CN113005126A - DgSPL3基因及其克隆方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提供一种能够提高鸭茅生长过程中对高温、盐胁迫和干旱的抗逆能力，同时可以改变其开花期的DgSPL3基因。该DgSPL3基因的cDNA全长序列如序列表SEQUENCE ID NO.1所示。利用转基因技术将本发明所述的DgSPL3基因在鸭茅中增强表达，可以针对性的提高鸭茅的耐高温性、抗旱性和耐盐性，改变其开花期，缩短育种时间，提高育种效率。适合在生物技术领域推广运用。

Description

DgSPL3基因及其克隆方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种DgSPL3基因及其克隆方法和应用。

背景技术

鸭茅(Dactylis glomerata L.)又名果园草(Orchardgrass)，属禾本科(Poaceae)早熟禾亚科(Festucoideae)鸭茅属(Dactylis)，是一种世界范围内广泛栽培的多年生冷季型丛生牧草。鸭茅具有生长速度快，生物产量高，糖分含量高，耐荫性强和适应范围广等特点。作为经济价值排名前四的多年生牧草，鸭茅对于世界温带地区草食动物肉类和乳制品生产有重要意义。除作为优良的牧草外，鸭茅也是我国林下草地和人工草地重要的优良混播禾草之一，主要适合于西部退耕还草和草场建设，对退耕还林还草和林-草复合建植等具有重要的积极意义。鸭茅开花期与鸭茅生物产量和质量密切相关，是鸭茅重要的农艺性状之一。实际牧草生产中，鸭茅其中一个主要用途便是与豆科牧草进行混播。因此选取不同开花期的鸭茅品种用以匹配不同成熟期的豆科牧草，从而在混播草地收割期达到最大化产量与最优良品质成为国内外鸭茅研究生产利用的热点方向。同时，选择早熟、中熟或晚熟鸭茅品种，配合具有对应成熟期的豆科牧草，可以大大改善混播草地牧草的季节分布和营养动态水平，提高混播草地综合生产性能和利用效率。

鸭茅是异化授粉牧草，其遗传转化困难，生长周期长，抗旱性、耐高温能力和耐盐性均较差，基因功能验证较为滞后，如何对鸭茅的品质改良是本领域亟需解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够提高鸭茅生长过程中对高温、盐胁迫和干旱的抗逆能力，同时可以改变其开花期的DgSPL3基因。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该DgSPL3基因的cDNA全长序列如序列表SEQUENCE ID NO.1所示。

进一步的是，所述DgSPL3基因编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQUENCE IDNO.2所示。

本发明还提供了一种DgSPL3基因的克隆方法，其克隆方法包括以下步骤：

1)、材料选择：选取鸭茅的幼嫩叶片作为提取样本；

2)、鸭茅总RNA的提取：将步骤1)得到的鸭茅幼嫩叶片采用植物总RNA提取试剂盒提取鸭茅总RNA；

3)、反转录；首先，将步骤2)RNA提取得到的鸭茅总RNA利用1％琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测得到完整的鸭茅RNA，并使用超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度，接着选用PrimeScript II 1st Strand cDNASynthesis Kit试剂盒进行反转录反应；

4)、PCR扩增：以鸭茅参考基因组为模板，通过序全长设计引物，

上游引物:DgSPL3:5’-TGTGCCGCTACCGCCAGAAGAGTGGA-3’；

下游引物:DgSPL3R:5’-GGCGGGTGAAGTCGGCCTACGTGACT-3’)

以cDNA为模板进行扩增，使用PrimeSTAR Max DNAPolymerase试剂盒进行进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应体系如表1所示：

表1 PCR扩增反应体系表

PCR扩增反应过程如下：在反应条件为98℃预变性4min；然后98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃运行10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳分离得到PCR产物；

5)、克隆；首先，将PCR产物在紫外灯下切胶，并采用MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行凝胶回收纯化，接着采用DNAA-TailingKit在目的片段DNA的3’末端添加“A”尾得到DNA溶液，然后取得到的DNA溶液4μl，加入1μlpMD18-T载体和5μlSolution混匀，在16℃反应30min，反应完成后将上所述溶液加入100μlDH5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃加热45s后，再在冰上放置1min，再将转化好的感受态细胞中加入890μlSOC培养基，37℃培养60分钟，涂于含有氨苄(Amp)的LB培养基上倒置过夜培养，培养后挑选单菌落培养并用菌液PCR验证目的片段是否插入成功，将目的片段插入成功的目的条带利用测序引物M13进行双端测序得到DgSPL3基因的cDNA全长序列，如序列表SEQUENCEID NO.1所示。

