CN104911194B - 小麦雄性不育基因wms及其花药特异性启动子的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种小麦雄性不育基因WMS及其花药特异性启动子的应用。本发明利用RNA测序技术对比了小麦近等基因系‘鲁麦15’和‘鲁麦15+Ms2’(简称‘鲁麦15Ms2’)在减数分裂初期的花药转录组，从中发现了只在‘鲁麦15Ms2’花药组织表达的基因WMS。WMS基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO:1所示；WMS基因编码的蛋白(即WMS蛋白)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；WMS基因启动子具有花药组织特异性驱动的活性，人为操作WMS基因能够改变小麦和短柄草的雄蕊育性。因此，本发明可用于实现目标基因的花药特异性表达、创建植物雄性不育特性、建立植物轮回选择体系、发展植物杂交制种技术。

Description

小麦雄性不育基因WMS及其花药特异性启动子的应用
一、技术领域
本发明涉及一种小麦雄性不育基因WMS及其花药特异性启动子的应用。
二、技术背景
植物雄性不育对于选择育种和杂交制种至关重要。在很多植物上，发现了大量的雄性不育株系，对于它们的收集和保存为现代农业提供了宝贵的遗传和种质资源。近年来，人工创制的植物雄性不育系，尤其对于重要粮食作物水稻(Oryza sativa L.)和玉米(Zeamays L.)，在生产上开始发挥作用。
美国先锋公司(Pioneer Hi-Bred International)创制了新型种子生产技术(Seed Production Technology，SPT)(Waltz.2012.Nature Biotechnology 30:215-217)。在玉米上，SPT技术应用到3个关键基因：显性雄性可育基因Ms45，隐性雄性不育基因ms45和红色荧光(可视)标记基因DsRed2。先锋公司构建了携带Ms45和DsRed2各自表达框架的植物表达载体(简称Ms45-DsRed2)，其中可育基因Ms45受花药特异性启动子驱动，可视标记基因DsRed2受组成型启动子驱动。先锋公司将Ms45-DsRed2载体导入玉米雄性不育系(ms45/ms45)，创制了玉米雄性不育保持系DP-32138-1(ms45/ms45，Ms45-DsRed2/_)。DP-32138-1作为花粉供体，为玉米雄性不育植株(ms45/ms45)授粉，不育株上收获的种子再经可视荧光自动分拣技术，获得玉米雄性不育系(ms45/ms45)和玉米雄性不育保持系DP-32138-1(ms45/ms45，Ms45-DsRed2/_)，其中的不育系可用于杂交种生产。在创制植物雄性不育系方面，利用花药特异性启动子驱动不育基因至关重要，有助于降低其它非预见性风险。在水稻上，罗等人(2006)通过cDNA差显技术鉴定到花药绒毡层特异性表达的基因RTS，该基因主要在减数分裂时期的绒毡层表达，其表达在植株开花前消失(Luo et al.2006.PlantMolecular Biology 62:397-408)。刘等人(2013)借助高通量技术发现了水稻花药特异性表达的基因LTP6，该基因编码脂类转运蛋白(Liu et al.2013.Planta 238:845-857)。总之，采用花药特异性启动子驱动植物雄蕊育性相关基因，对于雄性可育/不育系的创建和杂交种的生产有重要意义。
太谷核不育小麦(Triticum aestivum L.)是我国上世纪70年代初发现的“无花粉型”自然突变体，该表型受单显性核基因Ms2(原始命名Ta1)控制，位于小麦4D染色体的短臂(邓景扬，高忠丽.1980.作物学报6:85-98)。由于太谷核不育表现为单基因显性遗传，决定雄性不育的基因只能处于杂合状态(Ms2/ms2)，当接受雄性可育小麦(ms2/ms2)花粉所产生的种子中，大约50％的种子发育成雄性可育植株(ms2/ms2)，其余的种子形成雄性不育植株(Ms2/ms2)。上世纪80年代，刘秉华等人创制了携带显性矮秆基因Rht-D1c(原始命名Rht10)的太谷核不育小麦(简称‘矮败小麦’)(Shu/ed.2009.Induced Plant Mutations in theGenomics Era/FAO/Rome:370-372)。‘矮败小麦’中Rht-D1c基因和Ms2基因紧密连锁(Caoet al.2009.Genome 52:95–99；Shu/ed.2009.Induced Plant Mutations in theGenomics Era/FAO/Rome:370-372)，本发明称之为Rht-D1c_Ms2位点(简称RMs2位点)。自1983年，Ms2基因和RMs2位点成为小麦轮回选择的重要工具。到目前为止，中国已经回交转育了数百份携带Ms2或RMs2位点的小麦品系(本发明统称‘太谷核不育小麦’)，并利用它们选育了40多份小麦品种。
三、发明内容
为了解决人为控制植物育性的问题，本发明提供了一种小麦雄性不育基因WMS及其花药特异性启动子的应用。具体涉及小麦雄性不育基因WMS、该基因的花药特异性启动子及它们的应用。
本发明利用RNA测序(RNA-seq)对比了小麦近等基因系‘鲁麦15’和‘鲁麦15+Ms2’(简称‘鲁麦15Ms2’)减数分裂初期的花药转录组(transcriptome)，从中鉴定只在‘鲁麦15Ms2’花药组织中表达的基因；本发明从‘鲁麦15Ms2’中获得了控制小麦雄性不育的基因，命名为WMS基因。结果表明，WMS基因影响小麦雄蕊发育，人工调控WMS基因可以改变植物雄蕊的育性。另外，WMS基因启动子具有花药特异性驱动的活性，可以实现目标基因的花药特异性表达。因此，本发明可用于实现目标基因的花药特异性表达、创建植物雄性不育特性、建立植物轮回选择体系、发展植物杂交制种技术。
WMS基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO:1所示；WMS基因编码的蛋白(即WMS蛋白)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；WMS基因组全长表达框架，包括启动子、基因组编码区和终止子，其核甘酸序列如SEQ ID NO:4；WMS基因启动子核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；WMS基因组转录区段的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明主要涉及编码小麦WMS蛋白及其同源蛋白的cDNA、合成DNA和基因组DNA的应用。本领域的技术人员利用常规技术即可获得WMS基因相关的cDNA和基因组DNA。对于cDNA的制备大致需要如下步骤：a)从‘太谷核不育小麦’或其它物种中提取信使RNA(message RNA，mRNA)；b)利用mRNA作为模板合成cDNA；c)根据本发明WMS基因全长cDNA序列SEQ ID NO:1设计PCR引物，然后从cDNA模板中扩增WMS基因或其同源基因；d)将PCR产物克隆到质粒载体，获得WMS基因或其同源基因的cDNA。同理，本领域的技术人员也可以从‘太谷核不育小麦’或其它物种中提取基因组DNA，用以创建基因组DNA文库(如BAC、cosmid、fosmid等类型文库)，再利用基于本发明WMS基因组全长表达框架的核苷酸序列(SEQ IDNO:4)的DNA探针或PCR引物筛选DNA文库，获得携带WMS基因的阳性质粒。也可采用长片段PCR方法，利用本发明WMS基因组全长表达框架的核苷酸序列(如SEQ ID NO:4)的特异PCR引物，从植物基因组DNA或质粒DNA直接扩增WMS基因或其同源基因，进而将PCR产物连接到克隆载体。
本发明包括任何DNA片段，只要它们编码的蛋白与WMS蛋白(SEQ ID NO:2)功能等价。本文所指的“与WMS蛋白功能等价”意味着目标DNA片段所编码的蛋白在生物学功能和生理生化特征等方面与本发明中WMS蛋白(SEQ ID NO:2)类同。WMS蛋白典型的生物学功能是诱导植物雄性不育。为验证WMS基因是否诱导小麦雄性不育，可使用甲基磺酸乙酯(Ethylmethylsulfone，EMS)创建‘太谷核不育小麦’的突变群体(实施例7)，再用定向诱导基因组局部突变(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes，TILLING)技术筛选WMS基因敲除(knockout)或敲低(knockdown)的突变植株(实施例8)，然后分析WMS基因突变对‘太谷核不育小麦’雄蕊发育的影响。为明确WMS基因的功能，也可采用遗传互补(geneticcomplementation)手段加以验证。本发明利用基因枪轰击(biolistics bombardment)技术将WMS基因组全长表达框架载体(SEQ ID NO:7)导入雄性可育小麦‘Bobwhite’(实施例9)；也利用农杆菌介导转化(Agrobacterium-mediated transformation)方法将WMS基因组全长表达框架(SEQ ID NO:7)导入雄性可育的禾本科植物二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon L.)(实施例10)；对于所获得的转基因植株，分析了WMS基因的表达对雄蕊发育的影响。
WMS基因的一个突出特点为花药组织的特异性表达，即WMS基因在花药组织的表达较其它组织高出5倍或更多，优选高出10倍或更多，更优选高出15倍或更多(实施例5)。为评价基因是否在花药组织特异性表达，从各种植物组织分别提取mRNA，再合成相应的cDNA，然后采用定量PCR(quantitative reverse-transcription PCR，qRT-PCR)测定目标基因cDNA在不同组织中的相对含量(实施例5)。
