CN102206639B

CN102206639B - 调节植物种子淀粉合成代谢的基因及其应用

Info

Publication number: CN102206639B
Application number: CN2010101349596A
Authority: CN
Inventors: 薛红卫; 付芳芳
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2010-03-30
Filing date: 2010-03-30
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2030-03-30
Also published as: CN102206639A

Abstract

本发明涉及调节植物种子淀粉合成代谢的基因及其应用。本发明首次发现RSR1基因对淀粉合成代谢的整个途径起到了负调节作用，还与禾本科植物的产量、种子大小、粒重、直链淀粉含量、支链淀粉聚合度、淀粉糊化温度密切相关。因此，可以将RSR1基因应用于植物的培育中，选育出具有特定品质性状的品种。

Description

调节植物种子淀粉合成代谢的基因及其应用

技术领域

本发明属于植物学和基因工程领域，更具体地，本发明涉及调节植物种子淀粉合成代谢的基因及其应用。

背景技术

淀粉作为水稻胚乳的主要组成成分，其含量和品质直接影响着水稻种子的品质。因此，研究淀粉合成的调控对于提高种子的品质具有重要意义。对于淀粉代谢过程，以往主要集中在淀粉合成基因本身的研究上，如ADP葡萄糖焦磷酸化酶，淀粉合酶，淀粉分支酶和淀粉去分支酶等。对淀粉代谢的调控研究目前还较少，已有报道表明，淀粉合酶GBSSII基因的表达受到生物节律的调节；蔗糖和ABA协同作用能够促进ADP葡萄糖焦磷酸化酶ADPGL3基因的表达，从而增加淀粉含量。

另外，也有报道几个转录因子参与了淀粉代谢的调控，一个MYC蛋白和一个EREBP蛋白可以相互作用，增强淀粉合酶GBSSI基因的表达；ABI4蛋白，介导了蔗糖和ABA对ADPGL3基因的协同调节。所有这些研究，都只是直接或间接的调节了一个或少数几个淀粉合成基因的表达，而对淀粉代谢调节的系统研究，尤其是同时调节整个淀粉代谢过程的研究，尚没有报道。

因此，本领域有必要进一步研究与调节淀粉合成代谢相关的基因。在以往的研究中，本发明人采用基因共表达分析的方法，研究了可能参与到淀粉代谢调控的基因，从中获得了RSR1基因，一个AP2家族的转录因子。该基因属于AP2家族中euAP2分支，该分支在水稻中包含5个基因，其中一个基因报道参与控制小穗分生组织向花分生组织的转变，该分支在其他物种的同源基因也有一些报道，大多为参与调控花器官的发育或命运决定，及开花时间等，并未有对淀粉代谢调控的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调节植物种子淀粉合成代谢的基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种调节植物的产量，植物种子大小或粒重，植物种子的淀粉合成代谢，植物种子的淀粉结构或淀粉糊化温度的方法，所述方法包括：调节(包括：上调或下调)植物中RSR1蛋白的表达。

在一个优选例中，所述的植物选自：禾本科植物、茄科植物、大戟科植物。

在另一优选例中，所述的禾本科植物是水稻。

在另一优选例中，所述的RSR1蛋白选自下组：

(a)如SEQ ID NO：3氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO：3氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与(a)限定的蛋白序列有90％以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在另一优选例中，所述方法包括：降低(下调)植物中RSR1蛋白的表达；从而：

提高植物的产量、增加植物种子大小或粒重；

上调植物种子中淀粉合成基因的表达；

提高植物种子中直链淀粉含量；

下调植物种子中淀粉的糊化温度。

调节植物种子中支链淀粉的聚合度；较佳地，提高聚合度为5-8和18-38的糖链的比例；降低聚合度为9-17的糖链的比例；

调节植物种子中支链淀粉的不同类型链的比例；较佳地，降低短链A链的比例；提高中长链B₁链和长链B_2-3链的比例；或

降低植物种子中淀粉的糊化温度；较佳地，降低淀粉的糊化起始温度(To)，峰温度(Tp)和终止温度(Tc)。

在另一优选例中，所述降低(下调)植物中RSR1蛋白的表达包括：

将干扰所述RSR1蛋白的编码序列表达(或转录)的干扰分子(包括反义分子)转入植物细胞、组织、器官或种子，从而下调植物中蛋白的表达。

在另一优选例中，所述方法包括：

(i)提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌，所述的载体选自下组：

(a)含有反方向启动的RSR1蛋白的编码基因或基因片段(反义分子)的载体；

(b)含有可在植物体内形成特异性干扰RSR1蛋白的编码基因表达(或转录)的成分的干扰分子的载体；

(ii)将植物的细胞、组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物细胞、组织或器官。

较佳地，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和

(iv)将步骤(iii)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。

在另一优选例中，所述方法包括：提高(上调)植物中RSR1蛋白的表达，从而：

下调植物种子中淀粉合成基因的表达；

调节植物种子中支链淀粉的聚合度；较佳地，提高聚合度为9-21的糖链的比例；降低聚合度为5-8和22-42的糖链的比例；

调节植物种子中支链淀粉的不同类型链的比例；较佳地，提高短链A链的比例；降低中长链B₁链和长链B_2-3链的比例；或

提高植物种子中淀粉的糊化温度；较佳地，提高淀粉的糊化起始温度(To)，峰温度(Tp)和终止温度(Tc)。

在另一优选例中，所述方法包括：将编码RSR1蛋白的多核苷酸转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述多核苷酸的植物细胞、组织、器官或种子。

