CN102140472A

CN102140472A - 一种大豆中分离的种子特异性启动子及其应用

Info

Publication number: CN102140472A
Application number: CN 201110003835
Authority: CN
Inventors: 王庆钰; 张庆林; 赵艳; 王英; 李景文; 李晓薇; 翟莹; 张艳; 程浩
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2011-01-10
Filing date: 2011-01-10
Publication date: 2011-08-03
Anticipated expiration: 2031-01-10
Also published as: CN102140472B

Abstract

本发明涉及一种大豆中分离的种子特异性启动子序列及其应用，涉及生物技术领域。其核苷酸序列如SEQ No.1所述，该种子特异性启动子序列作为大豆种子特异性启动子的应用。本发明克隆了大豆的硬脂酸-ACP脱饱和酶启动子，研究该启动子在大豆中的组织表达特性及表达效率，为其有效应用提供依据；该启动子的获得为大豆转基因研究提供有利工具，特别为利用大豆种子作为生物反应器的研究和开发创造了条件。

Description

一种大豆中分离的种子特异性启动子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是指大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子的序列克隆及其应用。

背景技术

大豆是重要的粮食作物和油料作物，在世界范围内约有7000多万公顷的种植面积。大豆籽粒中含有丰富的蛋白质、脂类和多种营养元素, 磷、铁、钙矿质比其他作物高几十倍，并含有多种维生素，特别是大豆中含有人体不能合成的8 种必需氨基酸，是其他谷类作物不能比拟的。大豆不仅是人类蛋白和脂类的主要来源，医疗保健作用非常重要。

转基因大豆尽管有很多争议，但与传统大豆相比有很多应用方面的优势。在转基因大豆中增加或降低某些物质含量，实现外源目的基因在转基因大豆中正常、有效表达，而转基因表达的调控主要是通过合适的启动子来实现的，因此，选择合适的植物启动子并改进其活性是调节外源基因表达首先要考虑的问题。目前已经分离得到了许多植物的启动子，不同的植物启动子能使基因具有不同的表达特性。植物基因工程中常用的启动子按其功能及作用方式可分为三类：组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子能够调控下游基因在植物的在不同组织、器官及不同发育阶段都表达，受外界环境因素的影响不大，RNA和蛋白表达量比较恒定；诱导型启动子是在某些特定的物理或化学的刺激下,启动子可以大幅度地提高基因的转录水平；组织特异性启动子又称器官特异性启动子，调控基因的表达往往只限于某些特定的器官或组织，表现发育调控的特性。目前在植物表达载体中广泛应用的是组成型启动子，在该类启动子的调控下，外源基因在转基因植物的所有部位和发育阶段都会表达，造成植物营养不必要的浪费，往往还会引起受体植物的形态发生变化，有时还会影响到植物的正常生长发育。种子特异性启动子只有在植物种子成熟中、后期大量表达其下游基因，能够调控外源基因在种子中特异性表达，使所表达的外源蛋白都集中在种子中，最大限度的减少对农作物其他代谢途径的影响，种子中含有丰富的碳水化合物，特别是淀粉、蛋白质及脂肪，因此，种子特异性启动子的研究和应用在定向改良农作物品质性状方面具有重要的理论和事件意义。

目前，国内外的种子特异性启动子的研究进展非常快，已克隆获得的种子特异性启动子主要来自于粮食作物及油料作物种子中的蛋白、氨基酸、淀粉、脂类等合成代谢途径中相关的酶基因的启动子，如玉米醇溶贮藏蛋白基因启动子[赵倩等.(1999)玉米19KD醇溶贮藏蛋白基因启动子特异性表达控制区段的分析.植物学报，419(1),51~54]；

油菜napin蛋白启动子[Zhang Y J, L i L, Song Y R.,Identification of seed-specific promoter nap300 and itscomparison with 7S promoter [J].Progress in Natural Science, 2002, 12 (10) : 737- 741.]；

