CN102732551B

CN102732551B - 一种植物叶倾角调控基因及其用途

Info

Publication number: CN102732551B
Application number: CN201110087233.6A
Authority: CN
Inventors: 薛红卫; 赵淑青
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2011-04-07
Filing date: 2011-04-07
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2031-04-07
Also published as: CN102732551A

Abstract

本发明涉及一种植物叶倾角调控基因及其用途。本发明首次发现LC1基因对于植物的叶倾角起到了调节作用。因此，可以将LC1基因应用于植物的改良培育中，选育出具有特定品质性状的品种。

Description

一种植物叶倾角调控基因及其用途

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种植物叶倾角调控基因、其用途以及调控植物叶倾角大小的基因工程方法。

背景技术

水稻是重要的粮食作物，同时也是单子叶植物的模式植物。育种实践表明，水稻株型与产量密切相关，理想的株型是高产的形态和物质基础。水稻叶倾角通常是指叶片和植株茎秆之间的夹角，是构成水稻株型的重要组成部分。叶倾角的大小特别是剑叶倾角的大小对水稻的光合生产量有很大影响：研究表明，叶片直立有利于叶片两面受光，减少阳光反射率，增加透光度，并促进种子灌浆时期的氮源储藏增加，从而增加产量，剑叶直立更是被看作改善群体光照的重要条件，直接影响到稻穗的营养转化，因此剑叶直立是理想株型的一个指标。

水稻的第一片叶为不完全叶，仅有叶鞘，以后各叶都具有叶片和叶鞘。叶片基部存在白色缺少叶绿素的带状部分，叫叶枕。这部分组织主要由中脉组成，也有少量叶片组织存在。在水稻发育过程中，叶片和叶鞘充分伸长之后，叶枕部位近轴面的细胞开始延伸，从而使叶片从叶鞘的垂直轴弯向远轴端，弯向叶鞘形成叶倾角。

已有的研究表明叶倾角发育受到分子水平和激素特别是油菜素内酯等多方面的调控，对倾角形成的分子机理研究有利于指导育种实践。因此，找到调节叶倾角大小的调控基因对于植物改良育种是有积极意义的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物叶倾角调控基因及其用途。

在本发明的第一方面，提供一种调节植物的叶倾角大小的方法，所述方法包括：调节植物中LC1蛋白的表达。

在另一优选例中，所述的植物选自(但不限于)：禾本科植物。

在另一优选例中，所述的禾本科植物是水稻，小麦，大麦，玉米，高粱。

在另一优选例中，所述的LC1蛋白是：

(a)如SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与(a)限定的蛋白序列有90％以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在另一优选例中，所述的LC1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在另一优选例中，所述方法包括：提高植物中LC1蛋白的表达；从而调节植物的叶倾角增大。

在另一优选例中，所述方法包括：将编码LC1蛋白的多核苷酸转入植物，获得转化入所述多核苷酸的植物。

在另一优选例中，所述方法包括：

(S1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有多核苷酸，其编码LC1蛋白；

(S2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(S1)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(S3)选择出转入了所述的多核苷酸的植物细胞、组织、器官；和

(S4)将步骤(S3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。

在另一优选例中，所述方法包括：降低植物中LC1蛋白的表达；从而调节植物的叶倾角减小。

在另一优选例中，所述降低植物中LC1蛋白的表达包括：

将下调所述LC1蛋白的编码序列表达(或转录)的干扰分子(包括反义分子)转入植物细胞、组织、器官，从而下调植物中LC1蛋白的表达。

在另一优选例中，所述方法包括：

(i)提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌，所述的载体选自下组：

(a)含有反方向启动的LC1蛋白的编码基因或基因片段(反义分子)的载体；

(b)含有可在植物体内形成特异性干扰LC1蛋白的编码基因表达(或转录)的成分的干扰分子的载体；

(ii)将植物的细胞、组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物细胞、组织或器官。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和

