CN104480110B - 玉米组织特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了玉米组织特异性启动子及其应用，属于植物组织特异性启动子的分离和应用领域。本发明从玉米中分离获得核苷酸序列为SEQ ID NO.1的组织特异性启动子以及截短后的SEQ ID NO.2所示的组织特异性启动子。本发明还公开了含有所述组织特异性启动子的重组植物表达载体以及宿主细胞。本发明进一步公开了所述组织特异性启动子在提高作物种子品质、改良作物性状以及培育转基因植物新品种等方面的应用。

Description

玉米组织特异性启动子及其应用

技术领域

发明涉及一种从植物中分离的启动子，尤其涉及从玉米(Zea mays)中分离的组织特异性启动子，本发明还涉及含有该组织特异性启动子的重组植物表达载体以及宿主细胞，本发明进一步涉及它们在提高作物种子品质、改良作物性状、培育植物新品种等方面的应用，属于植物组织特异性启动子的分离及其应用领域。

背景技术

启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，是重要的顺式作用元件，一般位于结构基因5’端上游区。高等植物基因调控主要在转录水平进行，启动子控制着基因表达的起始时间和表达程度，同时对所使用的RNA聚合酶类型也起着决定性作用，所以启动子是理解基因表达模式和转录调控机制的关键，是植物基因转录调控的中心。

根据启动子的转录模式及功能，可将其分为三类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。目前，在植物基因工程中使用的大多数为组成型启动子，使外源目的基因在植物各组织部位高水平表达，但是，在此过程中会出现多种多样的问题，例如，不能从时间和空间上有效地调控目的基因的表达，过度消耗细胞内的物质和能量(GittinsJR,Pellny TK,Hiles ER,Rosa C,Biricolti S,et al.(2000)Transgene expressiondriven by heterologous ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small-subunit gene promoters in the vegetative tissues of apple(Malus pumilamill.).Planta 210:232-240.)；大量异源蛋白或代谢产物在植物体内积累，打破植物的代谢平衡，不利于植物生长(Robinson DJ(1996)Environmental risk assessment ofreleases of transgenic plants containing virus-derived inserts.Transgenicresearch 5:359-362.)；引起基因沉默或共抑制现象(Kumpatla SP,Chandrasekharan MB,Iyer LM,Guofu L,Hall TC(1998)Genome intruder scanning and modulation systemsand transgene silencing.Trends in Plant Science 3:97-104；Mette MF,Aufsatz W,van der Winden J,Matzke MA,Matzke AJ(2000)Transcriptional silencing andpromoter methylation triggered by double-stranded RNA.EMBO J 19:5194-5201.)；此外还存在转基因植物安全性隐忧。因此，科学家们不断寻找更为有效的组织或器官特异性启动子来代替组成型启动子，以期更精确的调控外源基因的表达。

组织或器官特异性启动子调控下的基因转录过程一般只发生在某些特定的组织或者器官中。组织或器官特异性表达启动子可以更加经济有效的调控外源基因的表达，特异地在特定需要的部位发挥作用，这样不仅可以提高外源基因的表达丰度，而且将生物能耗降到最低，从而不影响植株的正常生长。

玉米(Zea mays)是中国最大的粮食作物，也是重要的转基因作物。在基因工程改良中，外源基因在细胞中表达是基因工程研究的关键，而组织特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，增加区域表达量，同时也可以避免植物营养的不必要浪费。

玉米组织特异性启动子可分为根、茎、叶、花、胚、胚乳、果实、木质部、绿色组织等组织或器官特异性启动子，每一类型的组织特异性启动子都具有一些特殊的功能元件。玉米胚特异性启动子能驱动目的基因在玉米胚中特异性表达，如果能从玉米中分离获得组织特异性启动子，可以利用该组织特异性启动子将目的基因在胚中进行特异性的高效表达，这对玉米进行分子改良或生产具有特殊用途的新玉米品种等方面有重要的意义。

发明内容

本发明目的之一是提供从玉米(Zea mays)中分离的组织特异性启动子。

本发明目的之二是提供含有上述组织特异性启动子的重组表达载体以及含有该重组表达载体的宿主细胞。

本发明目的之三是将所述的组织特异性启动子以及含有该组织特异性启动子的重组表达载体应用于构建转基因植物、改良农作物种子性状、培育具有优良性状的植物新品种等。

为实现上述目的，本发明首先提供了一种从玉米(Zea mays)中分离的组织特异性启动子，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)或(d)所示:

