CN102876680B

CN102876680B - 一种大豆来源的油体蛋白基因种子特异性启动子及其应用

Info

Publication number: CN102876680B
Application number: CN2012103904920A
Authority: CN
Inventors: 章文华; 赵江哲; 柏杨
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-10-16
Filing date: 2012-10-16
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2032-10-16
Also published as: CN102876680A

Abstract

本发明涉及到一个大豆来源的油体蛋白基因启动子及其应用，属于生物技术领域，涉及到改变粮食作物或经济作物种子品质和产量的基因工程领域。本发明包括种子特异性启动子序列SEQ ID NO.1，以及重组载体转化宿主组织，并表达下游基因改变种子成分的方法。本发明克隆的启动子对油料作物(大豆)种子品质和产量的提高具有重要意义。

Description

一种大豆来源的油体蛋白基因种子特异性启动子及其应用

(一)技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及到一种从大豆中克隆到的油体蛋白基因种子特异性启动子序列及其应用。从大豆总DNA克隆到的这个种子特异性启动子并与目的基因连接到植物表达载体，导入植物中，使转基因植物种子中特异高效表达下游基因的方法和应用。

(二)背景技术

粮食作物(包括部分经济作物)中食用的部分主要是种子，，种子的品质和产量直接影响农业生产和人们的生活水平。在提高种子品质和质量的过程中，杂交是经典方法，通过选择两个性状好的父本和母本进行杂交，得到更理想的后代，但这个方法的缺陷就是周期太长。随着基因工程的发展，转基因则大大缩短了育种时间。在转基因工程研究的过程中，具有应用价值的外源基因在转基因植物中的表达往往达不到理想水平。而启动子是决定基因表达的关键因素，选择合适的启动子对于转基因有着重要作用。根据启动子的转录模式可将启动子分为三类：组成型启动子、组织特异性启动子和诱导启动子。组成型启动子在转基因工程中被广泛应用，如双子叶植物中应用的CaMV35S和CsVMV启动子，单子叶植物中应用的玉米Ubiqutin启动子和水稻的Actin1启动子。组织特异性启动子包括：根特异性启动子(YamamotoYT et al，1992；Elmayan and Tepfer，1995；Xu et al，1995；Nitz et al，2001；Vaughanet al，2006；Vi jaybhaskar et al，2008；Jeong et al，2010)、茎特异性启动子(Bostwicket al，1994)、花特异性启动子(van der Meer et al，1990；Irish and Yamamoto，1995；Ru1′z-Rivero and Prat，1998；Maizel and Weigel，2004；Chiou and Yeh，2008；Verdonket al，2008)、果实特异性启动子(Montgomery et al，1993；van Haaren and Houck，1993；Xu et al，1996；Coupe and Deikman 1997；Deikman et al，1998；Moon and Callahan，2004)和种子特异性启动子(Beachy R et al，1985)等。诱导启动子包括：缺水诱导启动子(Kasuga M et al，1999；Xiao et al，2001；Rai M et al，2009)、低温诱导启动子(SekiM et al，2001；Kasuga M et al，2004；杜娟等，2005)、盐诱导启动子(Russell BL et al，1998；Zhou SF et al，2001；Aryadeep R et al，2007)、损伤诱导性启动子(Farmer EE etal，1994)和受病原菌诱导启动子(吕华飞等，1999；Sa Q et al，2003；Peng JL et al，2004)等。