(iv)将步骤(iii)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。

在本发明的另一方面，提供一种植物，由前述任一所述的方法制备获得。

在本发明的另一方面，提供一种LC1蛋白或其编码基因的用途，用于调节植物的叶倾角；或用于制备调节植物的叶倾角的材料。

在另一优选例中，所述的LC1蛋白或其编码基因用于调节植物的叶倾角增大；或所述的LC1蛋白或其编码基因用于制备调节植物叶倾角减小的材料。

在另一优选例中，所述的调节植物叶倾角减小的材料。

在本发明的另一方面，提供一种降低LC1蛋白表达的物质的用途，用于调节植物的叶倾角减小。

在另一优选例中，所述的降低LC 1蛋白表达的物质是干扰所述LC1蛋白的编码序列表达(或转录)的干扰分子(包括反义分子)；或是LC1蛋白的抑制剂、拮抗剂、下调剂。

在另一优选例中，所述的降低LC1蛋白表达的物质是含有反方向启动的LC1蛋白的编码基因或基因片段(反义分子)的载体。

在本发明的另一方面，提供一种调节植物的叶倾角减小的物质，其是含有反方向启动的LC1蛋白的编码基因或基因片段(反义分子)的载体。

在本发明的另一方面，提供一种调节植物的叶倾角增大的物质，其是含有编码LC1蛋白的多核苷酸的表达载体。

在本发明的另一方面，提供一种LC1蛋白或其编码基因用途，用于作为鉴定植物的叶倾角大小的分子标记。

在另一优选例中，若经检测植物组织中LC1蛋白表达高于一个特定值，则相对而言，所述植物的叶倾角减小；若经检测植物组织中LC1蛋白表达低于该特定值，则相对而言，所述植物的叶倾角增大。其中，除非另外说明，所述的“特定值”是指该植物(较佳地为野生型的该植株)中LC1蛋白表达量的平均值。

在另一优选例中，检测相同物种不同品种的植物组织中LC1蛋白表达水平，则相对而言，LC1蛋白表达水平较低的植物品种叶倾角较大，LC1蛋白表达水平较高的植物品种叶倾角较小。此例可作为育种中亲本筛选的方法之一来应用。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1是水稻叶倾角突变体lc1(右)与野生型(左)材料的表型。图2是突变体lc1中T-DNA的插入位置示意图及PCR验证。

图3是突变体lc1中LC1基因表达情况的PCR鉴定。

图4是pCAMBIA2301-A-LC1载体图谱。

图5是功能互补实验T₀转基因水稻植株的表型。

图6是突变体lc1与互补转基因水稻植株的旗叶的叶倾角的角度统计。

图7是pCAMBIA1302-LC1载体图谱。

图8是LC1基因过表达转基因水稻植株的表型。

图9是LC1基因的DNA核苷酸序列。

图10是LC1基因编码的蛋白的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现LC1基因对植物叶倾角的大小具有调控作用。因此，可以将LC1基因应用于植物的培育中，选育出具有特定品质性状的品种，如选育出高产品种、株型理想的品种或观赏性好的品种。

如本文所用，所述的“植物(或作物、农作物)”包括任何种类的植物，只要该植物适合进行基因的转化操作(转基因操作)，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。例如但不限于：禾本科的水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、黑麦；十字花科芸薹属的大白菜、小白菜；十字花科鼠耳芥属植物，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。作为本发明的优选方式，所述的植物是禾本科植物，包括但不限于水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、黑麦。

如本文所用，所述的“叶倾角”是指植物完全展开的叶子主脉与植株中心轴之间形成的角度。通常，叶倾角以“度(°)”为单位。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的LC1蛋白”或“分离的LC1多肽”是指LC1蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化LC1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括LC1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的LC1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种LC1蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，LC1蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的LC1蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长LC1蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长LC1蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，术语“LC1蛋白”指具有LC 1蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与LC1蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括LC1蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与LC1蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗LC1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含LC1蛋白或其片段的融合蛋白。

任何与所述的LC1蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO：2所示的序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有LC1蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。

发明还提供LC1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然LC1蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“LC1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还涉及编码本发明LC1蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码LC1蛋白的多聚核苷酸。

应理解，虽然本发明的LC1基因优选获自禾本科植物，但是获自其它植物的与水稻LC1基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的LC 1蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或LC1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