如果DNA片段编码的蛋白功能等价于WMS蛋白(SEQ ID NO:2)，这些DNA片段的优选来源是单子叶植物(monocotyledon)，更优选来源是禾本科植物(Gramineae)，最优选来源是小麦族植物(Triticeae)。这些DNA片段包括本发明核苷酸序列(SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:6)对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；它们编码的蛋白类似于本发明WMS蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除、或插入现象，都属于本发明内容。
基因组编辑(genome editing)技术，可以定向敲除目的基因，在动植物上均有应用(Cheng and Alper.2014.Current Opinion in Biotechnology 30:87-94)。部分基因组编辑技术，如锌指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFNs)，转录激活类效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)和规律性重复短回文序列簇(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats，CRISPR)，在主要粮食作物小麦(Shan et al.2014.Nature Protocols 9:2395-2410；Wang etal.2014.Nature Biotechnology 32:947-951)和大麦(Wendt et al.2013.PlantMolecular Biology 83:279-285；Gurushidze et al.2014.PLoS ONE 9:e92046)上得到了成功应用。基因组编辑技术会造成目标基因特定区域发生一个、数个或数十个碱基的删除或插入、导致基因突变，位于转录区域的DNA变异则可能会造成编码蛋白的变异或截短(truncation)(Wang et al.2014.Nature Biotechnology 32:947-951)。转录区域DNA的碱基突变也会引起编码蛋白的氨基酸改变。利用基因组编辑或碱基突变创建的DNA片段，其编码的蛋白与WMS蛋白(SEQ ID NO:2)相比，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除、或插入等现象，但只要该DNA片段编码的蛋白与WMS蛋白(SEQ ID NO:2)功能等价，该DNA片段即属于本发明内容。本发明界定的DNA片段还包括那些发生了碱基突变，但不改变编码蛋白序列的突变，即保守突变(conservative mutation)。
对于本领域的技术人员，可以采用基因组编辑技术改变本发明内容中WMS基因(如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6)及其同源基因序列。另外，目标基因的变异可以通过突变诱导产生或通过种质筛选鉴定本已存在的自然变异。比如，Slade等人(2005)创建了小麦的EMS突变群体，进而采用TILLING技术鉴定目标基因的点突变(Slade et al.2005.NatureBiotechnology 23:75-81)。自然种质的长期进化积累了大量的变异，也可以采用Ecotilling手段从自然种质或育成品种中鉴定目标基因的变异(Till et al.2006.NatureProtocols 1:2465-2477)。对于本领域的技术人员，可以创建相关植物材料的突变群体，再从中筛选本发明内容中DNA片段(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6)发生变异的个体。本领域的技术人员还可以从相关植物的自然种质或育成品种中鉴定本发明DNA片段(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6)的自然变异。因此，本发明还涵盖：a)所有通过基因组编辑、诱变或自然变异筛选而获得的携带本发明内容的DNA片段(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6)发生变异的植物细胞；b)携带a)项植物细胞的植株；c)来自b)项植株的无性克隆或植株后代等，只要它们仍携带a)项植物细胞；d)来自b)和c)项内容的植物种子、植物组织或植物器官等，只要它们仍携带a)项植物细胞。
对于本领域的技术人员，获得DNA片段、使得它们编码的蛋白与WMS蛋白(SEQ IDNO:2)功能等价的方法很多，如PCR方法(Saiki et al.1985.Science 230:1350-1354；Hemsley et al.1989.Nucleic Acids Research 17:6545-6551；Landt et al.1990.Gene96:125-128)、DNA重组技术和DNA人工合成技术(Kosuri and Church.2014.NatureMethods11:499-507)。可以说，对于本领域的技术人员，从小麦或其它植物中获得与WMS基因高度同源的DNA片段为常规技术，可利用对应本发明核苷酸序列(SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:6)的PCR引物，或使用对应本发明核酸序列(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6)的DNA探针，通过筛选基因组DNA或cDNA文库，获得相应的DNA片段。对于DNA片段的获得，无论是通过PCR方法、DNA重组、DNA人工合成还是其它同类技术，只要这些DNA片段所编码的蛋白与WMS蛋白(SEQ ID NO:2)功能等价，这些DNA片段就属于本发明内容。这些DNA片段所编码的氨基酸序列应当与本发明WMS蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:2)高度同源；这里所指的高度同源，意味着两者之间在能够匹配的区段上，氨基酸序列的等同率(sequence identity)至少50％或更高，优选70％或更高，更优选90％或更高(比如95％、96％、97％、98％和99％或更高)。
氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用BLAST算法测定(Altschul etal.1990.Journal of Molecular Biology 215:403-410；Karlin andAltschul.1993.Proceedings of the National Academy of Sciences 90:5873-5877)。根据此算法，衍生了BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX算法(Korf et al./ed.2003.An essential guide to the basic local alignment search tool:BLAST/O’Reilly Associates/Sebastopol:P339)。BLASTN用核酸序列搜索核酸序列库；BLASTP用蛋白质序列搜索蛋白质序列库；BLASTX执行核酸序列和蛋白质序列库的比对，核酸序列在比对之前自动按照六个读码框翻译成蛋白质序列；TBLASTN执行蛋白质序列和核酸序列库的比对，核酸序列库中的序列按照六个读码框翻译后与蛋白质序列进行比对搜索；TBLASTX执行核酸序列对核酸序列库在蛋白质水平的比对，两者在搜索之前都翻译成为蛋白质再进行比对。以上各算法在美国国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI，blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站有专门介绍。
基因组DNA或cDNA文库文库的筛选可能会用到Southern印迹杂交技术(Southern.1975.Journal of Molecular Biology 98:503-517)；主要包括两个过程，一是将待测定的核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物，二是固定于膜上的核酸与标记的探针退火杂交；在退火杂交后的洗膜过程中，通过调节温度、离子强度和冲洗时间来控制实验的严格性，随着SCC溶液浓度的降低(20×、10×、6×、2×、1×、0.5×、0.2×、0.1×)、温度的升高(42℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃)和冲洗时间的延长(1min、2min、5min、10min、15min、20min、30min)，严格性逐渐升高；本发明所指的“在严格条件下”意味着在在洗膜过程中，优选SCC溶液为1×或更低、温度为55℃或更高、冲洗时间为10min或更长。
从应用角度出发，本发明WMS基因(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6)或其同源基因的DNA片段，当导入正常可育植物后，很可能诱导雄性不育表型。换句话说，对于本发明WMS基因(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6)或其同源基因的DNA片段或该DNA片段的重组载体，将它们导入具备形成正常可育植株能力的细胞，转基因细胞则分化再生形成雄性不育的转基因植株，从而将可育植物转换为雄性不育植物。由于雄性不育植物无法自交结实，需要借助雄性可育植株的花粉完成授精，方能维持世代交替。反过来，也可以创制WMS基因(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6)或其同源基因表达抑制的转基因植物。这里所指的“表达抑制”包括DNA转录水平和cDNA翻译水平两个层面，又包括完全抑制和部分抑制两种程度。比如说，根据本发明WMS基因(SEQ ID NO:1)或其同源基因设计能够形成反义RNA(antisense RNA，asRNA)或形成发夹结构RNA(hairpin RNA，hpRNA)的DNA片段，或将它们插入合适质粒载体，将以上DNA片段或其承载质粒导入携带WMS基因(SEQ ID NO:4)或其同源基因的植株细胞，转基因细胞分化形成正常可育的转基因植株，从而将雄性不育植物转换成正常可育植物。当把以上DNA片段或其承载质粒导入具备形成正常可育植株能力的细胞，转基因植株的育性原则上不受影响；利用这类转基因植株的花粉给携带WMS基因(SEQ ID NO:4)或其同源基因的雄性不育植株授粉，后代则能分离出携带WMS基因(SEQ ID NO:4)或其同源基因但雄性可育的植株。由于雄性不育植物无法自交结实，对于自花授粉植物，如何保持雄性不育性状存在难度，对于携带其它优异性状的雄性不育系的保持更值得考虑。利用针对WMS基因(SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:6)或其同源基因的asRNA或hpRNA等技术，可恢复WMS基因的雄性不育功能，使得携带WMS基因或其同源基因的植株可以自交结实，有利于优异性状的保持和利用。