本发明还发现DgSPL3基因在促进鸭茅37℃高温胁迫或盐胁迫或干旱胁迫中的应用。

本发明还发现DgSPL3基因在改变鸭茅开花期中的应用。

本发明的有益效果在于：利用转基因技术将本发明所述的DgSPL3基因在鸭茅中增强表达，可以针对性的提高鸭茅的耐高温性、抗旱性和耐盐性，改变其开花期，缩短育种时间，提高育种效率。

附图说明

图1为酵母初步验证DgSPL3功能图；

图2为亚细胞注射烟草叶片瞬时表达结果图；

图3为转DgSPL3拟南芥盐胁迫实验对照图

图4为转DgSPL3拟南芥与对照的正常生长发育试样对照图

图5为过表达DgSPL3鸭茅植株盐胁迫下游离脯氨酸含量图；

图6为过表达DgSPL3鸭茅植株盐胁迫下CAT和POD活性图

图7为过表达DgSPL3鸭茅植株盐胁迫后的表型对照图；

图8为过表达DgSPL3鸭茅阳性植株山梨醇模拟干旱胁迫下游离脯氨酸含量图；

图9为过表达DgSPL3鸭茅植株山梨醇模拟干旱胁迫下CAT和POD活性图；

图10为山梨醇模拟干旱胁迫后鸭茅的表型对照图；

图11为过表达DgSPL3鸭茅阳性植株37℃高温胁迫下游离脯氨酸含量图；

图12为过表达DgSPL3鸭茅阳性植株37℃高温胁迫下CAT和POD活性图；

图13为经过37℃高温胁迫后恢复正常生长15天后鸭茅的表型对照图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

该DgSPL3基因片段全长1,431bp，DgSPL3基因的cDNA全长序列如下所示：ATGGGCTCATTCGGGATGGACTGGAACCAGAAGAGCTCGGTGCTGTGGGACTGGGAGAATTTGCCGCCGCCGATAGGCGTGAATGCGGATGAGCCCAAGAATGGGATGCAGGCTGACCCAAGATTTGCAGCTGCCATGGGGAATGAAGCAATCCACTCTTCTGGCGGTAGCGGCACTTTCTCGTCCAGCTCGGAGATGGGATATGGTTCTTCCAAGAGCTCCATGTCCGCGTCGATTGATTCCTCGTTCAAGGAGGGGAACAGCATTGAATTCAGATTTGCACCTGCCAAAAACCCTGCTGATAGGAGCACCAGCAAAAATACTGAGCTGGGTAAAGTTAATAACACCAGGACTGGGACGTCTACTTCATCGGCAGTAGCAGTGAGCAGTGGAGAGCCGGTGATCGGCCTGAAGCTTGGAAAGAGAACTTACTTCGAAGATGTCTGTGGAGGGCAGAATGTAAAGAGCTCACCGTCTGGTGTGAGTGCGCCAAACCAGTCTCCTGCTTTGGTCAAGAAGGCAAAGGTGGATCAACATAAGCCGCATAATTCATATTGTCAAGTTGAAGGCTGCAAAGTCGATCTCTCCTCTGCCAAAGACTACCATCGAAAGCACAGAGTCTGTGAACTTCATGCTAAGGCTCCCAAAGTTATTGTCGCTGGTCTGGAGCGACGCTTTTGCCAGCAGTGTAGCCGGTTTCATGCTTTAGGCGAGTTTGACCAGATAAAGCGAAGCTGCCGTAGGCGTCTCAACGATCATAATTTCCGCAGACGGAAGCCACAGCCAGAAGCAATTTCATTCAGTTCATCAAGGATGTCTACGATGTTTTATGATGCAAGGCAACAGACAAGCCTTCTATTTGGTCAGGCTCCATATGTTCAAATGAGAGGCTGTGCAAGTTCTTCATGGGATGACCCAGGAGGCTTCAAATTTACAGAAACAAAAGCTTCTTGGTTAAAGCCAACAACTGCTGCGCGTATTGATGGGATGCATTTATCTAGTGAGCAGGTGTCGGACAATATTGTGCCCATTATGTCGCATGGTGCACATCATGGTTTTGATGGGTTCATGGCATTCAAGGGAACTGGTGCAAAGTTCCTTAATCAAGGCGTCGAAGCTTCTGCTGTCGCTTCCGACTCCAACGGCGCCCCAGATCTTCAGCGTGCTCTCTCTCTTCTGTCAAGCAACTCAGTGGGTGCTGCAAACCTCCAGCAAAGTCACCAGATACACCCCAGGGTCGCGACCACTGCCGGCGTCCCCAACCCTGCGATGCACGCACTGGGCTCATCGCCAGGGCTCTGGCTAGACTGCCCGCCACTCGATGATCACCCGCGGTTCCAGGTTTTTGACCGTTTGGGCGGCCACGACAGTGAGCTCCAGCTCCCAAAATCTACCTACGACCATGCCGCCCACTTCAGCCGGATGCACTGA

