CN103820445B - 一个植物花药特异表达启动子的鉴定和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一个水稻花药特异表达启动子的分离和功能鉴定及应用。本发明所公开的启动子在植物的花药中特异表达，在植物转基因领域具有很好的应用前景。

Description

一个植物花药特异表达启动子的鉴定和应用

技术领域

本发明属于植物生物技术种领域，具体而言，本发明涉及分离的DNA，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物花药中特异转录和/或表达。另外，本发明还涉及包含该DNA的表达盒和植物等，并涉及该DNA的应用。

背景技术

外源DNA序列通过连接到特定的启动子从而启动在植物宿主中的表达，启动子类型的选择决定基因的表达时间和部位。目前在农业生物技术领域广泛应用的主要是一些组成型的强启动子，比如CaMV35S启动子和玉米Ubiquitin-1启动子，然而在利用这些启动子诱导目的基因转化水稻等作物以期改良作物的品质时，往往会由于目的基因表达的时间（发育阶段特异性）或空间（组织器官特异性）不能很好地控制而导致改良效果不明显，或者由于这些组成型启动子诱导基因表达量太高而对植物的生长发育造成影响，这些都是目前利用组成型强启动子结合功能基因来改良作物品质时遇到的障碍。

植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调。启动子是重要的顺式作用元件，它是位于结构基因5′端上游区域调控基因转录的一段DNA序列，能活化RNA聚合酶,使之与模板DNA准确地结合，确保转录精确而有效地起始，在转录调控中起关键作用。根据其驱动基因表达的不同特点，启动子分为组成型启动子和特异性启动子。组成型启动子能在所有细胞或组织中，不分时间和空间地启动转录；特异性启动子又可分为组织特异性启动子和诱导型启动子，其中诱导型启动子平时不启动转录或转录活性很低，但在某些特定的逆境信号的刺激下，转录活性能够显著地提高。

此外，在研究某些代谢过程或调节途径时，常常需要将同一途径上的两个以上的基因转化到同一个株系中去，采用转化其中一个基因得到转基因植株后再转化另外一个基因，或者两个基因分别转化完成后再进行杂交，都需要等待较长的时间，为了提高效率缩短多个基因转化的时间，最近有报道可以利用新的载体同时进行多个基因的转化，但是在多基因转化时如果重复使用同一个启动子，也会由于启动子序列的高同源性可能导致基因沉默。

本发明通过实验分析，发现OSJFL2基因自翻译起始位点ATG往上-2520bp的启动子片段pOSJFL2，呈现出很强的花药特异表达特性，在pOSJFL2转基因水稻中，其所驱动的报告基因GUS在转基因水稻的花药中表现出很强的表达水平，这些数据充分表明pOSJFL2是一个很强的花药特异表达启动子。

发明内容

本发明提供了一种pOSJFL2启动子，所述启动子具有在花药中特异表达的功能，相应启动子序列如SEQIDNO:1所示。将SEQIDNO:1与报告基因GUS相连，转化植物，检测分析转基因植株中的GUS表达活性和表达模式，通过在转基因植株的根、茎、叶和花中都进行GUS染色分析，结果发现pOSJFL2启动子驱动GUS基因主要在水稻花药中表达,更具体地在花药发育的P6期特异性的高表达。说明本发明所提供的SEQIDNO:1是一个花药特异性表达的启动子。

本发明所提供的植物花药特异表达启动子，含有序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，或包含与SEQIDNO:1中所列核苷酸序列具有90%以上相似性的核苷酸序列，或包含来源于SEQIDNO:1序列上的100个及100以上连续的核苷酸片段，并且可以驱动与该启动子操作性连接的核苷酸序列在植物花药中的表达。含有上述序列的表达载体、转基因细胞系以及宿主菌等均属于本发明的保护范围。扩增本发明所公开的SEQIDNO:1启动子的任一核苷酸片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明所提供的启动子核苷酸序列还可用于从水稻以外的其它植物中分离相应序列，尤其是从其他单子叶植物中进行同源克隆。根据这些相应序列与本文所列启动子序列间的序列同源性，或与本启动子基因的同源性，使用如PCR、杂交等技术来鉴别分离这些相应序列。因此，根据它们与本发明所列的SEQIDNO:1启动子序列（或其片段）间的序列相似性而分离的相应片段，也包括在实施方案中。

