CN100562574C - 植物胚乳特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物胚乳特异性表达启动子及其应用。该启动子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。本发明的启动子可以启动外源基因在植物的胚乳中特异性的表达，适用于任何种子具有胚乳的植物，即单子叶植物或胚乳型双子叶植物。

Description

植物胚乳特异性启动子及其应用

技术领域

本发明涉及一种植物胚乳特异性表达启动子及其应用。

背景技术

植物生物技术的最新发展不仅实现了传统农艺形状的改良(如提高作物产量，增强抗病、抗虫、抗除草剂特性，改良品质等)，而且使植物成为生物医药和工业产品的生物反应器(Daniell et al.，Trends Plant Sci 2001，6：219-226；Giddingset al.，Nature Biotech 2000，18：1151-1156；Hood and Jilka，Curr OpinBiotechnol 1999，10：382-386；Hood and Woodard，Plants as Factories forProtein Production 2002，pp.119-135.Netherlands：Kluwer Academic)。对于绝大多数禾本科作物，由于其产量高、生产成本低、耐储藏且生产规模容易控制等特点，决定了其为第二代转基因产物的理想载体。近年来利用水稻种子生产具有保健作用的外源蛋白和可食性疫苗研究发展很快，且已经取得了巨大成功。如维生素A、具有降低血糖作用的大豆球蛋白(Glycinin)、具有预防和治疗缺铁性贫血和提高自身免疫功能的大豆铁蛋白(Ferritin)、具有刺激胰岛素分泌预防糖尿病发生功能的GLP、乙肝疫苗和花粉过敏症疫苗等均成功地在水稻中表达并高水平累积(Goto et al.，Nature Biotech 1999，17：282-286；Katsube et al.，Plant Physiol1999，120：1063-1073；Qu et al.，Planta 2005，222：225-233；Takagi et al.，Proc Natl Acad Sci 2005，102：17525-17530；Ye et al.，Science 2000，287：303-305；Zheng et al.，Plant Physiol 1995，109：777-786)。然而缺少相应的启动子成为目前生物技术应用(外源基因的理想表达部位，表达方式，表达时期和表达水平等)的限制因子。

植物基因工程的根本目标是培育能使目的基因稳定而且高效表达的转基因植株。基因表达受控于转录起始处的核苷酸序列即启动子成分，它主要包括RNA聚合酶启动转录的信号，以指导合成相应的信使RNA分子，进一步指导蛋白质的合成。启动子控制基因转录水平，同时还决定了基因的表达时间和表达方式。

目前广泛应用的启动子(包括CaMV35S、ubiquitin1、Actin1)尽管其表达效率高，然而由于其表达不受时空限制，它在几乎所有组织中都能使外源基因表达，在进行种子中外源基因过量表达过程中，会驱动基因在种子外的其它组织中表达，既消耗生物能源，同时会导致一些可能对生物生长发育产生不利影响的代谢产物的合成。且上述启动子的表达强度尚无法满足转基因产业化的需要。若选择胚乳特异性高强度表达启动子，有助于定时定向调控外源有用蛋白的合成，既节约能源，保证了植物正常生理活动不受干扰，同时又能提高外源有用蛋白在种子中的储藏水平。

水稻种子储藏蛋白以谷蛋白和醇溶性蛋白为主，分别占种子全蛋白的80％和10％。水稻谷蛋白基因只在胚乳中表达，而在其它组织中几乎检测不到谷蛋白。水稻谷蛋白由大约10个基因控制，这些基因根据其DNA序列的同源性分为GluA和GluB两个基因亚族(Subfamily)，分别由4个以上基因组成。虽然水稻谷蛋白基因在其碱基序列上具有较高的相似性(亚族内80-96％，亚族间60-80％)，但其启动子区域却几乎没有相似性，预示着其基因表达的调控机制各不相同。