本发明中，LC1蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得叶倾角性状发生改变的植物。

本发明提供了所述的LC1蛋白或其编码基因的用途，用于调节植物的叶倾角的大小；或用于筛选对于调节植物叶倾角大小有用的物质(即：所述物质通过调节LC1蛋白的表达来调节植物叶倾角大小的性状)。作为一种优选方式，所述的LC1蛋白可用于：调节植物的叶倾角增大。

本发明还涉及LC1的激动剂或拮抗剂及其用途。由于LC1的激动剂或拮抗剂可调节LC1的表达和/或调节LC1的活性等，因此，所述的LC1的激动剂或拮抗剂也可通过对LC1的影响来调节植物叶倾角的性状，从而达到改良植物(如提高植物产量，改变植物的株型或增加植物的观赏性)的目的。

任何可提高LC1蛋白的活性、提高LC1蛋白的稳定性、促进LC1蛋白的表达、延长LC1蛋白有效作用时间、或促进LC1的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调节植物叶倾角大小，特别是增大植物叶倾角的物质。任何可降低LC1蛋白的活性、降低LC1蛋白的稳定性、抑制LC1蛋白的表达、减少LC1蛋白有效作用时间、或降低LC1的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为LC1的下调剂、拮抗剂或抑制剂(即：下调LC1蛋白表达的物质)，如抗所述LC1蛋白的抗体，干扰所述LC1蛋白的编码基因表达的干扰分子(如可形成microRNA的干扰分子，反义分子)。所述的下调剂、拮抗剂或抑制剂可用于调节植物叶倾角大小，特别是减小植物的叶倾角。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的干扰分子的方法是本领域人员熟知的。

本发明还涉及一种改良植物的方法，该方法包括调节所述植物中LC1蛋白的表达。

一方面，本发明提供了一种增大植物的叶倾角的方法，所述的方法包括：使所述植物过量表达LC1蛋白。

另一方面，本发明还提供了一种减小植物叶倾角的方法，所述的方法包括：降低所述植物中LC1蛋白的表达(包括使LC1蛋白不表达或低表达)。

在得知了所述的LC1蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的LC1蛋白的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带LC1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的LC1蛋白。

此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低LC1蛋白的表达或使之缺失表达，比如将携带反义LC1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达LC1蛋白。

作为本发明的一种实施方式，将编码LC1蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述LC1蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达LC1蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达LC1蛋白的植物。

优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

(1)将外源的LC1蛋白的编码基因转入植物细胞、组织、器官或组织，获得转化入LC1蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官；和

(2)将步骤(1)获得的转入了外源LC1蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官再生成植物植株。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有LC1蛋白的编码基因；

(s2)将植物细胞、组织、器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使LC1蛋白的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(s3)选择出转入LC1蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官；以及

(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官再生成植物。

其它增加LC1基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强LC1基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该LC1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。

优选的，还提供了一种降低植物中LC1蛋白的表达的方法，所述的方法包括：

(1)将干扰LC1基因表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

较佳地，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和

(iv)将步骤(iii)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。

其它抑制LC1基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。

本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了LC1基因或其同源基因的转基因植物；或者LC1蛋白表达量(包括低表达或不表达)降低的植物等。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。

此外，本发明还涉及利用LC1蛋白或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用LC1蛋白或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中LC1蛋白的表达情况，鉴定植物的株型情况、叶倾角大小、产量高低等。

此外，本发明还提供筛选可调节植物叶倾角大小的潜在物质的方法。在得知了所述的LC1蛋白的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来筛选调节植物叶倾角大小的潜在物质。

在本发明的一种优选方式中，提供一种筛选调节植物叶倾角大小的潜在物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达LC1蛋白的体系接触，检测候选物质对LC1蛋白的影响；若所述候选物质可提高或降低LC1蛋白的表达，或促进或抑制LC1蛋白的活性，则表明其是可用于调节植物叶倾角大小。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于调节植物叶倾角有用的物质。

