CN103160541B - 调节植物种子淀粉理化性状的转录因子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及调节植物种子淀粉理化性状的转录因子。首次揭示一种转录因子OsbZIP58能够与淀粉合成相关基因SBE1和/或Wx的启动子结合，调节植物种子淀粉理化性状。因此，转录因子OsbZIP58本身及其调节剂可被应用于植物的品种改良。

Description

调节植物种子淀粉理化性状的转录因子

技术领域

本发明属于植物学和生物技术领域；更具体地，本发明涉及调节植物种子淀粉理化性状的转录因子。

背景技术

淀粉作为植物种子胚乳的主要组成成分，其含量和品质直接影响着水稻种子的品质。因此，研究淀粉合成的调控对于提高种子的品质具有重要意义。对于淀粉代谢过程，以往主要集中在淀粉合成基因本身的研究上，对淀粉代谢的调控研究目前还较少，已有报道表明，淀粉合酶GBSSII基因的表达受到生物节律的调节；蔗糖和ABA协同作用能够促进ADP葡萄糖焦磷酸化酶ADPGL3基因的表达，从而增加淀粉含量。

水稻是世界上最主要的粮食作物之一，全球二分之一的人口以稻米为主食。培育更优口感的栽培稻现在变为稻米消费者和育种学家的首要考虑。淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，淀粉的组成和结构是影响稻米产量品质的重要因素。水稻基因组中预测有27个基因编码淀粉合成酶类，这些基因分别表达在水稻叶片中或种子中。其中，14个预测的基因，包括AGP (OsAGPL3，OsAGPS2b，OsAGPL2)，GBSS(OsGBSSI)，SS(OsSSI，OsSSIIa，OsSSIIIa，OsSSIVb)，SBE(OsBEI，OsBEIIb)，DBE(OsISA2，OsISA1，OsP UL)和Pho1(OsPHOL)，主要表达在未成熟种子中并在开花后7天达到表达高峰(Dian et al.2005；Hirose andTerao 2004；Ohdan et al.2005)。这14个基因所编码的淀粉合成酶在胚乳淀粉合成中起到主要作用，其中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶催化AGP和1-P-葡萄糖转化为ADP-葡萄糖，后者是合成淀粉的直接原料。GBSSI/Wx在直链淀粉合成中起到关键作用，而其他酶参与支链淀粉合成(Tian et al.2009)。这些基因具有相似的表达特征，可见在水稻种子发育过程中有一个协同调控机制控制这些基因在特异的时期和部位表达。

某些蛋白参与调控淀粉合成酶类基因的表达已有报道。OsBP-5和OsBP-89形成异源二聚体调控水稻Wx基因的转录并且在OsBP5 RNAi植株中，成熟种子的直链淀粉含量减少(Zhu et al.2003)。FLOURY ENDOSPERM2(FLO2)编码一个功能未知的蛋白调控水稻籽粒大小和淀粉品质，在flo2突变体中淀粉合成酶类基因和编码储藏蛋白合成基因表达下调(She et al.2010)。RSR1是一个AP2/EREBP家族转录因子负调控种子特异淀粉合成酶类基因的表达，RSR1的缺陷可以增强种子中淀粉合成酶类基因的表达(Fu and Xue 2010)。

因此，本领域有必要进一步研究与调节植物种子淀粉合成代谢以及淀粉理化性状相关的基因或转录因子。

发明内容

本发明的目的在于提供调节植物种子淀粉合成以及淀粉理化性状的转录因子。

在本发明的第一方面，提供一种调节禾本科植物种子淀粉理化性状的方法，包括：调节禾本科植物中OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的表达，从而改变OsbZIP58蛋白或其同源蛋白与SBE1基因启动子和/或Wx(GBSSI)基因启动子的结合，调节禾本科植物种子淀粉理化性状。

在一个优选例中，所述的禾本科植物是水稻。

在另一优选例中，包括：抑制禾本科植物中OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的表达，减少OsbZIP58蛋白或其同源蛋白与SBE1基因启动子和/或Wx基因启动子的结合，从而降低禾本科植物种子重量、促进支链淀粉链长分布在DP9-15、DP38-50、降低淀粉糊化起始温度、升高淀粉糊化终止温度或减少禾本科植物种子的表观直链淀粉含量。

在另一优选例中，所述的OsbZIP58蛋白或其同源蛋白结合SBE1基因启动子C53片段(从Os06g0726400转录起始位点开始计算-116～-42，)和Wx基因启动子Ha-2片段(从Os06g0133000转录起始位点开始计算-1651～-1399)。

在另一优选例中，所述的OsbZIP58蛋白是：

(a)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)限定的蛋白功能的蛋白；

(c)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白的序列相同性高于70％(较佳地高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％；更佳地高于99％)，且具有(a)限定的蛋白功能的蛋白；或

(d)具有(a)限定的蛋白功能的SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白的活性片段。

在另一优选例中，所述的OsbZIP58蛋白的同源蛋白是来自于其它植物、特别是禾本科植物的，与水稻OsbZIP58蛋白具有较高同源性(序列一致性)的蛋白，且这种同源蛋白与OsbZIP58蛋白具有相同的功能。例如，在玉米中有同源基因OPAQUE2(O2)，蛋白序列一致性38％；大麦中同源基因BLZ1，蛋白序列一致性45％；高粱中同源基因SBO2，蛋白序列一致性47％，这些基因都在种子中特异表达。

在另一优选例中，采用核酸抑制物抑制禾本科植物中OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的表达，所述的核酸抑制物选自：

dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA；或

能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

在另一优选例中，所述的核酸抑制物是dsRNA或能形成所述dsRNA的构建物，其具有如下结构：

其中，

Seq’_正向是与OsbZIP58或其同源基因的mRNA互补的DNA片段，长度为50～500nt(较佳地80～300nt；更佳地150～250nt；更佳地为180～220nt)；Seq’_反向为与Seq’_正向互补的序列；