来自于水稻胚乳储藏蛋白基因的启动子对于外源基因的表达具有潜在的应用价值。Qu和Takaiwa(Plant Biotechn J，2004，2：113-125)利用GUS作报告基因，研究了3个水稻谷蛋白(GluB-1，GluB-2，GluB-4)，3个醇溶蛋白(10kD，13kD，16kD)和1个球蛋白(26kD)基因启动子的表达方式、组织表达特异性和表达强度。获得了4个表达活性比Ubiquitin高数倍的胚乳特异性表达启动子(GluB-4，10kDprolamin，16kD prolamine和Glb-1)。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物胚乳特异性表达启动子及其应用。

本发明所提供的植物胚乳特异性表达启动子，来源于水稻GluC基因的上游序列，可以是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列；

2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有70％或70％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中序列1是由2331个脱氧核苷酸组成。

上述自序列表中序列1的5′端第2264-2270位核苷酸为植物胚乳特异性表达启动子TATA盒核心区。将启动子除TATA盒核心区外的其他序列通过碱基突变或缺失等发生变化，一般不会使启动子活性完全丧失，因此也可根据需要将启动子的调控元件改变。

含有上述植物胚乳特异性表达启动子的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

在所述表达盒中，所述植物胚乳特异性表达启动子的下游连接结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA，用于驱动结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者天然或人工合成的小RNA的表达。

所述重组表达载体是上述表达盒与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体所述重组表达载体为重组植物表达载体，所述重组植物表达载体含有上述表达盒并且能够将所述的表达盒转送进入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够或者至少方便所述的表达盒整合到宿主的基因组中，它包括但不限于双元载体、共合载体。

上述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织或器官，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。

上述植物胚乳特异性表达启动子可用于培育胚乳特异性表达外源基因的植物。

利用该植物胚乳特异性表达启动子培育胚乳特异性表达外源基因的植物方法也属于本发明的保护范围。

所述培育胚乳特异性表达外源基因的植物方法可为将所述外源基因连接于所述植物胚乳特异性表达启动子下游，通过植物表达载体转入植物中，筛选得到在胚乳中特异性表达所述外源基因的转基因植物。

所述植物胚乳特异性表达启动子下游还可连接有调控基因表达的调控元件。所述调控基因表达的调控元件，该调控元件包括能增强外源基因表达或调控基因在植物中表达部位的元件，如增强子、组成型表达、组织特异性表达、诱导型表达的调控元件。

所述方法中，所述外源基因为蛋白编码基因和/或非蛋白编码基因；所述蛋白编码基因优选为品质改良基因；所述非蛋白编码基因为正义RNA基因和/或反义RNA基因。

所述方法中，所述植物为单子叶植物或胚乳型双子叶植物。

所述单子叶植物为水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦；所述胚乳型双子叶植物是荞麦、油桐或蓖麻。

本发明的植物胚乳特异性表达启动子是通过设计引物，以水稻基因组DNA为模板，利用PCR方法从水稻中分离得到的谷蛋白基因GluC启动子。通过其在水稻中的表达特异性实验表明本发明的启动子使β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因只在水稻种子胚乳中特异性表达。说明本发明的启动子可以启动外源基因在植物的胚乳中特异性的表达，适用于任何种子具有胚乳的植物，即单子叶植物或胚乳型双子叶植物。

利用本发明的启动子可提高外源基因在植物胚乳中的表达和累积水平，可改良种子品质、将具有生理活性的蛋白或短肽导入种子中创制保健型功能新品种、利用种子作生物反应器生产有用外源蛋白或可食性疫苗，增加农产品科技附加值等。本发明的启动子及其应用为利用生物技术改良种子品质、分子医药农场等研究奠定了基础，具有极大的应用前景。

附图说明

图1为从水稻基因组DNA中PCR扩增GluC启动子的电泳图谱

图2为GluC启动子融合GUS基因载体GluC-pGPTV-35S-HPT的结构示意图

图3为GluC-pGPTV-35S-HPT双酶切鉴定图谱

图4为转GluC-pGPTV-35S-HPT水稻中GluC::GUS基因在水稻种子中的GUS染色结果

图5为GluC::GUS基因在开花后7天，12天，17天水稻种子中的GUS染色结果

图6为GluC::GUS基因在水稻种子中的GUS荧光活性测定的柱形图

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、植物胚乳特异性表达启动子(GluC启动子)的获得

根据水稻谷蛋白基因GluC cDNA序列(GenBank号为AB016501；Mitsukawa etal.，1998，Plant Biotechnol 15：205-211)，从GenBank中查找GluC基因的上游序列，设计引物扩增GluC启动子。为便于载体构建，在每对引物上依次添加两个酶切位点(下划线所示)。