(a)、SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列；或

(b)、与SEQ ID NO.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有组织特异性启动子的功能或活性；或

(c)、与SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少有60％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有组织特异性启动子的功能或活性；优选的，与SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有组织特异性启动子的功能或活性；更优选的，与SEQ ID NO.1的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有组织特异性启动子的功能或活性；或

(d)、在SEQ ID NO.1的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入并包含SEQID NO.2序列的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体仍具有组织特异性启动子的功能或活性。

本发明进一步将SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列从5’端逐渐删除部分序列得到多个截短的序列，将截短后的各个序列分别连接到带有报告基因的表达载体上验证截短后的序列是否具有组织特异启动子的功能；本发明通过功能验证实验确定，将SEQ ID NO.1的5’端核苷酸序列截短后的SEQ ID NO.2所示的146bp的序列(为-146—+1之间的片段)能够驱动报告基因在玉米种子胚中进行特异表达，说明SEQ ID NO.2所示的146bp的序列具有组织特异性启动子的功能。

因此，本发明进一步提供了一种将SEQ ID NO.2所示的组织特异启动子截短后的启动子片段，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)或(d)所示:

(a)、SEQ ID NO.2所示的多核苷酸序列；或

(b)、与SEQ ID NO.2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有组织特异性启动子的功能或活性；或

(c)、与SEQ ID NO.2的多核苷酸序列至少有60％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有组织特异性启动子的功能或活性；优选的，与SEQ ID NO.2的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有组织特异性启动子的功能或活性；更优选的，与SEQ ID NO.2的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有组织特异性启动子的功能或活性；或

(d)、在SEQ ID NO.2的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入获得的多核苷酸变体，该多核苷酸变体含有SEQ ID NO.2中第1-13位的13bp碱基，且该多核苷酸变体仍具有组织特异性启动子的功能或活性。

本发明还将SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列从5’端逐渐删除部分序列得到SEQID NO.3所示的截短序列，该截短序列能够驱动报告基因在玉米种子胚中进行特异表达，说明SEQ ID NO.3所示的序列仍具有组织特异性启动子的功能。

因此，本发明又进一步提供了一种将SEQ ID NO.3所示的组织特异启动子截短后的启动子片段，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)或(d)所示:

(a)、SEQ ID NO.3所示的多核苷酸序列；或

(b)、与SEQ ID NO.3的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有组织特异性启动子的功能或活性；或

(c)、与SEQ ID NO.3的多核苷酸序列至少有60％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有组织特异性启动子的功能或活性；优选的，与SEQ ID NO.3的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有组织特异性启动子的功能或活性；更优选的，与SEQ ID NO.3的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有组织特异性启动子的功能或活性；或

(d)、在SEQ ID NO.3的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入获得的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体仍具有组织特异性启动子的功能或活性。

本发明中所述的“替换”是指分别用不同的碱基取代另外的碱基；所述的“缺失”是指缺少一个或多个碱基；所述的“插入”是指核苷酸的改变，相对天然分子而言，所述改变是因添加一个或多个碱基所致。

为研究本发明从玉米中分离的组织特异启动子的功能，本发明将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的启动子与GUS基因可操作的连接，构建得到植物表达载体；以玉米为受体材料，采用农杆菌介导的瞬时表达法对启动子进行功能验证，试验结果表明启动子驱动的GUS基因仅在玉米种子的胚中进行特异性表达，在玉米种子胚乳、根、茎、叶等其它组织部位里没有GUS表达活性；试验结果证实，本发明从玉米中所分离的SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2或或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为组织特异性启动子。

本发明进一步提供了含有所述组织特异性启动子的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。

将本发明所述组织特异性启动子与待转录的异源性DNA序列进行可操作的连接，即得到在农作物种子胚中特异性表达异源性DNA序列的重组植物表达载体。

所述的重组植物表达载体中还可含有选择标记基因。

另外，可以将本发明的组织特异性启动子与标记序列可操作的连接以确定标记序列的活性，所述的标记序列通常包括提供抗生素抗性或除草剂抗性的基因，诸如：四环素抗性基因、潮霉素抗性基因、草苷膦或草丁膦抗性基因等。