在另一优选例中，所述的编码RSR1蛋白的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。

在另一优选例中，所述方法包括：

(S1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有多核苷酸，其编码RSR1蛋白；

(S2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(S1)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物细胞、组织、器官或种子。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(S3)选择出转入了所述的多核苷酸的植物细胞、组织、器官或种子；和

(S4)将步骤(S3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。

在本发明的另一方面，提供一种RSR1蛋白或其编码基因用途，用于调节植物的产量，植物种子大小或粒重，植物种子的淀粉合成代谢，植物种子的淀粉结构或淀粉糊化温度。

在另一优选例中，所述的RSR1蛋白或其编码基因：

用于下调植物种子中淀粉合成基因的表达；

用于调节植物种子中支链淀粉的聚合度；较佳地，提高聚合度为9-21的糖链的比例；降低聚合度为5-8和22-42的糖链的比例；

用于调节植物种子中支链淀粉的不同类型链的比例；较佳地，提高短链A链的比例；降低中长链B₁链和长链B_2-3链的比例；或

用于提高植物种子中淀粉的糊化温度；较佳地，提高淀粉的糊化起始温度(To)，峰温度(Tp)和终止温度(Tc)。

在另一优选例中，所述的RSR1蛋白选自下组：

(a)如SEQ ID NO：3氨基酸序列的蛋白；

在另一优选例中，所述的RSR1的编码基因包含如下序列：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。

在本发明的另一方面，提供一种RSR1蛋白或其编码基因用途，用于作为鉴定植物的产量，植物种子大小或粒重，植物种子的淀粉合成代谢，植物种子的淀粉结构或淀粉糊化温度的分子标记。

在一个优选例中，若经检测植物组织中RSR1蛋白表达高于一个特定值，则相对而言，所述植物的产量低、种子小、种子中淀粉合成基因的表达低、种子淀粉中支链淀粉短链比例增加或种子中淀粉的糊化温度高；若经检测植物组织中RSR1蛋白表达低于该特定值，则相对而言，所述植物的产量高、种子大、种子中淀粉合成基因的表达高、种子中直链淀粉含量多或种子中淀粉的糊化温度低。其中，除非另外说明，所述的“特定值”是指植物中RSR1蛋白表达量的平均值。

在本发明的另一方面，提供一种降低(下调)RSR1蛋白表达的物质的用途，用于：

提高植物的产量、增加植物种子大小或粒重；

上调植物种子中淀粉合成基因的表达；

提高植物种子中直链淀粉含量；

下调植物种子中淀粉的糊化温度；

在一个优选例中，所述的降低RSR1蛋白表达的物质是干扰所述RSR1蛋白的编码序列表达(或转录)的干扰分子(包括反义分子)；或是RSR1蛋白的抑制剂、拮抗剂、下调剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1为种子中淀粉合成基因在rsr1突变体及3个RSR1基因过量表达转基因株系中的表达。纵坐标为real-time PCR检测各个基因在突变体或转基因株系中的相对表达量与在野生型中的相对表达量的比值的以2为底的对数。数据为3次试验的平均值。

图2为rsr1突变体与野生型种子中支链淀粉链长分配的差异。纵坐标指示聚合度5-56的糖链在支链淀粉中所占比例的差值。

图3为3个RSR1基因过量表达转基因株系与野生型种子中支链淀粉链长分配的差异。纵坐标指示聚合度5-56的糖链在支链淀粉中所占比例的差值。

图4为rsr1突变体及3个RSR1基因过量表达转基因株系的种子形态。与野生型相比，突变体种子明显变大，而转基因株系种子明显变小。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现RSR1基因对淀粉合成代谢的整个途径起到了负调节作用，还与植物种子的颗粒大小、粒重、直链淀粉含量、支链淀粉聚合度、淀粉糊化温度和产量密切相关。因此，可以将RSR1基因应用于植物的培育中，选育出具有特定品质性状的品种。

如本文所用，所述的“植物”包括但不限于：禾本科植物、茄科植物、大戟科植物等。比如，所述的“植物”包括但不限于：水稻、小麦、玉米、马铃薯、木薯等。较佳的，所述的植物是禾本科植物。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的RSR1蛋白”或“分离的RSR1多肽”是指RSR1蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化RSR1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括RSR1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的RSR1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种RSR1蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，RSR1蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的RSR1蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长RSR1蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长RSR1蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，术语“RSR1蛋白”指具有RSR1蛋白活性的SEQ ID NO：3序列的多肽。该术语还包括具有与RSR1蛋白相同功能的、SEQ ID NO：3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括RSR1蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与RSR1蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗RSR1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含RSR1蛋白或其片段的融合蛋白。

任何与所述的RSR1蛋白同源性高(比如与SEQ ID NO：3所示的序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有RSR1蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。

发明还提供RSR1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然RSR1蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“RSR1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe

Val(V)

Ile；Leu；Met；Phe；Ala

Leu

本发明还涉及编码本发明RSR1蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：3的蛋白质，但与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码RSR1蛋白的多聚核苷酸。

应理解，虽然本发明的RSR1基因优选获自禾本科植物，但是获自其它植物的与水稻RSR1基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的RSR1蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或RSR1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

本发明中，RSR1蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得淀粉合成代谢性状发生改变的植物。

本发明提供了所述的RSR1蛋白或其编码基因的用途，用于调节植物中淀粉的合成代谢；或用于筛选对于调节植物中淀粉合成代谢有用的物质(即：所述物质通过调节RSR1蛋白的表达来调节植物淀粉合成代谢的性状)。作为一种优选方式，所述的RSR1蛋白可用于：下调植物种子中淀粉合成基因的表达；调节植物种子中支链淀粉的聚合度(较佳地，提高聚合度为9-21的糖链的比例；降低聚合度为5-8和22-42的糖链的比例)；调节植物种子中支链淀粉的链类型(较佳地，提高短链A链的比例；降低中长链B₁链和长链B_2-3链的比例)；提高植物种子中淀粉的糊化温度(较佳地，提高淀粉的糊化起始温度(To)，峰温度(Tp)和终止温度(Tc))。