X’为无；或为位于Seq’_正向和Seq’_反向之间的间隔序列，所述间隔序列与Seq’_正向和Seq’_反向不互补；

||表示在Seq’_正向和Seq’_反向之间形成的氢键。

在另一优选例中，所述的Seq’_正向的序列是OsbZIP58基因序列(SEQ ID NO：1)中第115～313位。

在另一优选例中，所述的构建物是表达载体(质粒)。

在另一优选例中，所述的间隔序列长度为50～300nt；较佳地80～200nt；更佳地100～180nt；更佳地为154nt。

在另一优选例中，提高禾本科植物中OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的表达，从而增加OsbZIP58蛋白或其同源蛋白与SBE1基因启动子和/或Wx基因启动子的结合，从而调控SBE1基因和/或Wx基因的表达，改变禾本科植物种子淀粉理化性状。

在本发明的另一方面，提供一种OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的用途，用于结合SBE1基因启动子和/或Wx基因启动子，调节禾本科植物种子淀粉理化性状。

在另一优选例中，所述的OsbZIP58蛋白结合SBE1基因启动子C53片段。

在另一优选例中，所述的OsbZIP58蛋白结合Wx基因启动子Ha-2片段。

在本发明的另一方面，提供一种OsbZIP58蛋白或其同源蛋白或它们的编码基因的调节剂的用途，用于调节禾本科植物种子淀粉理化性状。

在一个优选例中，所述的调节剂是下调剂，用于抑制禾本科植物中OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的表达，减少OsbZIP58蛋白或其同源蛋白与SBE1基因启动子和/或Wx基因启动子的结合，从而降低禾本科植物种子重量、促进支链淀粉链长分布在DP9-15、DP38-50、降低淀粉糊化起始温度、升高淀粉糊化终止温度或减少禾本科植物种子的表观直链淀粉含量。

在另一优选例中，所述的下调剂是核酸抑制物，其是dsRNA或能形成所述dsRNA的构建物，具有如下结构：

其中，

Seq’_正向是与OsbZIP58或其同源基因mRNA互补的DNA片段，长度为50～500nt(较佳地80～300nt；更佳地150～250nt；更佳地为180～220nt)；Seq’_反向为与Seq’_正向互补的序列；

X’为无；或为位于Seq’_正向和Seq’_反向之间的间隔序列，所述间隔序列与Seq’_正向和Seq’_反向不互补；

||表示在Seq’_正向和Seq’_反向之间形成的氢键。

在本发明的另一方面，提供一种OsbZIP58蛋白或其同源蛋白或它们的编码基因的下调剂，其是dsRNA或能形成所述dsRNA的构建物，具有如下结构：

其中，

Seq’_正向是与OsbZIP58 mRNA互补的DNA片段，长度为50～500nt(较佳地80～300nt；更佳地150～250nt；更佳地为180～220nt)；Seq’_反向为与Seq’_正向互补的序列；

X’为无；或为位于Seq’_正向和Seq’_反向之间的间隔序列，所述间隔序列与Seq’_正向和Seq’_反向不互补；

表示在Seq’_正向和Seq’_反向之间形成的氢键。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、酵母单杂交系统载体图示。

A，含AD domain的酵母表达载体。

B，含启动子片段的鱼饵载体。

图2、OsbZIP58结合Sbe1和Wx基因启动子片段。Ck为阴性对照空载体pPC86。

A，X-gal底物显色平板。

B，CPRG底物定量显示OsbZIP58结合能力。

图3、OsbZIP58 RNAi植株的表型和分子检测。

A，OsbZIP58 RNAi载体的结构。

B，Southern杂交检测OsbZIP58 RNAi-1和RNAi-2植株T-DNA插入拷贝数。

C-E，OsbZIP58 RNAi-1(C)，OsbZIP58 RNAi-2(D)和ZH11(E)的T1代成熟种子表型。

F，T0代一些单株OsbZIP58基因的表达水平检测。

图4、OsbZIP58基因的表达模式。

(A)OsbZIP58基因表达的组织特异性半定量检测。

(B)和(C)OsbZIP58基因在开花后5和7天的原位杂交图。

(D)开花后7天的正义链探针负对照。

P，种皮；DV，背部维管束；E，胚乳。其中，(B)Bar＝100um；(C)和(D)Bar＝200um。

图5、OsbZIP58R NAi转基因植株的种子横切面表型。

图6、OsbZIP58R NAi转基因植株种子中的淀粉组成与结构变化。

每个数据都做3个生物学重复，**：P＜0.01。

A：胚乳中的总淀粉含量(百分数为重量百分数)。

B：胚乳中的表观直链淀粉含量(百分数为重量百分数)。

C：胚乳中的可溶性糖含量(百分数为重量百分数)。

D：OsbZIP58 RNAi-1(OsbZIP58 RNAi-1-p1301M)，OsbZIP58 RNAi-2(OsbZIP58 RNAi-2-p1301M)和对照植株的种子中的淀粉链长分布差异。

图7、OsbZIP58 RNAi植株开花后7天的未成熟种子中淀粉合成酶类基因的表达检测。^*P＜0.05，^**P＜0.01。

图8、In vivo，OsbZIP58可以通过和水稻淀粉合成酶基因启动子区相结合来直接调控淀粉的合成。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示一种转录因子OsbZIP58能够与淀粉合成相关基因SBE1和/或Wx(GBSSI)的启动子结合，调节植物种子淀粉理化性状。因此，转录因子OsbZIP58本身及其调节剂可被应用于植物的品种改良，获得淀粉合成性状或淀粉理化性状发生改变的植物。

植物

如本文所用，所述的“植物”为适合进行基因的转化操作的植物，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。

作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：禾本科植物、茄科植物、大戟科植物等。比如，所述的“植物”包括但不限于：水稻、小麦、玉米、马铃薯、木薯等。较佳的，所述的植物是禾本科植物。