可以采用任何植物转化方法将本发明所构建的重组植物表达载体引入到目标植物的细胞、组织或器官中，得到转化体；再由转化体通过植物组织培养方法再生得到完整的植株及其无性系或其后代；所述的转化方法包括：农杆菌介导的转化、原生质体转化、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电穿孔法、微粒轰击等；所述的目标植物包括单子叶植物、双子叶植物；优选的，所述的目标植物为禾本科植物，例如，可以是玉米、水稻、大麦、小麦、高粱等农作物。

本发明所分离的组织特异性启动子在提高作物种子的品质、改良植物性状、培育植物新品种等方面有广泛的应用。

将本发明的组织特异性启动子可操作的与待转录的异源性DNA序列相连接，可以指导或调控待转录的异源基因在植物种子中的胚进行转录或表达，得到具有预期性状的转基因植物或植物新品种；例如，将本发明的组织特异性启动子可操作的与待转录的异源DNA序列相连接(其中，该待转录的异源DNA序列还与3′非编码区可操作的连接，所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。)得到可以在植物种子胚中表达该待转录的异源DNA序列的植物表达载体。待转录的异源DNA序列不受限制，可以是调节基因、调节基因的反义基因或者能干扰内源基因表达的小RNA等；所述的待转录的异源DNA序列可以是来自非靶基因物种的核酸分子或基因，或者是起源于或存在于相同的物种中经过人工改造或修饰的核酸分子或基因。

通常来说，待转录的异源DNA序列多为改良作物种子品质、提高作物抗性、改善作物性状或代谢的相关基因，例如，可以是：改善植物生理、生长和发育的相关基因，提高产量的相关基因，强化营养、提高病虫害抗性等相关基因，这些基因或者为植物体提供有益的性状，或者提高或改善作物种子品质、促进种子胚发育或提高作物种子对病虫害抗性。还可以将促进作物种子中铁、锌、钾等微量元素的积累的有关基因可操作的与本发明的组织特异性启动子相连接之后构建得到重组植物表达载体，将该重组植物表达载体转化到受体植物组织或细胞中后，本发明组织特异性启动子能够驱动促进作物种子中铁、锌、钾等微量元素的积累的有关基因在作物种子胚中进行特异的高效表达，有效提高作物种子中铁、锌、钾等微量元素的积累，最终达到有效提高作物种子品质的目的。

该待转录的异源DNA序列可以包括具有RNA活性的序列或产生多肽产物的序列等，例如，可以是反义序列、RNAi序列、核酶序列、剪接体、氨基酸编码序列以及它们的片段。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(T_m)约5-10℃。T_m为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在T_m下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“启动子”指存在于目的基因编码序列的上游，提供RNA聚合酶和正确转录起始所必需的其它因子的识别位点，启动或指导目的基因转录为mRNA。

术语“组织特异性启动子”：调控或驱动目的基因在组织或器官中特异性表达的启动子。

术语“异源性DNA序列”指该DNA序列对该特定的宿主细胞而言属于外来的来源，或若来自相同的原始来源但对该原始序列进行了修饰或改造。

术语“内源基因”来自宿主本身的基因，包括DNA或RNA序列。

术语“选择标记基因”：该基因在植物细胞中的表达给予该细胞选择优势，用这些选择性标记基因所转化的这些细胞所具有的选择优势可以是由于它们与非转化细胞的生长相比具有在阴性选择剂(如：抗菌素或除草剂)的存在下生长的能力。选择标记基因还指多种基因的组合，它们在植物细胞中的表达给予该细胞阴性以及阳性的选择优势。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。

术语“植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

附图说明

图1 RNA质量检测电泳图；R：根；S1,S2,S3：第4、3、2节段茎；L1，L2，L3：第2、4、6片叶；SH1，SH2，SH3：第2、4、6片叶的叶鞘；SA：茎尖；T：雄花；EN：胚乳；E：胚；K：籽粒。