本发明还涉及RSR1的激动剂或拮抗剂及其用途。由于RSR1的激动剂或拮抗剂可调节RSR1的表达和/或调节RSR1的活性等，因此，所述的RSR1的激动剂或拮抗剂也可通过对RSR1的影响来调节植物淀粉代谢的性状，从而达到改良植物的目的。

任何可提高RSR1蛋白的活性、提高RSR1蛋白的稳定性、促进RSR1蛋白的表达、延长RSR1蛋白有效作用时间、或促进RSR1的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调节植物淀粉合成代谢，特别是负调控植物淀粉合成的物质。任何可降低RSR1蛋白的活性、降低RSR1蛋白的稳定性、抑制RSR1蛋白的表达、减少RSR1蛋白有效作用时间、或降低RSR1的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为RSR1的下调剂、拮抗剂或抑制剂(即：下调RSR1蛋白表达的物质)，如抗所述RSR1蛋白的抗体，干扰所述RSR1蛋白的编码基因表达的干扰分子(如可形成microRNA的干扰分子)。所述的下调剂、拮抗剂或抑制剂可用于调节植物淀粉合成代谢，特别是促进植物淀粉合成。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的干扰分子的方法是本领域人员熟知的。

本发明还涉及一种改良植物的方法，该方法包括调节所述植物中RSR1蛋白的表达。

一方面，本发明提供了一种下调植物种子中淀粉合成基因的表达或提高植物种子中淀粉的糊化温度的方法，所述的方法包括：使所述植物过量表达RSR1蛋白。

另一方面，本发明还提供了一种提高植物(如水稻)的产量、增加植物种子大小、增加植物种子粒重、上调植物种子中淀粉合成基因的表达、提高植物种子中直链淀粉含量或下调植物种子中淀粉的糊化温度的方法，所述的方法包括：降低所述植物中RSR1蛋白的表达(包括使RSR1蛋白不表达或低表达)。

在得知了所述的RSR1蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的RSR1蛋白的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带RSR1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的RSR1蛋白。

此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低RSR1蛋白的表达或使之缺失表达，比如将携带反义RSR1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达RSR1蛋白。

作为本发明的一种实施方式，将编码RSR1蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述RSR1蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达RSR1蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达RSR1蛋白的植物。

优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

(1)将外源的RSR1蛋白的编码基因转入植物细胞、组织、器官或组织，获得转化入RSR1蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了外源RSR1蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物植株。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有RSR1蛋白的编码基因；

(s2)将植物细胞、组织、器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使RSR1蛋白的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(s3)选择出转入RSR1蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；以及

其它增加RSR1基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强RSR1基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该RSR1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。

优选的，还提供了一种降低植物中RSR1蛋白的表达的方法，所述的方法包括：

(1)将干扰RSR1基因表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(c)含有反方向启动的RSR1蛋白的编码基因或基因片段(反义分子)的载体；

(d)含有可在植物体内形成特异性干扰RSR1蛋白的编码基因表达(或转录)的成分的干扰分子的载体；

较佳地，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和

(iv)将步骤(iii)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。

其它抑制RSR1基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。

本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了RSR1基因或其同源基因的转基因植物；或者RSR1蛋白表达量(包括低表达或不表达)降低的植物等。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。

此外，本发明还涉及利用RSR1蛋白或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用RSR1蛋白或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中RSR1蛋白的表达情况，鉴定禾本科植物的产量高低、种子大小、种子中淀粉合成基因的表达、种子中直链淀粉含量或种子中淀粉的糊化温度。还可利用RSR1基因相关的植物淀粉代谢特性作为杂交制种过程中真杂种的指示标记。

此外，本发明还提供筛选可调节植物淀粉合成代谢的潜在物质的方法。在得知了所述的RSR1蛋白的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来筛选调节植物淀粉合成代谢的潜在物质。

在本发明的一种优选方式中，提供一种筛选调节植物淀粉合成代谢的潜在物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达RSR1蛋白的体系接触，检测候选物质对RSR1蛋白的影响；若所述候选物质可提高或降低RSR1蛋白的表达，或促进或抑制RSR1蛋白的活性，则表明其是可用于调节植物淀粉合成代谢。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于调节植物淀粉代谢有用的物质。

因此，本发明还包括通过所述的筛选方法获得的物质，所述的物质可用于调节植物淀粉合成代谢。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、RSR1基因的鉴定

利用基因共表达的分析方法，鉴定了一个水稻AP2家族的转录因子，本发明人将之命名为RSR1(rice starch regulator 1)，预测其可能参与了水稻淀粉合成的调控。

本发明人从NCBI，GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载了171张水稻芯片数据(Affymetrix GeneChip

Rice Genome Array，GPL2025)，经统一标准化后，以24个淀粉合成基因为指导基因，计算芯片中所有其他基因与每个指导基因的表达相关系数，相关系数绝对值大于0.6即认为两个基因共表达。指导基因中，15个基因在胚乳中明显高表达，可能参与种子中淀粉合成。分析结果表明，307个基因与种子中淀粉合成基因共表达，45个为转录因子，其中，RSR1与种子中淀粉合成基因表达负相关，推测可能负调节了种子中的淀粉合成。