进一步的是，所述DgSPL3基因编码的蛋白序列共有476个氨基酸，其氨基酸序列如下所示：

MGSFGMDWNQKSSVLWDWENLPPPIGVNADEPKNGMQADPRFAAAMGNEAIHSSGGSGTFSSSSEMGYGSSKSSMSASIDSSFKEGNSIEFRFAPAKNPADRSTSKNTELGKVNNTRTGTSTSSAVAVSSGEPVIGLKLGKRTYFEDVCGGQNVKSSPSGVSAPNQSPALVKKAKVDQHKPHNSYCQVEGCKVDLSSAKDYHRKHRVCELHAKAPKVIVAGLERRFCQQCSRFHALGEFDQIKRSCRRRLNDHNFRRRKPQPEAISFSSSRMSTMFYDARQQTSLLFGQAPYVQMRGCASSSWDDPGGFKFTETKASWLKPTTAARIDGMHLSSEQVSDNIVPIMSHGAHHGFDGFMAFKGTGAKFLNQGVEASAVASDSNGAPDLQRALSLLSSNSVGAANLQQSHQIHPRVATTAGVPNPAMHALGSSPGLWLDCPPLDDHPRFQVFDRLGGHDSELQLPKSTYDHAAHFSRMH

本发明还提供了一种DgSPL3基因的克隆方法，其克隆方法包括以下步骤：

1)、材料选择：选取鸭茅的幼嫩叶片作为提取样本；

2)、鸭茅总RNA的提取：将步骤1)得到的鸭茅幼嫩叶片采用天根(北京)生化科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒提取鸭茅的RNA，操作参考内附说明书进行；

3)、反转录；首先，将步骤2)RNA提取得到的鸭茅RNA利用1％琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测得到完整的鸭茅RNA，并使用超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度，接着选用TaKaRa公司的PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录反应，操作流程参考内附说明书；

4)、PCR扩增：以鸭茅参考基因组为模板，通过序全长设计引物，

上游引物:DgSPL3:5’-TGTGCCGCTACCGCCAGAAGAGTGGA-3’；

下游引物:DgSPL3R:5’-GGCGGGTGAAGTCGGCCTACGTGACT-3’)

以cDNA为模板进行扩增，使用TaKaRa公司的PrimeSTAR Max DNA Polymerase试剂盒进行进行PCR扩增反应，操作流程参考内附说明书，所述PCR扩增反应体系如表1所示：

表1：PCR扩增反应体系表

PCR扩增反应过程如下：在反应条件为98℃预变性4min；然后98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃运行10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳分离得到PCR产物；

5)、克隆；首先，将PCR产物在紫外灯下切胶，并采用TaKaRa公司的

MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行凝胶回收纯化，具体操作参考内附说明书，接着采用TaKaRa公司的DNAA-TailingKit在目的片段DNA的3’末端添加“A”尾得到DNA溶液，然后取得到的DNA溶液4μl，加入1μlpMD18-T载体和5μlSolution混匀，在16℃反应30min，反应完成后将上所述溶液加入100μlDH5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃加热45s后，再在冰上放置1min，再将转化好的感受态细胞中加入890μlSOC培养基，37℃培养60分钟，涂于含有氨苄(Amp)的LB培养基上倒置过夜培养，培养后挑选单菌落培养并用菌液PCR验证目的片段是否插入成功，将目的片段插入成功的目的条带利用测序引物M13进行双端测序得到DgSPL3基因的cDNA全长序列，如序列表SEQUENCE IDNO.1所示。

为初步鉴定DgSPL3的功能，选择前期克隆的DgSPL3片段，以Hind III和Xba I为酶切位点进行酶切，采用诺唯赞生物的ClonExpress Ultra One Step Cloning kit试剂盒将酶切后的片段连入线性化后的pYES2酵母表达质粒。将重组pYES2-DgSPL3质粒通过CarrierDNA转入酿酒酵母株系(INVScI,MATa his3Δ1leu2 trp1-289 ura3-52/MATαhis3Δ1leu2trp1-289ura3-52)，以空白pYES2质粒为对照。转化后的酵母以含20mg/mL葡萄糖的SC-Ura培养基于28℃培养48h，选取单克隆进行PCR确认，引物为：

正向引物DgSPL3-F：ttggtaccgagctcggatccATGGAGTGGACGGCCCCG

反向引物DgSPL3-R：acatgatgcggccctctagaTCAATTCATCCGGTTTAGACCG

选取阳性转化酵母于含2mg/mL半乳糖的液体SC-Ura培养基培养后，150rpm离心后以10的倍数进行稀释，稀释后的酵母悬浮液分别涂布于含有3M山梨醇和1.5M NaCl的SD-Ura培养基上28℃培养，选择未添加山梨醇和NaCl的培养基涂布悬浮液于37℃培养进行热胁迫。图1为酵母初步验证DgSPL3功能图，由图1所示的结果表明，DgSPL3可以提高酵母对盐胁迫、山梨醇模拟的干旱胁迫以及高温胁迫的耐受性。