转录因子及淀粉合成相关基因

碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper，bZIP)蛋白是真核生物的转录因子和阻抑蛋白中最大而且最保守的类型之一。迄今为止，研究表明bZIP蛋白分布在从高等植物至哺乳动物等不同的真核生物物种之中。在植物中，bZIP蛋白与种子贮藏基因表达、光形态发生及器官建成的控制相关。

水稻亮氨酸拉链蛋白58(Oryza sativa basic leucine zipper(bZIP)protein 58；OsbZIP58)是水稻bZIP转录因子的一种，又名RISBZ1。有报道表明OsbZIP58/RISBZ1通过结合水稻胚乳中储藏蛋白启动子的GCN4元件对水稻胚乳中储藏蛋白合成起到直接调控作用。另有报道显示OsbZIP58/RISBZ1调控水稻种子中赖氨酸含量。前人的研究未能说明OsbZIP58对淀粉合成途径的调控机制。

淀粉分支酶I(starch-branching enzyme I；SBE1)和蜡质基因(waxy；Wx)；是本领域公知的参与水稻胚乳中淀粉合成的基因。

与淀粉粒结合存在的淀粉合成酶称颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)，水稻中的GBSS有两种同工酶，GBSS I和GBSS II。GBSS I是胚乳直链淀粉合成过程中的关键酶，由Wx基因编码。淀粉合成酶催化ADPG以α-1，4糖苷键掺入葡聚糖引物的非还原末端，延长一个葡萄糖单位，最终形成α-1，4糖苷键连接的聚糖。水稻wx突变体的种子直链淀粉完全缺失，胚乳呈现垩白表型。

淀粉分支酶(SBE)具有双重功能，一方面可以切开α-1，4糖苷键连接的葡聚糖，另一方面能催化α-1，6糖苷健的形成，这对于支链淀粉结构的形成有着重要的作用。水稻中的SBE1基因在未成熟种子的胚乳中高表达，sbe1突变体种子的支链淀粉精细结构发生改变，中等长度链(DP12至21)和长链(DP＞37)显著减少，短链(DP＜10)显著增加，中等长度链(DP24至34)略有增加。说明SBE I基因功能是特异合成支链淀粉B₁链和B_2-3链。

作为本发明的一种优选方式，所述的OsbZIP58转录因子(蛋白)的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：2的序列基本上相同；其核苷酸序列可以与SEQ ID NO：1所示的序列基本上相同。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的OsbZIP58蛋白或其同源蛋白或它们的生物活性片段的氨基酸序列也包括在本发明中。OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biologyof The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。

任何一种OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的OsbZIP58蛋白的全部或部分功能(与淀粉合成相关基因SBE1和/或Wx的启动子结合)。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长OsbZIP58蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长OsbZIP58蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在多种植物、特别是禾本科植物中，存在OsbZIP58蛋白的同源蛋白。因此，可以理解，来源于不同植物的OsbZIP58的同源蛋白均包含于本发明中。较佳地，它们是与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列相比，序列相同性(同一性、一致性)高于30％；更佳地高于40％；更佳地高于50％；更佳地高于60％，更佳地是高于70％，更佳地是高于80％，更佳地是高于85％，更佳地是高于88％，更佳地是高于90％，更佳地是高于95％，更佳地是高于98％的蛋白。

本发明也可采用经修饰或改良的OsbZIP58蛋白或其同源蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的OsbZIP58蛋白或其同源蛋白。所述经过修饰或改良的OsbZIP58蛋白或其同源蛋白可以是一种OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的OsbZIP58蛋白或其同源蛋白可以是与天然存在的OsbZIP58蛋白或其同源蛋白具有较小的共同点，但也能与淀粉合成相关基因SBE1和/或Wx的启动子结合，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

本发明还提供了编码OsbZIP58蛋白或其同源蛋白或它们的保守性变异多肽的多核苷酸，该多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2序列的蛋白，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与OsbZIP58蛋白或其同源蛋白或蛋白片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明人鉴定了在水稻Wx基因5’上游区有5个DNA片段(Ha-2，Hc-1，Hc-2，Hd和Re)，水稻未成熟种子抽提的核蛋白可以结合这5个片段(Chen et al.1996a)。在凝胶滞后实验中，Ha-2片段可以和SBE1基因启动子区的C53片段竞争。拟南芥中淀粉合成的研究表明，关键的淀粉合成基因的空间共表达模式也是通过调控启动子活性实现的(Tsai et al.2009)。现有技术公知，Wx基因负责直链淀粉合成，SBE1基因参与支链淀粉合成。因此，本发明人推测水稻胚乳中存在一个直链淀粉合成和支链淀粉合成的共调节机制，这些共调节因子可能是转录因子，通过结合淀粉合成基因启动子共有元件起到作用。

为了证实上述推测，同时也为了系统地研究水稻bZIP类转录因子在胚乳淀粉合成中的作用，本发明人搜索了网上水稻基因序列资源，将数据库中所有预测在水稻种子中表达的bZIP类转录因子基因都构建成靶质粒，分别以Wx基因和SBE1基因的启动子区作诱饵，进行酵母单杂交实验，筛选到4个能够与Wx基因和SBE1基因的启动子区结合的bZIP转录因子。进一步研究发现，其中一个bZIP转录因子OsbZIP58能广泛结合水稻的淀粉合成酶基因的启动子，在其表达受部分抑制的转基因植株中，一些淀粉合成酶基因表达受到了影响，淀粉成分和结构也受到了影响。因此，OsbZIP58通过直接结合淀粉合成酶基因启动子，在水稻胚乳的淀粉合成中起到了重要的调控作用。

因此，本发明提供了所述的OsbZIP58蛋白或其同源蛋白或它们的编码基因的用途，用于调节植物中淀粉合成的性状(通过与淀粉合成相关基因SBE1和/或Wx的启动子结合)；或用于筛选对于调节植物中淀粉合成性状有用的物质(即：所述物质通过调节OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的表达来调节植物淀粉合成代谢的性状)。