大麦β-淀粉酶启动子[Okada,Y.,Kihara,M.,Kuroda,H.,Yoshigi,N.,Ito,K., Cloning and Sequencing of the Promoter Region of the Seed Specific beta-Amylase Gene from Barley[J]., Plant Physiol, 2000,156:762-767]；油菜2S清蛋白启动子[Chatthal M,Forward BS,Yevtushenko D,Stefanov l,Osuska L,Osuaky M,Misra S,2S storage protein gene of douglas-fir:characterization and activity of promoter in transgenic tobacco seeds [J].Plant Physiol Biochem,2004, 42:417-423]；棕7S球蛋白启动子[MORCILLO F ,HARTMANN C,DUVAL YT,et al. Regulation of 7S globulin gene expression in zygotic and somatic embryos of oil palm[J]. Physiologia Plantarum,2001,112(2) :233 - 243.]等等。一些种子特异性启动子在应用中显现出了极显著的效果，如玉米胚乳特异启动子驱动小麦基因在玉米中表达，降低了籽粒的硬度，有利于玉米的湿磨及家畜饲喂；水稻中Ole18基因启动子驱动RINO1基因在种子中特异表达，降低了水稻籽粒中植酸含量；napin 基因启动子参与的自我剪切载体在油菜种子中特异表达，应用于建立无标记的安全转基因植物等。

大豆中研究较深入的种子特异性启动子主要与种子中富含的蛋白质有关，如伴大豆球蛋白、球蛋白、凝集素基因和油质蛋白的启动子，并在转基因中得到应用；已克隆的大豆种子特异性启动子脂肪氧化酶-3基因的启动子，还有一些基因已通过实验鉴定确定是在大豆中种子特异表达基因，如油酸去饱和酶基因、天冬氨酸蛋白酶基因、硬脂酰去饱和酶基因、Em 基因、及P39的蛋白基因等，与其他粮食作物相比数量较少。因此，获得一种新的大豆种子特异性启动子，对大豆新品种的研究开发及植物基因工程发展具有推动作用。

发明内容

本发明提供一种大豆中分离的种子特异性启动子序列及其应用，以解决目前缺少大豆种子特异性启动子的问题。并对启动子进行分析和验证，并做五个缺失载体验证了各个片段的作用功效。

本发明一种大豆中分离的种子特异性启动子的核苷酸序列如SEQ No.1所述。

本发明所述的大豆中分离的种子特异性启动子的制备方法，包括下列步骤：

a. 硬脂酸-ACP脱饱和酶基因上游远端序列的克隆：

利用TAIL-PCR方法，设计3个嵌套引物:

B1：5’-TGGAACTGTGGAGAGGTTGGAG -3’

B2：5’-GGTGTGACTAGTGATTAGCCCTTG -3’

B3：5’- GTGGAAATTTGGCCCGATACCT -3’

与随机兼并引物AD5：5’- AG(A/T) GNAG(A/T) ANCA(A/T) AGG -3’,进行三次PCR反应，获得ATG上游远端序列；

b. 对硬脂酸-ACP脱饱和酶基因ATG上游序列进行分析，利用

Z1: 5’- GGGGAATTC AAAGAAAAAAAAATCCGTCC-3’ 和

Z2: 5’- GAACCATGGTGAGTGGGCCTTCCGGGCTTTG-3’ 这对引物扩增2081bp的SACPD-Cp片段；

c. 将SACPD-Cp扩增片段与克隆载体pMD18-T进行连接，鉴定后测序，验证序列正确。

d、设计各缺失片段分别为AC1、AC2、AC3、AC4和AC5，分别与克隆载体pMD18-T进行连接，鉴定后测序，验证序列正确。

本发明所述的大豆种子特异性启动子作为大豆种子特异性启动子的应用。

硬脂酰-ACP脱饱和酶是一种可溶性酶，存在于质体基质中，催化硬脂酰- ACP 脱饱和而在脂肪酸链的C9- C10 间引入一个双键形成油酰- ACP 的反应。饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例与生物膜系统的流动性、选择透性以及植物的多种生理功能有密切的关系，因此，SAD受到人们的广泛重视。2003年，Nicholas J.等在所有寒冷致死突变株中的突变表达中鉴定出634个具有寒冷效应基因，这些基因包括与脂肪酸代谢、叶绿体功能、糖类代谢及自由基解毒相关的基因。细胞膜结构中脂类含量的改变能够提高植物的抗冷性，其中抗冷突变体中积累的一个转录物编码硬脂酰-ACP脱饱和酶基因，它催化C18不饱和脂肪酸的生物合成。Pradeep Kachroo等提出硬脂酰-ACP脱饱和酶的减少能够诱导某种防卫反应和抑制其他物质，参与不同防卫信号途径的信号调控。在“A seed specific stearoyl-ACP desaturase gene of soybean”文章中，将大豆的硬脂酰-ACP脱饱和酶命名为SACPD-C，表明SACPD-C是大豆中种子特异表达的基因，其启动子种子特异性启动子。