为了了解DgSPL3在细胞中发挥作用的部位，第一步：以DgSPL3基因序列设计引物DgSPL3-EcoRI和DgSPL3-SalI从cDNA中扩增出目的基因DgSPL3，引物序列为：

正向引物DgSPL3-EcoRI：GAATTCATGGAGTGGACGGCCCCGAA

反向引物DgSPL3-SalI：GTCGACATTCATCCGGTTTAGACCGAAGAAA

第二步：将亚细胞定位载体pYBA1132质粒用EcoRI和SalI酶切处理并回收，回收产物与第一步中扩增出的目的基因DgSPL3用DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌后涂抗性平板，并利用引物DgSPL3-EcoRI和DgSPL3-SalI进行菌液PCR扩增筛选阳性克隆，挑选个阳性克隆送测序；PCR扩增体系如表2所示：

表2：PCR扩增体系

PCR程序：98℃3min，94℃30sec，58℃30sec，72℃2min，72℃8min，25℃1min。

第三步：烟草注射及亚细胞定位观察

(1)将质粒电击转化农杆菌GV3101，挑单克隆28℃过夜摇菌；

(2)将菌液4000rpm离心5min。

(3)用侵染液(含10mM MgCl2，50mM MES(pH5.6)，100uM乙酰丁香酮)悬浮菌体，调节OD值至1-1.5；

(4)注射一个月大小的烟草叶片背面，25℃黑暗培养48h；

(5)共聚焦观察荧光信号；

第四步：结果与分析；通过注射烟草叶片瞬时表达后，在激光共聚焦显微镜下观察DgSPL3荧光发现细胞核核光信号明显，图2为亚细胞注射烟草叶片瞬时表达结果图，由图4可知，荧光发现细胞核核光信号明显可确定该蛋白定位于细胞核。

实施例1：转入拟南芥及功能验证

A、过表达载体构建：目的基因扩增：根据载体pCAMBIA121的图谱设计KpnI-XbaI为插入位点并合成引物，引物序列为：

上游引物：P1226F:5’-TGCTCTAGAATGGAGTGGACGGCCCCG-3’(保护碱基-XbaI-扩增引物)；

下游引物：P1254R:5’-CGCGGATCCATTCATCCGGTTTAGACC-3’(保护碱基-BamHI-扩增引物)，使用高保真酶扩增得到目的片段，扩增体系见表3；

表3：PCR扩增体系

PCR反应程序：98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸1min10s，30个循环；68℃延伸5min。PCR产物在1.8％琼脂糖凝胶电泳，电压150V，电泳15min，照相记录电泳结果，在紫外灯下观察，迅速切下目的条带，用胶回收试剂盒(OMEGA)回收目的片段，具体方法按试剂盒说明书进行；

B、超表达载体的构建

1)将用XbaI-BamHI酶切的目的基因与同样用XbaI-BamHI酶切的载体pBI121进行体外连接，连接体系见表4：

表4：目的基因与pPic9K重组质粒连接体系

吸打混匀，离心后加入矿物油；16℃连接2h；连接完后放入4℃冰箱中保存过夜；

2)连接产物的转化

a、超净工作台灭菌30min，从-70℃超低温冰箱中取出100μl的感受态细胞，放于冰上，预冷10min；

b、取出一个Ep管，标上记号，置于冰上，加入80μl的感受态细胞(冰上操作)；

c、加入10μl的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；

d、冰浴结束后，放在42℃的恒温水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴2min；

e、吸500μl不含Kan+的LB液体培养液到Ep管中，混匀，置于摇床中160rpm，37℃摇1h；

f、取出摇床结束的Ep管，2000～3000rpm离心5min，弃上清300μl，剩余的菌液轻柔吸打混匀后加在含Kan+的LB固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；37℃恒温培养箱中培养16～20h，挑取单克隆，PCR验证是否成功转入，选择阳性菌液提取重组质粒；

C、拟南芥转化

(1)农杆菌转化：-80℃冰箱取出感受态GV3101，冰上解冻2-3min加入3-5ul重组质粒，冰上放置5min。将EP管置于液氮中速冻1min，37℃水浴5min，冰浴2min，加入800ul无抗液体LB培养基，28℃摇床150rpm/min培养3h，8000rpm/min离心1min，弃上清600ul后，悬浮，涂于固体LB培养基上(含50ug/ml Kan和50ug/ml利福平)，28℃培养箱倒置培养48h。挑取单克隆，使用基因特异性引物及载体通用引物PCR鉴定；

(2)拟南芥种植：选择吸水性好，土质松软的蛭石配合基质(2：1)作为拟南芥种植土壤，选择直径9cm的花盆，每盆播种50-100颗，播种以后浇水并覆膜，给植株的生长提供一个湿润的环境，拟南芥室生长条件为光照强度为2000-3000lx，光照时间14h/day，湿度40-60％；