因此，本发明还包括通过所述的筛选方法获得的物质，所述的物质可用于调节植物叶倾角大小。

本发明利用叶倾角发生改变的水稻突变体lc1，通过Tail-PCR的技术首次在水稻中克隆到了LC1基因，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站做BLAST分析，找到了该基因在水稻染色体上的位置和序列。该基因编码IAA-amino合成酶，在水稻中控制了叶倾角的大小。通过对LC1基因的功能解读，进一步阐明了植物特别是禾本科植物叶倾角发育的遗传机制及其作用机理，为理想株型育种，创建水稻新种质打下基础。

当所述的植物是禾本科植物时，叶片倾角是禾本科植物“理想株型”的重要组成部分，也是当前超高产育种关注的重点。LC1基因的克隆和应用，使植物株型能够保持叶片挺直，减小叶倾角，改善植株的受光姿态，提高光能利用效率。因而，本发明能对叶倾角进行改良，最终能提高水稻产量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、基因的分离

1、水稻材料

以野生材料粳稻品种“中花11”为筛选对象，本发明人选择到一株水稻(Oryza sativa L.)突变体lc1(leaf inclination 1)，该突变体的叶倾角比野生型大，其表型见图1。

2、TAIL-PCR确定LC1基因：

2.1、使用简易法(TPS法)提取水稻基因组DNA

(1)取2cm的水稻叶片放入1.5ml的离心管中，加入200μl的TPS抽提液，用1ml的枪头捣碎。TPS抽提液的配制：100mM Tris-Cl(pH 8.0)，10mMEDTA(pH 8.0)，1M KCl。

(2)将捣碎的叶片放入75℃水浴20分钟。

(3)15000rpm离心5分钟。

(4)取120μl上清液于96孔板中，加入等体积的异丙醇，3500rpm离心10分钟。

(5)弃上清保留沉淀，加入120μl 70％的乙醇，3500rpm离心。

(6)弃上清，将沉淀干燥，加入30μl ddH₂O。

2.2、旁邻序列的确定(TAIL-PCR)

1)用TPS法抽提得到的水稻叶片基因组DNA作为PCR模板，进行三轮PCR反应。引物序列：

TDNA15’-TGCTTGATTTGAAGACATAGGG-3’(SEQ ID NO：3)；

TDNA25’-CGCCTATAAATACGACGGATCGTAA-3’(SEQ ID NO：4)；

TDNA35’-TAATAACGCTGCGGACATCTA-3’(SEQ ID NO：5)。

随机引物(Arbitrary primer)：

5’-TGWGNAGSANCASAGA-3’(SEQ ID NO：6)；

5’-AGWGNAGWANCAWAGG-3’(SEQ ID NO：7)；

5’-NTCGASTWTSGWGTT-3’(SEQ ID NO：8)；

5’-NGACGASWGANAWGAA-3’(SEQ ID NO：9)；

其中，W表示A/T、N表示A/T/G/C、S表示G/C。

第一轮PCR：以提取的基因组DNA为模板，使用T-DNA1引物和随机引物。PCR反应体系：总体积20μl(PCR缓冲液：2μl，Mg²⁺：2μl，dNTP：0.2mM，随机引物：2uM，TDNA1引物：0.2uM，Taq：0.08U，基因组DNA：1μl，用ddH₂O补齐至20μl)。

实验步骤：

步骤1：4.0℃2分钟；

步骤2：93.0℃1分钟；

步骤3：95.0℃1分钟；

步骤4：94.0℃30秒；

步骤5：62.0℃1分钟；

步骤6：72.0℃2分钟30秒；

步骤7：从步骤4到步骤6重复4次循环；

步骤8：94.0℃30秒；

步骤9：25.0℃3分钟；

步骤10：Ramp at 0.2℃/秒升至72.0℃；

步骤11：72.0℃2分钟30秒；

步骤12：94.0℃10秒；

步骤13：68.0℃1分钟；

步骤14：72.0℃2分钟30秒；

步骤15：94.0℃10秒；

步骤16：68.0℃1分钟；

步骤17：72.0℃2分钟30秒；

步骤18：94.0℃10秒；

步骤19：44.0℃1分钟；

步骤20：72.0℃2分钟30秒；

步骤21：从步骤12到步骤20重复14次循环；

步骤22：72.0℃5分钟；

步骤23：4.0℃保温结束。

第二轮PCR：以第一轮PCR产物为模板，使用T-DNA 2引物和随机引物。

PCR反应体系：总体积20μl(PCR缓冲液：2μl，Mg²⁺：2μl，dNTP：0.2mM，随机引物：2uM，TDNA1引物：0.2uM，Taq：0.06U，用第一轮的PCR产物，DNA：1μl，用ddH₂O补齐至20μl)。