所述的RSR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，基因组序列如SEQ IDNO：1所示，编码区序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例2、RSR1基因的T-DNA插入突变体rsr1和RSR1基因过量表达转基因株系的获得

为了进一步研究RSR1基因的生理功能，本发明人检索了水稻T-DNA插入突变体库(参见http://ship.plantsignal.cn)。搜索结果显示，编号为SHIP_ZSF6068的突变体为RSR1基因的插入突变体，插入位点在其对应的RSR1基因(Locusnumber为LOC_Os05g03040)中的第六个内含子距离第七个外显子61bp的位置，该突变体被命名为rsr1。

利用PCR的方法对rsr1的T-DNA插入位点进行检测。从具有潮霉素抗性的rsr1植株幼苗中提取DNA，用T-DNA特异的引物LB(5’-ATA GGG TTT CGCTCA TGT GTT GAG C-3’)和RSR1基因特异的引物P2(5’-CCG ATG GAT GATTTG TTT GC-3’)，验证了T-DNA在所示位置的插入；插入位点前端另一条的基因特异引物P1(5’-GGG AAT AGG GGA TGA GGT TG-3’)和P2组合，筛选出了rsr1的纯合植株。

利用RT-PCR的方法检测RSR1基因在突变体中的表达。提取rsr1纯合体植株的RNA进行反转录，采用RSR1基因上跨T-DNA插入位点的两条引物P3(5’-GAT AGC GGC TCC CTT GGC-3’)和P4(5’-TGG CTT CTT TCC TTT TTATCA A-3’)进行PCR扩增。结果显示，在突变体中，RSR1基因完全不表达，表明rsr1为RSR1基因的缺失突变体。

为了更全面地了解RSR1基因的生理功能，本发明人同时构建了该基因的正义表达载体，用于转化水稻。将从美国的AGI研究所获得的包含RSR1基因的水稻BAC克隆(OSJNBb0015N12)进行重转化，并提取质粒DNA，用XbaI进行酶切，将产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收，获得一段包含RSR1基因启动子及编码区的大约11kb的基因组的片段(具体包括基因起始密码子ATG之前6400bp，基因编码区3404bp和基因终止密码子TGA之后1802bp，经预测，整个片段内并无RSR1之外的其他基因存在)，连入到经同样酶切处理后的pCAMBIA1300双元载体(购自CAMBIA公司)中。采用电击转化方法将双元载体质粒导入根癌农杆菌EHA105，并采用农杆菌介导法(参见Hiei Y，Ohta S，Komari T，Kumashiro T.Plant J 1994；6：271-282)，对野生型水稻Zhonghuall(获自上海市农业科学院)进行转化。从获得的T0代转基因植株中提取RNA并进行反转录，同样用RSR1基因特异的引物P3和P4对该基因的表达进行检测，最终获得了3个独立的RSR1基因过量表达的转基因株系pRSR1::RSR1-L(1-3)。3个T0代植株收种后进行扩繁，并将T2代的种子分别单株收种，每个单株的种子取30粒，在含潮霉素(30mg/L)的水中进行萌发，全萌发的单株被鉴定为纯系。所得的3个转基因株系的纯系种子，用于后续的淀粉品质的分析。

采用RSR1基因的变体基因，该基因序列如SEQ ID NO：2，不同点在于第94位由C变为A，得到RSR1-M基因；从而其编码的蛋白相应位置由Leu变为Ile。同前述的方法将该RSR1-M基因插入到表达载体，转化水稻植株，结果，也获得多个转基因株系，经鉴定，这些转基因株系过量表达RSR1-M蛋白。

实施例3、RSR1基因的缺失突变体rsr1及过量表达转基因株系中淀粉合成基因的表达检测

前期的共表达分析显示，RSR1基因与种子中淀粉合成基因表达负相关，因此，本发明人首先检测了突变体及过量表达转基因株系种子中淀粉合成基因的表达。取实施例2制备的突变体及转基因株系开花后6天的种子，抽取RNA并进行反转录，对种子中淀粉合成基因的表达进行Real-time PCR检测。水稻ACTIN1基因的表达作为内标，该基因用ACT1(5’-GAA CTG GTA TGGTCA AGG CTG-3’)和ACT2(5’-ACA CGG AGC TCG TTG TAG AAG-3’)进行扩增，淀粉合成基因的引物均为文献报道(Ohdan T，Francisco PB Jr，Sawada T，et al.J Exp Bot 2005；56：3229-3244)。检测结果如图1所示，与野生型相比，在rsr1缺失突变体中，所有种子中淀粉合成基因的表达均被上调，最高可达约16倍，相反，在3个RSR1过量表达转基因株系中，这些淀粉合成基因的表达均不同程度地被下调，表明RSR1基因确实负调控了种子中淀粉合成基因的表达。

另外，在从RSR1-M蛋白过量表达的水稻株系获得的种子中，淀粉合成基因的表达也被下调。

实施例4、RSR1基因的缺失突变体rsr1及过量表达转基因株系种子中淀粉含量及淀粉结构的检测

由于相关的淀粉合成基因主要负责种子中淀粉的合成，因此本发明人首先检测了rsr1突变体及过量表达转基因株系的种子中淀粉的含量。将相应的种子去壳去皮，磨成精米后，再用磨粉机将精米磨成米粉，过100目筛，所得米粉供之后的实验所用。