(3)移栽：播种10-15天，待拟南芥幼苗长至四叶时期开始移栽，每盆4-5棵；

(4)去顶：移栽后每3天浇一次水，每两周添加一次营养液，约25-30天后，在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生，适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果；

(5)配制浸染液：在5％的蔗糖溶液中重悬农杆菌使OD＝0.8，为了保持蔗糖溶液的新鲜，可以现配现用，无需灭菌，100-200ml浸染2-3个小盆植株，400-500ml浸染2-3个花盆(9cm)植株，在浸染之前加入表面活性剂silwet-77至浓度0.05％(500ul/L)；

(6)浸染：将盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在农杆菌悬浮液中20-30s，同时轻轻旋转；

(7)暗培养：将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态暗室培养24h；

(8)浸染后培养：隔天浇水，保证水分充足即可；

(9)种子收集：种子成熟，角果自然开裂后可以收种子；

(10)转基因种子筛选：在含有卡纳霉素抗生素的平板上培养浸染后所得种子，40mg的种子大约200颗于含卡纳霉素10-50μg/ml的0.5×MS培养基上春化2天，之后在持续光照条件下培养7-10天。根据生长状况判断是否为转基因种子，成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出4片以上真叶，非转基因种子不能正常生长，仅能长出2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10天以后死亡；

(11)转基因植株转土栽培：转基因种子在MS+潮霉素平板上萌发2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养。具体方法如下：取阳性植株叶片进行基因组DNA的提取并使用载体植物筛选标记卡纳霉素基因序列引物：

上游引物卡纳霉素F：5’-GTGCAATCCATCTTGTTCAATCAT-3’；

下游引物卡纳霉素R：5’-GTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG-3’)

进行PCR验证，PCR扩增体系如表5，PCR反应程序：98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。

表5：PCR扩增体系

待T3代转基因植物生长至3对叶时期，分别对拟南芥转基因植株和未转基因野生型拟南芥植株进行250mM NaCl胁迫处理14天。图3为转DgSPL3拟南芥盐胁迫实验对照图，由图3的对照图表明与野生型拟南芥对照相比，转DgSPL3基因拟南芥株系耐盐能力明显高于野生型拟南芥对照，表明鸭茅DgSPL3基因的过量表达可以提高植物的耐盐能力。

将T3代拟南芥于正常条件下培养时，转入鸭茅DgSPL3基因的拟南芥开花期明显提前7-10天，图4为转DgSPL3拟南芥与对照的正常生长发育试样对照图，由图4表明DgSPL3参与植物的开花期调控，有助于改善牧草的生长发育性状。

实施例2：鸭茅遗传转化

A、鸭茅组织培养：将鸭茅成熟种子置于75％乙醇中浸泡1min，蒸馏水洗净残留在种子表面的乙醇，于4℃蒸馏水浸泡24h。超净工作台中将鸭茅种子于75％酒精中灭菌5min，无菌水冲洗3遍后，1.1％NaClO灭菌处理30min，接种于愈伤诱导培养基，培养基配方为SH基础盐培养基+2.0mg·L–1 CPA+0.1mg·L–1 6-KT+30μmol·L–1 dicamba+0.5mg·L–1 2,4-D。鸭茅成熟种子消毒处理完成后，于诱导培养基25±2℃暗培养，12～16d后减去幼芽继续培养，接种3～4周后选择胚性愈伤用于遗传转化；

B、鸭茅遗传转化选择根癌农杆菌菌株为GV3101，载体为pBI1300,XbaI-BamHI酶切的目的基因与同样用XbaI-BamHI酶切的载体pBI1301进行体外连接，体外连接的方法与实施例1的步骤B中的体外连接方法相同；-80℃冰箱取出感受态GV3101，冰上解冻2-3min加入3-5ul重组质粒，冰上放置5min；将EP管置于液氮中速冻1min，37℃水浴5min，冰浴2min，加入800ul无抗液体LB培养基，28℃摇床150rpm/min培养3h；8000rpm/min离心1min，弃上清600ul后，悬浮，涂于固体LB培养基上(含50ug/ml卡纳霉素和50ug/ml潮霉素)，28℃培养箱倒置培养48h；

外植体在A600 0.6-0.8的重悬液中15-30min，然后放到无菌滤纸上，除去多余液体，重悬液使用灭菌的YEP，诱导培养基上共培7-8天后，把外植体取出，放入灭菌水中，颠倒10-20次，以除去菌。倒去水，换上新鲜的灭菌水；重复以上过程2-3次；把外植体放在无菌滤纸上，然后转入诱导培养基上继续培养2-4周后转入生根培养基(1/2MS+0.2mg·L-1NAA+0.2mg·L–1IBA)中，在培养温度28±2℃、光照强度1000lx、光照时间16h·d-1条件下培养至生根；当鸭茅幼根淡黄、完整且幼苗健壮时，室温条件下打开培养瓶瓶口加入清水至没过培养基，炼苗3d即可，取出幼苗移栽至营养土(营养土在121℃、25min高温条件灭菌，营养土∶蛭石∶珍珠岩混合比例为3∶1∶1)中生长。