所述硬脂酸-ACP脱饱和酶启动子序列中含有多种与种子特异表达相关的顺式作用元件，参见图4a、图4b、图4c：对种子特异性基因高水平表达十分重要的RY- repeat，常出现在参与三酰基甘油合成和植物种子特异表达基因启动子中的E-box，转录因子结合位点TACGTA，增强转录的顺式元件CAAT，胚乳表达顺式作用元件Skn-1 motif，胚表达顺式作用元件SEF1、SEF4、种子特异元件AACA。

此外，硬脂酸-ACP脱饱和酶启动子序列中还含有:与光应答有关的顺式作用元件GT1(GRWAAW) 7个；1个W-box(TGACY)是WRKY转录因子的结合位点；2个CNGTTR基序是MYB转录因子的结合位点；12个AAAG核心序列是DOF转录因子的结合位点。

本发明所述的硬脂酸-ACP脱饱和酶启动子具有明显启动子特性，与现已知启动子无同源性，通过瞬时表达证明其能驱动基因在大豆种子中特异性表达，是一个全新的种子特异性启动子。

本发明的有益效果是：本发明中克隆了大豆的硬脂酸-ACP脱饱和酶启动子，研究该启动子在大豆中的组织表达特性及表达效率，为其有效应用提供依据；该启动子的获得为大豆转基因研究提供有利工具，特别为利用大豆种子作为生物反应器的研究和开发创造了条件。

附图说明

图1 是TAILPCR结果与PMD18-T连接酶切鉴定图

图2是Z1和Z2为引物PCR扩增硬脂酸-ACP脱饱和酶基因上游远端SACPD-Cp片段的电泳图；

图3 是硬脂酸-ACP脱饱和酶基因上游远端SACPD-Cp片段与T载体连接的重组质粒酶切鉴定；

图4a 是SACPD-Cp启动子序列的生物信息学分析第一部份图；

图4b 是SACPD-Cp启动子序列的生物信息学分析第二部份图；

图4c是SACPD-Cp启动子序列的生物信息学分析第三部份图；

图5 是SACPD-Cp启动子序列的缺少载体构建设计图；

图6是SACPD-Cp各缺失片段的PCR扩增电泳图；

图7 是SACPD-Cp片段及其缺失片段与表达载体连接后的PCR鉴定图；

图8 是SACPD-Cp片段及其缺失片段与表达载体连接后的酶切鉴定图；

图9是各表达载体转化农杆菌的PCR鉴定图；

图10是GUS组织化学染色观察结果，a : 根; b: 茎; c: 叶; d : 种子；A : 未侵染的大豆 ; B: GUS基因由CaMV35S 组成型启动子驱动; C: GUS 基因由SACPD-Cp启动子驱动;

图11 是玉米种子的GUS染色结果，A:未侵染的玉米种子；B: GUS基因由CaMV35S 组成型启动子驱动的玉米种子; C: GUS 基因由SACPD-Cp启动子驱动的玉米种子;

图12是SACPD-Cp片段在大豆各个组织中的荧光检测结果；

图13 是SACPD-Cp片段及其缺失片段在各个组织中的荧光定量检测比较结果；

图14 是PCAMBIA1301质粒图谱。

具体实施方式

实施例1：硬脂酸-ACP脱饱和酶基因上游远端片段的克隆及SACPD-Cp的序列分析

1、引物的设计与合成

根据大豆基因组中硬脂酸-ACP脱饱和酶基因ATG上游的一段已知序列（GeneBank assession AK245255），设计合成3个嵌套引物B1 、B2 、B3；参照论文《大豆种子特异性启动子的克隆及序列分析》（财音青格乐，李明春，蔡　易.作物学报，2005，31（1）:11-17）和《Rapid isolation and functional analysis of promoter sequences of the nitrate resuctase gene from Chlorella ellipsoidea》(Peng Wang ,Yongru Sun,Xia Li.Journal of Applied Phycology,2004,16:11-16.)中所述的TAIL-PCR方法，合成随机兼并引物AD1～AD6:

B1：5’-TGGAACTGTGGAGAGGTTGGAG -3’

B2：5’-GGTGTGACTAGTGATTAGCCCTTG -3’

B3：5’- GTGGAAATTTGGCCCGATACCT -3’

AD1：5’- NTCGA(G/C) T(A/T) T(G/C) G(A/T) GTT -3’

AD2：5’- NGTCGA(G/C) (A/T) GANA(A/T) GAA -3’

AD3：5’- (A/T) GTGNAG(A/T)ANCANAGA -3’

