CN102465114A - 一个植物根特异表达启动子的鉴定和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在植物体中调控异源核苷酸序列表达的方法和DNA构建体。该DNA构建体包含一个新的植物根部特异性表达启动子的核苷酸序列。提供了使用本文所公开的根特异启动子序列在植物根部优先表达异源核苷酸序列的方法。

Description

一个植物根特异表达启动子的鉴定和应用

技术领域

本发明属于植物生物工程和植物改良基因工程技术领域，具体涉及一种植物根特异性表达启动子的分离鉴定和应用。

背景技术

外源DNA序列通过连接到特定的启动子从而启动在植物宿主中的表达，启动子类型的选择决定基因的表达时间和部位。目前在农业生物技术领域广泛应用的主要是一些组成型的强启动子，比如CaMV 35S启动子和玉米Ubiquitin-1启动子(Battraw and Hall，1990；Christensen et al.1992)，然而在利用这些启动子诱导目的基因转化水稻等作物以期改良作物的品质时，往往会由于目的基因表达的时间(发育阶段特异性)或空间(组织器官特异性)不能很好地控制而导致改良效果不明显，或者由于这些组成型启动子诱导基因表达量太高而对植物的生长发育造成影响，这些都是目前利用组成型强启动子结合功能基因来改良作物品质时遇到的障碍。

此外，在研究某些代谢过程或调节途径时，常常需要将同一途径上的两个以上的基因转化到同一个株系中去，采用转化其中一个基因得到转基因植株后再转化另外一个基因，或者两个基因分别转化完成后再进行杂交，都需要等待较长的时间，为了提高效率缩短多个基因转化的时间，最近有报道可以利用新的载体同时进行多个基因的转化(Lin et al.2003；Chen et al.2006)，但是在多基因转化时如果重复使用同一个启动子，也会由于启动子序列的高同源性可能导致基因沉默。因此，克服以上转化技术上的困难，就很有必要克隆更多的组织器官特异性或者特定条件诱导型表达的启动子，这样可以根据需要选择不同的启动子诱导目的基因在适合的时间或空间表达。

组织特异性启动子亦称器官特异性启动子，在这类启动子的驱动下，基因的表达往往只限于某些特定的器官或组织部位，并表现发育调节等特性。组织特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，增加区域表达量，同时也可以避免植物营养的不必要浪费。随着植物基因工程技术的发展，这一特性必然使组织特异型启动子作为一种重要的顺式作用元件在生物反应器、选育抗虫、抗病、抗旱、抗高渗胁迫等抗逆特性的转基因植物优良品种等领域得到更加广泛的应用。

根是植物体吸收水分和营养物质的重要器官，根特异表达系统可用于研究植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等。Borisjuk等用根特异启动子mas2、GFP和烟草钙网蛋白(calreticulin)基因构建融合表达载体，转基因烟草水培研究结果表明：根细胞不仅能够高效产生GFP，而且可将目的蛋白质分泌到液体培养基中(Borisjuk NC等，1999)。此外，应奇才等运用松树根特异性启动子PmPgPR10驱动CMO/BADH双价基因并转入水稻，对转基因植株根和叶的CMO酶、BADH酶活性及其它生理生化指标进行了测定，结果表明：CMO/BADH双价基因可在根部特异性表达(应奇才等，2006)。

发明内容

本发明内容给出了本发明的一些实施方式，以及在多种情况中给出了这些实施方式的变动和变更。本发明内容只是很多的和不同的实施方式的示例。所提及的给定实施方式示例也是一个或多个代表性的特点。这样一个实施方式通常可以具有或不具有所提及的特点；同样，这些特点也可以被施用于本发明的其他实施方式中。为了避免过多的重复，本发明内容没有罗列或提及这些特点的所有可能的组合。