此外，本发明还涉及利用OsbZIP58蛋白或其同源蛋白或它们的编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用OsbZIP58蛋白或其同源蛋白或它们的编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的表达情况，鉴定禾本科植物的淀粉合成或代谢性状。还可利用OsbZIP58基因或其同源基因相关的植物淀粉合成或代谢特性作为杂交制种过程中真杂种的指示标记。

OsbZIP58的调节剂及调节方法

本发明还涉及OsbZIP58或其同源蛋白的调节剂及其用途。由于OsbZIP58或其同源蛋白的调节可改变蛋白表达和/或活性等，因此，所述的调节剂也可通过对OsbZIP58或其同源蛋白的影响来调节植物淀粉代谢的性状，从而达到改良植物的目的。

任何可提高OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的活性、提高OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的稳定性、促进OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的表达、延长OsbZIP58蛋白或其同源蛋白有效作用时间、或促进OsbZIP58或其同源基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调节植物淀粉合成代谢的物质。

任何可降低OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的活性、降低OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的稳定性、抑制OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的表达、减少OsbZIP58蛋白或其同源蛋白有效作用时间、或降低OsbZIP58或其同源基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为OsbZIP58或其同源蛋白的下调剂、拮抗剂或抑制剂，如抗所述OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的抗体，干扰所述OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的编码基因表达的干扰分子(如可形成microRNA的干扰分子)。所述的下调剂、拮抗剂或抑制剂可用于调节植物淀粉合成代谢。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的干扰分子的方法是本领域人员熟知的。

在得知了所述的OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带OsbZIP58基因或其同源基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的OsbZIP58蛋白或其同源蛋白。此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的表达或使之缺失表达，比如将携带反义OsbZIP58基因或其同源基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达OsbZIP58蛋白或其同源蛋白。

本发明还提供了一种调节植物种子淀粉理化性状的方法，包括：调节植物中OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的表达，从而改变OsbZIP58蛋白或其同源蛋白与SBE1基因启动子和/或Wx基因启动子的结合，调节植物种子淀粉理化性状。

作为一种优选方式，所述方法包括：提高植物中OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的表达，从而增加OsbZIP58蛋白或其同源蛋白与SBE1基因启动子和/或Wx基因启动子的结合，从而调控SBE1基因和/或Wx基因的表达，改变植物种子淀粉理化性状。作为本发明的一种实施方式，将编码OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达OsbZIP58蛋白或其同源蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的植物。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。

优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

(1)将外源的OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的编码基因转入植物细胞、组织、器官或组织，获得转化入OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了外源OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物植株。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的编码基因；

(s2)将植物细胞、组织、器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(s3)选择出转入OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；以及

(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。

其它增加OsbZIP58基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强OsbZIP58基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻Wx基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该OsbZIP58基因或其同源基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。

作为另一种优选方式，所述方法包括：抑制植物中OsbZIP58蛋白或其同源蛋白的表达，减少OsbZIP58蛋白或其同源蛋白与SBE1基因启动子和/或Wx基因启动子的结合，从而降低植物种子重量、促进支链淀粉链长分布在DP9-15、DP38-50、降低淀粉糊化起始温度、升高淀粉糊化终止温度或减少禾本科植物种子的表观直链淀粉含量。

根据本发明所提供的OsbZIP58基因序列，可设计出用于表达dsRNA、反义核酸、小干扰RNA或微小RNA的构建物。因此，本发明提供了一种人工构建的构建物。根据本发明提供的基因及其序列来设计所述的构建物是本领域技术人员可了解的，通常可使该构建物包含一个内含子序列(与两侧序列不互补)，两端连接上互补的基因序列，导入细胞后，能产生“茎环”结构，并且“茎”状部分能够形成dsRNA、反义核酸、小干扰RNA或微小RNA，这种dsRNA、反义核酸、小干扰RNA或微小RNA能特别有效的抑制目的基因的表达。

根据本发明的一种优选方式，所述的核酸抑制物具有如下结构：

其中，Seq’_正向是与OsbZIP58或其同源基因的mRNA互补的DNA片段；Seq’_反向为与Seq’_正向互补的序列；X’为无；或为位于Seq’_正向和Seq’_反向之间的间隔序列，所述间隔序列与Seq’_正向和Seq’_反向不互补；||表示在Seq’_正向和Seq’_反向之间形成的氢键。

所述的核酸抑制物可通过常规转基因技术转入植物中，以达到改良植物淀粉合成性状的目的。所述的构建物可以制备成可形成多于1个茎环结构的形式，例如，可以包含2个或2个以上的茎环结构。

通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建物。所述的表达载体通常还含有与所述的构建物操作性相连的启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡那霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化植物。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

材料与方法

植物材料

粳稻中花11(Oryza sativa L.subsp.Japonica cv.Zhonghua 11，简称ZH 11)及以中花11为背景的OsbZIP58RNAi转基因植株种植于人工气候室。

水稻田间种植于上海市农科院良种繁育基地。

水稻OsbZIP58转录因子的克隆和酵母单杂筛选

根据TIGR网站上预测的序列(网址http://rice.plantbiology.msu.edu/；序列登录号：LOC_Os07g08420.1)设计引物扩增OsbZIP基因的读码框(ORF区)，引物序列见表1中GE0121(正向引物)和GE0122(反向引物)。以水稻ZH11未成熟种子cDNA为模板，扩增反应条件：KOD-plus(TOYOBA)，94℃下预变性4min；94℃30s；60℃30s；68℃1min；循环30次；68℃延伸5min。扩增产物经胶回收后，连接至pBSK载体(购自默克公司)EcoRV位点，用PCR与酶切鉴定阳性克隆，送Invitrogen公司测序。