AD4：5’- AG(A/T) GNAG(A/T) ANCA(A/T) AGG -3’

AD5 ：5’- TG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(G/C)AGA-3’

AD6 ：5’- (G/C)TTGNTA(G/C)TNCTNCTNTGC -3’

2、TAIL-PCR方法扩增未知序列

A．采用CTAB法提取，从吉豆2号大豆品种叶片中提取基因组DNA,并进行纯化。

B．TAIL-PCR方法扩增：

a. 1st PCR 反应

以大豆基因组DNA作为模板，当以AD4 primer作为上游引物时扩增出未知序列，B1 primer 为下游引物，进行1st PCR 反应。

扩增反应体系

基因组DNA： 0.5 ul

dNTP Mixture(10mM each) : 1 ul

10×LAPCR Buffe(Mg+plus) : 2.5 ul

LA Taq(5U/ul) : 0.3 ul

AD5 Primer(100uM) : 0.5 ul

B1 primer(10uM) : 1 ul

ddH₂O : up to25ul

扩增反应条件：

b. 2nd PCR 反应

取1ul 1st PCR反应液作为2nd PCR 反应的模板，以AD4 primer作为上游引物，SP2 primer 为下游引物，进行2nd PCR 反应。

扩增反应体系：

Template(1st PCR反应液)： 1 ul

dNTP Mixture(10mM each) : 2 ul

10×LAPCR Buffe(Mg+plus) : 5 ul

LA Taq(5U/ul) : 0.5 ul

AD5 Primer(100uM) : 1 ul

B2 primer(10uM) : 2 ul

ddH₂O : up to50ul

扩增反应条件：

c. 3rd PCR反应

取1ul 2nd PCR反应液作为3rd PCR反应的模板，以AD4 primer作为上游引物，SP3 primer 为下游引物，进行3rd PCR反应。

扩增反应体系：

Template(2nd PCR反应液)： 1 ul

dNTP Mixture(10mM each) : 2 ul

10×LAPCR Buffe(Mg+plus) : 5 ul

LA Taq(5U/ul) : 0.5 ul

AD5 Primer(100uM) : 1 ul

B3 primer(10uM) : 2 ul

ddH₂O : up to50ul

扩增反应条件：

得到的扩增产物，在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测。扩增的片段长度大约为2100bp，与pMD18-T克隆载体连接后进行酶切鉴定，如图1所示：M:2000bp DNA Marker；1、2：EcoRI和SalI 双酶切，测序后与原已知序列重叠的147bp核苷酸序列完全一致。

利用Z1: 5’- GGGGAATTC AAAGAAAAAAAAATCCGTCC-3’ 和

Z2: 5’- GAACCATGGTGAGTGGGCCTTCCGGGCTTTG-3’ 这对引物扩增2081bp的SACPD-Cp片段,结果如图2所示：M:：2000bp DNA Marker；1：SACPD-Cp片段PCR结果；连接PMD18-T载体，EcoRI和NocI双酶切鉴定，结果如图3所示：M:2000bp DNA Marker；1、2、3、4为EcoRI和NocI双酶切，获得重组质粒PMD18-T-SACPD-Cp，测序后完全正确，大豆中分离的种子特异性启动子SACPD-Cp的核苷酸序列如Sequence N0.1。

本实施例中采用TAIL-PCR方法扩增未知序列。利用3个嵌套的特异性引物分别和兼并引物组合进行连续三次PCR循环，利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段，所获得的片段连接克隆载体验证后测序。并根据测序得到的序列设计引物扩增所需要的种子特异性启动子。该方法操作简便，成本较低，特异性高，重复性好，能够在较短的时间内获得未知的目标片段。TAIL-PCR 技术避免反向PCR和接头PCR的DNA 的环化和连接过程，且该方法中对基因组DNA 的纯度要求没有反向PCR和接头PCR的高，速度快，很多启动子序列的获得都是采取这种方法。

实施例2：SACPD-Cp片段的分析及其5’端缺失片段的克隆

SACPD-Cp的序列分析：

SACPD-C基因ATG上游序列2081bp，命名为SACPD-Cp。在线软件Neural Network Promote Prediction 对大豆SACPD-Cp进行生物信息学分析，其核苷酸序列分析如图4所述，进行基础启动子预测，在411bp-461bp，1146bp-1196bp，1530bp-1580bp，1988bp-2038bp和2021bp-2071bp 的位置存在基础启动子序列，可能性分别是0.95、0.83、0.90、0.97和0.94，后两个基础启动子区预测值较高。根据真核细胞基因启动子的基本特征，推测可能的转录起始位点在2062bp处的A。