本发明提供了一种能在植物根部驱动特异性转录的启动子核苷酸序列，及克隆并应用该启动子的方法。本发明还提供了用于在植物中表达核苷酸序列的方法。在一些实施方式中，方法包括(a)将核苷酸序列可操作地连接于包括SEQ ID No：1的启动子，以产生表达盒；和(b)生成包括表达盒的转基因植物，由此在植物中，更具体地说，是在植物根部表达所述核苷酸。在一些实施方式中，所述“生成”包括用表达盒转化植物细胞并从所转化的植物细胞中再生出植物。

本发明所提供的植物根部特异性表达启动子，含有序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，还包含与SEQ ID No：1中所列核苷酸序列至少具有95％相似性的核苷酸序列，可以驱动操作性连接的核苷酸序列在植物根部的特异性表达。

实施方案中的启动子核苷酸序列可用于从其它生物中分离相应序列，如其它植物(单子叶或双子叶植物等)。根据这些相应序列与本文所列序列间的序列同源性，使用如PCR、杂交等技术来鉴别分离这些相应序列。因此，根据它们与本文所列的完整KT630P启动子序列(或其片段)间的序列相似性而分离的相应片段，也包括在实施方案中。实施方案的启动子区域可从任何植物中分离，包括(但不限于)水稻、芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦(Rye)、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦(Spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(Gramma grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘蔗、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、薯蓣、观赏植物和松类等。

本文中“启动子”一词指DNA调控序列，其中通常含有一个TATA盒，该序列能够指导RNA聚合酶II在合适的转录起始位点上起始特定编码序列的转录。启动子也可另外含有其他识别序列，它们通常位于TATA盒的上游或5’端，被称作上游启动子元件，这些元件能够影响转录速率。应认识到当鉴别了本文所公开的启动子区域的核苷酸序列后，分离并鉴定位于本文所鉴别的特定启动子区域上游的其它调控元件就属于现有技术范围了。因此，本文公开的启动子区域可另外包含上游调控元件，如负责组织特异性和时间特异性表达的元件、调控组成型表达的元件和增强子等。

本文中的“特异性表达”是指目的基因在特定的时间或特定组织器官中表达。“组织特异性启动子”又称“器官特异性启动子”，在这类启动子的调控下，基因往往只在某特定的组织或器官中表达。本文中所述植物根特异性表达启动子指在植物根部特异表达的启动子。

通常，如果在某组织或器官中某特定基因的转录产物mRNA的量比在其它组织或器官中高至少5倍，优选至少高10倍，更优选至少高100倍，最优选至少高1000倍水平，则驱动其表达的启动子被认为具有组织或器官特异性。启动子的活性和强度可以根据其驱动基因的mRNA或蛋白质的含量来测定。

本发明的实施案例中也包括DNA构建体，该构建体含有操作性连接于异源核苷酸序列上的启动子，该启动子含有本发明公开的序列，并可在植物细胞中驱动上述异源核苷酸序列进行表达。本发明的实施方案还提供了表达载体，以及在基因组中稳定包含上述DNA构建体的植物或植物细胞。“操作性连接”指使异源核苷酸序列处于启动子作用下的连接方式，也指将两个核苷酸序列连接起来从而使每个DNA片段的编码序列都保持在适当的阅读框内。“异源核苷酸序列”指天然状态下没有与本文所述启动子序列KT630P操作性连接的序列，对于植物宿主来说可以是同源的，或是异源的。

本文所公开的KT630P根特异启动子及其变异体和片段可用于植物基因工程，例如制备转化或转基因植物，以产生目的表型。“转化植物”或“转基因植物”指在基因组内含有异源核苷酸序列的植物。通常转化植物或转基因植物基因组稳定含有这些异源核苷酸序列，可将该异源核苷酸序列稳定地遗传给下一代。这些异源核苷酸序列可单独或与重组DNA构建体一起存在于基因组中。这里所述的“转基因事件”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物体部分或完整植物体，只要它们的基因型被外源核酸的存在而改变，包括通过转基因操作而改变的起始宿主，以及通过这些起始宿主进行有性或无性繁殖所得的后代。这里所用的“转基因事件”并不包括通过传统植物种植方法或天然事件(例如随机杂交、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)改变了基因组(染色体或染色体外)的植物。