称取一定量的米粉，采用改进的碘蓝比色法检测直链淀粉含量(参见梅淑芳，贾莉萌，高君恺等，核农学报2007；21：246-248)，采用硫酸-蒽酮法检测总淀粉含量(参见何照范，张迪清，保健食品化学及其检测技术。北京：中国轻工业出版社，1998；165-168)。结果如表2所示，与野生型对照相比，rsr1突变体种子中表观直链淀粉含量(AAC)明显上调(t-test检测具有显著性差异，P＜0.05)，而总淀粉含量并无明显变化；在3个过量表达转基因株系中，不论直链淀粉还是总淀粉含量，与野生型相比均无明显变化。

表2

野生型(WT)，rsr1突变体及3个RSR1基因过量表达转基因株系种子的表观直链淀粉含量(AAC)，总淀粉含量及千粒重检测。数据为三次试验重复的平均值±标准差。^**代表t检验为显著性差异(P＜0.05)。

同时，本发明人也对淀粉的结构进行了检测。由于直链淀粉为无分支的糖链，结构上并无太大变异，而支链淀粉为高度分支的糖链，其结构受到很多基因调控，变异较大。因此，本发明人检测了突变体及转基因株系种子中支链淀粉的结构。采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC-PAD)技术，对支链淀粉的链长分配进行分析。

结果显示，与野生型相比，在rsr1突变体中，如图2所示，聚合度(DP)为5-8和18-38的糖链所占的比例明显升高，而DP为9-17的糖链所占的比例则显著减低，另外，DP为39-42和49-54的糖链有轻度减少，而DP为43-48和DP≥55的糖链则稍微增多。相反，在RSR1过量表达转基因株系中，支链淀粉的链长分配与突变体则完全不同，如图3所示，与野生型相比，DP5-8和22-42的糖链明显减少而DP9-21的糖链则明显增多，尽管在3个株系中变化的程度有所不同，但均呈现相同的的趋势。从支链淀粉的链类型分析，在突变体中，短链A链(DP≤17-18)的比例明显减少，而中长链B₁链(DP 18-28)和长链B_2-3(DP≥28)则明显增多，而在过量表达转基因株系中，A链则显著增多而B₁链和B_2-3链明显减少。

HPAEC-PAD检测根据Nagamine等报道的方法(参见Nagamine T，KomaeK.J Chromatogr 1996；732：255-259)并略作修改，具体如下：称取5mg的米粉，溶于5ml甲醇，沸水浴10min，然后2500g离心10min，沉淀用5ml 90％的甲醇洗两次，重悬于5ml蒸馏水中，沸水浴60min。之后取2.5ml的糊化样品，加入125μl醋酸钠(600mM，pH 4.4)，25μl NaN₃(2％，w/v)，3500单位的异淀粉酶，37℃放置24h。然后加入375μl的硼氢化钠，氨水调至PH9.0，室温放置24h。所有样品室温下真空干燥。之后将样品溶于300μl NaOH(1M)中，静置60min，然后加入2700μl蒸馏水稀释，将3ml的样品注射入BioLC(Model DX-500，Dionex，CA，USA)，以100-450mM线性梯度的醋酸钠进行淋洗。

实施例5、RSR1基因的缺失突变体rsr1及过量表达转基因株系种子淀粉的糊化温度检测

由于直链淀粉含量及支链淀粉结构均能影响到淀粉的糊化特性，因此本发明人用差示扫描量热法(DSC)检测了突变体及过表达转基因株系中淀粉的糊化温度。称取3mg米粉，放入配套的铝盒中，加入9μl蒸馏水，然后将铝盒密封，水平衡1h后，放入扫描仪内(DSC 200PC，NETZSCH，Germany)，温度由30℃以10℃min^-1的速度升至110℃。结果如表3所示，在rsr1突变体中，糊化起始温度(To)，峰温度(Tp)和终止温度(Tc)均低于野生型约10℃。而在3个RSR1过表达转基因株系中，To，Tp，和Tc则均高于野生型。

表3

差示扫描量热法检测野生型(WT)，rsr1突变体及3个RSR1基因过量表达转基因株系种子淀粉的糊化温度。To，糊化起始温度；Tp，糊化峰温度；Tc，糊化终止温度。数据为三次试验重复的平均值±标准差。t检验显示，与野生型相比，均有显著性差异(P＜0.05)。

实施例6、RSR1基因的缺失突变体rsr1及过量表达转基因株系种子形态及产量相关指标的统计

观察种子形态发现，rsr1的种子较野生型明显增大，如图4所示，而3个过量表达转基因株系的种子则明显减小。千粒重检测也证明(表2所示)，突变体的种子确实比野生型种子重，而转基因株系的种子则比野生型种子明显变轻。

鉴于突变体种子变大，本发明人进一步统计了突变体产量相关的一些指标。在自然环境下，于大田大面积种植突变体，统计了大于50株突变体的产量相关的指标。结果如表4所示，与野生型(WT)相比，突变体(rsr1)的每株有效穗，每穗粒数和结实率等均无显著差异，而千粒重则明显增大，每穗的产量也相应增加约7.2％，因此可推知突变体的产量约增加7.2％。也即下调RSR1基因的表达可提高产量，增加粒重。

表4

野生型(WT)和rsr1突变体产量相关指标的统计。数据为平均值±标准差(n＞50)。^**代表t检验为显著性差异(P＜0.05)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>调节植物种子淀粉合成代谢的基因及其应用