实验步骤：

步骤1：4.0℃2分钟；

步骤2：94.0℃10秒；

步骤3：64.0℃1分钟；

步骤4：72.0℃2分钟30秒；

步骤5：94.0℃10秒；

步骤6：64.0℃1分钟；

步骤7：72.0℃2分钟30秒；

步骤8：94.0℃10秒；

步骤9：44.0℃1分钟；

步骤10：72.0℃2分钟30秒；

步骤11：从步骤2到步骤10重复11次循环；

步骤12：72.0℃5分钟；

步骤13：4.0℃保温结束。

第二轮PCR产物需要用1％琼脂糖电泳检验，有条带的样品才进行第三轮PCR。

第三轮PCR：以第二轮PCR产物为模板，使用T-DNA 3引物和随机引物。

PCR反应体系：总体积30μl(PCR缓冲液：3μl，Mg²⁺：1.5μl，dNTP：0.2mM，随机引物：2uM，TDNA1引物0.2uM，Taq：0.06U，用第二轮的PCR产物，DNA：1μl，用ddH₂O补齐至30μl)。

实验步骤：

步骤1：4.0℃2分钟；

步骤2：94.0℃10秒；

步骤3：44.0℃1分钟；

步骤4：72.0℃2分钟30秒；

步骤5：从步骤2到步骤4重复19次循环；

步骤6：72.0℃5分钟；

步骤7：4.0℃保温结束。

2.3、基因预测和比较分析

在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站做Blastn分析，将获得的旁邻序列与已知的水稻基因组序列进行比对发现，T-DNA插入在水稻第一染色体的33.3Mb处。对插入位点附近的序列进行基因预测，结果显示，T-DNA插入了一个预测基因的上游启动子内，距转录起始位点上游136bp。该基因启动子区域内的T-DNA插入导致了基因的高表达。该功能基因具有SEQ ID NO：1所示的DNA序列(图9)，预测功能蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列(图10)。

实施例2、变体水稻的PCR鉴定

用突变体水稻DNA作为模板，进行PCR来确定突变体是否有T-DNA插入。Hygromycin抗性引物检测突变体中是否存在T-DNA插入；根据Tail-PCR推测T-DNA插入位点，在插入位点的两侧设计引物：

P1：5’-TGCTTGATTTGAAGACATAGGG-3’(SEQ ID NO：10)；

P2：5’-GATGTAGGCAGCGGTATGG-3’(SEQ ID NO：11)；

在T-DNA左边界区段设计引物：

LB3：5’-CCAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGAAT-3’(SEQ ID NO：12)；

用P1和P2，P1和LB3两对引物分别PCR扩增，进一步确认插入位点和鉴定纯系。以野生型植株的DNA为模板时，基因组的一对引物P1/P2可以扩增出预期的597bp的条带，而T-DNA引物LB3和P2组合则不能扩增出条带；以突变体植株的DNA为模板时，T-DNA引物LB3和P2组合能扩增出482bp的条带，纯合的突变体中，由于插入的T-DNA片段太大，P1/P2不能扩增出条带，如第2、3、5-9单株；而T-DNA杂合体则2对引物均能扩增出对应大小的条带，如第4、11单株(图2)。