C、阳性植株鉴定：取阳性植株叶片进行基因组DNA的提取并使用载体植物筛选序列；

上游引物GAATTCATGGAGTGGACGGCCCCGAA；

下游引物GTCGACATTCATCCGGTTTAGACCG)

进行PCR验证，PCR扩增体系如表6，PCR反应程序：98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min；同时进行Southern鉴定；

表6：PCR扩增体系

D、选择阳性转基因株系分别于3M山梨醇和1.5M NaCl的胁迫和37℃高温处理，分别测定各胁迫条件下游离脯氨酸、CAT和POD含量，测定方法如下：

D1、游离脯氨酸测定方法：

D1.1标准曲线制作：

(1)取7支具刻度试管，如下表7中所示加入个试剂，混匀后沸水浴中加热40min；

(2)水浴后取出，冷却，加入5mL甲苯，振荡萃取，静置分层后取甲苯层以0号管为对照在530nm测OD值；

表7标准曲线制作

(3)以OD值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，求线性回归方程得到标准曲线；

D1.2样品脯氨酸含量测定：

(1)脯氨酸提取：植物组织0.2-0.5g，加液氮研磨多次，将研磨后的样品转到大试管中，加入5mL 3％磺基水杨酸溶液，沸水中加热10min；

(2)加热完成后取出，冷却，取上清2mL，加2mL冰乙酸和3mL显色液，沸水中加热40min，然后采用和标准曲线制作相同的步骤萃取和比色；

(3)结果计算：按照标准曲线查出测定液中脯氨酸含量，按照下面公式计算脯氨酸含量：

脯氨酸(μg/g)＝(C×V/a)/W

C:提取液中脯氨酸浓度(μg)

V：提取液总体积

a：测定时所取体积

W：样品质量；

D2、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)测定：

D2.1酶液提取

取植物组织样品0.25g，加入5倍体积的PH 7.0的PBS，冰浴研磨，14000r/min离心15min，取上清；

D2.2 CAT活性测定

向灭菌后的5mL试管中加入1mL0.3％H2O2，0.95mL H2O，1mL PH 7.0的PBS，最后加入0.05mL酶液使体系达到3mL并启动反应，测定240nm波长处的OD降低速度，以每分钟OD降低0.01定义为一个酶活力单位，CAT的酶活性以U/gFW表示；

D2.3 POD活性测定

向灭菌后的5mL试管中加入1mL0.3％H2O2，0.95mL 0.2％愈创木酚，1mL PH 7.0的PBS，最后加入0.05mL酶液使体系达到3mL并启动反应，测定470nm处OD增加速度，以每分钟OD增加0.01定义为一个活力单位，POD的酶活性以U/gFW表示。

利用1.5M NaCl处理鸭茅幼苗15天后，取新鲜叶片测定游离脯氨酸含量、CAT和POD活力，图5为过表达DgSPL3鸭茅植株盐胁迫下游离脯氨酸含量图；图6为过表达DgSPL3鸭茅植株盐胁迫下CAT和POD活性图；图7为过表达DgSPL3鸭茅植株盐胁迫后的表型对照图；由图5-7可知，过表达DgSPL3的鸭茅植株游离脯氨酸含量、CAT和POD活力均优于对照，表现出更好的耐盐性。

利用山梨醇模拟干旱胁迫分别对过表达DgSPL3鸭茅株系和对照进行处理14天后，取新鲜叶片测定游离脯氨酸含量、CAT和POD活力，图8为过表达DgSPL3鸭茅阳性植株山梨醇模拟干旱胁迫下游离脯氨酸含量图；图9为过表达DgSPL3鸭茅植株山梨醇模拟干旱胁迫下CAT和POD活性图；图10为山梨醇模拟干旱胁迫后鸭茅的表型对照图；由图8-10可知，过表达DgSPL3鸭茅株系叶片中游离脯氨酸含量高于对照，同时CAT和POD活性也比对照株系强，表现出较强的耐旱性。

在37℃高温胁迫分别对过表达DgSPL3鸭茅株系和对照进行处理7天后，取新鲜叶片测定游离脯氨酸含量、CAT和POD活力，图11为过表达DgSPL3鸭茅阳性植株37℃高温胁迫下游离脯氨酸含量图；图12为过表达DgSPL3鸭茅阳性植株37℃高温胁迫下CAT和POD活性图；图13为经过37℃高温胁迫后恢复正常生长15天后鸭茅的表型对照图；由图11-13可知，37℃胁迫7天后，过表达DgSPL3鸭茅叶片和根系游离脯氨酸含量、CAT和POD活力均高于对照，恢复正常温度15天后，过表达DgSPL3鸭茅植株恢复力显著强于对照，表明DgSPL3可以提高鸭茅对高温的耐受性。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> DgSPL3基因及其克隆方法和应用