对于本领域的技术人员，asRNA技术常被用来抑制植物内源基因的表达。如依据本发明WMS基因序列(SEQ ID NO:1)，针对WMS cDNA的5’端非翻译区(5'untranslatedregion，5UTR)设计的asRNA将可能有效抑制翻译过程，但针对WMS cDNA的编码区(codingDNA sequence，CDS)或3’端非翻译区(3'untranslated region，3UTR)设计的asRNA同样可能奏效。可见，WMS基因的编码区和非翻译区都可选作设计asRNA的区段。本发明涉及的asRNA技术，可以采用适合启动子驱动反义核酸片段的转录，如玉米泛素启动子(Ubi)(Christensen et al.1992.Plant Molecular Biology 18:675-689)和WMS基因启动子(SEQ ID NO:5)；在反义核酸片段的3’端接入带有转录终止信号的终止子片段；最后利用各种技术将构建的asRNA表达盒或asRNA表达载体导入目标植物。制备反义核酸片段，优选与被转化植物中内源基因在全长范围或部分片段互补的DNA模板，反义核酸与内源基因之间不见得完全互补，只要所设计的asRNA具有抑制内源目标基因表达的效果。对比所形成的asRNA和目标基因mRNA之间的互补程度，优选互补程度在90％或以上，更优选互补程度在95％或以上(比如96％、97％、98％、99％或以上)的反义核酸片段。为了有效抑制内源目标基因的表达，所选反义核酸片段应当包含至少15bp或以上，优选100bp或以上，更优选500bp或以上，但反义核酸片段的长度一般不超过5kb，优选不超过2.5kb的反义核酸片段。
利用内源基因本身同样可以实现对内源基因的表达抑制(Hammond etal.2001.Nature Reviews Genetics 2:110-119；Paddison et al.2002.Genes&Development 16:948-958)。为了在植物中形成hpRNA，需要设计转录后即能形成hpRNA并可引起RNA干涉(RNA interference，RNAi)的DNA表达盒，该DNA表达盒包含适合的启动子(如玉米Ubi启动子)和有效的终止子。应用hpRNA或RNAi，可以有效地抑制本发明内容DNA片段的表达。
通过导入与内源基因序列相同或相似的DNA片段也可能造成共抑制(co-suppression)现象，即外源导入基因和植物内源基因的表达同时抑制(Smyth.1997.Current Biology 7:R793-R796；Ketting and Plasterk.2000.Nature 404:296-298)。为抑制WMS基因(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6)或其同源基因，可将承载WMS或其同源基因的表达载体导入携带WMS或其同源基因的植物，比较转基因植株和未转基因对照植株的雄蕊发育情况，选择雄性不育表型减弱的转基因植株。为实现共抑制，导入基因序列不必等同于内源基因，但导入基因和内源基因之间核苷酸序列的等同率至少70％或以上，优选80％或以上，更优选90％或以上(比如95％、96％、97％、98％、99％或以上)。序列等同率采用前面介绍的算法判定。
导入对植物内源基因有显性抑制(dominant-negative)作用的核酸片段，也可达到抑制植物内源基因表达的效果。假设某基因具有显性抑制功能，该基因的表达会消除或降低目标基因的活性。比如，在短柄草中，微小RNA分子(microRNA，miRNA)miR5200特异靶标开花基因FT，造成FT mRNA的切割；在短柄草中过量表达miR5200，有效下调FT mRNA的积累水平，转基因植株的开花受阻(Wu et al.2013.Plant Cell 25:4363-4377)。对于WMS基因或其同源基因，或存在与之作用的miRNA或干扰小RNA(small interfering RNA，siRNA)，或可以设计与之作用的人工miRNA(artificial microRNA，amiRNA)；合理控制特异小RNA分子(amiRNA、miRNA和siRNA)的合成，将会影响WMS基因或其同源基因mRNA的积累，调控植物雄蕊育性。
本发明对用于开展植物细胞转化的质粒载体没有限制，只要它们在植物细胞中能够表达承载基因。比如，使用携带组织特异性启动子(如WMS基因启动子，SEQ ID NO:5)、组成型启动子(如玉米Ubi启动子)或诱导型启动子的载体。本发明所指的“植物细胞”形式多样，包括各类具备生命全能性的单细胞、多细胞、植物组织或器官，可以是悬浮培养细胞、原生质体细胞，也可以是植物切片组织、植物愈伤组织，它们统一的特点是通过分化再生或无性繁殖能形成植株或部分植株。本发明所指的“植物细胞”还涵盖各种植物来源的细胞，比如粮食作物、花卉植物、蔬菜和林木，它们统一的特点是通过分化再生或无性繁殖能形成植株或部分植株。
对于本领域的技术人员，可以使用各种手段将质粒载体导入植物细胞，比如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)法，电穿孔(electroporation)法，农杆菌介导方法，基因枪轰击法等，并将转化细胞发展成为转基因植株。在植物领域，各种转基因技术趋向成熟，并得到广泛应用。比如，利用PEG方法将基因导入原生质体然后再生成苗，或利用电穿孔方法将基因导入原生质体然后再生成苗，或利用基因枪轰击方法将基因导入植物细胞然后再生成苗，或利用农杆菌介导方法将基因导入植物细胞然后再生成苗。以上这些方法均适用于本发明领域。
对于携带本发明DNA片段的转基因植株，进而通过有性或无性方式得到它们的有性后代(如种子)、无性克隆(如不定枝、愈伤、原生质体等)、分生组织(如芽点、茎尖、根尖等)，大量繁殖转基因植株。因此，本发明涵盖：a)所有携带本发明内容DNA片段的转基因植物细胞；b)携带a)项转基因细胞的植株；c)来自b)项植株的无性克隆和植株后代等，只要它们仍携带a)项转基因细胞；d)来自b)和c)项内容的植物种子、植物组织或植物器官等，只要它们仍携带a)项转基因细胞。
利用以上方式获得的转基因植株或携带转基因细胞的植株，其雄蕊育性在理论上将有别于野生型植株。比如，通过基因互补技术，将小麦WMS基因(SEQ ID NO:4)或其同源基因导入正常可育植株，将可能创制雄性不育表型；通过反义核酸或同类技术，抑制植物内源WMS基因或其同源基因，将可能把本来雄性不育的植物转变为正常可育的植物。因此，可以利用本发明内容调控植物雄蕊育性，比如利用植物获得性雄性不育，可以遏制自花授粉(self-pollination)、强制开放授粉(cross-pollination)，充分发挥杂种优势，创新杂交制种技术。
本发明还提供了具有花药特异性驱动活性的启动子DNA片段，比如WMS基因(SEQID NO:4)起始密码子上游的基因组DNA(SEQ ID NO:5)。本发明中花药特异性启动子DNA片段包括WMS基因启动子(SEQ ID NO:5)或与之同源的DNA片段；与WMS基因启动子(SEQ IDNO:5)相比，同源DNA片段可能存在一个、数个或数十个碱基的替换、删除、或插入等现象，只要它们仍具有花药特异性启动子的活性。本发明启动子DNA片段的植物来源不限，优选单子叶植物，更优选禾本科植物，最优选小麦族植物，只要这些DNA片段呈现花药特异性启动子的活性。
如果获得了编码本发明WMS蛋白或其同源蛋白的DNA片段，也可利用它们捕获具有花药特异性启动子活性的DNA片段。比如，利用WMS基因组转录区段(SEQ ID NO:6)或其部分片段作为探针，筛选不同植物来源的基因组DNA文库，有可能获得WMS基因或其同源基因的上游启动子片段。由于本发明认定的启动子具有花药特异性驱动的活性，可以利用它们驱动任意基因(arbitrary gene)在花药组织的特异性表达，具有良好的应用前景和产业化价值。本文所指的“任意基因”包括编码蛋白的DNA片段和非编码蛋白的DNA片段(如能形成amiRNA、asRNA、hpRNA、miRNA、siRNA和呈现核酶活性RNA的DNA片段)，当连接到WMS基因启动子(SEQ ID NO:5)之后，这些DNA片段在WMS基因启动子的作用下，在花药组织特异性表达。
通过PCR克隆(Saiki et al.1985.Science 230:1350-1354)、DNA重组和人工合成(Kosuri and Church.2014.Nature Methods 11:499-507)等手段也能获得类似本发明WMS基因启动子核苷酸序列(SEQ ID NO:5)的DNA片段。比如，针对本发明核苷酸序列(SEQ IDNO:5)设计PCR引物，从携带WMS基因或其同源基因的物种上扩增目标DNA片段，从而分离到类似本发明核苷酸序列(SEQ ID NO:5)的DNA片段。
对于本领域的技术人员，还有多种手段制备各类DNA片段的变异体。基因组编辑技术可定向改变本发明WMS基因启动子(SEQ ID NO:5)，引起一个、数个或数十个碱基的删除或插入。基因定点突变(site-directed mutagenesis)，诱变剂/射线诱导的突变(mutagen/radiation induced mutagenesis)和PCR技术等(Saiki et al.1985.Science230:1350-1354；Hemsley et al.1989.Nucleic Acids Research 17:6545-6551；Landt etal.1990.Gene 96:125-128)也可以创建DNA变异。