对SACPD-Cp序列进行启动子元件分析后，设计五个缺失载体，如图5所示：分别为，设计五个5’端缺失片段序列的PCR引物：上游引物F1、F2、F3、F4和F5，下游引物Z2（引物序列如下）：

F1：5’-CGGAATTCCCAACTCGAGATCACACTATAA-3’（加横线者为EcoRI酶切位点）

F2：5’-CGGAATTCCCTAGTCGAGCTTGTAATTTGT-3’（加横线者为EcoRI酶切位点）

F3：5’-GGGGAATTCCACTATCATATCATAATCCA-3’（加横线者为EcoRI酶切位点）

F4：5’-CCGAATTCTTCCTTACGCCGCTAGCACTAC-3’（加横线者为EcoRI酶切位点）

F5：5’-GAGAATTCGAAAAGCCCACCACCGCCACCT-3’（加横线者为EcoRI酶切位点）

Z2：5’-GAACCATGGTGAGTGGGCCTTCCGGGCTTTG-3’ （加横线者为NcoI酶切位点）

扩增后的片段分别为AC1（-1818~+21），AC2（-1526~+21），AC3（-1059~+21），AC4(-433~+21)和AC5（-61~+21）。

PCR扩增反应体系为：

基因组DNA： 0.5 ul

dNTP Mixture(10mM each) : 1 ul

10×ExPCR Buffe(Mg+plus) : 2.5 ul

Ex Taq(5U/ul) : 0.3 ul

F1/F2/F3/F4/F5 Primer(100uM) : 0.5 ul

Z2 primer(10uM) : 1 ul

dH₂O : up to25ul

扩增反应条件：

94℃ 5min

94℃ 30s

X℃ 40s 30Cycles

72℃ 1min

72℃ 10min

退火温度X：AC1 62℃，AC2 60℃,AC3 60℃,AC4 67℃,AC5 67℃。

将上述序列的扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测；如图6所示，M为DL2000 marker,1、2、3、4、5分别为AC1、AC2、AC3、AC4和AC5的扩增结果。将这五个分别进行切胶回收，将其分别与pMD18-T克隆载体连接，分别获得重组质粒pMD18-T- AC1、pMD18-T- AC2、pMD18-T- AC3 、pMD18-T- AC4和pMD18-T- AC5，通过蓝白斑筛选阳性克隆，对5个重组质粒用EcoRI和NocI双酶切进行鉴定，结果表明5个片段已完全插入pMD18-T载体中。将4个重组质粒进行测序，测序结果与SACPD-Cp比对验证正确。

实施例3：SACPD-Cp片段各缺失片段表达载体的构建

将pMD18-T-SACPD-Cp、pMD18-T- AC1、pMD18-T- AC2、pMD18-T- AC3、pMD18-T- AC4、pMD18-T- AC5质粒载体和pCAMBIA1301载体分别用EcoRI和NocI进行双酶切,将酶切前6个质粒载体得到的小片段分别与酶切pCAMBIA1301载体得到的大片段连接，分别得到SACPD-Cp、 AC1、AC2、AC3、AC4、AC5与GUS基因融合的表达载体pCAM-SACPD-Cp、pCAM- AC1、pCAM- AC2 、pCAM- AC3 、pCAM- AC4和pCAM- AC5。分别用菌液PCR和双酶切对这6个载体质粒进行酶切鉴定，菌液PCR结果图7所示，M:2000bp DNA Marker；1、2、3、4、5、6分别为表达载体pCAM-SACPD-Cp、pCAM- AC1、pCAM- AC2 、pCAM- AC3 、pCAM- AC4和pCAM- AC5；酶切结果图8所示：M: 2000bp DNA Marker；1、2、3、4、5、6分别为EcoRI和NocI 双酶切表达载体pCAM-SACPD-Cp、pCAM- AC1、pCAM- AC2 、pCAM- AC3 、pCAM- AC4和pCAM- AC5，证明pCAM-SACPD-Cp、pCAM- AC1、pCAM- AC2 、pCAM- AC3 、pCAM- AC4和pCAM- AC5表达载体构建正确。