表1.引物名称和序列一览表

实验所用酵母菌株为EGY48(MATα，his-，trp-，leu-，ura-)(购自英俊公司)。SBE1基因启动子C53片段(Os06g0726400(NCBI)，-116～-42，从转录起始位点开始计算)和Wx基因启动子Ha-2片段(Os06g0133000，-1651～-1399，从转录起始位点开始计算)分别串联双拷贝并分别克隆至鱼饵质粒p178(Chen etal.1996b)的XhoI位点，获得p178-C53、p178-Ha。p178本身含Pcyc1最小启动子，插入启动子片段位于Pcyc1上游，此杂合启动子将驱动LacZ报告基因的表达。

将前述PCR扩增获得的OsbZIP58基因的读码框融合同框连接至表达载体pPC86(购自英俊)中的GAL4AD区的EcoRI-SacI位点之间(去除OsbZIP58基因的ATG，以GAL4AD的ATG为起始密码子，GAL4AD和OsbZIP58ORF翻译为一个蛋白)，获得pPC86-OsbZIP58质粒。

先将诱饵质粒p178-C53，p178-Ha转化至EGY48菌株(MATα，his-，trp-，leu-，ura-)，再转入pPC86-OsbZIP质粒，在双缺显色培养基上进行显色(SD/-ura-trp+x-gal)，检测LacZ基因的表达。以CPRG为底物，按照Clontech YeastProtocols Handbook标准方法定量检测pPC86-OsbZIP58对启动子的结合能力。

OsbZIP58RNAi转基因植株的获得

分析OsbZIP58DNA序列，选取基因特异区段设计引物，引物序列见表1中GE0279(正向引物)和GE0280(反向引物)扩增得到正向片段，GE0281(正向引物)和GE0282(反向引物)扩增得到反向片段，扩增产物(其中包括OsbZIP58基因中+115～+313)正向片段BamHI酶切后连入转化载体pCAMBIA1301-35S-int的外源Intron前BamHI位点；反向片段SalI/PstI酶切后连入转化载体pCAMBIA1301-35S-int的外源Intron后SalI/PstI位点形成RNAi发夹结构。

pCAMBIA1301-35S-int改造自pCAMBIA1301，插入CaMV 35S启动子在pCAMBIA1301载体的EcoRI位点和SacI位点之间；插入T7终止子在pCAMBIA1301载体PstI和SphI之间；外源Intron序列插入到BamHI/XbaI位点，该外源Intron来自拟南芥基因actin-11(ATU27981)，Intron序列为GATTACGTAAGTAGAACTTAAACACCTACACCATTTTTTTAATCACTACTACCCATTGCATTGAACAAACTTCAAGTTCTTCTTAGCTTCAGATTAAGAAAGTACCCTTCCTTGGCTTTGTTGATGTGGTACCATTGTCTTGTGTGTTTGCAGG(SEQ ID NO：47)。

构建完成的RNAi载体转化根癌农杆菌EHA105，对水稻中花11幼胚诱导获得的愈伤组织进行转化(Liu et al.1998)。对T0代转基因植株观察表型并进行RT-PCR分析检测目标基因的下调情况。

OsbZIP58RNAi转基因植株，选取T1代符合3∶1分离比的两个株系，收集T2代纯合株叶片进行Southern检测，确定为单拷贝插入且OsbZIP58基因下调比较明显的两个株系进行进一步分析。从T2代纯合株上收获的T3代成熟种子用于淀粉理化性状分析。

Southern检测

从水稻叶片中提取的总DNA(10μg)，限制性酶切后，用1％琼脂糖凝胶电泳分离，中性条件下转移至带正电尼龙膜(Amersham)，Southern探针标记和杂交采用ECL核酸标记和检测试剂盒(RPN3690，GE，USA)。潮霉素抗性基因探针使用质粒pCAMBIA1301XhoI酶切后的1.1kb潮霉素抗性基因片段。

半定量RT-PCR检测

按照TRIzol总RNA提取试剂说明书的方法，本发明人提取了RNAi转基因植株T2代部分单株开花后7天的未成熟种子材料的总RNA，用DNaseI(TaKaRa)对总RNA进行消化，经琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量后，以Oligo(dT)18为引物，ImProm-II^TM逆转录酶(Promega)进行反转录合成cDNA。以OsActin1为内参基因，引物GE0013(正向引物)+GE0014(反向引物)序列见表1，扩增26个循环；OsbZIP58RT-PCR引物GE0332(正向引物)+GE0333(反向引物)序列见表1，扩增30个循环。

原位杂交

原位杂交采用地高辛标记方法(Dong et al.2005)。为了合成OsbZIP RNA探针，设计引物GE0336 5’-GCGGATCCATGGAGCACGTGTTCGCCG-3’和GE0311 5’-GCAAGCTTAAGGATCATATTTCCCATTGCC-3’，扩增OsbZIP58基因CDS区1-699bp区段，克隆至pBSK载体(购自默克公司)。

质粒模板酶切并沉淀完成转录模板线性化。RNA探针按照转录试剂盒体系进行地高辛标记，并沉淀回收RNA探针，重溶于TE，检测探针标记效率后用于原位杂交。

淀粉粒结构的观察

将完全干燥的水稻种子用解剖刀沿种子的横轴轻切，使其自然断裂，断面用铜金粉包覆后在扫描电镜(JEOL JSM-6360LV，Tokyo，Japan)下观察。

未成熟种子解剖学观察

未成熟种子用50％FAA浸泡，抽真空后4℃固定过夜。经不同浓度酒精系列脱水，样品用环氧树脂包埋并切成2-3μm厚薄片；42℃展片过夜后，0.5％甲苯胺蓝染色，封片后用显微镜观察(Olympus BX53 plus DP72)。