验证DNA片段是否具备花药特异性驱动的活性，可采用报告基因测试方法。本发明对于不同类型报告基因的使用不限，只要它们可以检测目标基因的表达。对于本领域的技术人员，通常使用的报告基因有荧光素酶(luciferase，LUC)基因，β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUS)基因和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因等。对于不同类型的报告基因，本领域的技术人员掌握了相应的检测手段。比如，LUC基因产物荧光素酶通过氧化荧光素(Luciferin)形成可发光中间产物，当荧光素过量时，中间产物的发光量与样品中的荧光素酶的活性成正比；GUS基因产物β-葡糖苷酸酶通过水解5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(X-Gluc)形成呈蓝色的靛蓝染料，再根据颜色深浅判断GUS活性；对于GFP基因产物则可通过直接测定绿色荧光的强度来判定GFP蛋白的含量。
本发明启动子DNA片段可以驱动“任意基因”在花药组织的表达。基本方案如下：a)构建携带本发明启动子DNA片段的质粒载体；b)将任意基因“可行性插入”a)项载体中本发明启动子DNA片段的下游；c)获得携带本发明启动子DNA片段或b)项载体的转基因植物细胞；d)获携带c)项转基因植物细胞的再生植株。这里所指的“可行性插入”意味着插入到本发明启动子DNA片段下游的“任意基因”能转录表达。鉴于本发明启动子DNA片段具有花药特异性表达的活性，“任意基因”则优选那些本来在花药组织中特异表达的基因。本发明内容的WMS基因在花药组织特异性表达、调控植物雄蕊育性，为本发明启动子DNA片段的优选目标基因。本发明启动子DNA片段可用于各种构建技术、载体类型和植物细胞。对于本领域的技术人员，可采用各种技术，构建携带本发明启动子DNA片段的质粒载体或重组DNA片段，并将它们导入受体植物细胞，形成植株个体。
本发明包括：a)所有携带本发明启动子DNA片段的转基因植物细胞；b)携带a)项转基因细胞的植株；c)来自b)项植株的无性克隆或植株后代等，只要它们仍携带a)项转基因细胞；d)来自b)和c)项内容的植物种子、植物组织或植物器官等，只要它们仍携带a)项转基因细胞。
对于本领域的技术人员，可采用基因组编辑技术改变本发明WMS基因启动子(SEQID NO:5)或其同源序列；也可以通过创建相关植物材料的突变群体，从中筛选本发明启动子DNA片段(如SEQ ID NO:5)的变异；或者从相关植物的自然种质或育成品种中鉴定本发明启动子DNA片段(如SEQ ID NO:5)的自然变异。因此，本发明包括：a)所有通过基因组编辑、诱变或自然变异筛选而获得的携带本发明启动子DNA片段(如SEQ ID NO:5)发生变异的植物细胞；b)携带a)项植物细胞的植株；c)来自b)项植株的无性克隆或植株后代等，只要它们仍携带a)项植物细胞；d)来自b)和c)项内容的植物种子、植物组织或植物器官等，只要它们仍携带a)项植物细胞。
综上所述，本发明包括WMS基因(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6)、WMS同源基因以及它们的启动子(如SEQ ID NO:5)。利用正常可育植物作为受体，在花药组织中特异表达WMS基因或其同源基因，可能将正常可育植物转变为雄性不育植物。反过来，针对携带WMS基因或其同源基因的雄性不育植物，通过基因工程等方式抑制WMS基因或其同源基因的表达，可能将雄性不育植物转变为正常可育植物。另外，WMS基因及其同源基因的启动子可能具有花药特异性驱动的活性，该类启动子有利于实现在花药组织中特异表达“任意基因”。由此推测，WMS及其同源基因以及它们的启动子将在育种和制种等领域发挥巨大作用。
关于本发明的实验基础和科学依据将通过下文的具体实施例加以诠释，但是本发明的创造和应用并非局限于此。具体来讲，本发明申请专利范围如下：
1.克隆或合成获得的如下a)至e)项规定的任何DNA片段：a)互补DNA(cDNA)片段如SEQ ID NO:1所示；b)DNA片段，其编码的蛋白如SEQ ID NO:2所示；c)DNA片段如SEQ ID NO:6所示；d)DNA片段，其编码的蛋白(i)功能上如同本发明WMS蛋白(SEQ ID NO:2)，(ii)序列上如同WMS蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，但存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除、或插入等现象；e)DNA片段，其编码的蛋白(i)功能上如同本发明WMS蛋白(SEQ ID NO:2)，(ii)在严格条件下能与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6所示的DNA片段退火杂交；
2.DNA片段，其转录产物RNA与本发明核酸序列(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6)对应的转录产物RNA互补或部分互补；
3.DNA片段，其转录产物RNA呈现核酶(ribozyme)活性，能特异切割本发明核酸序列(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6)对应的转录产物RNA；
4.DNA片段，其转录产物RNA在植物细胞中通过共抑制(cosuppression)下调本发明核酸序列(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6)对应基因的表达；
5.DNA片段，其转录产物RNA在植物细胞中对第1条任何DNA片段的转录本RNA具有显性抑制(dominant-negative)作用；或DNA片段，其在植物细胞中所编码的蛋白对第1条任何DNA片段所编码的蛋白具有显性抑制作用；
6.携带以上第1至第5条任何DNA片段的质粒载体；
7.携带以上第1至第6条任何内容的植物转基因细胞；
8.携带第7条内容的转基因植株；
9.来源于第8条内容的无性克隆或植株后代，该无性克隆或植株后代携带第7条内容；
10.来源于第8和第9条内容的植物种子、植物组织或植物器官，它们携带第7条内容；
11.克隆或合成的如下a)至c)项所规定的任何具有花药特异性启动子活性的DNA片段：a)DNA片段如SEQ ID NO:5所示；b)DNA片段如SEQ ID NO:5所示，但存在一个、数个或数十个碱基的替换、删除、或插入等现象；c)DNA片段在严格条件下能与SEQ ID NO:5所示的DNA片段退火杂交；
12.携带以上第11条内容的质粒载体；
13.携带以上第11和第12条任何内容的植物转基因细胞；
14.携带第13条内容的转基因植株；
15.来源于第14条内容的无性克隆或植株后代，该无性克隆或植株后代携带第13条内容；
16.来源于第14和第15条内容的植物种子、植物组织或植物器官，它们携带第13条内容；
17.任何利用基因组编辑(genome editing)、诱导突变(induced mutagenesis)或种质筛选(germplasm screening)等手段获得的植物细胞，该植物细胞携带如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4所示DNA片段的变异体，只要该DNA片段的变异足以引起植物雄蕊育性的改变；
18.携带第17条内容的植株；
19.来源于第18条内容的无性克隆或植株后代，该无性克隆或植株后代携带第17条内容；
20.来源于第18和第19条内容的植物种子、植物组织或植物器官，它们携带第17条内容。
四、附图说明
下图中‘Lumai 15’代表‘鲁麦15’，‘Lumai 15Ms2’代表‘鲁麦15Ms2’。
图1为基于WMS-PM和WMS-EM标记的基因型分析图。
上面两个图片表示基于WMS-EM标记的基因型分析，下面两个图片表示基于WMS-PM标记的基因型分析；左边两个图片表示普通小麦亲本和BAC克隆的基因型分析，右边两个图片表示来自‘鲁麦15Ms2’/‘鲁麦15’组合的F1单株的基因型分析。F1单株包括3个雄性败育单株(S1，S2和S3)和3个雄性可育单株(F1，F2和F3)。箭头表示与雄性不育性状紧密连锁的特异条带。
图1说明本发明获得了与太谷核不育小麦的雄性不育性状紧密连锁的分子标记。
图2为携带WMS/wms基因的BAC克隆示意图。
BAC克隆P89和P1076来源于携带隐性wms基因的小麦4D染色体；BAC克隆P204和P1593来源于携带显性WMS基因的小麦4D染色体。灰色背景区域(中间垂直区域)代表WMS基因组全长表达框架(SEQ ID NO:4)。BAC克隆中插入片段的大小按比例绘制。
图2说明本发明获得了携带显性WMS基因的BAC克隆。
图3为WMS基因在花药组织的特异性表达图。
图中：A图应用RT-PCR检测了WMS cDNA在小麦花药(anther)、颖片(glume)、叶片(leaf)、外稃(lemma)、内稃(palea)、雌蕊(pistil)、根系(root)和茎段(stem)中的表达情况。B图应用qRT-PCR检测了WMS cDNA在小麦花药、内外稃及颖片(glume,lemma and palea：GLP)、叶片、雌蕊和茎段中的表达水平。RT-PCR和qRT-PCR测试中均应用小麦Actin基因作为内源参照。测试材料为‘鲁麦15Ms2’。
图3说明本发明获得的显性WMS基因只在小麦花药组织中表达。
图4为WMS基因启动子花药特异活性的验证图。