GluC启动子的正向引物为F1：5’-GGGAAGCTTGTTCAAGATTTATTTTTGG-3’(Hind III)，反向引物为R1：5’-ACGCGTCGACAGTTATTCACTTAGTTTCCC-3’(Sal I)

CTAB法从水稻(野生型水稻Kitaake)叶片中小量提取基因组DNA，以其为模板，以F1和R1为引物，进行PCR扩增GluC启动子序列。反应体系为：10μM正反向引物各1μl，10×Ex Buffer 2μl，基因组DNA 1μl(10ng)，ExTaq(TAKARA)0.5unit，加超纯水至20μl；反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃1min，55℃1min30sec，72℃2min30sec，30个循环，最后72℃，10min。PCR扩增得到2.3kb的目的条带，如图1所示。图1中第1泳道为分子量标准，第2泳道为GluC启动子。回收扩增产物，直接连接到pT7Blue载体(购自Novagen公司)上，进行测序，结果表明，扩增得到的GluC启动子序列大小为2331bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列。将测序检测表明含有GluC启动子片段的重组载体命名为pT7-GluC。

实施例2、植物胚乳特异性表达启动子(GluC启动子)表达载体构建与遗传转化

1、GluC启动子融合GUS基因的植物表达载体构建

用Hind III和Sal I双酶切pT7-GluC质粒，回收含有GluC启动子的2331bp的酶切片段，将该片段插入到pGPTV-35S-HPT(按照文献Qu and Takaiwa，PlantBiotech J 2：113-125所述的方法构建)的Hind III和Sal I酶识别位点之间。将得到的重组质粒在PCR鉴定的基础上，利用Hind III和Sal I进行双酶切鉴定，得到含有4.5kbGluC启动子的片段；将酶切鉴定表明含有GluC启动子的重组质粒命名为GluC-pGPTV-35S-HPT(其结构示意图如图2所示)。其中，

GluC-pGPTV-35S-HPT的双酶切鉴定图谱，如图3所示。图3中泳道1为DNA分子量标记，泳道2为GluC启动子的片段。

2、转GluC-pGPTV-35S-HPT水稻的获得

用冻融法将GluC-pGPTV-35S-HPT导入农杆菌EHA105中，然后转化野生型水稻Kitaake。

利用潮霉素筛选方法(按照文献Hiei et al.，Plant J 1994，6：271-282所述方法进行)，获得9株T0代转GluC-pGPTV-35S-HPT水稻植株。

利用PCR方法对上述筛选得到的转GluC-pGPTV-35S-HPT水稻进行PCR分子检测，PCR扩增引物为为上述GluC启动子的扩增引物，即：GluC启动子的正向引物F1：5’-GGGAAGCTTGTTCAAGATTTATTTTTGG-3’(Hind III)，反向引物R1：5’-ACGCGTCGACAGTTATTCACTTAGTTTCCC-3’(Sal I)

反应体系为：10μM正反向引物各1μl，10×Ex Buffer 2μl，基因组DNA 1μl(10ng)，ExTaq(TAKARA)0.5unit，加超纯水至20μl；反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃1min，55℃1min30sec，72℃2min30sec，30个循环，最后72℃，10min。PCR扩增得到2.3kb的目的条带即为检测阳性。

结果表明得到8株PCR检测阳性的转GluC-pGPTV-35S-HPT水稻T0代植株。

T0代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T1代，依此类推，T2、T3分别表示转基因植株第2代和第3代。