水稻胚乳淀粉品质检测

水稻的种子去壳(台州粮仪厂JIGJ4.5型检验砻谷机)，脱糙(Kett Pearlest精米机)，再用旋风式磨粉机(Cyclotec 1093，FOSS，USA)将精米磨成米粉，过150目筛，所得样品供检测用(总淀粉含量测定，直链淀粉含量测定，可溶性糖测定，DSC测定)。米粉纯化为淀粉后进行支链淀粉链长测定。总淀粉相对含量测定，使用Megazyme公司Total Starch Assay Kit(K-TSTA，Megazyme，Ireland)，按照其实验手册操作。表观直链淀粉相对含量用碘蓝法测定，按照Tan等报道的方法进行(Tan et al.1999)。可溶性总糖测定用硫酸-蒽酮比色法测定：称取50mg米粉，用80％(v/v)乙醇80℃振荡摇晃40分钟，洗两次；合并上清并用水定容至15ml。取100ul加入硫酸-蒽酮试剂620nm处读取吸光度测定糖含量。

米粉热力学特性的测定在差示扫描量热仪DSC(Different scanningcalorimeter)(德国，耐驰公司，DSC 200F3)上进行，用配套的分析软件进行分析。温度范围为20℃～120℃，得到试样的DSC热效应曲线，其特征参数包括淀粉糊化时的热焓(ΔH)变化、起始温度(To)、峰值温度(Tp)、终结温度(Tc)。

支链淀粉链长分配测定采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC-PAD)技术，参照Nagamine和Komae报导的方法(Nagamine andKomae 1996)。米粉纯化为淀粉后进行支链淀粉链长测定。用ICS3000离子色谱仪(Dionex，CA，USA)，带有PAD检测器和PA-20色谱柱。以50mM-350mM线性梯度的醋酸钠进行淋洗，淋洗速度0.5ml/min。不同链长所对应的峰面积用PeakNet软件(Dionex，CA，USA)进行分析。计算相对峰面积作图。

定量PCR

以人工种植的中花11和T3代纯合RNAi植株为材料，开花当天标记颖壳，开花后7天(7DAF)取材。每粒未成熟种子为一个生物学重复，利用Plant PlusReagent试剂(DP437，Tiangen，China)提取未成熟种子材料的总RNA，用DNaseI(D2210，TaKaRa，Japan)对总RNA进行消化，经琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量后，取2μg RNA以Oligo(dT)18为引物，ImProm-II^TM逆转录酶(A3801，Promage，USA)进行反转录合成cDNA。反转录产物稀释16倍，取2μl作为定量PCR模板。定量PCR扩增使用Premix Ex Taq^TM(DRR041，TaKaRa，Japan)，用Bio-Rad My-IQ 2定量PCR仪(Bio-Rad，USA)进行反应，用IQ5软件将所有反应设置一致的基线后读得Ct值，用水稻基因OsUBQ10(AK101547)做内标，根据公式Ratio＝[(E_target)^{ΔCt，target(calibrator-test)}]/[E(_ref)^{ΔC，tref(calibrator-test)}]计算得到上下调数值。定量PCR引物为OsAGPS2b(GE0348/GE0349)，OsAGPL2(GE0352/GE0353)，OsAGPL3(GE0548/GE0549)，OsSSI(GE0354/GE0355)，OsSSIIa(GE0356/GE0357)，OsSSIIIa(GE0556/GE0557)，OsSSIVb(GE0360/GE0361)，OsGBSSI(GE0362/GE0363)，OsBEIIb(GE0364/GE0365)，OsISA1(GE0366/GE0367)，OsPUL(GE0368/GE0369)，OsBEI(GE0386/GE0387)，UBQ10(GE0422/GE0423)，OsPHOL(GE0841/GE0842)，OsISA2(GE0566/GE0567)，OsbZIP58(GE0390/GE0391)，序列见表1。

染色质免疫共沉淀(ChIP)

以原核表达的多肽OsbZIP58(1-233aa，LOC_Os07g08420)为抗原，交由英基公司制备兔多抗；兔多抗经亲和纯化后，每次2μg用于ChIP实验。水稻开花后7DAF左右未成熟种子0.5g，经甲醛交联后提取核蛋白-DNA复合物(Haring et al.2007)。用超声波细胞破碎仪(JY92-II DN，宁波新芝)将基因组DNA打断(200W)。按照试剂盒EZ-ChIP Assay Kit(EZ ChIP17-371，MILLPORE，USA)进行后续处理，直至得到解交联的DNA片段。负对照抗体为试剂盒提供的Normal Rabbit IgG。PCR引物序列见表5，均为扩增35个循环。

实施例1、OsbZIP58结合SBE1和Wx基因启动子片段

将OsbZIP58的CDS区连接至酵母单杂交系统的表达载体pPC86中的GAL4AD区(图1A)，然后将质粒分别转化到含鱼饵质粒p178-C53的酵母和含鱼饵质粒p178-Ha的酵母(图1B)中。通过报告基因LacZ的表达来分析蛋白OsbZIP58与这两个启动子片段的结合能力，空载体pPC86为阴性对照(Ck-)。

结果显示，在酵母系统中OsbZIP58蛋白可以结合SBE1基因启动子C53片段和Wx基因启动子Ha片段(图2)。

实施例2、OsbZIP58RNAi植株的获得与表型

选择OsbZIP58基因特异区段构建了RNAi质粒(图3A)，转化水稻中花11，获得了T0代转基因株系33个。对种植的转基因植株进行表型观察发现：OsbZIP58的RNAi转基因植株有较多株系出现高比例腹白表型种子(表2)；对T0代各单株OsbZIP58基因的表达水平检测表明，腹白表型与OsbZIP58基因表达下调一致(图3F)。