图中：A图为WMS基因启动子所涉及的质粒；PC613是一个gateway技术兼容并携带GFP表达框的受体载体；质粒PC966携带PWMS::GFP表达盒，这里PWMS代表WMS基因启动子(SEQID NO:5)；质粒PC976携带WMS基因组全长表达框架(SEQ ID NO:7)；以上3个载体的质粒骨架都是pCAMBIA1300。B图为小麦花药组织中GFP荧光的瞬时表达，箭头指示荧光信号；对应PC613质粒的转化没有荧光信号，而对应PC966质粒的转化有荧光信号，说明本发明得到的启动子(SEQ ID NO:5)在花药组织中具有活性。C图应用RT-PCR检测了WMS cDNA在小麦转基因植株‘JZ7-2’的花药、颖片、叶片、外稃、内稃、雌蕊和茎段中的表达情况，发现该基因只在花药组织中表达；小麦转基因植株‘JZ7-2’(表3)来自针对质粒PC976的小麦转化；这里还包含了两个对照花药材料，即花药1(Anther 1)来自‘鲁麦15’和花药2(Anther2)来自‘鲁麦15Ms2’。比例尺＝100μm。
图4说明本发明得到的WMS基因启动子(SEQ ID NO:5)具有花药特异驱动的活性。
图5为显性WMS基因点突变的TILLING检测以及M1突变个体中可育花药的形成图。
图中：A图使用PCR引物WMS-FP12和WMS-RP12确认了显性WMS基因的存在(如A图中上图所示)；基于PCR引物WMS-FP8和WMS-RP8的TILLING分析(S代表雄性不育分蘖；F代表雄性可育分蘖；箭头指示CelI酶切产物条带；如A图中下图所示)。B图为M1突变体中(Mu1-F、Mu2-F、Mu3-F和Mu4-F)可育分蘖的花药发育情况。以‘鲁麦15’和‘鲁麦15Ms2’为对照材料。比例尺＝1.5mm。
图5说明WMS基因可影响太谷核不育小麦的雄性发育。
图6为利用小麦‘Bobwhite’开展WMS基因的遗传互补研究图。
图中：A图利用PCR方法验证了T0植株中BAR和WMS基因的整合情况以及WMS和Actin基因的表达情况。B图为基于BAR基因的除草剂抗性分析图(B图中上图所示；比例尺＝2.5mm)；显性WMS基因cDNA的表达导致T0植株雄性不育(B图中下图所示；比例尺＝1.5mm)。‘Bobwhite’为野生型对照。
图6说明WMS基因的表达会造成转基因小麦的雄性不育。
图7为利用短柄草‘Bd21-3’开展显性WMS基因的遗传互补研究图。
图中：A图利用PCR方法验证了T0植株中BAR和WMS基因的整合情况以及WMS和Actin基因的表达情况。B图是基于BAR基因的除草剂抗性分析图(B图中上图所示；比例尺＝2.5mm)；显性WMS基因cDNA的表达导致T0植株雄性不育(B图中下图所示；比例尺＝0.5mm)。以短柄草‘Bd21-3’为野生型对照。
图7说明WMS基因的表达会造成转基因短柄草的雄性发育。
五、具体实施方式
本发明利用了山东农业大学自主培育的小麦近等基因系‘鲁麦15’和‘鲁麦15Ms2’。小麦植株在温室条件下种植，温室配备长日照(16h、105μmol/m2/s1)，白天温度25-30℃，夜间温度15-20℃。本发明中分子生物学实验的用水、常规药品以及植物激素购自美国飞世尔科技公司(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA，USA)和美国西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，植物组织培养基购自美国植物技术公司(PhytoTechnologyLaboratories，Overland Park，KS，USA)，微生物培养基购自美国BD公司(Becton，Dickinson and Company，Franklin Lakes，NJ，USA)，抗生素和双丙氨膦(bialaphos)购自美国GoldBio公司(Gold Biotechnology，St.Louis，MO，USA)。本发明所涉及的PCR引物及序列见表1。
表1：本发明中应用到的PCR引物
备注：为方便基因克隆，PCR引物WMS-FP11携带限制性内切酶NotI位点,另外在PCR引物WMS-FP11中添加了限制性内切酶AscI位点，下划线标注酶切位点识别序列。*RT-PCR引物Actin-FP1和Actin-RP1在小麦和短柄草上都工作。
实施例1：利用转录组学鉴定‘鲁麦15Ms2’花药特异性表达基因
RNA测序(RNA-seq)利用高通量测序技术直接测定样本衍生的全部或部分cDNA分子。本发明通过RNA测序对比了小麦近等基因系‘鲁麦15’和‘鲁麦15Ms2’各自花药组织的转录组。当小麦主茎或分蘖的旗叶和倒二叶之间的叶环距达到4公分，花药大致处于减数分裂I前期(本文称减数分裂初期)，收集该主茎/分蘖的幼穗，采集幼穗中部5个小穗各自第一和第二朵小花的花药。对于‘鲁麦15’和‘鲁麦15Ms2’，分别收集了3个生物学重复，每个重复大约150个花药。总RNA的提取采用TRIzol试剂及相关方法(Life Technologies，GrandIsland，NY，USA)。RNA测序涉及的文库构建(优选500bp左右的mRNA碎片)和高通量双端测序(HiSeq 2500，Illumina，San Diego，CA，USA；paired-end，PE125)由北京贝瑞和康生物技术有限公司承担(Berry Genomics Company，Beijing，China)。
对于RNA-seq原始数据，首先剔除接头信息、低质量碱基(Q值≤3的碱基，占整个read的50％以上)和未测出碱基(N比例大于3％),获得有效数据；利用Trinity软件(Haaset al.2013.Nature Protocols 8:1494-1512)开展有效数据的从头拼装；使用RSEM算法(Li and Dewey.2011.BMC Bioinformatics 12:323)估算样品中基因表达丰度；利用edgeR程序包(Robinson et al.2010.Bioinformatics 26:139-140)计算样品中转录本表达的差异。通过比较‘鲁麦15’和‘鲁麦15Ms2’各自的花药转录组数据，发现个别基因在‘鲁麦15Ms2’中的转录水平远超过‘鲁麦15’。本发明鉴定到一个未知基因,其序列如SEQ ID NO:1所示；该基因在‘鲁麦15Ms2’花药中表达，但在‘鲁麦15’花药中未被检测到。发明人预测该基因(SEQ ID NO:1)可能影响小麦雄蕊育性，暂定名为Wheat Male Sterility(WMS)基因，并围绕该基因开展了功能研究。
实施例2：小麦WMS基因全长cDNA的验证
为验证WMS基因的全长(full-length)cDNA，使用TRIzol试剂提取了‘鲁麦15Ms2’幼穗的总RNA，然后利用RevertAid Frist Strand cDNA Synthesis试剂盒(ThermoScientific，Waltham，MA，USA)制备了cDNA模板。采用cDNA末端快速扩增技术(rapidamplification of cDNA ends，RACE)分离WMS基因(SEQ ID NO:1)全长cDNA的5'和3'末端，使用SMARTer RACE cDNA Amplification试剂盒(Clontech Laboratories，MountainView，CA，USA)，操作方法参照试剂盒说明书。5'端RACE PCR的嵌套引物为WMS-RP1和WMS-RP2，其中WMS-RP2为WMS-RP1的巢式引物(nested primer)；3'端RACE PCR的嵌套引物为WMS-FP1和WMS-FP2，其中WMS-FP2为WMS-FP1的巢式引物。对RACE PCR产物进行测序，证实了WMS基因全长cDNA序列(SEQ ID NO:1)两端的完整性，说明RNA测序及序列拼装高度可靠。为此，根据WMS基因全长cDNA序列(SEQ ID NO:1)设计了PCR引物WMS-FP3和WMS-RP3，从‘鲁麦15Ms2’的幼穗cDNA样本中扩增到WMS基因的全长cDNA克隆，该克隆的序列和本发明得到的WMS基因核苷酸序列(SEQ ID NO:1)相同。WMS基因全长cDNA共1,485bp，包含一个882bp的开放阅读框(open reading frame，ORF)；在起始密码子的上游，有两个框内终止密码子(in-frame stop codon)，预示当前ORF相对可靠、可能编码真正意义上的WMS蛋白。据此，发明人将起始密码子或当前ORF上游的DNA片段认定为WMS基因启动子区域。
实施例3：‘鲁麦15Ms2’基因组BAC文库的构建
为方便基因组DNA的克隆，创建了‘鲁麦15Ms2’基因组DNA的细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)文库，构建方法参照已发表的文献(Grotewold/ed.2003.Plant Functional Genomics/Humana/Totowa:3-19；Shi et al.2011.PlantMethods 7:33)。简而言之，从‘鲁麦15Ms2’叶片中提取大分子量基因组DNA(high-molecularweight，HMW)，经限制性内切酶HindIII部分酶切，利用1％的琼脂糖凝胶及脉冲电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)分离酶切产物，从中纯化片段大小介于100-300kb的DNA，重复脉冲电泳和片段纯化步骤，将经过两次纯化获得的DNA片段插入BAC载体pIndigoBAC536-S(经HindIII完全酶切和末端去磷酸化处理)，然后转化大肠杆菌感受态细胞(E coli DH10B T1Phage-Resistant Cells，Invitrogene，Carlsbad，CA，USA)，并用LB培养基(添加了chloramphenicol 12.5mg/L，X-gal 80mg/L，IPTG 100mg/L)筛选转化子(transformant)，最终挑取白色菌落于384孔板保存。
‘鲁麦15Ms2’基因组BAC文库包含706,176BAC克隆、保存在1,839个384孔板中。根据随机挑选的337个BAC克隆检测文库质量，文库空载率为0.5％，单克隆的平均插入片段124.6kb，整个文库覆盖小麦全基因组(按16Gb计算)约5.5倍(表2)。
表2：‘鲁麦15Ms2’基因组DNA BAC文库
表2说明成功构建了‘鲁麦15Ms2’基因组BAC文库。
实施例4：‘鲁麦15Ms2’BAC文库的筛选、BAC克隆的测序及序列分析