<130>100412

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>4300

<212>DNA

<213>稻属

<400>1

acttcccgcc ttctatctat atatcccccc ctccctcctt tttctcctcc tcgccaccgc 60

tcgccggcgc cggagaccac caccaccacc tcacctcacc cacctctgct tcttcttctt 120

cttcttcccc gtggtgtggt gtggtggtga attgttgttc tgttcccttc atttttcgtt 180

gattcgtgag cgcggcgacg tacgtacggt ggtaagcatc gtcgtggatt cgtctccggc 240

gacggggggg agtgggtagg gtagggatgt tcgtcaagga ctgggactga ggtgatcggc 300

taaatgtacc gccagaacga gtcggccctc tcctgcttct acctcttcct cctctggttc 360

ttcttcttga aatagactcc acgccgcgcc aattcccagc ccgagcggga gccagctgct 420

caatccgtcg ttgagattgg ttgcggtttg ctctagcttg tgaactcggc ggagattttt 480

ggttttttgt tttggttttg ggtttggttg ggtgagtggt cgatcgatcg gaaggtgttc 540

gatcgattgc ttgcctgctt tgtgatggag ttggatctga acaacgtggc ggaaggggtg 600

gtggagaagc atgagacggc ggcgaggagc gactccggca cgtcggagtc gtcggtgctc 660

aacggggagg cgtctggcgc ggccatcgcg ccggcggaag aggggtcgag ctcgacgccg 720

ccgtcgccgc cgccgcctcc cgcggcggtg ctcgagttca gcatcctgag gagctcggcg 780

tcggcgtcgg gcgagaacga cgccgacgac gacgaggagg aggaggccac cccctcgccg 840

ccgccgcacc accaacacca gcagctgctc gtcacccggg agctattccc ttccgccgct 900

ccctcgccgc agcattgggc ggagctcggc ttcctccgcc ccgacccacc gcgcccacac 960

ccagacatca gaatcctcgc ccacgcgcct cccccggcgc caccgccgcc gccgccgcag 1020

ccgcagcctc aggcggccaa gaaaagccgc cgcgggccgc gctctcgcag ctcgcaatac 1080

cgcggcgtca ccttctaccg ccgcaccggc cgctgggaat cccacatctg ggattgcggc 1140

aagcaagtct acctaggtaa tttcatcgaa cacatcatct tcctcctctc aatccaacgc 1200

gacatcgcca tgaacaatct aacaaacacc ttcatcttct cccaaacaat cacaggtgga 1260

ttcgacactg ctcacgcagc tgcaaggtaa agaacacatc acatcattca tcagaacatg 1320

agctctgtgt ttgtgaagga gattgagaga attgaatgat gatggatgga tgcagggcgt 1380

acgacagggc ggcgatcaag ttcaggggag tagaggctga catcaacttc aacctgagcg 1440

actacgagga ggacatgagg cagatgaaga gcttgtccaa ggaggagttc gtgcacgttc 1500

tccggcgaca gagcaccggc ttctcccgcg gcagctcaaa gtacaggggt gtcaccctcc 1560

acaagtgcgg ccgctgggag gctcgcatgg gccaattcct tggcaagaag taagaacacc 1620

atatatatat atagctctct ctctctccat cttcttcttc ctcatctttt catttcaaca 1680

tgttcttgat ttattgtgat tgtgatcatc cattttgagt agggatgata gtaagtagag 1740

atagggtgtg attagatgca tagaacagat aagagttaag ctagaaatta ggcagtggat 1800

agggaattcc tcaccggtgg gaacgccatg cttggctgca ggtacatata tcttgggcta 1860

ttcgacagcg aagtagaggc tgcaaggtta tcatcagctt ggattctctt ctcttgtaca 1920

attgattcaa accaaaaaaa agtcttttct tttttaaaat tttactttct cgtgttgttg 1980

attttcgatg gaccttgtac cgactcgaat ctcctctctt tttttttctc ttcttttttc 2040

tcttctcgtt ttaaacatca gggcttatga taaggctgcg atcaaatgca atggcagaga 2100

agccgtcacc aacttcgagc ccagcacata tgatggtgag ctgcctactg atgctgctgc 2160

tcaaggtaac atgcgtgctg aatctgattt gattaaattt tttttctgta actgattaac 2220

tagctgatga actcagctct gaacagattt aattaaatcc gggttcaatt gtgatttctt 2280

attattttta ggagccgatg tggatctgaa cctgagaata tctcagcctg cagcctcaca 2340

gcagagcccc aagagggata gcggctccct tggcctgcaa atccaccatg gatcatttga 2400

aggttctgaa ttcaagagag caaaggcaag ttgcaattca gtcaaaattc ttccgatgga 2460

tgatttgttt gcatgtcaag caagttgcag taatgcgaaa gaaacacaaa agcataaata 2520

atcaagattc gctttcaccg tggtagcgac taaagtatga tgtgcaaatt gcatatgtag 2580

tcttctacct agtgtacttc atagacccca tttctattgc taccgtctaa atttgatttc 2640

tctattgtcg gacccaccat acgtacaaat tggccccaaa tttcatcaaa tagtaacaag 2700

tttctctttt tcttcctgat tacgttgtag gagcatctct ttcatgaaaa ctgtaaatga 2760

tattcaggat cactgcttag ttgatatttc aactgaaaaa cttgtgcttt gctgtgcaga 2820

atgatgcagc tccctctgaa cttgctagcc gccctcatcg gttccctctt ctgaccgagc 2880

atccgccaat ctggactgcc caacctcatc ccctattccc aaataatgag gtgaaaattt 2940

tgtagctttc aacactgtat ttagcttcat ccacttgcat ttcttgtgtg gctatcagtt 3000

tagctcaagt cttacatcaa tgtgcttcat ttccttccgg cctgtcgact tcagtagtat 3060