实施例3、植物胚乳特异性表达启动子(GluC启动子)的功能验证

对转GluC-pGPTV-35S-HPT水稻T₀代植株进行组织化学染色。具体步骤：将转GluC-pGPTV-35S-HPT水稻T₀代植株或野生型水稻Kitaake(对照)根、叶片、叶鞘、茎杆，切成小块，将开花后7天、12天、17天的灌浆期种子，用解剖刀从中部纵切开，浸泡于GUS反应液(0.1M NaPO₄缓冲液，pH 7.0，10mM EDTA，pH7.0，5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾，1.0mM X-Gluc，0.1％Triton X-100)，37℃反应。结果表明转GluC-pGPTV-35S-HPT水稻根、叶片、叶鞘、茎杆均未观察到GUS表达；开花后7天的种子糊粉层、亚糊粉层和胚乳外部变蓝，胚未被染成蓝色；开花后12天的种子糊粉层、亚糊粉层、胚乳外部和胚乳中心部位蓝色清晰可见，与开花后7天的种子相比，蓝色更明显，胚未被染成蓝色；开花后17天的种子糊粉层、亚糊粉层和整个胚乳蓝色清晰可见，与开花后12天的种子相比，胚乳中心蓝色更深，胚未观察到GUS表达；而野生型水稻Kitaake(对照)根、叶片、叶鞘、茎杆、以及开花后7天、12天、17天的灌浆期种子都未观察到被染成蓝色的现象；结果表明GluC启动子使β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因只在水稻种子胚乳中特异性表达。70％乙醇中保存、观察。解剖显微镜下照相。结果如图4、图5所示，图4中1为野生型水稻Kitaake(对照)花后17天的灌浆期种子染色结果；2为转GluC-pGPTV-35S-HPT水稻T₀代植株花后17天的灌浆期种子染色结果。图5中7、12、17分别表示转GluC-pGPTV-35S-HPT水稻T₀代植株花后7天、12天、17天的灌浆期种子染色结果。

实施例4、转基因水稻的组织GUS荧光活性测定

对转GluC-pGPTV-35S-HPT水稻T₀代植株开花后17天的灌浆期种子进行GUS定量分析，方法按照Jefferson等(1987)的荧光检测方法(Jefferson，Plant Mol.Biol.Report，1987，5：387-405)进行。具体为：取1粒种子，置于1.5mleppendorf管中，用玻璃棒将种子碾碎，加入30μl抽提液(50mM NaPO₄(pH7.0)，10mM β-Mercaptoethanol，10mM Na₂EDTA(pH 8.0)，0.1％SDS，0.1％Triton X-100)，摇匀。4℃ 15,000rpm离心10min，取10μl上清于新管中，加入90μl保温至37℃的反应液(1mM MUG)，37℃反应60分钟，加入900μl终止液(0.2M Na₂CO3)，室温终止反应。用F-4500(日立)型荧光分光光度计在360nm激发波长和460nm吸收波长下检测相对4MU含量。以牛血清蛋白为对照，利用BIO-Rad Protein AssayKit测定蛋白质含量。结果如图6所示，结果表明，GluC启动子驱动的GUS在转基因水稻种子中表达的平均活性为36.1±24.2pmol 4MU/min/μg蛋白。其中图6中1-8分别为不同转GluC-pGPTV-35S-HPT水稻T0代植株种子中GUS活性：1为47.9pmol 4MU/min/μg蛋白，2为56.3pmol 4MU/min/μg蛋白，3为78.3pmol 4MU/min/μg蛋白，4为31.1pmol 4MU/min/μg蛋白，5为20.1pmol4MU/min/μg蛋白，6为37.1pmol 4MU/min/μg蛋白，7为10.6pmol 4MU/min/μg蛋白，8为7.4pmol 4MU/min/μg蛋白。