<130> 2020

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

atgggctcat tcgggatgga ctggaaccag aagagctcgg tgctgtggga ctgggagaat 60

ttgccgccgc cgataggcgt gaatgcggat gagcccaaga atgggatgca ggctgaccca 120

agatttgcag ctgccatggg gaatgaagca atccactctt ctggcggtag cggcactttc 180

tcgtccagct cggagatggg atatggttct tccaagagct ccatgtccgc gtcgattgat 240

tcctcgttca aggaggggaa cagcattgaa ttcagatttg cacctgccaa aaaccctgct 300

gataggagca ccagcaaaaa tactgagctg ggtaaagtta ataacaccag gactgggacg 360

tctacttcat cggcagtagc agtgagcagt ggagagccgg tgatcggcct gaagcttgga 420

aagagaactt acttcgaaga tgtctgtgga gggcagaatg taaagagctc accgtctggt 480

gtgagtgcgc caaaccagtc tcctgctttg gtcaagaagg caaaggtgga tcaacataag 540

ccgcataatt catattgtca agttgaaggc tgcaaagtcg atctctcctc tgccaaagac 600

taccatcgaa agcacagagt ctgtgaactt catgctaagg ctcccaaagt tattgtcgct 660

ggtctggagc gacgcttttg ccagcagtgt agccggtttc atgctttagg cgagtttgac 720

cagataaagc gaagctgccg taggcgtctc aacgatcata atttccgcag acggaagcca 780

cagccagaag caatttcatt cagttcatca aggatgtcta cgatgtttta tgatgcaagg 840

caacagacaa gccttctatt tggtcaggct ccatatgttc aaatgagagg ctgtgcaagt 900

tcttcatggg atgacccagg aggcttcaaa tttacagaaa caaaagcttc ttggttaaag 960

ccaacaactg ctgcgcgtat tgatgggatg catttatcta gtgagcaggt gtcggacaat 1020

attgtgccca ttatgtcgca tggtgcacat catggttttg atgggttcat ggcattcaag 1080

ggaactggtg caaagttcct taatcaaggc gtcgaagctt ctgctgtcgc ttccgactcc 1140

aacggcgccc cagatcttca gcgtgctctc tctcttctgt caagcaactc agtgggtgct 1200

gcaaacctcc agcaaagtca ccagatacac cccagggtcg cgaccactgc cggcgtcccc 1260

aaccctgcga tgcacgcact gggctcatcg ccagggctct ggctagactg cccgccactc 1320

gatgatcacc cgcggttcca ggtttttgac cgtttgggcg gccacgacag tgagctccag 1380

ctcccaaaat ctacctacga ccatgccgcc cacttcagcc ggatgcactg a 1431

<210> 2

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 2

Met Gly Ser Phe Gly Met Asp Trp Asn Gln Lys Ser Ser Val Leu Trp

1 5 10 15

Asp Trp Glu Asn Leu Pro Pro Pro Ile Gly Val Asn Ala Asp Glu Pro

20 25 30

Lys Asn Gly Met Gln Ala Asp Pro Arg Phe Ala Ala Ala Met Gly Asn

35 40 45

Glu Ala Ile His Ser Ser Gly Gly Ser Gly Thr Phe Ser Ser Ser Ser

50 55 60

Glu Met Gly Tyr Gly Ser Ser Lys Ser Ser Met Ser Ala Ser Ile Asp

65 70 75 80

Ser Ser Phe Lys Glu Gly Asn Ser Ile Glu Phe Arg Phe Ala Pro Ala

85 90 95

Lys Asn Pro Ala Asp Arg Ser Thr Ser Lys Asn Thr Glu Leu Gly Lys

100 105 110

Val Asn Asn Thr Arg Thr Gly Thr Ser Thr Ser Ser Ala Val Ala Val

115 120 125

Ser Ser Gly Glu Pro Val Ile Gly Leu Lys Leu Gly Lys Arg Thr Tyr

130 135 140

Phe Glu Asp Val Cys Gly Gly Gln Asn Val Lys Ser Ser Pro Ser Gly

145 150 155 160

Val Ser Ala Pro Asn Gln Ser Pro Ala Leu Val Lys Lys Ala Lys Val

165 170 175

Asp Gln His Lys Pro His Asn Ser Tyr Cys Gln Val Glu Gly Cys Lys

180 185 190

Val Asp Leu Ser Ser Ala Lys Asp Tyr His Arg Lys His Arg Val Cys

195 200 205

Glu Leu His Ala Lys Ala Pro Lys Val Ile Val Ala Gly Leu Glu Arg