taatgcctgg cacaagtttc atatgtaggt tcttgaattt tcagaaaagg cctaattagg 3120

gtagcagtac tagtctatat gcattataaa tatgtttgat tttttcttca aaaggaactt 3180

cctagagagt tgacgatttc gcgttaggct ttttataaat cgtcagtcca actgttcctc 3240

tcaacgtgct aatatcttat aaaattagtg tcggctgttg ttcaaaattc cccattggga 3300

aagaaaaatg atactctgcc atcttgttat tattcagaat gattagtata ctacatcaat 3360

tggttattaa aagaggttag actggtttgc cgttagacat ttggacctgg gagttttgtt 3420

caaatttacc tctgagactt caaggatagc ttcagttacg tccttctctt attttccttg 3480

gacggaaagg tgatctcgac gtctgtagct gagatttctg tccaattgaa tcgtcgcaaa 3540

tccaatccga taatcatatt ttatccaaac aaaaatacaa tataatagtt cttggcaatt 3600

tgtacacctg tatcttgatg gatggataag aaattcagca agctaagcta agtacaattt 3660

ttcactgttt gatgatgcag gatgcatcca gatcatcgga tcagaagagg aagccatcag 3720

agggggtagc tgttccaagc tgggcatgga agcaggtgag ccatcatcac cctgctcctc 3780

ctcacacgct gccattgccc ttcttctcct cctcctcgtc gtcgccgtcg tcgtcctccg 3840

ctgcagcatc atcaggattc tccaaagccg ccacgacagc agctgctgcc caacacactg 3900

ccaccctccg gttcgacccg acggcgccgt cgtcttcgtc gtcaagccgc catcaccacc 3960

accattgata aaaaggaaag aagccatcac caccactgta aattttgccg ggaagccggc 4020

aaattttttt ttttcttggc cgtcgccggc gtttcaacgt tttcgtcttt gcgccggcgg 4080

gccggccggg tggtttcttg tagtgattag ttaattggga ttcatgactg tatttgcatc 4140

cacacataaa acgcccaaaa aatgttccaa atgctcctag tctctttgcc ccctgatctc 4200

agagaacaga tcatactaac ctgagatgta ttgatccaca caccttgttg tagagaattt 4260

gttatatcag ttactgagat tactaaacag tacaggcatc 4300

<210>2

<211>1539

<212>DNA

<213>稻属

<400>2

atggagttgg atctgaacaa cgtggcggaa ggggtggtgg agaagcatga gacggcggcg 60

aggagcgact ccggcacgtc ggagtcgtcg gtgctcaacg gggaggcgtc tggcgcggcc 120

atcgcgccgg cggaagaggg gtcgagctcg acgccgccgt cgccgccgcc gcctcccgcg 180

gcggtgctcg agttcagcat cctgaggagc tcggcgtcgg cgtcgggcga gaacgacgcc 240

gacgacgacg aggaggagga ggccaccccc tcgccgccgc cgcaccacca acaccagcag 300

ctgctcgtca cccgggagct attcccttcc gccgctccct cgccgcagca ttgggcggag 360

ctcggcttcc tccgccccga cccaccgcgc ccacacccag acatcagaat cctcgcccac 420

gcgcctcccc cggcgccacc gccgccgccg ccgcagccgc agcctcaggc ggccaagaaa 480

agccgccgcg ggccgcgctc tcgcagctcg caataccgcg gcgtcacctt ctaccgccgc 540

accggccgct gggaatccca catctgggat tgcggcaagc aagtctacct aggtggattc 600

gacactgctc acgcagctgc aagggcgtac gacagggcgg cgatcaagtt caggggagta 660

gaggctgaca tcaacttcaa cctgagcgac tacgaggagg acatgaggca gatgaagagc 720

ttgtccaagg aggagttcgt gcacgttctc cggcgacaga gcaccggctt ctcccgcggc 780

agctcaaagt acaggggtgt caccctccac aagtgcggcc gctgggaggc tcgcatgggc 840

caattccttg gcaagaagta catatatctt gggctattcg acagcgaagt agaggctgca 900

agggcttatg ataaggctgc gatcaaatgc aatggcagag aagccgtcac caacttcgag 960

cccagcacat atgatggtga gctgcctact gatgctgctg ctcaaggagc cgatgtggat 1020

ctgaacctga gaatatctca gcctgcagcc tcacagcaga gccccaagag ggatagcggc 1080

tcccttggcc tgcaaatcca ccatggatca tttgaaggtt ctgaattcaa gagagcaaag 1140

aatgatgcag ctccctctga acttgctagc cgccctcatc ggttccctct tctgaccgag 1200

catccgccaa tctggactgc ccaacctcat cccctattcc caaataatga ggatgcatcc 1260

agatcatcgg atcagaagag gaagccatca gagggggtag ctgttccaag ctgggcatgg 1320

aagcaggtga gccatcatca ccctgctcct cctcacacgc tgccattgcc cttcttctcc 1380

tcctcctcgt cgtcgccgtc gtcgtcctcc gctgcagcat catcaggatt ctccaaagcc 1440

gccacgacag cagctgctgc ccaacacact gccaccctcc ggttcgaccc gacggcgccg 1500

tcgtcttcgt cgtcaagccg ccatcaccac caccattga 1539

<210>3

<211>512

<212>PRT

<213>稻属

<400>3

Met Glu Leu Asp Leu Asn Asn Val Ala Glu Gly Val Val Glu Lys His

1 5 10 15

Glu Thr Ala Ala Arg Ser Asp Ser Gly Thr Ser Glu Ser Ser Val Leu

20 25 30

Asn Gly Glu Ala Ser Gly Ala Ala Ile Ala Pro Ala Glu Glu Gly Ser

35 40 45

Ser Ser Thr Pro Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ala Val Leu Glu