图2原始验证载体pCAMBIA3301的示意图。

图3 pEU13387-EZ的示意图。

图4 pUM3G中间载体的示意图。

图5表达载体pEU13387G3的示意图。

图6稳定表达载体p13387-5G3的示意图。

图7稳定表达载体p13387-8G3的示意图。

图8胚特异性启动子的瞬时表达结果；胚的发育时间为20天。

图9胚特异启动子启动GUS基因在种子中的表达情况；图中1,2,3,4及5分别代表不同的玉米种子。

图10不同长度启动子驱动报告基因表达的瞬时表达结果。

图11稳定表达载体p13387-5G3和p13387-8G3的稳定转化T0代转基因玉米三叶一心时期的叶片、叶鞘、以及授粉后30天的籽粒的GUS染色图；

A-C:p13387-5G3稳定转化的T0代转基因玉米三叶一心时期的叶片、叶鞘、以及授粉后30天的籽粒的GUS染色图；D-F:p13387-8G3稳定转化的T0代转基因玉米三叶一心时期的叶片、叶鞘、以及授粉后30天的籽粒的GUS染色图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 玉米组织特异启动子的克隆及序列分析

1、利用基因芯片数据筛选驱动玉米种子特异表达基因的启动子

(1)基因芯片材料的准备

首先提取玉米B73(购自北京奥瑞金种业股份有限公司)大喇叭口期的根、叶、茎和茎间，成熟期但未授粉的幼穗和花丝，授粉后10天、15天、20天、25天的胚和胚乳等共14个样品类型的RNA，每个样品类型有3个重复，然后利用基因芯片(Affymetrix公司的MaizeGenomeArray)来分析这42个样品的基因表达谱。

(2)生物信息学分析

采用生物信息学的方法对42个样品进行数据分析，分别发现了一个基因(001149167)(该基因的启动子序列为SEQ ID NO.1所示)在胚发育的中后期，特异性的大量表达。

表1 利用基因芯片分析基因(其启动子序列为SEQ ID NO.1)在不同组织中的表达量

2、定量RT-PCR筛选驱动胚特异表达基因的启动子

提取玉米B73大喇叭口期的根、茎、叶、叶鞘和茎尖，授粉后10天、15天、20天、25天的胚和胚乳组织中的RNA，每个样品设置三个重复。采用实时定量RT-PCR来进一步验证基因芯片分析的结果，并验证基因(001149167)(该基因的启动子序列为SEQ ID NO.1)在胚中的表达特异性及表达强度。发现定量RT-PCR的结果和基因芯片分析的实验结果基本一致，该基因(001149167)主要表达于胚中。

表2 利用RT-PCR分析基因(其启动子SEQ ID NO.1)在不同组织中的表达量

(1)、自交系B73取材

取材品种：B73自交系。

取样内容：大喇叭口期的根、茎、叶、叶鞘、茎尖以及授粉后10天、15天、20天、25天的胚和胚乳。其中茎采取了形态学上端的三个节段，叶与对应的叶鞘分别取从形态学下端数起的第2片、4片、6片叶及叶鞘。

取样方式：在大田里选好合适的植株后，首先拍摄整株的照片，而后将取样的组织表面清理掉污垢，再分成三份置于2mL离心管中迅速置于盛有液氮的液氮罐中速冻保存起来。而后用干冰冷冻空运到实验室保存到-80℃冰箱。

(2)、RNA的提取以及cDNA获得

将组织样品在用液氮预冷的研钵磨成粉末后，采取通用的TRIzol试剂提取方法提取RNA。RNA的质量用1.5％的琼脂糖胶电泳检测，电泳图见图1。从图1中可以看出，各个组织的RNA质量均达到反转录的要求。按反转录试剂盒的要求的RNA用量先除DNA，而后反转录成cDNA。

将获得的不同节段的茎、不同位置的叶片、不同位置的叶鞘的cDNA按等体积比进行混合形成玉米茎、叶、叶鞘cDNA样本。包括其它组织的cDNA样本母液均稀释25倍后使用，每个反应使用5微升的稀释后的cDNA。内参基因使用actin，目标基因与内参基因每个反应均做三个平行点。验证引物见表3。