从OsbZIP58RNAi转基因植株的T0代中选择了腹白表型显著、OsbZIP58基因下调明显的四个株系种植T1代：A043-1，6，11和15。经T1代分离比鉴定和Southern鉴定(图3B)，选择了A043-6&15两个T-DNA插入为单拷贝的株系的后代，命名为OsbZIP58RNAi-1和OsbZIP58RNAi-2，用于纯合株筛选和淀粉组分分析。这两个株系的T1代纯合植株中，未成熟种子中OsbZIP58基因表达分别下调至0.61倍和0.45倍，同时成熟种子也呈现高比例的腹白表型(图3C，D)。这两个株系的T2代植株种植于大田，从T2代纯合植株上收获的T3代成熟种子，仍呈现了腹白表型。这说明腹白表型可遗传，因此本发明人认为转基因植株中种子的腹白表型是OsbZIP58基因表达水平下降所引起。

表2、OsbZIP58RNAi T0代转基因植株成熟种子腹白表型统计表

株系编号	总粒数	腹白粒数	腹白粒百分比
				A025-1(CK)	21	3	14.29％
A025-2(CK)	20	0	0.00％
				A043-1	24	15	62.50％
A043-2	22	7	31.82％
				A043-3	25	7	28.00％
A043-4	20	4	20.00％
				A043-5	20	6	30.00％
A043-6	33	18	54.55％

A043-8	25	5	20.00％
				A043-9	20	0	0.00％
A043-10	23	12	52.17％
				A043-11	25	19	76.00％
A043-13	24	14	58.33％
				A043-14	25	11	44.00％
A043-15	18	14	77.78％
				A043-16	14	5	35.71％
A046-1	45	12	26.67％
				A046-5	44	9	20.45％
A046-7	44	29	65.91％
				A046-8	40	15	37.50％
A046-9	24	8	33.33％
				A046-10	38	14	36.84％
A046-13	50	12	24.00％
				A046-14	42	13	30.95％
A046-15	35	5	14.29％
				A046-16	32	6	18.75％

实施例3、OsbZIP58基因在水稻种子发育过程中的时空表达模式

为了了解OsbZIP58基因的时空表达模式，本发明人收集了中花11的根、茎、叶等组织材料和开花后各天未成熟种子材料，对该基因表达的组织特异性和时期特异性进行了检测。RT-PCR结果表明，该基因在种子中特异表达，5-10DAF未成熟种子中表达较高(图4A)。

然后本发明人用原位杂交的方法检测了OsbZIP58基因的在水稻发育早期至中期的未成熟种子中表达部位，结果如图4B-D所示，开花后5DAF时，OsbZIP58在果皮中高量表达，在胚乳中表达很微弱，在背部维管束区域也有表达(图4B)。开花后7DAF时，OsbZIP58在果皮中表达略有减弱，在胚乳的中心区域中表达增强(图4C)。作为负对照的正义探针没有信号(图4D)。

以上结果显示的OsbZIP58基因表达模式与报道的部分淀粉合成酶类基因的表达模式非常类似(Hirose and Terao 2004)。这暗示了OsbZIP58基因不仅是一个具有种子特异性表达模式的转录因子，而且提示其参与调控淀粉合成酶类基因的表达。

实施例4、OsbZIP58影响种子形态和淀粉颗粒形态

从成熟种子横切面上可以看到，与对照植株(转入p1301M；CK)相比，OsbZIP58RNAi-1和OsbZIP58RNAi-2株系的种子有从中心区域到腹部的垩白区域，垩白区域淀粉粒近球形，包裹松散，淀粉粒之间空隙增大(图5)。

对OsbZIP58RNAi转基因植株的种子大小进行了测量，成熟种子显著变窄，OsbZIP58RNAi-2的种子还比对照(转入p1301M；CK)种子薄而长，OsbZIP58RNAi转基因植株的千粒重也比对照植株的种子轻(表3)。

表3、OsbZIP58RNAi-2种子的大小和千粒重

a：N＝50，平均值±标准差；

^*P＜0.05，^**P＜0.01。

实施例5、OsbZIP58对胚乳淀粉理化性质的影响

OsbZIP58RNAi转基因植株种子的淀粉颗粒形态发生了变化，提示了淀粉成分和结构也可能发生变化，所以本发明人测量了淀粉组成和支链淀粉的链长分布。

结果表明，OsbZIP58RNAi转基因植株种子的总淀粉含量和可溶性糖含量，呈现无规律的变化(图6A和C)，OsbZIP58RNAi-2植株种子的表观直链淀粉含量显著减少(图6B)。

为了进一步分析改变OsbZIP58基因表达对支链淀粉精细结构的影响，野生型和OsbZIP58RNAi转基因植株的胚乳淀粉用异淀粉酶去分支，利用HPAEC-PAD的方法分析支链淀粉的链长分布(Nagamine and Komae 1996；Yamakawa et al.2007)。OsbZIP58RNAi转基因植株的支链淀粉链长分布和野生型相比，DP9至15、DP38至50显著增加，DP17至34显著减少(图6D)。其中，DP指葡聚糖单体的数目，是公认的支链淀粉去分支后，各分支的长度单位。

为了进一步分析OsbZIP58基因对淀粉理化性质的影响，胚乳淀粉的糊化温度用差示热量扫描法(DSC)进行分析。OsbZIP58RNAi-1转基因株系胚乳淀粉糊化的起始温度(To)比对照(转入p1301M；CK)低1.6℃，终止温度(Tc)高1.6℃；OsbZIP58RNAi-2转基因株系胚乳淀粉糊化的终止温度(Tc)比对照高1.6℃(表4)。转基因株系淀粉糊化终止温度和起始温度差值较大表示其淀粉颗粒形状较不规则。

表4、胚乳淀粉糊化温度

a：起始温度。b：峰值温度。c：终止温度。d：糊化热焓值。

^*P＜0.05，^**P＜0.01。

实施例6、OsbZIP58调控水稻胚乳中淀粉合成酶类基因的表达

上述实验结果可知，在RNAi植株的种子中，由于淀粉成分和结构的变化产生了腹白表型，那这些淀粉成分和结构的变化是OsbZIP58调控了哪些基因所引起呢？本发明人对OsbZIP58RNAi转基因植株未成熟种子中基因表达谱进行了系统分析。