50 55 60

Phe Ser Ile Leu Arg Ser Ser Ala Ser Ala Ser Gly Glu Asn Asp Ala

65 70 75 80

Asp Asp Asp Glu Glu Glu Glu Ala Thr Pro Ser Pro Pro Pro His His

85 90 95

Gln His Gln Gln Leu Leu Val Thr Arg Glu Leu Phe Pro Ser Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Pro Gln His Trp Ala Glu Leu Gly Phe Leu Arg Pro Asp Pro

115 120 125

Pro Arg Pro His Pro Asp Ile Arg Ile Leu Ala His Ala Pro Pro Pro

130 135 140

Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Pro Gln Pro Gln Ala Ala Lys Lys

145 150 155 160

Ser Arg Arg Gly Pro Arg Ser Arg Ser Ser Gln Tyr Arg Gly Val Thr

165 170 175

Phe Tyr Arg Arg Thr Gly Arg Trp Glu Ser His Ile Trp Asp Cys Gly

180 185 190

Lys Gln Val Tyr Leu Gly Gly Phe Asp Thr Ala His Ala Ala Ala Arg

195 200 205

Ala Tyr Asp Arg Ala Ala Ile Lys Phe Arg Gly Val Glu Ala Asp Ile

210 215 220

Asn Phe Asn Leu Ser Asp Tyr Glu Glu Asp Met Arg Gln Met Lys Ser

225 230 235 240

Leu Ser Lys Glu Glu Phe Val His Val Leu Arg Arg Gln Ser Thr Gly

245 250 255

Phe Ser Arg Gly Ser Ser Lys Tyr Arg Gly Val Thr Leu His Lys Cys

260 265 270

Gly Arg Trp Glu Ala Arg Met Gly Gln Phe Leu Gly Lys Lys Tyr Ile

275 280 285

Tyr Leu Gly Leu Phe Asp Ser Glu Val Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp

290 295 300

Lys Ala Ala Ile Lys Cys Asn Gly Arg Glu Ala Val Thr Asn Phe Glu

305 310 315 320

Pro Ser Thr Tyr Asp Gly Glu Leu Pro Thr Asp Ala Ala Ala Gln Gly

325 330 335

Ala Asp Val Asp Leu Asn Leu Arg Ile Ser Gln Pro Ala Ala Ser Gln

340 345 350

Gln Ser Pro Lys Arg Asp Ser Gly Ser Leu Gly Leu Gln Ile His His

355 360 365

Gly Ser Phe Glu Gly Ser Glu Phe Lys Arg Ala Lys Asn Asp Ala Ala

370 375 380

Pro Ser Glu Leu Ala Ser Arg Pro His Arg Phe Pro Leu Leu Thr Glu

385390 395 400

His Pro Pro Ile Trp Thr Ala Gln Pro His Pro Leu Phe Pro Asn Asn

405 410 415

Glu Asp Ala Ser Arg Ser Ser Asp Gln Lys Arg Lys Pro Ser Glu Gly

420 425 430

Val Ala Val Pro Ser Trp Ala Trp Lys Gln Val Ser His His His Pro

435 440 445

Ala Pro Pro His Thr Leu Pro Leu Pro Phe Phe Ser Ser Ser Ser Ser

450 455 460

Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Gly Phe Ser Lys Ala

465 470 475 480

Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Gln His Thr Ala Thr Leu Arg Phe Asp

485 490 495

Pro Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg His His His His His

500 505 510

Claims

1.一种调节植物的产量，植物种子大小或粒重，植物种子的淀粉合成代谢，植物种子的淀粉结构或淀粉糊化温度的方法，其特征在于，所述方法包括：调节植物中RSR1蛋白的表达；

所述的RSR1蛋白是如SEQ ID NO:3氨基酸序列的蛋白；

所述的植物是水稻。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：降低植物中RSR1蛋白的表达；从而：

提高植物的产量、增加植物种子大小或粒重；

上调植物种子中淀粉合成基因的表达；

提高植物种子中直链淀粉含量；

下调植物种子中淀粉的糊化温度；

调节植物种子中支链淀粉的聚合度；或

调节植物种子中支链淀粉的不同类型链的比例。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述降低植物中RSR1蛋白的表达包括：

将干扰所述RSR1蛋白的编码序列表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官，从而下调植物中蛋白的表达。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：提高植物中RSR1蛋白的表达，从而：

下调植物种子中淀粉合成基因的表达；

调节植物种子中支链淀粉的聚合度；

调节植物种子中支链淀粉的不同类型链的比例；或

提高植物种子中淀粉的糊化温度。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括：将编码RSR1蛋白的多核苷酸转入植物细胞、组织、器官，获得转化入所述多核苷酸的植物细胞、组织、器官。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括：

(S2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(S1)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物细胞、组织、器官。

7.一种RSR1蛋白或其编码基因用途，用于调节植物的产量，植物种子大小或粒重，植物种子的淀粉合成代谢，植物种子的淀粉结构或淀粉糊化温度；

所述的RSR1蛋白是如SEQ ID NO:3氨基酸序列的蛋白；

所述的植物是水稻。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的RSR1蛋白或其编码基因：

用于下调植物种子中淀粉合成基因的表达；

用于调节植物种子中支链淀粉的聚合度；

用于调节植物种子中支链淀粉的不同类型链的比例；或

用于提高植物种子中淀粉的糊化温度。

9.如权利要求7或8所述的用途，其特征在于，所述的RSR1的编码基因序列如下：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。