表3 验证引物

3、启动子的克隆

以SEQ ID NO.1所示的2.0kb序列作为包含“组织特异性高表达”启动子全长的序列设计克隆引物，所设计的克隆引物如下：

13387F7 5-AAGGAACATCTTAGGAAGTGTT-3

13387R6 5-TGTCGTCGTCCGCCACCCGAC-3

以自交系B73基因组DNA为模板，通过高保真DNA聚合酶KOD扩增获得目的启动子克隆，克隆片段加载到克隆载体pEASY-Blunt(购自北京全式金生物技术有限公司)上，经测序验证序列无误，将新载体命名为pEU13387-EZ。

试验例1 候选启动子驱动报告基因在玉米胚中特异表达试验

为了验证SEQ ID NO.1所示的2.0kb左右的片段是否具有组织特异性启动子功能，将SEQ ID NO.1所示的片段克隆到原始验证载体pCAMBIA3301(购自Cambia公司，http://www.cambia.org)(图2)来验证启动子的功能。为了便于克隆，本试验将pCAMBIA3301载体的多克隆位点进行改造，用EcoRⅠ和BglⅡ对其进行双酶切，并在此插入一个合成的含有多个酶切位点小片段(序列为如下所示)，来替代原有的多克隆位点构成中间载体pUM3G：

5-GAATTC GGTACCCGGG(EcoRⅠ/BamHⅠ/KpnⅠ/SmaⅠ)ctattgcggtgcaggctgccagagcggcggctgtgacgctgtctttgccggcgccatcaccgccaactccactcttctcgcagaatgatgatagatccaccatggttaacctagacttgtccatcttctggattggccaacttaattaatgtatgaaataaaaggatgcacacatagtgacatgctaatcactataatgtgggcatcaaagttgtgtgttatgtgtaattactagttatctgaataaaagagaaagagatcatccatatttcttatcctaaatgaatgtcacgtgtctttataattctttgatgaaccagatgcatttcattaaccaaatccatatacatataaatattaatcatatataattaatatcaattgggttagcaaaacaaatctagTCTAGACTGCAGCCATGGTAGATCT(XbaⅠ/PstⅠ/NcoⅠ/BglⅡ)-3

利用HindIII和SmaI对pEU13387-EZ(图3)进行酶切处理，将启动子片段连入用HindIII酶切和XbaⅠ酶切补平处理的pUM3G中间载体(图4)，获得表达载体pEU13387G3(图5)，报告基因为GUS，瞬时表达验证2.0kb左右的片段是否具有组织特异启动子功能。

(1)转化材料的获得

根据real-time PCR实验结果，绝大多数候选基因的转录本均是在玉米授粉后20天左右达到最高值，因此，进行瞬时表达体系中选用的转化材料(玉米幼胚)则是选用授粉后20天的玉米幼胚。

玉米授粉后20天，取下幼穗，去掉苞叶和花丝，用5％的次氯酸钠浸泡消毒灭菌30分钟，而后用无菌水清洗三次。在超净工作台中，无菌条件下用解剖刀剥取幼胚，并将幼胚集中浸泡在液体MS培养基中以便除去胚表面上的淀粉和保持胚的活力。取完足够胚后再用液体MS培养基清洗一次，而后转移到固体高渗培养上高渗处理4小时备用。每皿放置9-12颗幼胚，三个胚一行放置3-4行。

(2)转化

微弹的制作及基因枪轰击方法参考文献(通过ubi内含子改造提高单子叶植物外源基因表达，作者：潘阳阳；导师：郎志宏；中国农业科学院，生物化学与分子生物学，2012，硕士学位论文)，只是将可裂膜换成1100psi的规格。每皿轰击一次，每个构建2-3个平行，质粒用量为1微克/枪。轰击完后一小时，再将幼胚转移到恢复培养基上28℃暗培养24小时。

(3)GUS组织化学染色

在超净工作台中将暗培养的玉米转化材料转移到无菌2毫升离心管中(1枪/管)，每管加400微升GUS染液，扣上管盖，将离心管水平放置在37℃恒温箱中保温至少8小时后即可观察分析幼胚的着色斑点的有无和深浅来验证SEQ ID NO.1所示的候选启动子的功能。

试验结果见图8。从试验结果可见，SEQ ID NO.1所示启动子驱动GUS报告基因在玉米胚中进行高强度的特异表达。

2、稳定转化玉米进一步鉴定胚特异性启动子的功能

将以GUS基因为报告基因的稳定转化载体pEU13387G3(图5)以农杆菌介导的方法转化了玉米材料HiⅡ(购自北京奥瑞金种业有限公司)，得到了稳定转化的植株，玉米稳定转化流程如下：