为建立‘鲁麦15Ms2’BAC文库的筛选体系，首先复制了整套基因组文库，将复制后的单块384孔板中的菌液混合(板内混合)，并利用ZR BAC DNA Miniprep试剂盒(ZymoResearch Corporation，Irvine，CA，USA)提取板内混合菌液中所有BAC质粒的初级池(primary pool)，每10个BAC初级池再等量混合形成BAC质粒的高级池(super pool)。针对整套‘鲁麦15Ms2’基因组BAC文库，共制备了1,839个BAC质粒初级池和184个BAC质粒高级池。
为获得携带WMS基因的BAC克隆，根据WMS基因全长cDNA(SEQ ID NO:1)设计了多套PCR引物，测试不同引物组合在‘鲁麦15’和‘鲁麦15Ms2’基因组DNA上的扩增效果，确定了适用引物组合WMS-FP4和WMS-RP4。该引物组合在‘鲁麦15’上扩增1个条带，但在‘鲁麦15Ms2’上扩增2个条带；在1％的琼脂糖凝胶上，‘鲁麦15’来源的条带与‘鲁麦15Ms2’来源的长条带迁移位置相同(图1)。由此可见，‘鲁麦15Ms2’来源的短条带为特异条带，可能来自决定‘太谷核不育小麦’雄性不育的Ms2基因区段。为验证短条带和雄性不育性状的关系，本发明检测了大约5,000株来自“鲁麦15Ms2/鲁麦15”组合的F1单株，其中正常可育和雄性不育的植株数目相当，而短条带的出现和雄性不育性状完全连锁。因此，WMS-FP4和WMS-RP4可以用作鉴定“鲁麦15Ms2/鲁麦15”后代植株雄蕊育性的分子标记，命名为WMS-EM(exon-derivedmarker)。
利用WMS-EM标记筛选了‘鲁麦15Ms2’BAC质粒的高级池和初级池，并利用对应阳性初级池的384孔板开展了菌液PCR，确认了阳性BAC单克隆的位置，并获得阳性BAC单克隆质粒。针对WMS-EM标记，筛选到3个阳性BAC单克隆(P89、P1076和P1593)(图2)，其中BAC克隆P1593对应短条带，而BAC克隆P89和P1076则对应长条带(图1)。考虑到Ms2基因区段在‘鲁麦15Ms2’中处于杂合状态，初步推测，P1593来源于携带显性Ms2基因的小麦4D染色体，而P89和P1076则来源于携带隐性ms2基因的小麦4D染色体。如前所述，WMS-EM标记在P1593上的基因型(短条带)与“鲁麦15Ms2/鲁麦15”后代植株的雄蕊不育性状完全连锁，但WMS-EM标记在P89和P1076上的基因型(长条带)则与雄蕊不育性状不连锁。据此推测，P1593携带显性WMS基因，而P89和P1076则携带隐性wms基因。采用新一代高通量测序技术，对以上3个阳性BAC克隆(P89、P1076和P1593)进行测序。BAC质粒测序涉及的文库构建(优选300bp左右的DNA碎片)和高通量双端测序(HiSeq 2000，Illumina；PE100)由北京贝瑞和康生物技术有限公司承担。
对于获得的原始序列数据，首先剔除其中的接头信息、低质量碱基(Q值≤5的碱基，占整个read的50％以上)和未测出的碱基(N比例大于10％)；利用Phrap软件包CrossMatch软件(http://www.phrap.org/)去除剩余序列中的BAC载体(pIndigoBAC536-S)序列和大肠杆菌基因组序列，获得有效数据；利用拼接软件ABySS 1.5.2(Simpson etal.2009.Genome Research 19:1117-1123)对有效序列数据进行De novo拼接；在此过程中，对比不同K-mer值(21-91)所对应的N50值，最终选择K-mer值为41时的拼接序列。对比发现，P89和P1076共享54,056bp的相同序列，说明二者代表同一条染色体，但二者的序列与P1593的序列之间多态性丰富。对照WMS cDNA序列(SEQ ID NO:1)，发现P89，P1076和P1593分别携带对应WMS基因全长cDNA的基因组转录区段。根据P1593预测的WMS cDNA与本发明WMS基因全长cDNA(SEQ ID NO:1)的序列相同，但与P89/P1076预测的wms cDNA存在11个单核苷酸多态性位点(single neucleotide polymorphism，SNP)。P89和P1076克隆中wms基因的上游序列较长(SEQ ID NO:3)(图2)，估计该基因的启动子序列完整；P1593克隆中WMS基因位于插入片段的一端，插入断点位于WMS基因启动子区域，因此P1593克隆中的WMS基因启动子区域序列有待拓展(图2)。
为拓展WMS基因启动子区域序列，根据现有wms基因启动子序列(SEQ ID NO:3)设计了多套PCR引物，测试不同引物组合在‘鲁麦15’和‘鲁麦15Ms2’基因组DNA上的扩增效果，确定了适用引物组合WMS-FP5和WMS-RP5。该引物组合在‘鲁麦15’基因组DNA扩增2个条带，但在‘鲁麦15Ms2’基因组DNA扩增3个条带；在1％的琼脂糖凝胶上，‘鲁麦15’来源的2个条带与‘鲁麦15Ms2’来源的最长条带和最短条带迁移位置相同，而‘鲁麦15Ms2’来源的中间条带为特异条带(图1)，可能来自决定‘太谷核不育小麦’雄性不育的Ms2基因区段。然后利用“鲁麦15Ms2/鲁麦15”组合的F1群体证实了中间条带和雄性不育性状之间紧密连锁。因此，WMS-FP5和WMS-RP5可以用作鉴定“鲁麦15Ms2/鲁麦15”后代植株雄蕊育性的分子标记，命名为WMS-PM(promoter-derived marker)。利用WMS-PM标记筛选了‘鲁麦15Ms2’BAC质粒的高级池、初级池和384孔板，额外鉴定到阳性BAC克隆P204(图1和图2)，WMS-PM标记在P204克隆对应中间条带，说明该克隆来源于携带显性WMS基因的小麦4D染色体。对P204质粒进行高通量测序和序列组装，发现P204与P1593重叠1,212bp，P204和P1593两克隆拼接后的序列包含WMS基因组全长表达框架(SEQ ID NO:4)。序列比较显示，本发明认定的隐性wms基因组全长表达框架(SEQ ID NO:3)为8,657bp，与之对应的显性WMS基因组全长表达框架(SEQ ID NO:4)为10,592bp,两者之间的长度差异主要归结于WMS基因启动子区段存在转座子插入。
实施例5：小麦WMS基因的花药特异性表达分析
利用反转录PCR(reverse-transcription PCR，RT-PCR)和定量PCR(qRT-PCR)测定了‘鲁麦15Ms2’不同组织中WMS基因mRNA的积累。RT-PCR使用WMS基因引物WMS-FP6和WMS-RP6，还涉及内源参照基因Actin(肌动蛋白基因)，应用到PCR引物Actin-FP1和Actin-RP1。由于‘鲁麦15Ms2’中WMS/wms位点杂合，通过对RT-PCR产物的克隆和测序，明确了显性WMSmRNA占据了表达产物(约98％)。qRT-PCR使用WMS基因引物WMS-FP7和WMS-RP7及内源对照基因引物Actin-FP2和Actin-RP2(Fu et al.2007.Molecular Genetics and Genomics 277:301-313)。结果表明，WMS基因只在小麦花药中特异表达，在颖片(glume)、叶片(leaf)、外稃(lemma)、内稃(palea)、雌蕊(pistil)、根系(root)和茎段(stem)中均检测不到(图3A)；根据qRT-PCR结果，WMS基因在小麦花药中的表达较其它测试过的组织高出上百倍(图3B)。
实施例6：WMS基因启动子的认定和功能分析
真核生物中，通常将起始密码子上游一定长度的基因组DNA用作基因启动子。本发明通过比较WMS和wms两基因预测起始密码子上游的基因组序列来认定WMS基因启动子。对于未知功能基因，通常克隆起始密码子上游2-4kb的片段，以期获得完整并具有活性的启动子。通过分析wms基因组全长表达框架(SEQ ID NO:3)和WMS基因组全长表达框架(SEQ IDNO:4)，本发明选取了预测起始密码子上游3,502bp(wms)和5,578bp(WMS)作为候选启动子序列。对比候选启动子区段发现，所选区段最上游的2,414bp在wms和WMS基因之间序列相同；而wms候选启动子剩余的1,088bp则对应WMS候选启动子剩余的3,164bp，这种差异主要是由于WMS候选启动子存在两个转座子插入，分别为275bp和1,791bp；除了转座子插入之外，对应wms候选启动子剩余的1,088bp区段，wms和WMS两基因候选启动子之间也存在十多个SNP。初步推测，wms和WMS两基因各自的启动子应当从最上游相同序列(2,414bp)的某个位置开始。为保险起见，本发明选择保留最上游2,414bp的相同序列，连同随后的序列一起认定为启动子。因此，本发明认定的显性WMS基因启动子为5,578bp(SEQ ID NO:5)，该启动子应当具有花药特异性驱动的活性。
为确认WMS基因启动子(SEQ ID NO:5)的功能，本发明构建了2个载体：受体载体(Destination vector)PC613和PWMS::GFP表达载体PC966(图4A)，这里PWMS代表WMS基因启动子(SEQ ID NO:5)。PC613和PC966载体中GFP融合表达框架来自pGWB4载体(Nakagawa etal.2007.Journal of Bioscience and Bioengineering 104:34-41)；PC613和PC966两载体的质粒骨架为pCAMBIA1300。在载体PC966中，PWMS和GFP之间的连接序列为5’-TAGGGAGAGGCGCGCCGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATCATG-3’，5’端的TAGGGAG碱基为WMS基因启动子(SEQ ID NO:5)的末端，3’端的ATG代表GFP基因的起始密码子。利用PC613和PC966分别转化小麦的不同花器组织(外稃、内稃、雌蕊和雄蕊)，基因强轰击转化方法参见实施例9。瞬时表达三天后，在立体荧光显微镜下观察GFP绿色荧光，对照质粒PC613的转化未造成绿色荧光，而质粒PC966(携带PWMS::GFP表达盒)的转化则产生了GFP荧光信号，尤其是在花药组织(图4B)。可见，本发明WMS基因启动子(SEQ ID NO:5)具有启动子活性，能驱动GFP基因在花药组织的表达。