实施例2、基因表达的分析

1、水稻RNA提取

取水稻组织材料(约100mg)于液氮中充分研磨。转移至1.5ml离心管中，加入1mL Trizol(Invitrogen，Cat.15596-018)，混匀，室温放置5min。12,000rpm离心10min，弃沉淀。上清中加入600μL三氯甲烷，混匀，12,000rpm离心10min。取上清，加入等体积异丙醇-20℃半小时沉淀RNA。12,000rpm离心10min，用70％乙醇洗涤沉淀两次，真空干燥，溶于20-50μL H₂O(RNase free)。将RNA用Rnase free H₂O做适当稀释，测定波长在200nm-300nm之间的UV吸收值。RNA浓度＝40μg/mL ×A₂₆₀×稀释倍数。A₂₆₀/A₂₈₀应当在1.8至2.0之间。

2、RT-PCR分析

水稻的花和叶的总RNA，各取1μg进行反转录，稀释后分装，-70℃保存。反转录按照大连宝生物工程公司提供的方法进行(RNA PCR Kit(AMV)Ver.2.1)。反转录反应条件为：30℃，10min；42℃，30min；99℃，5min；4℃，5min。用水稻ACTIN基因引物：

Actin-3：5’-GAACTGGTATGGTCAAGGCTG-3’(SEQ ID NO：13)；

Actin-4：5’-ACACGGAGCTCGTTGTAGAAG-3’(SEQ ID NO：14)；

进行PCR反应定量分析反转录模板的结果，确定不同的eDNA模板的用量，以基因特异引物：

LC1-1：5’-CACGTATTCCGGGTTGTATC-3’(SEQ ID NO：15)；

LC1-2：5’-GGCTAAGTCGTCATCTCATAAC-3’(SEQ ID NO：16)；

以花和叶组织总RNA反转录的eDNA为模板，用RT-PCR的方法分别检测了叶和花中LC1基因的表达情况。相对于野生型植株，lc1突变体的叶和花中LC1的转录水平都有明显的升高(图3)。

实施例3：转基因植物及功能验证

1.LC1基因的正义载体和反义载体的构建

(1)正义双元载体

以实施例2中水稻花的eDNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

LC1-55’CATGCCATGGATATGCCGGAAGCACCGACCG-3’(SEQ ID NO：17)；

LC1-65’CGGGATCCGAGGCGTCTCCCTTGCCGACCA-3’(SEQ ID NO：18)；

以pfu聚合酶扩增所述的cDNA，PCR反应条件为：94℃，3min，1次循环；94℃，30sec，58℃，40sec，72℃，150sec，28次循环；72℃，10min，1次循环。扩增产物经测序验证，其序列如SEQ ID NO：1所示，与Genbank基因库登录号为AK063368中的编码基因序列相同，表明克隆产物为LC1基因。NcoI和SpeI酶切后连入到经过同样酶切处理后的p35S-1302双元载体(购自CAMBIA)中，构建成为CaMV35S启动子驱动的LC1正义双元载体(p35S-1302/LC(pCAMBIA1302-LC1)，图7)。

(2)反义双元载体

采用以下引物：

LC1-3：5’GGACTAGTGCCTCAACCTGAATCCCATG-3’(SEQ ID NO：19)；

LC1-4：5’AACTGCAGGGTAGACGCTGTTCAGTGCCT-3’(SEQ ID NO：20)；

PCR扩增LC1基因3’端非保守的0.7kb的片段：

BamHI和PstI酶切后连入同样酶切处理的p35S-2301双元载体中，构建成为含有35S启动子驱动的LC1反向序列的的反义双元载体(p35S-2301/反义LC1(又称为：pCAMBIA2301-A-LC1或p35S-2301-A-LC1)，图4)，即LC1基因5’端的位置与载体的启动子位置相远离，而3’端终止密码子的位置与载体的启动子位置相靠近。

2、菌种构建

以常规的CaCl₂处理法(参见《分子生物学实验技术》；郝福英等编著，北京大学出版社，北京，1998)制备根癌农杆菌EHA105(CAMBIA公司)感受态，通过电击转化法将LC1基因的正义载体和反义载体分别转入农杆菌中，在含抗生素如卡那霉素(Km)的LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)上，于28℃下培养2大。