通过冻融法，将pCAM-SACPD-Cp、pCAM- AC1、pCAM- AC2 、pCAM- AC3 、pCAM- AC4和pCAM- AC5载体质粒转化农杆菌EHA105，菌液PCR对其进行验证，如图9所示，M:2000bp DNA Marker；1、2、3、4、5、6：分别为表达载体pCAM-SACPD-Cp、pCAM- AC1、pCAM- AC2 、pCAM- AC3 、pCAM- AC4和pCAM- AC5的农杆菌菌液PCR扩增产物，证实各载体转入农杆菌。

实施例4：SACPD-Cp片段农杆菌介导法侵染大豆根、茎、叶、种子的GUS染色

参照胡新文《Embryo and anther regulation of the mabinlin Ⅱ sweet protein gene in Capparis masaikaiLevl》（Xin-Wen Hu,Si-Xin Liu,Jian-Chun Guo. Funct Integr Genomics,2009,9:351-361）的方法，农杆菌介导法转化大豆根、茎、叶、种子。将大豆幼苗的根、茎剪成小块，取幼嫩叶片，种子去种皮后切成两瓣，浸没在分别含有pCAM-SACPD-Cp质粒和含有CaMV35S启动子的pCAMBIA1301载体质粒的农杆菌EHA105的重悬液MMA中（菌体重悬后OD₆₀₀约为0.2；MMA重悬液：MS,10 mM 的MES, 20mM LAS, 2%蔗糖，PH 5.6 ），另设一个空白对照，真空压力0.09-0.1MPa，15分钟。侵染后，在16h光照、8h小时黑暗光周期、22℃条件下，共培养1d 。

取出部分未侵染和侵染含有SACPD-Cp片段启动子的pCAMBIA1301质粒载体的大豆根、茎、叶、种子，放入GUS 染色液中，该GUS 染色液包括：50 mmol L^?1磷酸钠缓冲液pH 7. 0 ,10 mmol L^?1 EDTA ,1 mmol L^?1 X- Gluc ,0. 1 % Triton X- 100 , 10 mmol L^?1巯基乙醇，37℃温育过夜，75%乙醇脱色，10倍显微镜下观察染色情况，如图10（A、B、C分别为未侵染、侵染35S、侵染SACPD-Cp；a、b、c、d分别为根、茎、叶、种子），未侵染的大豆根茎叶几乎没有被染成蓝色，叶中比较浅的蓝色推测是褪色未完全；与未侵染的大豆种子、根、茎、叶相比，转化含有35S启动子的pCAMBIA1301表达载体的大豆根、茎、叶、种子被X-Gluc溶液染成蓝色，说明该载体中的GUS报告基因能够被CaMV35S组成型启动子激活表达。转化pCAM- SACPD-Cp载体的大豆根、茎、叶的颜色与未侵染的大豆根、茎、叶差不多，种子染色相对较深，说明SACPD-Cp启动子序列具有种子特异表达特性，以上的实验证明SACPD-Cp启动子序列能够驱动基因在大豆种子中特异性表达，是一个全新的种子特异性启动子。

实施例5：SACPD-Cp片段农杆菌介导法侵染玉米种子的GUS染色分析

农杆菌介导法转化玉米种子，将玉米种子切成两瓣，浸泡在分别含有pCAM-SACPD-Cp质粒和含有CaMV35S启动子的pCAMBIA1301载体质粒的农杆菌EHA105的重悬液中MMA中（菌体重悬后OD₆₀₀约为0.2；MMA重悬液：MS,10 mM 的MES, 20mM LAS, 2%蔗糖，PH 5.6 ），另设一个空白对照，真空压力0.09-0.1MPa，15分钟。侵染后，在16h光照、8h小时黑暗光周期、22℃条件下，共培养1d 。然后分别取未侵染的玉米种子、侵染含有pCAM-SACPD-Cp质粒农杆菌的玉米种子和侵染含有CaMV35S启动子农杆菌的玉米种子，分别进行GUS染色（染色方法如例4），结果如图11所示（A为无侵染的玉米种子、B为侵染35S、C为侵染SACPD-Cp）：无侵染的玉米种子没有被染成蓝色，而侵染含有pCAM-SACPD-Cp质粒农杆菌的玉米种子和侵染含有CaMV35S启动子农杆菌的玉米种子都被染成了蓝色，说明pCAM-SACPD-Cp启动子在玉米种子也中有启动功能。