“转基因事件”通过以下步骤获得，使用外源DNA构建体(含有核酸表达盒，其中又含有目的基因)转化植物细胞，用基因组插入了外源DNA构建体的植物细胞再培养获得大量植物体，根据插入的外源基因进行筛选获得所需的阳性转基因系。转基因事件的典型表型特征是目的基因的表达。在遗传水平上，“目的基因”是植物基因组组成的一部分。“转基因事件”也指转基因植物体与其它植物体进行杂交所得的含有外源DNA的后代。

本文的“植物”包括整株植物、植物组织器官(如叶、根、茎等)、种子、植物细胞，以及它们的后代。实施方案中转基因植物的部分植株应理解为包括转基因植物或其后代的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚，及从转基因植物或其后代长出的花、茎、果实、胚珠、叶或根等。

这里所用的“植物细胞”包括但不限于种子悬浮培养物、胚芽、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子、花粉、孢子体和小孢子。可用于本文所公开方法的植物种类包括所有可进行转化的高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物。

本文所公开的启动子序列可在宿主植物中调控任何异源核苷酸序列的表达。因此，所述的异源核苷酸序列可以是操作性连接于本文所公开的启动子之上的结构基因(编码目的蛋白)。实施方案中的目的基因包括参与信号传导调控的基因如转录因子、激酶等，持家基因如热休克蛋白基因。更具体地说，转基因的种类包括如，所编码蛋白赋予植物耐受非生物逆境的抗性基因，所述非生物逆境包括干旱、温度、盐和毒素(杀虫剂和除草剂)等。或是所编码蛋白赋予植物耐受生物逆境的抗性基因，如真菌、病毒、细菌、昆虫和线虫的侵害，以及由这些胁迫引起的疾病。表型的编码包括改变植物中某个基因的表达，从而改变植物对病原体或昆虫等的防御机制，或是提高植物对除草剂的抗性，根据环境改变植物的生长发育过程等。这些改变可通过在植物体内表达外源基因或提高内源特定基因的表达来获得。或者是通过降低植物体内一个或多个内源基因的表达产物，如酶、转运蛋白、辅因子等，通过影响植物的代谢机制来获得相应的表型。

由上可见，可将任何目的基因操作性连接到实施方案中的启动子序列上，并在植物体中进行表达，优选在植物根系中表达。

根据RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)，操作性连接于本文所公开的KT630P根特异性表达启动子上的异源核苷酸序列，可以是某些靶基因的反义序列。“反义核苷酸序列”指一段与靶基因核苷酸序列互补的双链RNA分子。当导入到植物细胞中后，反义DNA序列的转录能阻止靶基因DNA序列的正常表达。反义核苷酸序列编码的RNA转录产物可与靶基因转录生成的内源mRNA互补，并可与其杂交，由此，靶基因编码的天然蛋白的合成就受到限制，从而获得相应的表型。

下面通过具体实施方式，结合附图对本发明做进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。

附图说明

图1是表达载体pHPG的T-DNA区图谱。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hpt表示潮霉素抗性基因；Pnos表示nos基因的启动子；Tnos表示nos基因的终止子；GUS表示gus蛋白基因；T35s表示35s基因的终止子；HindIII和BamHI分别表示限制性内切酶HindIII和BamHI的酶切位点；根特异启动子即为本发明所分离鉴定的根特异表达启动子。