本发明所述的“启动子”是指一种DNA调控区域，其通常包含能指导RNA聚合酶II在特定编码序列的合适转录起始位点起始RNA合成的TATA盒。启动子还可包含其它识别序列，这些识别序列通常位于TATA盒的上游或5’端，通常被称为上游启动子元件，起调控转录效率的作用。本领域技术人员应该知晓，虽然已经鉴定了针对本发明公开的启动子区域的核苷酸序列，但是分离和鉴定处于本发明鉴定的特定启动子区域的TATA盒上游区域的其它调控元件也在本发明的范围内。因此，本文公开的启动子区域通常被进一步界定为包含上游调控元件，例如用于调控编码序列的组织表达性和时间表达功能的那些元件、增强子等。以相同的方式，可以鉴定、分离出使得能在目标组织(例如雄性组织)中进行表达的启动子元件，将其与其它核心启动子一起使用，以验证雄性组织优先的表达。核心启动子指起始转录所需的最小限度的序列，例如被称为TATA盒的序列，这是编码蛋白质的基因的启动子通常都具有的。因此，可选地，pOSJFL2启动子可与其自身的或来自其它来源的核心启动子关联使用。

核心启动子可以是任何一种已知的核心启动子，例如花椰菜花叶病毒35S或19S启动子(美国专利No.5,352,605)、泛素启动子(美国专利No.5,510,474)、IN2核心启动子(美国专利No.5,364,780)或玄参花叶病毒启动子。

所述基因启动子的功能可以通过以下方法进行分析：将启动子序列与报告基因可操作性连接，形成可转化的构建体，再将该构建体转入植株中，在获得转基因后代中，通过观察报告基因在植物各个组织器官中的表达情况来确认其表达特性；或者将上述构建体亚克隆进用于瞬时表达实验的表达载体，通过瞬时表达实验来检测启动子或其调控区的功能

用来测试启动子或调控区域功能的适当表达载体的选择将取决于宿主和将该表达载体引入宿主的方法，这类方法是本领域普通技术人员所熟知的。对于真核生物，在载体中的区域包括控制转录起始和控制加工的区域。这些区域被可操作地连接到报告基因，所述报告基因包括YFP、UidA、GUS基因或荧光素酶。包含位于基因组片段中的推定调控区的表达载体可以被引入完整的组织，例如阶段性花药，或引入愈伤组织，以进行功能验证。

启动子的活性和强度可以根据其驱动的报告基因的mRNA或蛋白质的表达量来测定。报告基因(reportergene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来确定目的基因的表达调控特性。常用的报告基因有β-葡萄糖苷酸酶基因GUS，和绿色荧光蛋白基因GFP。

本发明通过GUS报告基因来检测启动子的活性和表达特性。根据GUS基因检测所用的底物不同，有三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法（灵敏度为分光光度检测法最高），其中最为常用的是组织化学法。组织化学法检测以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）作为反应底物。将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡，若组织细胞转入了GUS基因，并表达出了GUS酶蛋白，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物，这是由其初始产物经氧化二聚作用形成的靛蓝染料，它使各组织细胞中有GUS表达活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出GUS活性的强弱。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。

此外，本发明的启动子可与并非OSJFL2基因的核苷酸序列相连，以表达其它异源核苷酸序列。本发明的启动子核苷酸序列及其片段和变体可与异源核苷酸序列一起组装在一个表达盒中，用于在目的植株中表达，更具体地，在该植株的雄性器官中表达。所述表达盒有合适的限制性酶切位点，用于插入所述启动子和异源核苷酸序列。这些表达盒可用于对任何植株进行遗传操作，以获得想要的相应表型。

本发明所公开的pOSJFL2启动子,可用于驱动下列异源核苷酸序列的表达,以使转化的植株获得雄性不育的表型。所述异源核苷酸序列可编码促使碳水化合物降解的酶或修饰酶、淀粉酶、脱支酶和果胶酶，更具体的如a淀粉酶基因、生长素(auxin),rotB、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶、亲和素，或者可选自原核调控系统，还可以是显性的雄性不育基因。