一方面为了开展小麦遗传互补实验(实施例9)，另一方面为了研究WMS基因启动子(SEQ ID NO:5)的功能，本发明克隆了“鲁麦15Ms2”WMS基因组全长表达框架(SEQ ID NO:7)，并构建了携带WMS基因组全长表达框架的双元表达载体PC976(图4A)。该载体的创建办法以及小麦基因枪转化参见实施例9。值得强调的是，PC966和PC976中使用了长度和序列完全一样的WMS基因启动子(SEQ ID NO:5)。利用携带WMS基因组全长表达框架的小麦转基因植株JZ7-2(表3)，来确认了WMS cDNA表达的组织特异性，这里应用了WMS基因引物WMS-FP6和WMS-RP6以及内参基因引物Actin-FP1和Actin-RP1。结果发现本发明认定的WMS基因启动子(SEQ ID NO:5)能够驱动WMS基因在小麦花药组织的特异表达，而在颖片、叶片、外稃、内稃、雌蕊和茎段中均未检测到WMS cDNA的表达(图4C)。综上所述，WMS基因启动子(SEQ ID NO:5)具备花药特异性驱动的活性。
由此可见，构建WMS基因启动子(SEQ ID NO:5)和目的基因表达盒，将其导入植物(如粮食作物、花卉植物，蔬菜和林木等)，可能会实现目标基因的花药特异性表达，这对于创建植物雄性不育等性状非常重要。
实施例7：‘鲁麦15Ms2’EMS突变群体的创建
为确认显性WMS基因的功能，本发明利用EMS水溶液处理了11,000粒“鲁麦15Ms2/鲁麦15”组合的F1种子，经温室种植和分子标记筛选，保留了携带显性WMS基因的1,200株突变个体(M1世代)。群体的创建如下：将400粒种子(F1或M0种子)浸泡在100毫升EMS水溶液(87.4μM)，放置于水平摇床震荡10h(150rpm，25℃)，然后在室温下用自来水冲洗4h；将处理过的种子(M1种子)摆放到湿润滤纸，一起放入敞口塑料盆(长×宽×高＝40cm×30cm×20cm)，然后覆上一层保鲜薄膜，在温室下催芽8d；将长势健康、根系健全的幼苗移栽到营养土中，在春化室(4℃，12h光照)处理6w；将幼苗转移到温室生长，利用WMS-EM标记鉴定突变单株的基因型，只保留携带显性WMS基因的植株，共1,200株(M1植株)。为区分主茎和分蘖，在植株拔节期间，将单株上发育最快、长势最强的茎秆作为主茎，并挂牌标注。
实施例8：利用TILLING技术筛选‘鲁麦15Ms2’EMS突变群体
实施例4结果表明，“鲁麦15Ms2/鲁麦15”后代中显性WMS基因和雄性不育性状完全连锁。由于显性WMS基因的存在，现有的1,200株M1突变个体应当表现雄性不育。考虑到WMS/wms区段在‘鲁麦15Ms2’中处于杂合状态，如果显性WMS基因发生点突变并且该突变影响基因功能，在M1世代将可能看到突变表型。为此，实验统计了该突变群体M1植株上所有麦穗的育性情况，总计3,138个麦穗，其中20麦穗表现雄性可育的特征(图5)，主要表现为花药正常生长、花药外挂、花粉散粉和部分结实等现象。
为开展TILLING筛选，需提取植物基因组DNA，这里采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)方法(Yuan et al.2012.Journal of Genetics and Genomics 39:587-592)。针对整个群体，首先收集单株主茎旗叶组织，获得基因组DNA，利用ND2000微量分光光度计(Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA)测定DNA浓度，统一调整为100ng/μl。分别移取部分DNA样品，每4个DNA样品等量混合成池(四重池)，于96孔板保存。对于鉴定到的20个可育麦穗，分别提取与之对应的旗叶组织DNA；当可育麦穗同时为主茎穗时，不需要重复提取；移取部分DNA样品，分别与野生型‘鲁麦15Ms2’的DNA等量混合成池(二重池)，同样于96孔板保存。
WMS基因突变个体的筛选采用改良的TILLING技术(Uauy et al.2009.BMC PlantBiology9:115)。利用普通聚丙烯酰胺胶电泳鉴定突变个体需要两轮筛选过程。第一轮筛选又涉及两轮PCR反应：a)利用长片段KOD FX试剂盒(Toyobo Co.，Osaka，Japan)扩增显性WMS基因，PCR引物WMS-FP8和WMS-RP10；反应体系为50μl，包括1×PCR缓冲液(KOD-Plus-Neo)，硫酸镁1.5mM,dNTPs各0.2mM,引物各0.2μM，基因组DNA 200ng，1U聚合酶(KOD-Plus-Neo)，加双蒸水补足体系；PCR反应条件为，初始变性94℃、2min，35个循环(变性98℃、10sec，退火60℃、30sec，延伸68℃、6min)，终延伸68℃、10min；用双蒸水稀释PCR产物500倍，用作第二轮PCR反应的模板；b)第二轮PCR的反应体系为25μl，包含1×PCR缓冲液(氯化镁1.5mM，dNTPs各0.2mM；Promega，Madison，USA)，引物各0.2μM，第一轮稀释后的PCR产物2μl，1U聚合酶(Promega)，加双蒸水补足体系；将全长5,925bp的模板分三段扩增，第一段使用PCR引物WMS-FP8和WMS-RP8，第二段使用PCR引物WMS-FP9和WMS-RP9，第三段使用PCR引物WMS-FP10和WMS-RP10；PCR反应条件为，初始变性94℃、5min，35个循环(变性94℃、30sec，退火61℃、30sec，延伸72℃、90sec)，终延伸72℃、10min；最后经历变性和缓慢复性的过程(变性99℃、10min，从72℃开始90个循环，每循环20sec，依次降低0.3℃)，以保证携带突变碱基的PCR产物形成杂合链(heteroduplex)。
对于经历了缓慢复性的第二轮PCR产物，用具有CelI核酸酶活性的芹菜粗提产物(celery juice extract，CJE)进行酶切，CJE的提取以及CJE酶切缓冲液的配制参照Till等人的方法(Till et al.2006.Nature Protocols 1:2465-2477)，CJE用量的优化参照Uauy等人的方法(Uauy et al.2009.BMC Plant Biology 9:115)。本发明建立的CJE酶切体系为，PCR产物14μl，芹菜粗提产物1μl，10×酶切缓冲液2μl，加双蒸水3μl补足体系；将酶切体系放置到45℃条件下催化30min；随后加入5μl EDTA(75mM)终止反应；最后加入5μl溴酚蓝缓冲液(6×)，混匀后，将其中的24μl样品在3％的聚丙烯酰胺胶(丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺＝19:1)上分离。对于携带突变的DNA池，单个泳道中酶切形成的条带长度相加近似于非酶切完整条带。对于直接与野生型DNA混合的双重DNA池，如果出现特异酶切小条带，说明与野生型DNA相混的那个DNA样品携带点突变。但对于四重DNA混合池来讲，如果能鉴定到点突变，则需要第二轮筛选确定突变单株。
第二轮筛选用来确定四重DNA混合池中携带点突变的单个样本。为此，挑取四重阳性池对应的原始DNA样品，移取部分DNA样品，分别与野生型‘鲁麦15Ms2’的DNA等量混合成池(二重池)，然后重复第一轮筛选过程，确定携带点突变的单株。
通过TILLING筛选，在1,200个主茎旗叶DNA样品中，发现大约35个主茎旗叶携带WMS基因组DNA点突变；而对于20个雄性可育穗对应的旗叶DNA样品，其中8个携带WMS基因点突变(图5)。根据主茎数据计算，WMS基因突变的概率为2.92％。在20个雄性可育穗对应的旗叶DNA样品中，实际观察到8样品携带WMS基因点突变而其它12个样品可能不携带WMS基因点突变。假设WMS基因和雄性不育性状无关(H0假设)，对于20个雄性可育穗对应的旗叶DNA样品，根据主茎WMS基因的突变概率(2.92％)，携带WMS基因点突变和没有WMS基因点突变的预想值分别为0.58和19.42；据此开展卡方拟合优度检验(χ2＝97.13，df＝1，P＝6.49E-23)，推翻H0假设。据此，WMS基因很可能决定‘太谷核不育小麦’的雄性不育性状。
实施例9：转基因小麦的获得、表型分析及分子验证
为开展小麦遗传互补实验，首先从“鲁麦15Ms2”上扩增了WMS基因组全长表达框架(SEQ ID NO:7)，这里应用到长片段KOD FX试剂盒以及PCR引物WMS-FP11和WMS-RP11；克隆PCR产物到入门载体；再重组到携带BAR筛选标记(Block et al.1987.The EMBO Journal6:2513-2518)的目的载体，得到植物表达载体PC976(图4A)。本发明获得了携带显性WMS基因的BAC质粒，从质粒上克隆WMS基因组全长表达框架(SEQ ID NO:7)相对容易。如果需要从‘太谷核不育小麦’基因组DNA上直接扩增，可以采用重叠延伸PCR(Vasl etal.2004.BioTechniques 37:726-730)等技术加以解决。
小麦幼胚培养和基因枪轰击转化参照Lv等人的流程(Lv et al.2014.PLoS ONE9:e94171)。本发明选择正常可育的普通小麦品种‘Bobwhite’作为转化受体；取‘Bobwhite’开花后7-14d左右的幼胚，进行幼胚表面灭菌，首先70％酒精(含0.05％吐温-20)处理5min，然后20％高乐氏漂白液(Regular Bleach，Oakland，CA，USA；额外添加了0.05％吐温-20)处理15min，最后用灭菌水冲洗3-5遍。在超净台上剥取幼胚(幼胚长度介于1-1.5mm)，按盾片朝上摆放到诱愈培养基(MS基本培养基4.3g/L，麦芽糖40g/L，维生素B10.5mg/L，天冬氨酸0.15g/L，2,4-D 2mg/L，硫酸铜0.78mg/L，植物凝胶2.5g/L，PH 5.8)，于22-23℃条件下暗培养4-6d。将幼胚转移到高渗培养基(即诱愈培养基+蔗糖171.15g/L，PH 5.8)处理4h，随后开展基因枪轰击。轰击处理20h后，将幼胚转移到恢复培养基(等同于诱愈培养基)，22-23℃条件下暗培养2w。将幼胚衍生的胚性愈伤转移到分化培养基(即诱愈培养基+6-苄氨基嘌呤0.1mg/L+双丙氨膦3mg/L，PH 5.8)，22-23℃和16h光照(25μmol/m2/s1)条件下培养2w。将分化出的再生苗(高度2-3cm)转移至生根培养基(MS基本培养基2.15g/L，麦芽糖20g/L，维生素B10.25mg/L，天冬氨酸0.075g/L，2,4-D 1mg/L，硫酸铜0.39mg/L，植物凝胶2.5g/L，双丙氨膦3mg/L，PH 5.8)，并在同样环境条件下培养。待再生苗根系发育完全后，转为盆栽，在温室条件下种植。