在组成型启动子的控制下，外源基因一般会在转基因植物所有部位和所有发育阶段都高量表达，这样会造成资源浪费，甚至会影响植物的生长发育，得不到理想的转基因植物。种子特异性启动子则可以很好的控制外源基因的表达，只在种子中高效表达，在其他部位和发育阶段几乎不表达。这就为提高种子的品质和产量奠定了很好的基础。在上个世纪80年代就开始有种子特异性启动子的研究，1985年Beachy等人(Beachy RN，et al.(1985)Accumulation and assembly of soybean β-conglycinin in seeds of transformed petuniaplants.The EMBO Journal，4(12)，3047-3053.)研究大豆伴球蛋白基因时发现，β-球蛋白的α-亚基启动子具有很强的时空调控性，在转基因植株中只在成熟过程中的种子中高效表达，而在其他部位和发育阶段几乎不表达。随后，其它种子特异性启动子被发现并克隆出来：Baumlein等从野生大豆分离出来USP基因启动子(Baumlein H et al，1991)；Russell等1997发现水稻谷蛋白1基因和玉米素基因启动子分别在胚乳和胚乳外层表达(Russell DA etal，1997)；油菜napinB基因启动子可在种子中特异表达(Wu CY et al，2000)；Rossak等发现3-酮脂酰辅酶A合成酶启动子(Rossak M et al，2001)在转基因拟南芥中开花5天后表达，9-11天后达到高峰；Hwang等发现水稻球蛋白启动子(Hwang YS et al 2002)；Kluth等发现gbss1基因上游40kb碱基与GUS基因连接后转入植物发现其在小麦灌浆时表达，并进一步确定启动子序列为基因上游1.0kb(Kluth A et al，2002)；Sunikumar等从棉花胚cDNA中分离出1108bp的β-球蛋白B基因的启动子(Sunikumar G et al，2002)；Mei等2004年发现的玉米中球蛋白启动子(Mei C et al，2004)；Qu等将水稻SBE1基因启动子与GUS连接后转入植物发现水稻种子盾片中表达(Qu LQ et al，2004)；丙氨酸氨基转移酶启动子和谷氨酸合成酶基因的启动子控制外源基因分别在胚乳内层和水稻盾片中表达(Qu LQ et al，2004)。

(三)发明内容

技术问题

本发明目的是提供一个大豆油体蛋白基因种子特异性启动子的序列，它能够使下游基因在种子中特异高效表达，在其他组织中或发育阶段几乎不表达，为提高农作物或经济作物种子的品质和产量提供重要元件。

技术方案

本发明提供了一个大豆来源的种子特异性启动子序列，其特征在于，该启动子的全长序列为SEQ ID NO.1。

大豆油体蛋白基因表达模式鉴定步骤：

提取大豆(品种为“南农99-10”)各个发育阶段根、茎、幼叶、老叶、花、幼荚、老荚、未成熟种子和成熟种子的RNA，并反转成cDNA，设计引物(5’CAATGTTCTCGTCCTCGCCG 3’；5’GATGGAGGTGATGCCGAAGA 3’)对基因做RT-PCR，大豆cons6基因(Libault等，2008)做内参对照，检测该基因各个发育阶段的表达情况。

克隆该启动子序列和鉴定其功能如下步骤：

1.利用SDS法提取大豆总DNA。

2.设计并合成如下一对引物：

引物1：5’GTCGACAACGTGGCTTGCACTTGTCTC 3’，

引物2：5’GGATCCGGTATGGAAAGCGAGAGAGG 3’。

3.以大豆总DNA为模版，用上述引物做PCR，将PCR片段和T载体连接，挑单菌落提取质粒测序，确定启动子序列。将阳性菌株提取的质粒和PBI101载体用Sal I和BamH I限制性内切酶进行双酶切，回收酶切片段并在4℃过夜连接，将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，37℃恢复1小时后涂板过夜培养。挑取单菌落提质粒测序，确定目的启动子序列。

4.将连接好的重组载体，转入农杆菌GV3101，转化拟南芥，其所结种子在含有50mg/L的卡那霉素的MS平板上生长，阳性植株为正常生长的拟南芥，将阳性植株繁殖2代，在F3代分离比为3∶1的植株为单克隆。选取纯合体鉴定各个发育阶段的GUS染色。

(四)附图说明

图1RT-PCR检测大豆油体蛋白基因各个发育阶段表达情况，图从左到右依次为根、茎、幼叶、老叶、花、未成熟种子、成熟种子、幼荚和老荚。油体蛋白基因只在未成熟种子中表达。

图2PCR扩增得到的油体蛋白基因启动子片段电泳图。1是油体蛋白基因启动子；M是DNAmarker。

图3构建种子特异性启动子与PBI101的重组载体。

图4转化拟南芥后得到的单克隆纯和阳性植株在各个发育阶段的GUS染色。从左到右依次是：萌发10天幼苗、生长25天植株、生长50天茎和花和开花后5天、8天、11天、14天、20天的种子和荚子。

(五)具体实施方案

大豆油体蛋白基因表达模式的鉴定

1.提取大豆组织RNA

(1)取100mg组织样品用研磨棒研磨，期间不断加入液氮，直至样品成粉状；转入装有1mLTotal RNA提取试剂Trizol溶液室温静置5min。利用Trizol法提取各组织RNA。