在某些实施方式中，本发明中所提到的可操作地连接在本发明启动子下游的核酸，其中所述的“核酸”可以是操作性连接于本文所公开的启动子之上的结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA。

本发明所提供的启动子序列可分离自任何植物，包括但不限于芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦（Rye）、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦（Spelt）、双粒小麦、亚麻、格兰马草（Grammagrass）、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘蔗、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、观赏植物和松类等。优选地，植物包括玉米、大豆、红花、芥菜、小麦、大麦、黑麦、稻、棉花和高粱。

本发明还包括含有pOSJFL2启动子的构建体，所述构建体包括通常所说的载体或表达盒。上述构建体中还可包括其它组分，这主要取决于载体构建的目的和用途，例如可进一步包括选择标记基因、靶向或调控序列、稳定序列或引导序列、内含子等。表达盒还将在目标异源核苷酸序列的3’端包括在植物中具有功能的转录和翻译终止子。终止子可以是本发明所提供基因的终止子，也可以是来自外源的终止子。更具体地，上述终止子可以是胭脂氨酸合酶或章鱼碱合酶终止区域。

在希望将异源核苷酸序列的表达产物引向特定细胞器，例如质体、造粉体，或者引向内质网，或在细胞表面或细胞外分泌的情况下，表达盒还可包含用于编码转运肽的核苷酸序列。此类转运肽是本领域所公知的，其包括但不限于Rubisco的小亚基、植物EPSP合酶、玉米Brittle-1叶绿体转运肽等。

在制备表达盒的过程中，可对多种DNA片段加以操作，以提供处于合适方向，或是处于正确读码框中的DNA序列。为达到此目的，可使用衔接子或接头，将DNA片段连起来，或者进一步包括其它操作，以提供方便的限制性酶切位点等。

进一步地，本发明所提供的构建体中还可包括选择标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述选择标记基因包括赋予抗生素抗性或对除草剂抗性的基因。合适的选择标记基因包括但不限于:氯霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，链霉素抗性基因，奇霉素抗性基因，磺胺类抗性基因，草甘磷抗性基因，草丁嶙抗性基因。所述选择标记基因还可以是红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青甙p1等基因。

本发明所提供的表达盒或载体可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可被插入被转化的植物细胞的基因组中。插入可以是定位的或随机的插入。优选地，插入通过诸如同源重组来实现。另外，表达盒或载体可保持在染色体外。本发明的表达盒或载体可存在于植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中。优选地，本发明的表达盒或载体被插入植物细胞核的染色体DNA中。

本发明还包括所公开的pOSJFL2启动子的应用，在某些应用的实施方式中，可以应用本发明所提供的pOSJFL2启动子来实现一些育性相关基因突变所获得的雄性不育系的繁殖和保持，所述育性相关基因包括但不限于Ms26、Ms45、MSCA1等。

本发明的所提供的花药特异表达启动子可用于外源基因在花药中的特异性表达，从而避免该外源基因在植物其他组织中持续表达所带来的不利影响，还可以用于植物花药生长发育相关基因的功能分析和鉴定；可用于雄性不育系和恢复系的创建；并可应用于花粉败育实验中，从而避免由植物转基因漂移或花粉逃逸所带来的生物安全问题，对植物雄性不育系和恢复系的创造具有重要意义。

本发明的转基因植物使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射，等。在本发明的具体实施方式中，本发明使用了基于土壤杆菌的转化技术（可参见HorschRB等(1985)Science225：1229；WhiteFF，VectorsforGeneTransferinHigherPlants，TransgenicPlants，第1卷，EngineeringandUtilization，AcademicPress，1993，pp.15-38；JenesB等.TechniquesforGeneTransfer，TransgenicPlants，第1卷，EngineeringandUtilization，AcademicPress，1993，pp.128-143，等）。土壤杆菌菌株(例如根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌)包含质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件，所述质粒和元件在用土壤杆菌转染后被转移至植物，而T-DNA被整合进植物细胞的基因组中。T-DNA可位于Ri-质粒或Ti-质粒上，或独立地包含在所谓的双元载体中。土壤杆菌介导的转化方法描述于例如中。土壤杆菌介导的转化最适合双子叶植物，但是也适合单子叶植物。土壤杆菌对植物的转化描述于例如中。转化可导致瞬时或稳定的转化和表达。尽管本发明的核苷酸序列可被插入落入这些广泛种类中的任何植物和植物细胞中，但是其尤其适用于作物植物细胞。

