CN116769002B - 转录因子StERF75及调控马铃薯支链淀粉合成用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转录因子StERF75及调控马铃薯支链淀粉合成用途，所述转录因子StERF75的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的有益效果为：本发明首次利用ABA和蔗糖处理马铃薯块茎的转录组数据，并结合酵母单杂交等技术手段鉴定了转录因子StERF75能够与支链淀粉合成基因ISA1.1启动子的ATCTA元件特异结合，对下游靶标基因发挥转录激活作用，该转录因子的发现为高支链淀粉马铃薯品种的获得提供了候选转录因子资源。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种转录因子StERF75及调控马铃薯支链淀粉合成用途。
背景技术
马铃薯(Solanum tuberosumL.)是一年生茄科植物，其块茎营养价值高，是继水稻、小麦和玉米之后的世界第四大粮食作物。淀粉是马铃薯块茎的主要加工产品，包括直链淀粉和支链淀粉，淀粉的利用价值与它的糊化、老化这两个特性是直接相关的。直链淀粉和支链淀粉具有不同的糊化和老化特性，因此它们在不同的工业领域均有广泛的应用价值。
虽然直链淀粉应用价值较高，但是，许多工业领域也需要高纯度的支链淀粉，因为相比于直链淀粉，支链淀粉更容易糊化却不易老化，稳定性好。因此，培育高支链淀粉含量的品种有利于提高马铃薯的经济价值，同时也有利于降低提纯支链淀粉带来的成本。
支链淀粉的合成不仅需要多种酶的参与，而且也受到转录因子的调控，在小麦、玉米、水稻等作物中已经报道了多种转录因子调控淀粉合成。目前马铃薯中淀粉合成转录因子尚不清楚，转录因子具体结合的靶标基因以及作用机制都是未知的，不利于利用多种方式对支链淀粉合成进行调控。因此深入解析支链淀粉合成的分子机制，包括转录调控机制，对于培育特定用途的加工专用型高支链淀粉马铃薯品种至关重要。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供一种转录因子StERF75及调控马铃薯支链淀粉合成用途。所述转录因子StERF75能够与支链淀粉合成相关基因ISA1.1结合，激活ISA1.1的表达，进而提高马铃薯块茎的支链淀粉合成，该转录因子的发现为高支链淀粉马铃薯品种的获得提供了候选转录因子资源。
本发明的一方面，提供一种转录因子StERF75，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的另一方面，提供一种转录因子StERF75基因，其编码前述转录因子StERF75。优选地，所述转录因子StERF75基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的另一方面，提供包含前述转录因子StERF75基因的重组载体。
本发明的另一方面，提供包含前述转录因子StERF75基因的重组菌株。
本发明的另一方面，提供用于扩增或检测前述转录因子StERF75基因的特异性引物，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和 SEQ ID NO:4所示的正向引物和反向引物。
本发明的另一方面，提供前述转录因子StERF75，或转录因子StERF75基因在调控马铃薯支链淀粉合成中的应用。
本发明的另一方面，提供前述转录因子StERF75与马铃薯支链淀粉合成基因ISA1.1启动子的ATCTA元件的特异性结合在调控马铃薯支链淀粉合成中的应用。
本发明的另一方面，提供过表达前述转录因子StERF75在提高马铃薯支链淀粉合成中的应用。
本发明的另一方面，提供一种培育高支链淀粉马铃薯的方法，所述方法包括在马铃薯细胞中过表达转录因子StERF75。
本发明的有益效果为：
本发明首次利用ABA和蔗糖处理马铃薯块茎的转录组数据，并结合酵母单杂交等技术手段鉴定了转录因子StERF75能够与支链淀粉合成基因ISA1.1启动子的ATCTA元件特异结合，对下游靶标基因发挥转录激活作用，该转录因子的发现为高支链淀粉马铃薯品种的获得提供了候选转录因子资源。
附图说明
图1为StERF75在4种处理中的FPKM值；CK：对照处理；ABA：ABA处理；SUC：蔗糖处理；SUC+ABA：蔗糖和ABA共同处理；
图2为酵母单杂交显示StERF75与ISA1.1启动子互作；
图3为酵母单杂交显示StERF75与ISA1.1启动子的ATCTA元件互作；
图4为EMSA体外验证StERF75与ISA1.1启动子的ATCTA元件互作；
图5为StERF75激活ISA1.1的转录活性。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 转录因子StERF75的筛选
将苗龄1个月的二倍体马铃薯材料C151组培苗种植于云南师范大学校园温室内。植株生长约3个月时，收获直径约0.5 cm的幼嫩块茎，将其横切为4~5片备用。准备以下处理溶液：（1）对照：基础溶液（20 mmol/L 氯化钙和20 mmol/L 琥珀酸钠，pH 5.0，10 µmol/L氯霉素+200 mmol/L 甘露醇+5 mmol/L 葡萄糖；（2）蔗糖处理：基础溶液+200 mmol/L蔗糖；（3）ABA处理：基础溶液+200 mmol/L甘露醇+5 mmol/L葡萄糖+100 µmol/L ABA；（4）蔗糖+ABA处理：基础溶液+ 200 mmol/L蔗糖+100 µmol/L ABA。将处理溶液各取5 ml放置在100mL三角瓶中，每瓶加入预处理后的块茎薄片6~9片。将三角瓶置于摇床，黑暗条件下28 °C静置36小时。处理完的块茎薄片用滤纸轻轻拭干水分，提取总RNA，将RNA样品送到安诺优达基因科技（北京）有限公司进行转录组测序。对转录组数据进行分析，发现其中一个差异表达基因是AP2/ERF转录因子StERF75。该基因的表达受到ABA和蔗糖诱导，如图1所示。