轰击处理采用PDS-1000/He台式基因枪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)。轰击微粒混合物的准备步骤如下：在1.5ml的硅化离心管中加入2mg金粉(直径0.6μm)，再加入35μl无水乙醇，震荡混匀，离心收集(12,000rpm，5sec)，弃上清；加入200μl冰预冷的灭菌水，震荡混匀，离心收集(12,000rpm，5sec)，弃上清；加20μg质粒DNA(浓度约1μg/μl)，再加入冰预冷的灭菌水至245μl，震荡混匀；然后加入250μl冰预冷的氯化钙(2.5M)，震荡混匀；最后加入50μl亚精胺(1.45％，v/v)，4℃条件下震荡15-20min，离心收集(12,000rpm，10sec)，弃上清；再加入36μl冰预冷的无水乙醇，震荡混匀。吸取10μl金粉和DNA悬浊液至载体膜中央，无菌风干后，将载体膜(金粉面朝下)置入微粒发射器(microcarrierlaunch assembly)，该发射器位于可裂膜(1,100psi)下方3cm处。接受轰击的愈伤摆放到高渗培养基(直径约3.5cm的区域)，然后放置于载体膜下方6cm处。PDS-1000/He基因枪的使用参照仪器说明书，轰击参数为1,300psi(轰击压力)和25mm Hg(真空度)。
本发明共轰击了2,742个小麦幼胚，经过组培、筛选和移栽，成功获得来自26个幼胚的26棵独立株系(表3)。在小麦拔节期，测试了所有茎秆/分蘖对草胺磷的抗性(，0.3％，v/v；Bayer Corporation，Pittsburgh，PA，USA)，每个茎秆/分蘖涂抹一个叶片(涂抹长度3cm)；涂抹5天后检查效果，抗性叶片涂抹部位持绿，感性叶片涂抹部位枯死；在26棵独立株系中，只有5棵植株对草胺磷表现抗性(图6；表3)。在小麦开花期，观察了植株的雄蕊发育情况，有3棵植株表现雄性不育，其中2棵植株同时抗草胺磷(图6；表3)。分子方面，用常规PCR检测了BAR基因和WMS基因在26棵独立株系中的整合情况，发现7棵植株同时为BAR和WMS阳性(表3)；BAR基因整合的检测应用PCR引物BAR-FP1和BAR-RP1，WMS基因整合的检测应用PCR引物WMS-FP8和WMS-RP12。利用RT-PCR，还检测了WMS基因在幼穗中的表达情况，只在3棵呈现雄性不育的植株中检测到WMS cDNA的表达(图6)；RT-PCR应用到WMS基因引物WMS-FP6和WMS-RP6以及内源参照基因引物Actin-FP1和Actin-RP1。综上所述，WMS基因组全长表达框架(SEQ ID NO:7)的导入和WMS基因cDNA(SEQ ID NO:1)的表达可以引起雄性不育，将正常可育小麦转变为雄性不育小麦。
由此可见，将WMS基因组全长表达框架(SEQ ID NO:7)或其它启动子驱动下的WMS基因cDNA(SEQ ID NO:1)导入正常可育植物(如粮食作物、花卉植物，蔬菜和林木等)，可以创建植物雄性不育系，这将在建立植物轮回选择体系、发展植物杂交制种技术等发面发挥重大作用。
表3：针对WMS基因的候选转基因小麦植株
备注：“+”表示抗除草剂，BAR基因整合阳性，WMS基因整合阳性，能检测到WMScDNA，或植株表现雄性不育；“-”表示不抗除草剂，BAR基因整合阴性，WMS基因整合阴性，未能检测到WMS cDNA，或植株表现雄性可育。带“+”的表格使用灰色背景标注。
实施例10：转基因短柄草的获得、表型分析和分子验证
本发明还在短柄草(Brachypodium distachyon L.)上开展了遗传互补实验。短柄草的转化采用农杆菌介导方法(Bragg et al.2012.PLoS ONE 7:e41916)。为此，将小麦转化中使用的WMS基因组全长表达载体PC976(图4A)导入农杆菌AGL1感受态细胞(电击转化)，然后在添加了卡那50mg/L、羧苄100mg/L和利福平40mg/L的MG/L培养基中筛选农杆菌转化细胞。每升MG/L培养基的配方为：蛋白胨5g、酵母粉2.5g、氯化钠5g、甘露醇5g、硫酸镁0.1g、磷酸氢二钾0.25g、谷氨酸1.2g和琼脂粉15g，并用氢氧化钠(1M)调pH至7.2。
本发明选择正常可育的短柄草自交系‘Bd21-3’作为转化受体，转化方法参照Bragg等人的方法(Bragg et al.2012.PLoS ONE 7:e41916)。将农杆菌涂布于额外添加了卡那50mg/L、羧苄100mg/L和利福平40mg/L的MG/L固体培养基中，28℃暗培养2d。用枪头刮取农杆菌，放到液体诱愈培养基(MS基本培养基4.43g/L，蔗糖30g/L，硫酸铜0.6mg/L，2,4-D2.5mg/L，植物凝胶2g/L，PH 5.8；Bragg et al.2012.PLoS ONE 7:e41916)悬浮，用液体CIM培养基调整OD600值至0.6，再根据悬浮液体积加入乙酰丁香酮(AS，200uM)和PE/F68(0.1﹪)。使用农杆菌悬浮液侵染短柄草愈伤组织，然后置于3层灭菌滤纸上，在22℃条件下暗培养3d；将愈伤从滤纸转移到含有潮霉素40mg/L和特美汀150mg/L的CIM培养基，28℃暗培养1w，筛选抗潮霉素的愈伤。每14d继代一次，如果愈伤状态良好，把它们转移到含有潮霉素40mg/L和特美汀150mg/L的再生培养基(LS基本培养基4.43g/L，麦芽糖30g/L，激动素0.2mg/L，植物凝胶2g/L，PH 5.8；Bragg et al.2012.PLoS ONE 7:e41916)上，培养条件为28℃和16h光照(20μmol/m2/s1)。待幼苗长至1-2cm(高度)，将它们转移到含特美汀150mg/L的生根培养基(MS基本培养基4.42g/L，蔗糖30g/L，植物凝胶2g/L，PH 5.7；Bragg etal.2012.PLoS ONE 7:e41916)中，待根发育完善(长度2-3cm)、须根较多时，把它们放到4℃培养箱春化2w，然后转移到温室种植。
本发明共侵染了100块短柄草愈伤，经过组培、筛选和移栽，成功获得来自8块愈伤的11棵植株(表4)。待幼苗长至3叶期(大约10cm高度)，测试候选植株对草胺磷的抗性(，0.3％，v/v)，每个茎秆/分蘖涂抹一个叶片(涂抹长度1cm)；涂抹5天后检查效果，抗性叶片涂抹部位持绿，感性叶片涂抹部位枯死；在11棵植株中，有10棵植株对抗草胺磷表现抗性(图7；表4)。在短柄草开花期，观察了所有植株的雄蕊发育情况，发现有10棵植株表现雄性不育，并且这10棵植株都对草胺磷表现抗性(图7；表4)。分子方面，用常规PCR检测了BAR基因和WMS基因在11棵植株中的整合情况，发现其中10棵植株同时携带BAR基因和WMS基因；BAR基因的检测应用到PCR引物BAR-FP1和BAR-RP1，WMS基因的检测应用到PCR引物WMS-FP8和WMS-RP12。利用RT-PCR，还检测了WMS基因在短柄草幼穗中的表达情况，发现10棵呈现雄性不育的植株中均能检测到WMS cDNA(图7；表4)；RT-PCR应用了WMS基因引物WMS-FP6和WMS-RP6以及内源参照基因引物Actin-FP1和Actin-RP1。总之，在所有11棵植株中，其中10棵抗除草剂、携带BAR基因和WMS基因、并表达WMS cDNA，而且这10棵植株都表现雄性不育；只有1棵植株为隐性，不抗除草剂、无BAR基因和WMS基因的整合、正常可育。由此可见，WMS基因组全长表达框架(SEQ ID NO:7)能提供雄性不育功能，可以将正常可育短柄草植株转变为雄性不育短柄草植株。
以上结果再次表明，将WMS基因组全长表达框架(SEQ ID NO:7)或其它启动子驱动下的WMS基因cDNA(SEQ ID NO:1)导入正常可育植物(如粮食作物、花卉植物，蔬菜和林木等)，可以创建植物雄性不育系，这将在建立植物轮回选择体系、发展植物杂交制种技术等方面发挥重大作用。
表4：针对WMS基因的候选转基因短柄草植株
备注：“+”表示抗除草剂，BAR基因整合阳性，WMS基因整合阳性，能检测到WMScDNA，或植株表现雄性不育；“-”表示不抗除草剂，BAR基因整合阴性，WMS基因整合阴性，未能检测到WMS cDNA，或植株表现雄性可育。带“+”的表格使用灰色背景标注。愈伤22-5、22-6和22-12各对应两个植株，其余愈伤则只对应一个植株。

Claims (9)

1.如下a）至c）任一项所述的DNA片段作为小麦雄性不育基因在小麦育种中的应用；
a）DNA片段如SEQ ID NO: 1所示；b）DNA片段，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；c）DNA片段如SEQ ID NO: 6所示。
2.携带如权利要求1所述DNA片段的质粒载体在小麦育种中的应用。
3.具有花药特异性驱动活性的启动子DNA片段在小麦育种中的应用；
所述启动子DNA片段如SEQ ID NO: 5所示。
4.携带如权利要求3所述DNA片段的质粒载体在小麦育种中的应用。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述小麦育种为小麦制种。
6.一种获得携带权利要求1所述DNA片段的植物细胞的方法，其特征在于，通过转基因或基因组编辑手段而获得。
7.一种获得携带权利要求1所述DNA片段的植株的方法，其特征在于，由权利要求5所述方法获得的植物细胞再生成苗。
8.携带如权利要求3所述DNA片段的植物细胞的获得方法，其特征在于，通过转基因或基因组编辑而获得携带权利要求3所述DNA片段的植物细胞。
9.携带权利要求3所述DNA片段的植株的获得方法，其特征在于，由权利要求8所述获得方法得到的植物细胞而形成的植株个体。
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