实施例6：SACPD-Cp片段侵染大豆根、茎、叶、种子的荧光定量检测

荧光定量检测参照《植物基因工程原理和技术第二版》（王关林，方宏筠著，北京：科学出版社，2002）和《Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system》(Jefferson Jefferson R A . Plant Molecular Biology Reporter, 1987, 5 (4):387-405)的方法进行。取未侵染和侵染含有SACPD-Cp片段的pCAMBIA1301质粒载体的大豆根、茎、叶、种子约100mg，分别放入研钵中，用液氮研磨成粉末，加入600ul提取缓冲液，离心后的上清液为GUS蛋白粗提液。样品粗提液分为两部分，一部分采用Bradford法测定GUS蛋白含量；另一部分用于荧光定量检测，粗提液中加2 mmol L^?1的GUS 反应底物4-MUG, 37℃保温15 min 后, 加0.2 mmol L^?1 Na₂CO₃反应终止液终止反应，在激发波长365nm，发射波长455nm下，测定荧光值。GUS活性用获得的荧光值除以蛋白浓度和时间得到相对活性。荧光测定结果如图12显示，无侵染的各组织表达GUS荧光值都比较低，侵染含有SACPD-Cp启动子的pCAMBIA1301质粒载体的大豆种子的GUS荧光值比较高，说明SACPD-Cp启动子驱动下游基因在种子中特异表达；证明SACPD-Cp启动子是一个全新的种子特异性启动子。

实施例7：各个缺失片段嵌合表达载体的的荧光定量分析

对含有35S启动子、SACPD-Cp启动子和各个缺失片段的pCAMBIA1301质粒载体侵染大豆根、茎、叶和种子，取未侵染和侵染含有CaMV35S启动子、SACPD-Cp片段、AC1、AC2、AC3、AC4、AC5的pCAMBIA1301质粒载体的大豆根、茎、叶、种子约100mg，分别放入研钵中，用液氮研磨成粉末，加入600ul提取缓冲液，离心后的上清液为GUS蛋白粗提液。样品粗提液分为两部分，一部分采用Bradford法测定GUS蛋白含量；另一部分用于荧光定量检测，粗提液中加2 mmol L^?1的GUS 反应底物4-MUG, 37℃保温15 min 后, 加0.2 mmol L^?1 Na₂CO₃反应终止液终止反应，在激发波长365nm，发射波长455nm下，测定荧光值。GUS活性用获得的荧光值除以蛋白浓度和时间得到相对活性。荧光测定结果如图13显示，SACPD-Cp和AC1片段驱动下游基因在种子中的表达能力与CaMV35S启动子相近；AC2片段较AC1片段驱动下游基因在种子中的表达能力有较明显的下降，推测在SACPD-Cp启动子序列的-1818~ -1527bp之间存在促使种子中表达的正调控元件；AC3较AC2驱动下游基因在种子中的表达能力有较明显上升，推测-1526~ -1059之间存在影响该启动子表达的负调控元件；AC3较AC2驱动下游基因在根、茎、叶中的表达能力明显提高，推测在-1526~ -1059bp之间有种子特异性表达元件。

实施例1至实施例7中pCAMBIA-1301结构示意图如图14所述，限制性内切酶EcoRI、NcoI、pMD18-T克隆载体、ExTaq、T4连接酶均购自Takara公司，DNA凝胶回收试剂盒购自维特洁公司，5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸（X-Gluc）购自Clontech公司，4-MU和4-MUG购自Sigma公司，大肠杆菌DH 5α感受态购自北京鼎国生物技术公司，PCR引物和DNA序列测定由北京华大基因公司合成，其他试剂均为进口或国产分析纯。

实施例1至实施例7中，实验所用的主要仪器，PCR扩增仪(Bio-Rad Peltier Thermal Cycler)，电泳仪（Bio-Rad3000xi）；高速冷冻离心机（Sigma 2K-15）；凝胶成相分析仪（英国UVItec公司）；F4600 Fluorescence Spectrophotometer（型号：512-0004）。

实施例1至实施例7中，采用的DNA提取、PCR、酶切、连接、转化等基因工程操作方法记载于《分子克隆实验指南第三版》中（（美）J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002年出版）和《植物基因工程原理和技术第二版》中（王关林，方宏筠著，北京：科学出版社，2002）。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林大学