(1)、取授粉后10天的HiⅡ幼穗，首先用无菌水配制5％的次氯酸钠溶液对幼穗进行浸泡灭菌15min,而后用无菌水浸泡清洗三次。

(2)、在无菌条件下，剥取长度在1.5mm-2.0mm左右的幼胚置于加有乙酰丁香酮的液体侵染培养基(培养基配方详见论文Molecular Breeding，2001年，第8卷，页码:323–333)中。

(3)、将事先在具有相应抗性的YEB固体培养基上在28℃培养4天的含有目的表达载体的重组克隆菌体刮取适量重悬在加有乙酰丁香酮的液体侵染培养基中，28℃恒温摇床低速恢复培养至OD₂₆₀到0.4-0.6。

(4)、用液体侵染培养基清洗剥好的幼胚两次，吸弃清洗液，加入OD₂₆₀＝0.4-0.6的菌体颠倒混匀20次，置于黑暗条件下静置5min。

(5)、吸弃菌液，并用液体侵染培养基清洗浸染的幼胚两次，连带第二次清洗液和幼胚一起倾倒在无筛选压的固体共培养基(培养基配方详见论文Molecular Breeding，2001年，第8卷，页码:323–333)上，将幼胚均匀分布在培养基上，并将幼胚的平滑面紧贴培养，弧形面朝上。

(6)、吸弃清洗液，将培养物置于25℃恒温箱黑暗条件下培养3天。将共培养3天后的幼胚在无菌条件下转移到无筛选压的固体恢复培养基上，28℃黑暗条件下培养7-10天。

(7)、将恢复培养长势良好且无菌的幼胚衍生物转移到具有basta筛选压的筛选培养基上筛选28℃黑暗条件下培养1-2个月，每2周继代一次。

(8)、待有生长速度显著高于一般愈伤组织的抗性愈伤出现后，将其繁殖到一定后，将一定量的抗性愈伤转移到具有多种激素的分化培养基(培养基配方详见论文Molecular Breeding，2001年，第8卷，页码:323–333)上28℃黑暗条件下培养2周左右，诱导形成胚状体。

(9)、将胚状体转移到固体生根培养基中，28℃光照条件下培养1周左右。生根成苗，将小苗转移到盛有固体生根培养基的圆柱状培养管中，28℃光照条件下培养1周左右。

(10)、再将展开2-3片幼叶的试管苗转移到有营养土的营养钵中在光照培养箱培养1周左右后即可转移到温室进一步培养并最终移栽到大田中。

图9为SEQ ID NO.1所示启动子在玉米种子驱动GUS基因表达的情况，从图9中可以发现SEQ ID NO.1所示启动子可以高强度驱动GUS基因特异的稳定表达于胚中，在胚乳中基本没有GUS基因的表达。

试验例2 最短启动子的分离及其功能验证试验

将SEQ ID NO.1所示启动子从5’端开始逐渐删除得到多个截短的启动子片段，其长度分别为1.2kb、0.74kb、0.45kb、0.22kb、0.14kb、0.13kb、0.12kb；然后再分别将各个截短的片段连入瞬时验证载体pCAMBIA3301(购自Cambia公司，http://www.cambia.org)，来验证各个截短的片段是否能够驱动报告基因在玉米种子胚中进行特异表达启动子的功能，以确定具有玉米胚特异表达功能的最短启动子序列。

试验结果见图10。从图10可以看出，将SEQ ID NO.1所示启动子从5’端开始逐渐删除所得到的1.2kb、0.74kb、0.45kb、0.22kb以及0.14kb的截短序列均能驱动GUS基因在玉米种子胚中进行特异表达，在胚乳中基本未见GUS基因的表达；其中0.14kb(最短的启动子片段)为-146—+1之间的片段(SEQ ID NO.2)：