实施例2 转录因子StERF75基因的克隆
Charfeddine(2014)等将PGSC0003DMT400035731命名为StERF75，根据该基因在参考基因组DM中的序列，设计扩增StERF75的引物（正向引物：ATGGCTATGAAGGAAAAAGTTACAAAC，反向引物：TTAAACTTCCATTGGTGGAGCAAG），以二倍体马铃薯C151块茎的cDNA为模板，克隆得到StERF75，编码区序列为SEQ ID No.2所示，共894 bp，其中49-240 bp碱基序列编码AP2/ERF结构域。
实施例3 酵母单杂交实验分析与转录因子StERF75互作的淀粉合成基因启动子
将StERF75构建到pGADT7载体上，7个淀粉合成基因启动子分别构建到pHIS2载体上，转录因子和启动子质粒共转化到酵母菌株Y187，在含有不同浓度3-AT的SD-Trp-Leu-His固体培养基上静置培养。结果表明，StERF75质粒和淀粉合成基因SBE3、GBSS1、SS3、 SuSy4、APL3、AGPS1.1启动子质粒分别共转后，酵母菌落不能在选择性培养基上生长；相反，在70 mM 3-AT的SD-Trp-Leu-His固体培养基上，对照组pGADT7+Pro-ISA1.1的自激活被抑制，实验组StERF75+Pro-ISA1.1的酵母菌落能够正常生长，说明StERF75特异性地结合ISA1.1启动子，如图2所示。
实施例4 酵母单杂交实验分析与转录因子StERF75互作的ISA1.1启动子的结合元件
StERF75属于AP2/ERF转录因子家族，文献报道AP2/ERF转录因子结合启动子的GCC、ERE和ATCTA元件。ISA1.1启动子中含有这3类元件，我们对离起始密码子最近的这3类元件进行酵母单杂交验证。文献报道核心序列周围的序列也会影响结合能力，因此我们将每个元件及元件前后的4个碱基进行3次重复，分别构建到pHIS2载体上，将StERF75构建到PGADT7载体上。转录因子和元件质粒共转化到酵母菌株Y187，在含有不同浓度3-AT的SD-Trp-Leu-His固体培养基上静置培养。结果显示，在加入不同浓度3-AT的SD-Trp-Leu-His固体培养基上，对照组的自激活被抑制，实验组StERF75+ISA1.1(GCC)以及StERF75+ISA1.1(ERE)的酵母菌落均不能生长，相反，在10 mM 3-AT的SD-Trp-Leu-His固体培养基上，对照组的自激活被抑制，实验组StERF75+ISA1.1(ATCTA)能够生长，说明StERF75与ISA1.1启动子的ATCTA结合元件存在互作，如图3所示。
实施例5 凝胶迁移实验（EMSA）体外验证StERF75特异结合ISA1.1启动子的ATCTA元件
为进一步明确StERF75是否体外直接结合ISA1.1启动子的顺式作用元件，将StERF75的CDS序列重组到带有His标签的His-pET30a载体上，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，获得阳性菌株。将阳性菌株大摇后，加入100 mM的IPTG溶液，16 ℃180 rpm振荡培养16~18h诱导StERF75蛋白表达。获得诱导蛋白后，EMSA验证StERF75结合元件。生物素标记和野生型的探针序列为：TGTCGTATCTACATATC，突变型的探针序列为：TGTCGTCCCCCCATATC。实验共设置5组，第一组不加纯化蛋白（负对照），第二组加入200×的野生型探针（Un-Probe），第三组加入20×的野生型探针，第四组（实验组）不加野生型探针和突变探针（Un-mProbe），第五组加入突变型探针。 结果表明，高浓度的野生型探针竞争结合StERF75蛋白，浓度低则竞争越少，结合条带越亮，而没有标记修饰的突变探针并没有结合StERF75蛋白，结合条带不变。由此可以看出，体外原核表达的StERF75蛋白直接结合ISA1.1启动子的顺式作用元件，结合位点序列为ATCTA，如图4所示。
实施例6 双荧光素酶实验分析StERF75对下游靶标基因表达的影响
将StERF75的CDS序列重组到pCAMBIA1305.4载体上，ISA1.1的启动子序列重组到Reporter载体pGreenⅡ-0800luc上。转化农杆菌液等浓度等体积重悬混合后注射烟草叶片，检测LUC和REN的化学发光值，进行显著性差异分析。结果表明两组组合之间存在差异，相比对照组，实验组中StERF75显著激活ISA1.1启动子的活性，如图5所示。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.转录因子StERF75，或转录因子StERF75基因在调控马铃薯支链淀粉合成中的应用；
所述转录因子StERF75的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述转录因子StERF75基因编码所述转录因子StERF75。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转录因子StERF75基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1所述转录因子StERF75与马铃薯支链淀粉合成基因ISA1.1启动子的ATCTA元件的特异性结合在调控马铃薯支链淀粉合成中的应用。
4.过表达权利要求1所述转录因子StERF75在提高马铃薯支链淀粉合成中的应用。
5.一种培育高支链淀粉马铃薯的方法，其特征在于，所述方法包括在马铃薯细胞中过表达权利要求1所述转录因子StERF75。
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- 2023-08-11 CN CN202311007287.6A patent/CN116769002B/zh active Active
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