图2是KT630P转基因水稻的组织器官GUS染色。A为水稻幼苗期；B为转基因抗性愈伤；C为苗期叶片；D为苗期的茎；E为苗期的根；F为水稻花器官。

图3是KT630P转基因拟南芥植株的GUS染色。

图4是本发明KT630P启动子驱动的GUS基因在转基因水稻各组织器官中的表达情况。

图5是KT630P启动子序列的基序分析。翻译起始位点ATG的A定义为“+1位；“W-盒”用粗体下划线表示；“TATA-盒”用方框表示。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成，测序由北京华大基因完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司，pEASY-T1连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司，T4DNA连接酶购自Promega公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体pHPG由本实验改造所得，基本骨架来自于CAMBIA公司的pCAMBIA1303。

1.启动子KT630P的分离和鉴定

设计克隆启动子KT630P所需引物：

引物1：5′-CCCaagcttGCTATATGTGTACGTGATAGTATAT-3′

引物2：5′CGggatccTTAATTTGCTCTTGTATTAGCTCTA-3′

引物1中序列aagctt为HindIII的酶切位点，引物2中序列ggatcc为BamHI的酶切位点。

利用启动子的正反向引物(其中带下划线部分的序列为启动子序列)，以植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取的水稻(中花11)基因组DNA作为模板，进行扩增，反应条件是：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸1分钟；30个循环；72℃延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-T1，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明：所扩增序列为预期的KT630P启动子序列。

2.构建表达载体

将测序验证已经插入KT630P启动子序列的质粒用HindIII和BamHI双酶切，连入同样用HindIII和BamHI双酶切的载体pHPG，挑取菌落PCR结果为阳性的菌落进行测序，测序验证正确后，提取相应阳性克隆质粒，命名为pHPG-KT630P。

菌落PCR检测所需引物：

引物3：5′-TCTCCGCTCATGACGATAAT-3′

引物4：5′-GACGTAACATGGTGAAGGGG-3′

引物3和引物4为pHPG载体上引物，位于所克隆的启动子片段两侧，扩增片段约为启动子的长度，以菌液为模板，扩增检测，PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸1分钟；34个循环；72℃延伸10分钟。

所构建的表达载体的T-DNA区的图谱如图1所示，其中：LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hpt表示潮霉素抗性基因；Pnos表示nos基因的启动子；Tnos表示nos基因的终止子；GUS表示gus蛋白基因；T35S表示35S基因的终止子；HindIII和BamHI分别表示内切HindIII和BamHI的酶切位点；根特异启动子即为本发明通过PCR克隆出的根特异表达启动子。

3.农杆菌共转化

利用热激法将质粒pHPG-KT630P转入农杆菌AGL0菌株，利用农杆菌介导法对水稻进行共转化，同时利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥植株。

4.功能鉴定

从转基因植株中分离各组织器官，进行GUS活性检测，将各组织器官置于含有GUS染色缓冲液的EP管中，放于37℃温箱温育过夜，然后室温条件下在无水乙醇中脱色保存。

4.1转基因水稻苗的组织器官染色

将转化KT630P启动子得到的具有潮霉素抗性的水稻愈伤组织，进行GUS染色实验，结果如图2B所示，抗性愈伤中基本没有GUS基因表达。将水稻KT630P转基因水稻苗的组织器官，如叶片、茎、根和花分别进行GUS染色，结果如图2所示，GUS基因只在植株的根系中有很强的表达，显现出很强的蓝色，在其它各组织器官中基本没有检测到GUS基因的表达。并且，这种根特异表达特性在水稻的各个发育阶段均表现出很强的根特异性。

4.2 RT-PCR表达分析

取KT630P转基因水稻纯系的根、茎、叶和花器官，提取RNA，反转录为cDNA作为模板，以水稻ACTIN基因作为内参，分析KT630P启动子驱动的GUS报告基因在转基因水稻中的表达情况。

RT-PCR的检测引物是：

引物5：5′-TAATGTTCTGCGACGCTCAC-3′

引物6：5′-CGGCGAAATTCCATACCTG-3′

引物7：5′-TGTTCCTGCCATGTATGT-3′

引物8：5′-ATGTCCCTCACAATTTCC-3′

其中引物5和引物6是GUS基因的检测引物，其扩增片段大小为321bp；引物7和引物8是水稻内参基因ACTIN的分析引物，其扩增片段大小为252bp。PCR检测体系和程序是：