挑取单菌落，在含抗生素的YEP酵母培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸膏10g/L，NaCl 5g/L，卡那霉素50mg/L，pH 7.0)中28℃培养约24小时至对数期。按1％的量接种到相同的培养基中，28℃下培养24小时。将培养液于4℃、3000rpm下离心10min，取沉淀(菌体)，用等体积AAM-As培养基(AA培养基无机盐和氨基酸MS维他命，干酪素500mg/L，蔗糖68.5g/L，葡萄糖36g/L，乙酰丁香酮，pH 5.2)悬浮，静置2小时。

3、共培养外植体(幼胚)的准备

取粳稻(中花11或lc1突变体)未成熟种子，经75％的乙醇漂洗1min后用无菌水漂洗3遍，之后用0.1％升汞浸泡15min，再用无菌水漂洗3遍；然后取幼胚接种于ND2培养基(N6大量元素，N6微量元素和N6维他命，脯氨酸500mg/L，干酪素300mg/L，蔗糖30g/L，2，4-D 2mg/L，琼脂8g/L，pH 5.8)上，在25℃、黑暗条件下培养三天。

4、转化外植体

将经培养后的外植体浸入上述2所得菌体悬液，静置20min，用无菌滤纸吸干后转移到ND2-As培养基(ND2培养基加入乙酰丁香酮(30μmol/L))上，25℃、黑暗条件下共培养3天。

用无菌水将培养后的外植体洗涤5次以除去表面吸附的农杆菌，然后用含羧苄青霉素250mg/L和头孢霉素100mg/L的无菌水浸泡2小时。用无菌滤纸吸干后转移至ND2CH(ND2培养基加入水解酪蛋白500mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸2mg/L)培养基，25℃下培养，筛选抗性愈伤，每两周继代一次。

5、再生

筛选得到的抗性愈伤转移到NN1B2H分化培养基(N6大量元素、N6微量元素、N6维他命，干酪素300mg/L，蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L，潮霉素50mg/L，琼脂10g/L，pH 5.8)上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到含抗性如潮霉素的MS分化培养基(DUCHEFA BIOCHEMIE公司)上，25℃下培养至约10cm高，移至人工气候室培养至成熟。

水稻在人工气候室，每天于26℃下培养12小时；再于18℃下培养12小时。

对植株进行鉴定和连续的观察，发现转入反义载体的突变体植株(lc1pA-LC1)的叶倾角变小，恢复了正常形态，见图5和图6。

LC1正义转基因植株(pO-LC1)，其叶倾角明显大于野生型植株，见图8。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种调节植物的叶倾角大小的方法，所述方法包括：调节植物中LC1蛋白的表达，所述的LC1蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO:2的蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：提高植物中LC1蛋白的表达；从而调节植物的叶倾角增大。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：将编码LC1蛋白的多核苷酸转入植物，获得转化入所述多核苷酸的植物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，包括：

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：降低植物中LC1蛋白的表达；从而调节植物的叶倾角减小。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述降低植物中LC1蛋白的表达包括：

将下调所述LC1蛋白的编码序列表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官，从而下调植物中LC1蛋白的表达。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)含有反方向启动的LC1蛋白的编码基因或基因片段的载体；

(b)含有可在植物体内形成特异性干扰LC1蛋白的编码基因表达的成分的

干扰分子的载体；

(ii)将植物的细胞、组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物。

8.一种LC1蛋白或其编码基因的用途，用于调节植物的叶倾角；或用于制备调节植物的叶倾角的材料；所述的LC1蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO:2的蛋白。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的LC1蛋白或其编码基因用于调节植物的叶倾角增大；或

所述的LC1蛋白或其编码基因用于制备调节植物叶倾角减小的材料。

10.含有反方向启动的LC1蛋白的编码基因的载体的用途，用于调节植物的叶倾角减小；所述的LC1蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO:2的蛋白。

11.含有编码LC1蛋白的多核苷酸的表达载体的用途，用于调节植物的叶倾角增大的物质；所述的LC1蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO:2的蛋白。

12.一种LC1蛋白或其编码基因用途，用于作为鉴定植物的叶倾角大小的分子标记；所述的LC1蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO:2的蛋白。