CN102295693A - 一种水稻wrky类转录因子及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种水稻WRKY类转录因子及其编码基因OsWRKYS2，转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，OsWRKYS2基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。构建OsWRKYS2植物表达载体和干扰表达载体，用农杆菌转化水稻，获得转OsWRKYS2基因水稻，结果表明OsWRKYS2基因在水稻中过量表达，籽粒十分饱满。而反义导入OsWRKYS2基因时则出现大量瘪粒。证明OsWRKYS2基因具有改善稻米品质和提高稻米重量的作用。

Description

一种水稻WRKY类转录因子及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种水稻WRKY类转录因子及其编码基因与应用。
背景技术
稻米淀粉主要由直链淀粉(amylose)和支链淀粉(amylopectin)组成。直链淀粉是脱水葡萄糖苷元通过α-D-1，4糖苷键连接而成的线性长链。支链淀粉除有α-D-1，4糖苷键外，约每20-30个脱水葡萄糖苷元就有一个分支；该分支在淀粉分支酶的作用下通过α-D-1，6糖苷键连接而成，最后由淀粉去分支酶(starch debranching enzyme)对分支进行修饰，最终合成具有一定结构和功能的支链淀粉。异淀粉酶1(Isoamylase 1，ISA1)属于淀粉去分支酶中的一类，它以变性支链淀粉、糖原和支链淀粉类似物为底物，去除α-D-1，6糖苷键，参与支链淀粉的合成，影响了直链淀粉和支链淀粉在淀粉中的比例。
大麦糖信号因子SUSIBA2是一个WRKY家族的转录因子，它能够识别大麦的一种淀粉脱分支酶基因——异淀粉酶基因iso1和一种淀粉分支酶基因sbeIIb的启动子区域上的糖响应元件SURE，激活iso1基因和sbeIIb基因的表达，从而影响胚乳中淀粉的积累状况。
自2004年已克隆到多个水稻WRKY基因，目前已筛选到四个具有明显生物学功能的水稻WRKY基因。它们分别是OsWRKY45，其在提高转基因拟南芥抗病性的同时也显著地提高了它们的耐盐性和耐旱；OsWRKY23，其在提高转基因拟南芥抗病性的同时还加速了它们叶片细胞生理性死亡的进程；OsWRKY08，其在提高转基因拟南芥耐高渗透势胁迫的信号通路是不依赖脱落酸信号途径的；OsWRKY72，通过增强脱落酸信号途径中部分基因的表达和干扰生长素运输途径中部分基因的表达改变转基因拟南芥的正常生长状况，特别是极显著地削弱转基因拟南芥的顶端优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水稻WRKY类转录因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的第二个目的在于提供一种编码水稻WRKY类转录因子的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明的第三个目的在于提供一种含有水稻WRKY类转录因子基因的表达载体。
所述表达载体为植物表达载体。
本发明的第四个目的在于提供所述水稻WRKY类转录因子极其编码基因在改善稻米品质和重量中的应用。
本发明的第五个目的在于提供一种提高水稻稻米品质和重量的方法，将水稻WRKY类转录因子基因导入水稻组织或细胞，得到品质和重量提高的水稻，所述水稻WRKY类转录因子基因是下述核苷酸序列之一：
1)SEQ ID NO：2所示DNA序列；
2)编码SEQ ID NO：1所示氨基酸残基序列的DNA序列。
所述水稻WRKY类转录因子基因通过含有所述水稻WRKY类转录因子基因的植物表达载体导入植物组织或细胞。
所述植物表达载体为p3300-Ubi-OsWRKYS2。
本发明的技术路线为：
1)利用分子生物学方法从籼稻中克隆WRKY类转录因子基因，命名为OsWRKYS2；
2)构建OsWRKYS2植物表达载体和干扰表达载体，用农杆菌转化水稻，获得转OsWRKYS2基因水稻；
3)结果表明：OsWRKYS2基因在水稻中的过量表达，籽粒十分饱满。而反义导入OsWRKYS2基因时则出现大量瘪粒。
本发明克隆了一种水稻WRKY类转录因子基因OsWRKYS2，构建OsWRKYS2植物表达载体和干扰表达载体，用农杆菌转化水稻，获得转OsWRKYS2基因水稻，结果表明OsWRKYS2基因在水稻中过量表达，籽粒十分饱满。而反义导入OsWRKYS2基因时则出现大量瘪粒。证明OsWRKYS2基因具有改善稻米品质和提高稻米重量的作用。
附图说明
图1OsWRKYS2植物表达载体构建流程图；
图2OsWRKYS2干扰表达载体构建流程图；
图3a野生型水稻T0代籽粒图；
图3b转OsWRKYS2干扰表达载体T0代籽粒图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。
实施例1OsWRKYS2基因克隆
取籼稻(Oryza sativa ssp.japonica)幼穗RNA，根据SUSIBA2设计引物RT-PCR，得到1713bp的目的片段，目的片段连接T载体测序，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示，命名为：OsWRKYS2。OsWRKYS2基因编码的水稻WRKY类转录因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