本发明人利用定量PCR手段系统对OsbZIP58RNAi纯合的T1代植株种子中的淀粉合成酶类基因的表达进行了定量分析。在开花后7天的未成熟种子中，部分淀粉合成酶类基因的表达都随着OsbZIP58基因表达的下降而发生的变化，其中SBE1表达在OsbZIP58RNAi株系中显著下调(图7)。

根据上述实验数据，本发明人得出结论：OsbZIP58基因协同调控水稻胚乳中调控淀粉合成酶类基因的表达。

实施例7、OsbZIP58可以在体内结合编码淀粉合成途径酶基因的启动子

在酵母系统中OsbZIP58可以结合Wx与SBE1基因的启动子，RNAi植株中的研究显示，它能协同调控多个淀粉合成酶类基因。为了验证OsbZIP58对淀粉合成酶类基因表达的调控是否是通过直接结合其启动子而实现的，本发明人通过染色质免疫共沉淀的方法验证在水稻植株体内，OsbZIP58与Wx，SBE1以及其他淀粉合成酶基因的启动子区的结合。

本发明人对水稻SBE1基因C53片段与Wx基因启动子Ha-2片段进行了启动子元件分析(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE//)，仅有ACGT元件是两个基因启动子的共有元件。因此本发明人分析了ACGT元件在水稻淀粉合成酶基因启动子上的分布情况。对14个淀粉合成酶类基因启动子(转录起始位点前2K至ATG)进行分析，300bp内含有3个及以上ACGT元件的区段认为是富集ACGT的区段。在10个基因的启动子中含有15个富集ACGT元件的区段(表5)，其中Wx基因启动子区域内有3个富集ACGT元件的区段含有16个ACGT元件。启动子元件分析的结果提示水稻淀粉合成酶基因可能通过ACGT元件受共有的转录因子协同调控。

水稻开花后7天的未成熟种子进行DNA和蛋白的交联处理，免疫兔得到的OsbZIP58抗体用于沉淀OsbZIP58蛋白-DNA复合体，将复合物中的DNA解离下来之后作为PCR模板。设计针对上述16个富集ACGT box区段的特异引物(表5)进行扩增，每组扩增使用三种模板：Input正对照，OsbZIP58抗体(anti-OsbZIP58)免疫沉淀得到的DNA，负对照用兔IgG免疫沉淀得到的DNA。有9个区段的引物扩增得到了特异抗体比IgG PCR条带更亮的结果，说明这9个区段在OsbZIP58抗体免疫沉淀得到的DNA中富集(图8)。Actin的ORF区作为扩增的负对照，结果显示OsbZIP58特异抗体和IgG PCR条带均无扩增条带。用于酵母单杂实验的C53片段位于SBEI-b扩增区段中(-115～-41)，Ha-2片段位于Wx-a扩增区段中(-1651～-1399)，PCR结果都显示为在OsbZIP58特异抗体免疫沉淀得到的DNA中显著富集。

由以上实验结果本发明人得到如下结论：In vivo，OsbZIP58可以通过和水稻淀粉合成酶基因启动子区相结合来直接调控淀粉的合成，这种结合可能是通过ACGT元件进行的。

表5.ChIP实验中基因启动子区的位置和引物的序列

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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Claims (3)

1.一种促进支链淀粉链长分布在DP9-15、DP38-50或升高淀粉糊化终止温度的方法，包括：抑制水稻中OsbZIP58蛋白的表达，减少OsbZIP58蛋白与SBE1基因启动子和/或Wx基因启动子的结合；

采用核酸抑制物抑制水稻中OsbZIP58蛋白的表达，所述的核酸抑制物是dsRNA或能形成所述dsRNA的构建物，其具有如下结构：

其中，

Seq’_正向是与OsbZIP58的mRNA互补的DNA片段；Seq’_反向为与Seq’_正向互补的序列；所述的Seq’_正向的序列是OsbZIP58基因序列中第115～313位；OsbZIP58基因序列如SEQ ID NO:1所示；

X’为无；或为位于Seq’_正向和Seq’_反向之间的间隔序列，所述间隔序列与Seq’_正向和Seq’_反向不互补；

||表示在Seq’_正向和Seq’_反向之间形成的氢键。

2.一种OsbZIP58蛋白或其编码基因的下调剂的用途，用于抑制水稻中OsbZIP58蛋白的表达，减少OsbZIP58蛋白与SBE1基因启动子和/或Wx基因启动子的结合，从而促进支链淀粉链长分布在DP9-15、DP38-50或升高淀粉糊化终止温度；

所述的下调剂是核酸抑制物，其是dsRNA或能形成所述dsRNA的构建物，具有如下结构：

其中，

Seq’_正向是与OsbZIP58 mRNA互补的DNA片段；Seq’_反向为与Seq’_正向互补的序列；所述的Seq’_正向的序列是OsbZIP58基因序列中第115～313位；OsbZIP58基因序列如SEQ ID NO:1所示；

X’为无；或为位于Seq’_正向和Seq’_反向之间的间隔序列，所述间隔序列与Seq’_正向和Seq’_反向不互补；

||表示在Seq’_正向和Seq’_反向之间形成的氢键。

3.一种OsbZIP58蛋白或它们的编码基因的下调剂，其是dsRNA或能形成所述dsRNA的构建物，具有如下结构：

其中，

Seq’_正向是与OsbZIP58 mRNA互补的DNA片段；Seq’_反向为与Seq’_正向互补的序列；所述的Seq’_正向的序列是OsbZIP58基因序列中第115～313位；OsbZIP58基因序列如SEQ ID NO:1所示；

X’为无；或为位于Seq’_正向和Seq’_反向之间的间隔序列，所述间隔序列与Seq’_正向和Seq’_反向不互补；

||表示在Seq’_正向和Seq’_反向之间形成的氢键。