<120> 一种大豆中分离的种子特异性启动子序列及其应用

<130> jluwangqy20101

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2081

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

aaagaaaaaa aaatccgtcc tcctttaata ggttcctgta tatgtccatg tatatctctg 60

taaatcattc tttttatgtt aggcaaatgt atatgaaaga aatttttcct agtaaatttt 120

ccgcttatgt aaacatatgt atcgtttttt tttttttttt gtcttttgtt cgagtgggat 180

agtacccttc tgagcagcaa agttttcatt tgagaattta atgcagctga atatctaaaa 240

ttccaactcg agatcacact ataattaagt tggaataact tcacatcaat taatctcgcc 300

gtacatatta taagatattc tatctatcta tatacgtata taatatttaa ttatatatac 360

tttgatcaat atgtttagtg atatttaaaa ataattctac aaataattaa ttagcaagta 420

tttataaaat ccctcaaaga atctataccc aaaaacagct agcaaaaata atcatgcatc 480

gagttttaaa aacataataa ctctaataaa taattaatca aataaattta atttcctagt 540

cgagcttgta atttgtatgg ttaaatcata ttcaaatagc aatgatttta tatattttca 600

tattaaattt tcatttttat gtgaagtgaa aatttaaatt taagatatat gcacgaataa 660

agctaacaaa taaaatatta aattatacaa gttaatttct tttacagtaa attatattca 720

attcaatcat ctttttcatc ataggattga agatatatat ttatcttaag taaatactat 780

tttatttcca tatcttttgt ttcatacttt aaaatagaag cttccttatt gttattattt 840

cttgtaagtt attagaccca aaatctttca tatacacaaa attatcttta aattaatata 900

aaaatattaa taacatatat ttcataaaat atcaaaattt atatccctga aaaaaattgt 960

agtgatgttt tcttttagag aaaaaatgat tatgaacact gcactatcat atcataatcc 1020

actgttaact tttaaaatta tcttaaaata atcttgttta taaatgacaa tataaaatta 1080

tttaactata ttaaactctt tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata 1140

tatatatata tatatatata tatatattag tttatatgtc aaaacaaaat ttcatctaaa 1200

ttttaaaatt cttatataat ggtttaaaaa cttagtatat taatataata tagaataaaa 1260

cattttagtt aatatccata aaatacccat tacacttact aataaatacg tacaccaaaa 1320

ataataatag aaaacattgt tactcttcaa tagattaatt tatttatttt ttttcttgtt 1380

aaccaacaag tatcaccatt cactttaaag aatacgaaga cgaagaaaac tgcgctggca 1440

aattcaaaga cgcccacaaa gcggaaaaag atccacagaa atcacgattc actcgtctct 1500

acttattcta cgtaccaaaa ccacagcacc ccctgtttta caaaatcccc cattatttat 1560

ttcacctgca gcctggaact tttgtcatcc catgccacgt agcttttctt caatgaccat 1620

agtacccttc cttacgccgc tagcactacc cctaaaaact gcaatatttt cttaactgaa 1680

agcatccaac tatctaaaca cacattttcg caggtatcgg gccaaatttc cacataaatt 1740

cgcataaact tcaaccatcc aacaactaat ttggtaaata ttactacata acttaaatac 1800

ccaacatggc atttccgtaa attatcaaca aaccaagggc taatcactag tcacaccctt 1860

tacaaatatc tccaacctct ccacagttcc actcaaacaa cactagtcaa gtacaataga 1920

cacgtaatca aaaccatgca gatacgaacc tgccactcca tcaccaccca aacccttcca 1980

caacttccgt gttcttctag aaaagcccac caccgccacc tccttccgcc gttaaacgct 2040

gcggtttccg cgcgccgttc aaagcccgga aggcccactc a 2081

Claims

1.一种大豆中分离的种子特异性启动子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ No.1所述。

2.如权利要求1所述的大豆中分离的种子特异性启动子的制备方法，包括下列步骤：

a. 硬脂酸-ACP脱饱和酶基因上游远端序列的克隆：

利用TAIL-PCR方法，设计3个嵌套引物:

B1：5’-TGGAACTGTGGAGAGGTTGGAG -3’

B2：5’-GGTGTGACTAGTGATTAGCCCTTG -3’

B3：5’- GTGGAAATTTGGCCCGATACCT -3’

b. 对硬脂酸-ACP脱饱和酶基因ATG上游序列进行分析，利用

Z1: 5’- GGGGAATTC AAAGAAAAAAAAATCCGTCC-3’ 和

c. 将SACPD-Cp扩增片段与克隆载体pMD18-T进行连接，鉴定后测序，验证序列正确；

d. 设计各缺失片段分别为AC1、AC2、AC3、AC4和AC5，分别与克隆载体pMD18-T进行连接，鉴定后测序，验证序列正确。

3.如权利要求1所述的大豆种子特异性启动子作为大豆种子特异性启动子的应用。