(2)将提取好的RNA加入适量的RNase-free水溶液沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后，经过电泳和紫外分光光度计(A260/A280)检测样品的RNA浓度和质量，于-80℃保存。

2.半定量RT-PCR

(1)取RNA样品各2μg，在反转录酶M-MLV的作用下合成cDNA第一链，由RNA到cDNA的逆转录反应操作按M-MLV说明书进行，只是体系加倍；将合成的cDNA稀释25倍作为模板用于半定量PCR扩增。

(2)逆转录反应完成后，进行半定量PCR反应。油体蛋白基因的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳根据溴化乙锭(EB)染色信号分析扩增片段大小，拍摄凝胶的照片。以在大豆中高度保守、并组成型表达的cons6基因为内参照。扩增引物为：5’CAATGTTCTCGTCCTCGCCG 3’；5’GATGGAGGTGATGCCGAAGA 3’

油体蛋白基因启动子的获得和功能鉴定

1.启动子的克隆

利用SDS法提取大豆(品种为“南农99-10”，来源于国家大豆改良中心)总DNA

设计引物扩增目的启动子序列，扩增引物为：5’CAATGTTCTCGTCCTCGCCG 3’；5’GATGGAGGTGATGCCGAAGA 3’，扩增片段大小为1774bp

将PCR片段和T载体(购自PROMEGA公司)连接，挑单菌落提取质粒测序，确定启动子序列。将阳性菌株提取的质粒和PBI101载体(购自Biovector Science Lab)用Sal I和BamH I限制性内切酶进行双酶切，回收酶切片段并在4℃过夜连接，将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，37℃恢复1小时后涂板过夜培养。挑取单菌落提质粒测序，确定目的启动子序列。提取质粒并转化农杆菌GV3101(购自Biovector Science Lab)，测序获得阳性菌株，-80℃保存。

2.蘸花法转化拟南芥

(1)农杆菌侵染拟南芥

根据Clough and Bent(1998)的Floral Dipping方法进行拟南芥转化。取生长一个月左右，生长状况良好的植株，去除结实的果荚。将转化有PBI101和种子特异启动子重组载体的农杆菌GV3101于28℃培养过夜后，按1∶100接菌培养至OD600≈2.0，4500rpm离心10min，菌体沉淀用转化液悬浮，至终浓度OD600≈0.8。转化时将拟南芥地上部分浸泡于菌液中5-15s，确保全部花苞都被浸没。用吸水纸吸去多余的液体，将植物平放并保持湿度，避光过夜。第二天将植物取出，竖直并转移到正常条件下生长，每隔一周转化一次，一般转化三次后收种。

转化液：MS液体培养基加5％蔗糖(灭菌)，0.05％Silwet L-77(购自GE公司)。

(2)阳性植株的筛选

转基因植株种子在含50μg/ml Kanamycin的抗性MS培养基上生长，一周后挑取正常生长的转化苗移入土壤中继续生长。提取野生型及转基因植株基因组DNA，将两个DNA分别为模板对转基因植株进行PCR鉴定。PCR检测为阳性的转基因植株经过两代自交后就能得到转基因植株纯系(上一代植株Kanamycin抗性具有3∶1的分离比，本代植株抗性为100％，并于后代植株保持100％抗性用于进一步的实验。

(3)GUS基因的检测

GUS报告基因的检测参照Yadegari et al(1994)GUS染色，将各组织浸入GUS溶液，37℃浸泡2h，种子和荚子浸泡时间则需几个小时甚至过夜，染色后各组织乙醇脱色完毕后，经透明液透明(幼苗、根尖等组织透明5-10min左右；荚子、种子等组织需透明几小时乃至过夜)，然后利用体视显微镜观察并拍照。鉴定结果是：启动子只在未成熟种子和种子萌发时期启动下游CUS基因的表达，而在其他组织中基本不启动下游基因。

Claims

1.一种大豆来源的种子特异性启动子，其序列为SEQ NO.1。

2.含有权利要求1所述核苷酸序列的重组载体。

3.一种在植物中应用权利要求1的所述的种子特异启动子的方法，其特征是：

(1)权利要求2所述的重组载体导入植物细胞，

(2)使所述的植物细胞生长成能够结种子的成熟植物。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，所述植物是拟南芥。