引物序列为：
上游引物5’-GGCGAGGTACAAGGCGATGT-3’
下游引物5’-TACAGCTCTCGCCTCCGGTT-3’。
实施例2OsWRKYS2植物表达载体和干扰表达载体构建
OsWRKYS2植物表达载体p3300-Ubi-OsWRKYS2构建过程参见图1；
根据OSWRKYS2序列两端设计引物，上游引物加BamHI酶切位点，下游引物加SacI酶切位点，
引物序列为：
SU-BamHI：5’-CGCGGATCCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGCGAGGTAC-3’；
SU-SacI：5’-CGAGCTCTCACGGACCCATGACT-3’。
对目的片段做PCR，用takara公司的BamHI和SacI酶对质粒p3300-ubi-Tnos和PCR回收片段做双酶切，用T4DNA ligase连接。最终得到质粒p3300-Ubi-OsWRKYS2。
OsWRKY2干扰表达载体pTCK303-OsWRKYS2构建过程参加图2。
从OSWRKYS2序列中选取300bp片段设计引物，上游引物加KpnI，SpeI；下游引物加SacI，BamHI酶切位点，
引物序列为：
SU-SK：5’-GGGGTACCACTAGTGACGATATGATGA-3’；
SU-SB：5’-CGCGGATCCGAGCTCGTTAGGATGTG-3’。
对目的片段做PCR，对质粒pTCK303和PCR回收产物分别用KpnI，BamHI和SpeI，SacI做双酶切，用T4DNA ligase分步连接。最终得到质粒pTCK303-OsWRKYS2。
实施例3OsWRKY2植物表达载体和干扰表达载体农杆菌介导转化水稻
1、水稻幼胚愈伤组织的诱导培养
取开花后12-15天左右的水稻幼穗脱粒，用清水漂去秕粒，用70％乙醇浸泡1-2分钟，然后用加有几滴Tween20的1.25％的次氯酸钠溶液。浸泡90分钟，进行表面灭菌，吸干置于固体诱导培养基上，26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基上，在相同条件下继代培养5天左右共培养。
2、农杆菌的培养
将分别含有OsWRKYS2植物表达载体p3300-Ubi-OsWRKYS2和OsWRKYS2干扰表达载体pTCK303-OsWRKYS2的农杆菌Agr0活化，加入乙酰丁香酮(AS)，使乙酰丁香酮(AS)终浓度为100mM，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。
3、农杆菌侵染
挑选状态较好的水稻愈伤组织放入无菌三角瓶中，然后加入农杆菌悬浮液浸没过水稻愈伤组织，室温放置20min，并不时晃动。取出愈伤组织，在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26℃黑暗培养2-3天。
4、抗性愈伤组织的筛选
将共培养后的愈伤组织放在含有10mg/ml草甘膦(ppt)的筛选培养基上，26℃暗培养14天，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。
5、抗性愈伤组织的分化
从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有草甘膦(ppt)的分化培养基上，先暗培养3天，然后转至15h/d光照条件下培养，一般经过15-25天左右，有绿点出现。30-40天后分化出小苗。
6、再生苗的生物学检测
检测转基因T0代苗结实率，结果发现转OsWRKY2干扰表达载体pTCK303-OsWRKYS2的水稻籽粒与野生型水稻相比有大量瘪粒(图3a和图3b)，饱满的籽粒数小于10％，基本都是瘪粒。而转OsWRKYS2植物表达载体p3300-Ubi-OsWRKYS2的水稻，OsWRKYS2基因在水稻中过量表达，籽粒十分饱满。
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Figure ISA00000578086600051
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Claims (9)

1.一种水稻WRKY类转录因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种编码水稻WRKY类转录因子的基因，其碱基序列如SEQ IDNO：2所示。
3.含有权利要求2所述水稻WRKY类转录因子基因的表达载体。
4.权利要求3所述表达载体为植物表达载体。
5.权利要求1所述水稻WRKY类转录因子在改善稻米品质和重量中的应用。
6.权利要求2所述水稻WRKY类转录因子基因在改善稻米品质和重量中的应用。
7.一种提高水稻稻米品质和重量的方法，将水稻WRKY类转录因子基因导入水稻组织或细胞，得到品质和重量提高的水稻，所述水稻WRKY类转录因子基因是下述核苷酸序列之一：
1)SEQ ID NO：2所示DNA序列；
2)编码SEQ ID NO：1所示氨基酸残基序列的DNA序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述水稻WRKY类转录因子基因通过含有所述水稻WRKY类转录因子基因的植物表达载体导入植物组织或细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体为p3300-Ubi-OsWRKYS2。
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