10×buffer        2

10mM dNTP         0.4

10mM引物F         0.4

10mM引物R         0.4

Taq polymerase    0.4

cDNA              1

ddH2O             15.4

PCR反应条件：95℃，预变性5分钟；94℃，变性30秒；55℃，退火30秒；72℃，延伸25秒；28个循环，72℃，10分钟。

反应结束后，对PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR检测结果如图3所示，在根、茎、叶和花组织器官中，只在根组织中检测到了GUS基因的表达。

4.3转基因拟南芥的组织器官染色

将KT630P启动子转化拟南芥所得的阳性苗，整棵进行GUS染色，结果如图4所示，在转基因拟南芥的各个发育阶段，报告基因GUS都只在植物根部表现出很强的表达，而在其它组织器官中的染色程度均处于肉眼不可见水平。

用体式镜观察KT630P转基因拟南芥的根系染色情况，发现结果如图4D所示，GUS基因只在根系的中柱鞘中表达。

5.启动子序列的基序分析

以翻译起始位点ATG的A定义为“+1位”，对KT630P的启动子序列进行分析，结果如图5所示，发现在翻译起始位点ATG上游含有一个启动子基本元件“TATA-盒”，一个应答环境胁迫的“W-盒”。其中，“W-盒”用粗体下划线表示；“TATA-盒”用方框表示。

Claims (16)

1.一种转化的植物细胞，其特征是含有一种启动子核酸分子，所述启动子核酸分子具有选自SEQ ID NO：1，或其互补链的核酸序列。

2.权利要求1所述转化的植物细胞，其中所含的启动子核酸分子可与异源核苷酸序列操作性相连。

3.权利要求2所述转化的植物细胞，其中所含的异源核苷酸序列指天然状态下没有与所述启动子序列操作性连接的序列，对于植物宿主来说可以是同源或是异源的。

4.权利要求2所述转化的植物细胞，其中所含的异源核苷酸序列编码的基因产物可赋予植物对除草剂、盐、低温、干旱、病原体或昆虫的抗性，或是调控植物的生长发育。

5.权利要求2所述转化的植物细胞，其中所含的异源核苷酸序列为靶基因的部分同源序列，以RNA干扰技术的方式抑制植物内源或外源基因的表达。

6.权利要求1所述转化的植物细胞，其中所述转化的植物细胞来自单子叶植物。

7.权利要求6所述转化的植物细胞，其中所述单子叶植物细胞来自禾本科植物，优选为水稻。

8.权利要求1所述转化的植物细胞，其中所述转基因植物细胞来自双子叶植物。

9.权利要求8所述转化的植物细胞，其中所述双子叶植物细胞来自十字花科，优选为拟南芥。

10.一种在植物中表达核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物体导入DNA构建体，所述DNA构建体含有启动子及操作性连接于所述启动子的目的异源核苷酸序列，其中所述启动子含有的核苷酸序列选自：

a)含有SEQ ID NO：1所示的启动子核苷酸序列；

b)包含的序列与SEQ ID NO：1所示序列至少有95％序列相似性的启动子核苷酸序列，其中所述启动子核苷酸序列可以在植物根部启动异源核苷酸序列的特异转录和表达。

11.一种核酸分子，包含选自SEQ ID NO：1的分离的启动子。

12.一种载体，它含有权利要求11所述的核酸分子。

13.一种细胞，它含有权利要求12所述的载体。

14.权利要求13所述细胞，其中所述细胞包括细菌细胞，哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，或真菌细胞。

15.权利要求14所述细胞，其中所述细菌细胞来自根癌土壤杆菌或大肠杆菌。

16.权利要求13的细胞，其中所述植物细胞为水稻细胞。

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