下面通过具体实施方式，结合附图对本发明做进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。

附图说明

图1是OSJFL2基因在水稻中的Real-timePCR表达分析，根、茎、叶、种子、P3、P6和P8分别指取自该组织器官或时期的材料中OSJFL2基因的表达情况，其中P3、P6和P8分别指P3、P6和P8期的幼穗。

图2是表达载体pHPG的T-DNA区图谱。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hpt表示潮霉素抗性基因；Pnos表示nos基因的启动子；Tnos表示nos基因的终止子；GUS表示gus蛋白（β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase））基因；T35s表示35s基因的终止子；BamHI和SalI分别表示限制性内切酶BamHI和SalI的酶切位点；花特异启动子即为本发明的分离的花药特异表达启动子。

图3是pOSJFL2转基因水稻的组织、器官的GUS染色。其中，A为转基因水稻苗根；B为转基因水稻苗茎；C为转基因水稻苗叶片；D为转基因水稻苗P3期花；E为转基因水稻苗P6期花；F为转基因水稻苗P8期花。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成，测序由北京华大基因完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司，pEASY-T1连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司，T4DNA连接酶购自Promega公司，方法均参照试剂盒提供商推荐的方法进行。实验中所用的载体pCAMBIA1303可购自于CAMBIA公司。

实施例1.OSJFL2基因在水稻中的Real-timePCR表达分析

发明人在研究中偶然发现，水稻OSJFL2基因仅在花的P6期表达，对花的不同时期进行了Realtime-PCR表达分析。取水稻植株的根、茎、叶、种子和P3期、P6期和P8期的幼穗，提取RNA，反转录为cDNA作为模板，以水稻ACTIN基因作为内参照，分析OSJFL2基因在水稻中的表达情况。本发明中所述的P3期是指颖花原基分化期，P6期是指花粉减数分裂时期，P8期是指花粉成熟期。

RT-PCR的检测引物是：

引物1：5'-CCAACTTCCCCGTCAACCT-3'（SEQIDNO:2）;

引物2：5'-TGGTAGTGCCAGATGGTCATG-3'（SEQIDNO:3）;

引物3：5'-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3'（SEQIDNO:4）;

引物4：5'-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3'（SEQIDNO:5）;

其中，引物1和引物2是OSJFL2基因的检测引物；引物3和引物4是水稻内参基因ACTIN的检测分析引物。PCR检测体系和程序是：

PCR反应条件：95℃，预变性5分钟；94℃，变性30秒；55℃，退火30秒；72℃，延伸25秒；40个循环，72℃，10分钟。

在Real-timePCR仪上进行反应，反应结束后，分析软件输出的数据，得到的Realtime-PCR检测结果如图1所示，OSJFL2基因的表达集中在P6期幼穗阶段，在P6期时该基因的表达最为明显，量也最高。这表明，本发明的OSJFL2基因是花器官特异性表达基因。

实施例2.启动子pOSJFL2的分离和鉴定

设计如下克隆启动子pOSJFL2所需引物：

引物5：5'-CGggatccTTCTGACCAAAGAAGGGCG-3'（SEQIDNO:6）;

引物6：5'-GgtcgacTTTCGCCGGGCAAATTC-3'（SEQIDNO:7）;

引物5中序列ggatcc为BamHI的酶切位点,引物6中序列gtcgac为SalI的酶切位点。

利用启动子的正反向引物（其中带下划线部分的序列为启动子序列），以植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取的水稻(日本晴)基因组DNA作为模板，进行扩增，反应条件是：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸2:30分钟；30个循环；72℃延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-T1载体，筛选阳性克隆并进行测序验证。结果表明，所扩增序列为我们预期的pOSJFL2启动子序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