210 215 220

Arg Phe Cys Gln Gln Cys Ser Arg Phe His Ala Leu Gly Glu Phe Asp

225 230 235 240

Gln Ile Lys Arg Ser Cys Arg Arg Arg Leu Asn Asp His Asn Phe Arg

245 250 255

Arg Arg Lys Pro Gln Pro Glu Ala Ile Ser Phe Ser Ser Ser Arg Met

260 265 270

Ser Thr Met Phe Tyr Asp Ala Arg Gln Gln Thr Ser Leu Leu Phe Gly

275 280 285

Gln Ala Pro Tyr Val Gln Met Arg Gly Cys Ala Ser Ser Ser Trp Asp

290 295 300

Asp Pro Gly Gly Phe Lys Phe Thr Glu Thr Lys Ala Ser Trp Leu Lys

305 310 315 320

Pro Thr Thr Ala Ala Arg Ile Asp Gly Met His Leu Ser Ser Glu Gln

325 330 335

Val Ser Asp Asn Ile Val Pro Ile Met Ser His Gly Ala His His Gly

340 345 350

Phe Asp Gly Phe Met Ala Phe Lys Gly Thr Gly Ala Lys Phe Leu Asn

355 360 365

Gln Gly Val Glu Ala Ser Ala Val Ala Ser Asp Ser Asn Gly Ala Pro

370 375 380

Asp Leu Gln Arg Ala Leu Ser Leu Leu Ser Ser Asn Ser Val Gly Ala

385 390 395 400

Ala Asn Leu Gln Gln Ser His Gln Ile His Pro Arg Val Ala Thr Thr

405 410 415

Ala Gly Val Pro Asn Pro Ala Met His Ala Leu Gly Ser Ser Pro Gly

420 425 430

Leu Trp Leu Asp Cys Pro Pro Leu Asp Asp His Pro Arg Phe Gln Val

435 440 445

Phe Asp Arg Leu Gly Gly His Asp Ser Glu Leu Gln Leu Pro Lys Ser

450 455 460

Thr Tyr Asp His Ala Ala His Phe Ser Arg Met His

465 470 475

Claims (5)

1.DgSPL3基因，其特征在于：所述DgSPL3基因的cDNA全长序列如序列表SEQUENCE IDNO.1所示。

2.如权利要求1所述的DgSPL3基因，其特征在于：所述DgSPL3基因编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQUENCE ID NO.2所示。

3.DgSPL3基因的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、材料选择：选取鸭茅的幼嫩叶片作为提取样本；

2)、鸭茅总RNA的提取：将步骤1)得到的鸭茅幼嫩叶片采用植物总RNA提取试剂盒提取鸭茅总RNA；

3)、反转录；首先，将步骤2)RNA提取得到的鸭茅总RNA利用1％琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测得到完整的鸭茅RNA，并使用超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度，接着选用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录反应；

4)、PCR扩增：以鸭茅参考基因组为模板，通过序全长设计引物，

上游引物:DgSPL3:5’-TGTGCCGCTACCGCCAGAAGAGTGGA-3’；

下游引物:DgSPL3R:5’-GGCGGGTGAAGTCGGCCTACGTGACT-3’)

以cDNA为模板进行扩增，使用PrimeSTAR Max DNA Polymerase试剂盒进行进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应体系如表1所示：

表1 PCR扩增反应体系表

PCR扩增反应过程如下：在反应条件为98℃预变性4min；然后98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃运行10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳分离得到PCR产物；

5)、克隆；首先，将PCR产物在紫外灯下切胶，并采用MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行凝胶回收纯化，接着采用DNAA-TailingKit在目的片段DNA的3’末端添加“A”尾得到DNA溶液，然后取得到的DNA溶液4μl，加入1μlpMD18-T载体和5μlSolution混匀，在16℃反应30min，反应完成后将上所述溶液加入100μlDH5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃加热45s后，再在冰上放置1min，再将转化好的感受态细胞中加入890μlSOC培养基，37℃培养60分钟，涂于含有氨苄(Amp)的LB培养基上倒置过夜培养，培养后挑选单菌落培养并用菌液PCR验证目的片段是否插入成功，将目的片段插入成功的目的条带利用测序引物M13进行双端测序得到DgSPL3基因的cDNA全长序列，如序列表SEQUENCE IDNO.1所示。

4.DgSPL3基因在促进鸭茅37℃高温胁迫或盐胁迫或干旱胁迫中的应用，所述DgSPL3基因的cDNA全长序列如序列表SEQUENCE ID NO.1所示。

5.DgSPL3基因在改变鸭茅开花期中的应用，所述DgSPL3基因的cDNA全长序列如序列表SEQUENCE ID NO.1所示。

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