料到11月底为止，叶片完整，顶芽很少焦化或完全健壮。相比之下，野生型对照材料(C3)则叶子枯黄焦化，顶芽大面积焦化，如图26。从大田试验看，木薯转基因材料也明显好于野生型，表现出较好的抗冷性。

本发明人观察田间木薯表型，发现野生型C3的顶部叶片变黄，而转基因植株的叶片保持较好的绿色，为量化叶片颜色的改变，取相同位置的转基因和野生型叶片，95%乙醇过夜抽提，紫外分光光度计测定叶绿素(Chl)含量。叶绿素含量测定方法如下：

叶片浸泡95%酒精在黑暗中12-24h提取色素，至叶片白色为止，分光光度计法测定OD663(nm)和OD646(nm)；计算公式如下：

Chl a=12.21*A663-2.81A646；

Chl b=20.13*A646-5.03*A663；

Chl a+Chl b=8.02*A663+20.2A646。

从测量结果可以看出，转基因木薯叶片的叶绿素含量明显高于野生型，如图27A。

同时，由于转基因材料较野生型抗冷，本发明人检测了叶片中的脯氨酸含量，脯氨酸含量的测定方法如下：

(1)脯氨酸提取：取不同处理的剪碎混匀待测叶片0.5g(干样根据水分含量酌减)，分别置于大试管中，加入5ml3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min。冷却至室温后，以3000rpm离心10min；

(2)吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和4ml显色液，于沸水浴中加热60min，下一步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色。

(3)结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数。

脯氨酸(μg/g FW或

DW) = \frac{C \times \frac{V}{a}}{W}

式中，C：提取液中脯氨酸浓度(μg)，由标准曲线求得；

V：提取液总体积(ml)；

A：测定时所吸取的体积(ml)；

W：样品重(g)。

计算：脯氨酸(microg·g-1·FW)=(C*V/a)/W=C*2.5/W

C：浓度，a:2ml，V：5ml，W：0.5000g。

脯氨酸含量的测定结果显示，转基因材料的叶片含有较高的脯氨酸，如图27B。这提示转基因材料的细胞质中有较高的渗透调节物质(如脯氨酸等)，从而使其具有较强的抗冷胁迫的能力。

实施例13、MeCBF1过表达木薯植株具有具有明显的抗氧化胁迫的能力

甲基紫精(MV)可以诱导植物氧化，引起叶片叶绿素含量降低，表现出叶片发白，为一种量化指标。本实施例采用MV处理木薯过表达植株，以观察其抗氧化胁迫的能力。MV染色方法如下：玻璃平皿放上2张滤纸，加入25ml100uM的MV工作液，将叶片放置在液体中，20持续光照条件放置，观察叶片变化。

100uM MV处理MeCBF1过表达木薯组培叶片24h后，本发明人发现转基因苗可以更强的抵抗MV处理，表现出叶片偏绿，而野生型C3则明显变白，如图28。

本发明人测量了MV处理前和MV处理后叶片的叶绿素含量。结果显示，MV处理后，野生型叶绿素含量明显降低，而转基因植株的叶绿素含量明显高于野生型(p<0.01)，如图29。

实施例14、MeCBF1过表达木薯植株具有具有明显的抗失水能力

将离体的组培苗叶片置于干燥的滤纸上，每隔一段时间拍照记录叶片失水情况，发现转基因木薯失水速率较野生型慢，在同样的处理时间下，野生型更容易失水萎蔫如图30。

经过1小时的离体干旱处理，转基因与野生型的叶片都明显失水萎蔫，之后在平皿中加等量的水，观察叶片的复水能力。结果发现，转基因植株的叶片基本恢复伸展，如脱水处理前的表型，而C3仍然萎蔫，复水效果较慢，如图31。

为量化叶片的失水速率，每15分钟对叶片称重，按照(FW0-FW1)/FW0公式计算特定时间点的失水速率，绘制曲线，如图32。可以看出，转基因苗失水速率较野生型低。

实施例15、MeCBF1过表达木薯植株具有具有较强的抗干旱能力

温室生长约3个月的木薯扦插苗，WT和转基因材料生长状态良好。停止浇水3周后，WT木薯叶片多变白干枯，并且大部分已脱落；而过表达株系底部仅有部分叶片干枯，顶部叶片仍呈现绿色，如图33。

同时我们发现，温室生长3个月木薯扦插苗，每3天浇等量且过量的含200mMNaCl的盐水，3周后，本发明人发现，过表达木薯的生长状态明显好于野生型，表明其有较强的抗盐能力。

2011-2012年度将MeCBF1过表达木薯种于转基因试验田，观察转基因植株表型及块根产量。经过约6个月的栽培，过表达木薯株高与块根产量与野生型相似，见图34。

综上实施例，本发明人从木薯基因组中分离得到了两个新的MeCBF蛋白，分别为MeCBF1和MeCBF2，通过冷胁迫处理下的MeCBF基因表达量变化及启动子顺式作用元件分析，说明MeCBF1和MeCBF2参与了植物抗逆境信号途径。细胞定位和酵母实验证明了MeCBF1可能以转录因子的活性发挥功能。转基因实验也证明了MeCBF1过表达植株较强的抗胁迫能力，如：低温，盐，渗透和氧化等，进一步验证了此蛋白的功能。同样的，本发明人也在木薯中过表达了MeCBF1，胁迫处理及生理实验证明MeCBF1过表达的木薯植株具有较高的抗冷，氧化和失水能力。本发明通过在拟南芥和木薯两套体系中证明了MeCBF1蛋白具有抗冷，氧化等多种胁迫的能力，为获得抗冷能力提高的转基因木薯提供了新的策略与可能。同时对MeCBF1分子机制的研究也为研究木薯及热带作物低温响应的分子机制奠定了坚实的基础。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽是如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，选自下组：

(1)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；或

(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷酸。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2-3中任一项所述的多核苷酸。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体；所述的宿主细胞是原核细胞。

6.一种制备植物的方法，其包括将权利要求2-3中任一项所述的多核苷酸转入植物中。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有权利要求2-3任一所述的多核苷酸；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使权利要求2-3任一所述的多核苷酸转入植物细胞。

8.一种权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。

9.权利要求1所述的多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用于提高植物抗逆境能力或制备提高植物抗逆境能力的物质。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的逆境是冷环境、高盐环境、干旱环境、氧化环境、渗透环境。

11.如权利要求9所述的用途，其特征在于，还用于：

降低植物地上部分的Na⁺浓度，增加K⁺浓度；

降低植物中积累的H₂O₂量；

提高植物中超氧化物歧化酶或过氧化氢酶的酶活性；

提高植物中CBF信号通路基因的表达；

提高植物中叶绿素含量；

提高植物中脯氨酸含量；

提高植物的抗失水能力；

改善植物在冷环境下的生长状态；

提高植物在冷环境下的生物量；

提高植物在冷环境下的叶长叶宽。

12.一种提高植物抗逆境能力的方法，其特征在于，所述方法包括：提高植物中的权利要求1所述的多肽的表达或活性。