序列表

<160>1

<210>1

<211>2331

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>1

gttcaagatt tatttttggt atttaattta cttgcttaag tcagatatat tcccatcgtt 60

gcaggtttgt cacttagtat tattattaag cgctctagca ctaggactct ggataaataa 120

gaaagtttat tcacgaggct agagtagtaa tcaataacat aagcgtggtg tctaggtcag 180

cggttatctt catatgtagt gtgctccatg gaaagtgagg taggaggaag gtggtgacag 240

tcccgtccgt cctttgtatc cctccatgtt cgggtatatc atagagctac aggctagact 300

tagcttggca gactagggga gagccggtgc tcgaagcaat ccatgaggct ttacatttaa 360

cataagttag taaattaacc cataggaatc atctctagac tgaacctacc agtagttgtg 420

cttggatata attatattcc tacatataca tacacgttcc ctgcgattag atacccttgg 480

aatactctaa ggtgaagtgc tacagcggta tccgtgcgct tgcggattta tctgtgaccg 540

tatcaaatac caacaggtag atacaaggaa tcatctctcc tatccattgg tttatcatct 600

tttaaaatta tctcttgctc tcctattgcc tctgcaactg cggataggtg tttctcaaca 660

atgaaggttg tgaagaatgc tttgtgcaac aagatggatg acaagtatct cagccatagc 720

ctcatttgct ttgtagaaaa ggatatgtcg gacacaatca ctaagtatca ccgtggaaag 780

gatgcactgt atgccctatc tatatttacc atttagtaat atttatatgg cttgtgctaa 840

ctttatgttg tctttacagg caataacatt atttggaagg catatctata tattactatt 900

taagataatg taatatctca aagtttttat aagctgcaat gaggtgagtt tcacttagct 960

ttctaacttg ttatgagtta tagatgcatg ccaccagtca ttttttatct tgcatcagcc 1020

cctgcctgtt agaatatgtt tctttgtctg ggagtccatg tcaactagcc aatttccaaa 1080

tatatgaaca aaactatgtg gcctttgtaa cccaaatgag ataaagacta ctctccatag 1140

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gaagtttgtc catagctgaa gaggagtttt atagtgtcta gcttaccttg ctgctgattg 1500

catgtctaaa atgtcgttta atttgggcta taatgaaata ttcaccaata tttctgctgg 1560

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cctatgtttt tgttagtcta ttttatttcc ctagtgtgca ctagcttaac cccaaattag 1680

ttttgaacac ttaacctaaa tgtgtctatt atggtcagac actctctcac ggcactctaa 1740

caaaaagtga attttgttgt tatgtttttg tcatgatctc acaagcaatg tacatgtacg 1800

tttctagagt gcaatcttat gctagcctga ttgtgaattt agtgtagttt gttttctctt 1860

tttgtagcta cactaccaat aacctattgt cctctagtca taccacgtaa tcacaaggca 1920

aatccctaac tctcaccttt aaaagcatgt ctttattttc ttgggtggca ctaatacaaa 1980

atctttttca gcattcctat gtgcgatagc aagaaaacat ggcataactc ttgcttcact 2040

ctaacaaaaa aaacactttt ccaactttaa aacaatggta tctatgtgtt taatgatcaa 2100

tcaagcatat aatgacttac aagtttttac ctatgccctt tttgcatcat cttgtttgca 2160

acagacaaac tagatattcc tttaggctat aaacacatca gcatgataaa gagattaggt 2220

aagtttgtta tccctttttg catatattct cgtctactcc gtgtatataa gcccctctcc 2280

tccaactcgt ccatccatca ccaagagcag tgggaaacta agtgaataac t          2331

Claims (10)

1、一种植物胚乳特异性表达启动子，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。

2、含有权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子的表达盒。

3、含有权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子的重组表达载体。

4、含有权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子的宿主菌。

5、权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子在培育单子叶转基因植物中的应用，所述单子叶转基因植物中的外源基因是在胚乳中特异性表达的。

6、根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述培育单子叶转基因植物的方法，是将所述外源基因连接于所述植物胚乳特异性表达启动子下游，通过植物表达载体转入植物中，筛选得到在胚乳中特异性表达所述外源基因的单子叶转基因植物。

7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述胚乳特异性表达启动子下游还连接有调控基因表达的调控元件。

8、根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述外源基因为蛋白编码基因和/或非蛋白编码基因。

9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述蛋白编码基因为品质改良基因；所述非蛋白编码基因为正义RNA基因和/或反义RNA基因。

10、根据权利要求5-9中任意一项所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物为水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。

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