实施例3.表达载体的构建

将测序验证已经插入pOSJFL2启动子序列的pEASY-T1质粒用BamHI和SalI双酶切，连入同样用BamHI和SalI双酶切的载体pHPG中，挑取菌落进行PCR检测，选取PCR结果为阳性的菌落进行测序，测序验证正确后，提取相应阳性克隆质粒，命名为pHPG-pOSJFL2。其中，菌落PCR检测所需引物为pHPG载体上引物，位于所克隆的启动子片段两侧，扩增片段约为启动子的长度，以菌液为模板，扩增检测，PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸2:30分钟；34个循环；72℃延伸10分钟。

所构建的表达载体pHPG-pOSJFL2的T-DNA区的图谱如图2所示，其中：LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hpt表示潮霉素抗性基因；Pnos表示nos基因的启动子；Tnos表示nos基因的终止子；GUS表示gus蛋白（β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase））基因；T35S表示35S基因的终止子；BamHI和SalI分别表示内切BamHI和SalI的酶切位点；花特异启动子即为实施例2获得的pOSJFL2启动子。

实施例4.植物转化和功能鉴定

利用热激法将质粒pHPG-pOSJFL2转入农杆菌AGL0菌株，利用农杆菌介导法对水稻进行共转化。从转基因植株中分离各组织器官，进行GUS活性检测，将各组织器官置于含有GUS染色缓冲液的离心管中，放于37℃温箱温育过夜，然后室温条件下在无水乙醇中脱色保存。

4.1转基因水稻苗的组织器官染色

将转化pOSJFL2启动子的转基因水稻的组织器官，即根、茎、叶和P3期、P6期和P8期的幼穗分别进行GUS染色。结果分别如图3A、图3B、图3C和图3D、E、F所示，GUS基因只在转基因水稻的P6期幼穗的花药中有很强的表达，显现出肉眼可明显观测到的很强的蓝色；而在其它各器官（叶片、茎、和根）及花的其它时期中，基本没有检测到GUS基因的表达。这表明，本发明的启动子能够在转基因植株P6期的花药中指导其下游的GUS蛋白表达，而且这种表达具有花药组织表达特异性。

SEQUENCELISTING

<110>深圳市作物分子设计育种研究院

深圳兴旺生物种业有限公司

兴旺投资有限公司

<120>一个植物花药特异表达启动子的鉴定和应用

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<170>PatentInversion3.3

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<212>DNA

<213>水稻(OryzasativaL.ssp.japonica)

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Claims (14)

1.一种启动子，具有花药特异表达的特性，其特征在于所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

2.一种表达盒，其特征在于所述表达盒包含权利要求1所述的启动子序列。

3.一种表达载体，其特征在于所述表达载体包含权利要求2所述的表达盒。

4.一种工程菌，其特征在于所述工程菌含有权利要求3所述的表达载体。

5.一种在植物中表达目的核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物体导入DNA构建体，所述DNA构建体含有启动子及操作性连接于所述启动子的目的核苷酸序列，其中所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

6.权利要求5所述的方法，其中所述的植物为单子叶植物。

7.权利要求6所述的方法，其中所述的单子叶植物为禾本科植物。

8.权利要求7所述的方法，其中所述的禾本科植物为水稻或小麦。

9.权利要求5所述的方法，其中所述的目的核苷酸序列对于植物宿主来说是同源或是异源的。

10.权利要求5所述的方法，其中所述的目的核苷酸序列是结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA，其在花粉发育晚期的特异性表达可以调节花粉的育性及花粉萌发。

11.权利要求1所述的启动子在以下（a）至（d）中任一项中的应用：

（a）培育植物品种或品系；

（b）培育授粉受精能力增强植物品种或品系；

（c）培育授粉受精能力消弱的植物品种或品系；

（d）培育雄性不育植物品种或品系。

12.权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的植物为单子叶植物。

13.权利要求12所述的应用，其中所述的单子叶植物为禾本科植物。

14.权利要求13所述的应用，其中所述的禾本科植物为水稻或小麦。