-146 TCCCC-133

TCGTCTCATGCTCGGCCATGTACATCGACCCAGCCATCTCCTCACCC

-86 TCGTTCACCACACAGTCCGCCACTCCTTTAGTAGCTTGTGATTTGTACGTCGACGAGATC

-26 ACTGGTCGGGTGGCGGACGACGACAC+1

-146—+1为具有功能的最小片段；

-133—+1为没有功能的最大片段；两者相差13bp，这13bp中包含一个TATAbox。

试验结果证实，SEQ ID NO.2所示的截短的启动子片段能够驱动GUS基因在玉米胚中进行特异性的高效表达，证明SEQ ID NO.2所示的截短的片段仍具有组织特异性启动子功能。

试验例3 截短启动子稳定转化玉米的启动子功能验证试验

将以GUS基因为报告基因的稳定转化载体p13387-5G3(图6)和p13387-8G3(图7)以农杆菌介导的方法分别转化玉米材料HiⅡ(购自北京奥瑞金种业有限公司)，得到稳定转化的玉米植株，玉米稳定转化流程同试验例1。

试验结果见图11。A图的左半部分是p13387-5G3稳定转化的转基因玉米叶一心时期的叶片，右半部分是同时期阴性对照材料。可以明显看出转基因叶片截面的边缘(左右两侧)有着色，但叶片的自然生长的边缘(上下两侧)没有着色，而对照叶片任何部位均无着色。B图的左半部分是p13387-5G3稳定转化的转基因玉米叶一心时期的叶鞘，右半部分是同时期阴性对照材料。可以明显看出转基因叶鞘截面的边缘(上下两侧)有着色，但叶鞘的中部没有着色，而对照叶鞘任何部位均无着色。C图是p13387-5G3稳定转化授粉后20天的籽粒，可以看出其何部位均无着色。

D图的左半部分是p13387-8G3稳定转化的转基因玉米叶一心时期的叶片，右半部分是同时期阴性对照材料；可以明显看出转基因叶片截面的边缘(左右两侧)有着色，但叶片的自然生长的边缘(上下两侧)没有着色，而对照叶片任何部位均无着色。E图的左半部分是p13387-8G3稳定转化的转基因玉米叶一心时期的叶鞘，右半部分是同时期阴性对照材料。可以明显看出转基因叶鞘截面的边缘(上下两侧)有着色，但叶鞘的中部没有着色，而对照叶鞘任何部位均无着色；F是p13387-8G3稳定转化授粉后20天的籽粒，可以看出其何部位均无着色。

启动子缺失片段的稳定转化的结果表明，这些截短的启动子片段仍具有启动子的活性。

Claims (10)

1.从玉米(Zea mays)中分离的组织特异性启动子，其特征在于，其多核苷酸为SEQ IDNO.1所示。

2.从玉米中分离的组织特异性启动子，其特征在于，其多核苷酸为SEQ ID NO.2所示。

3.一种表达盒，其特征在于，包括：含有权利要求1或2所述的组织特异性启动子和待转录的异源基因序列。

4.按照权利要求3所述的表达盒，其特征在于：所述的异源基因是提高或改善作物种子品质的基因、促进种子胚发育的基因或提高作物种子对病虫害抗性的基因。

5.含有权利要求1或2所述的组织特异性启动子的重组植物表达载体。

6.权利要求5所述的重组植物表达载体，其特征在于，包含：权利要求1所述的组织特异性启动子和待转录的异源基因序列；其中，组织特异性启动子和待转录的异源基因序列可操作地相连接，待转录的异源基因序列位于所述组织特异性启动子的下游；所述的异源基因是提高或改善作物种子品质的基因、促进种子胚发育的基因或提高种子对病虫害抗性提高的基因。

7.权利要求1或2所述组织特异性启动子在调控、指导或启动异源基因在植物种子胚中进行特异性表达的用途。

8.权利要求1或2所述组织特异性启动子在提高作物种子品质、改良植物性状或培育转基因植物新品种中的用途。

9.按照权利要求7所述的用途，其特征在于，包括：将权利要求1或2所述的组织特异性启动子和待转录的异源基因序列可操作地连接后转化到植物细胞、组织或器官中得到转化体；将转化体通过组织培养再生得到完整的植株或无性系。

10.按照权利要求8所述的用途，其特征在于，包括：将权利要求1或2所述的组织特异性启动子和待转录的异源基因序列可操作地连接后转化到植物细胞、组织或器官中得到转化体；将转化体通过组织培养再生得到完整的植株或无性系。